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厚藤I(mǎi)pLEA基因及其編碼蛋白和應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):11766656閱讀:461來(lái)源:國(guó)知局
厚藤I(mǎi)pLEA基因及其編碼蛋白和應(yīng)用的制作方法與工藝

本發(fā)明屬于生物基因工程領(lǐng)域,具體涉及厚藤(ipomoeapes-caprael.)中一個(gè)新的耐鹽抗旱基因iplea,該基因編碼厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白(late-embryogenesisabundantproteins,lea蛋白),在調(diào)控生物體耐鹽抗旱性方面的應(yīng)用。



背景技術(shù):

厚藤(ipomoeapes-caprael.)是一種具有高度耐鹽和抗旱能力的鹽生植物,在全世界熱帶亞熱帶濱海及島嶼地區(qū)均有分布,是典型的鹽生植物之一。由于厚藤具有高度的抗逆能力,其抗逆分子機(jī)制的探討具有重要的理論意義,而通過(guò)對(duì)其抗逆遺傳資源的發(fā)掘以及對(duì)抗逆功能基因的深入研究具有廣泛的應(yīng)用前景。

植物在其生長(zhǎng)過(guò)程中,通常會(huì)遭遇多種逆境脅迫對(duì)其生長(zhǎng)和發(fā)育產(chǎn)生不利的影響,其中水分缺失是常見(jiàn)的一種。造成植物或細(xì)胞缺水的逆境主要包括以下幾種:冷凍、干旱和鹽脅迫。植物在適應(yīng)這些逆境的進(jìn)化過(guò)程中,發(fā)展了一系列的生理及分子機(jī)制減緩逆境脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的傷害,維持其完成正常的生長(zhǎng)周期和世代交替。lea蛋白是植物中廣泛存在的一類(lèi)小分子親水性蛋白,自從首次從棉花胚胎中獲得分離以來(lái),經(jīng)過(guò)三十多年的研究,盡管該類(lèi)蛋白確切的生化功能和作用機(jī)制仍不完全清楚,但已有越來(lái)越多的研究表明,植物lea蛋白廣泛地參與應(yīng)答非生物逆境脅迫(尤其是失水脅迫)的生理過(guò)程中,并在提高植物抗逆性方面發(fā)揮重要的功能。

lea蛋白的全稱(chēng)為晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白(lateembryogenesisabundantproteins,leaproteins),首次由dure等(1981)在棉花胚胎發(fā)育后期的分離得到其mrna,該mrna翻譯的產(chǎn)物即為lea蛋白。幾十年來(lái),在多種植物、藍(lán)藻、細(xì)菌及動(dòng)物中均分離得到了lea蛋白,由此可見(jiàn),lea蛋白并不是植物所特有的,而是廣泛分布于生物界中。lea蛋白及其mrna在生物體內(nèi)的積累往往與耐脫水性密切相關(guān),但由于其分布的廣泛性及成員的多樣性,該類(lèi)蛋白具體的生物學(xué)功能并不完全清楚。在植物中,早期關(guān)于lea蛋白的研究表明,該類(lèi)蛋白及其編碼的mrna主要積累于種子發(fā)育過(guò)程中胚胎發(fā)生的晚期(種子形成并干燥之前),以及一些暴露于脫水、滲透壓、低溫等失水脅迫環(huán)境下的營(yíng)養(yǎng)組織中,這些結(jié)果暗示該類(lèi)蛋白可能參與植物應(yīng)答水分限制相關(guān)的逆境脅迫,并通過(guò)改善失水脅迫中的細(xì)胞狀況而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。由于lea蛋白通常在缺水的組織/細(xì)胞中聚集,且通常含有較多的親水性氨基酸,因此也被稱(chēng)為親水素(hydrophilin)。

而目前,厚藤的lea蛋編碼白及其基因的作用還有待開(kāi)發(fā)。

在本發(fā)明中,我們公開(kāi)了厚藤體內(nèi)的一個(gè)編碼lea蛋白基因iplea,該基因表達(dá)能夠提高酵母菌對(duì)鹽和氧化脅迫的耐受性,提供了將該基因應(yīng)用于工程菌釀酒酵母的耐鹽和抗氧化遺傳改良的應(yīng)用;iplea在大腸桿菌中的表達(dá)能夠提高工程菌大腸桿菌對(duì)高鹽和干旱的耐受性,提供了將該基因用于包括大腸桿菌在內(nèi)的工程菌耐鹽和耐脫水的遺傳改良方面的應(yīng)用。本發(fā)明也簡(jiǎn)單闡述了可將該基因應(yīng)用于植物的遺傳改造,培育用于提高耐鹽/耐旱性的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因植物。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明的目的是提供一種耐鹽、耐旱植物功能性蛋白——厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白iplea及其應(yīng)用。我們?cè)诤裉賑dna文庫(kù)篩選過(guò)程中發(fā)現(xiàn)一個(gè)代表胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白基因的克隆能夠提高酵母菌株的耐鹽性,本研究在前期研究的基礎(chǔ)上,克隆了該胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白基因,功能研究表明,該基因可提高生物體的耐鹽和抗旱能力。

氨基酸序列如seqidno.1所示的厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白iplea和/或iplea基因在提高植物對(duì)高鹽/干旱的耐受中的應(yīng)用,所述iplea基因的cdna為如seqidno.2所示的核苷酸序列,或?yàn)榕cseqidno.2互補(bǔ)配對(duì)的核苷酸序列,或?yàn)榫幋a氨基酸序列如seqidno.1所示的厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白的核苷酸序列。

氨基酸序列如seqidno.1所示的厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白iplea和/或iplea基因在農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因育種中改良農(nóng)作物對(duì)高鹽/干旱耐受性、和/或調(diào)控農(nóng)作物對(duì)氧化脅迫耐受性的應(yīng)用,所述厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白基因iplea的cdna為如seqidno.2所示的核苷酸序列,或?yàn)榕cseqidno.2互補(bǔ)配對(duì)的核苷酸序列,或?yàn)榫幋a氨基酸序列如seqidno.1所示的厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白的核苷酸序列。

本發(fā)明的厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白iplea,其氨基酸序列如seqidno.1所示,其編碼基因iplea的核苷酸序列如seqidno.2所示。應(yīng)當(dāng)理解,考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性,在不改變氨基酸序列的前提下,對(duì)上述編碼基因的核苷酸序列進(jìn)行修改,也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)一組厚藤iplea蛋白重組表達(dá)載體及其應(yīng)用,該重組載體插入了iplea基因。將該重組載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入釀酒酵母中,通過(guò)半乳糖誘導(dǎo)該基因在酵母中的超表達(dá),能夠在高鹽和過(guò)氧化氫脅迫處理下,提高酵母對(duì)鹽脅迫和氧化脅迫的耐受性。

同時(shí),公開(kāi)構(gòu)建厚藤iplea蛋白重組原核表達(dá)載體及其運(yùn)用,該重組載體插入了iplea基因,將該載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌bl21菌株中,通過(guò)iptg誘導(dǎo)該基因在大腸桿菌中的超表達(dá),證明iplea基因能夠提高工程菌大腸桿菌的耐鹽和耐旱性。

實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下:

插入有iplea基因的釀酒酵母重組表達(dá)載體,所述iplea基因的cdna為如seqidno.2所示的核苷酸序列,或?yàn)榕cseqidno.2互補(bǔ)配對(duì)的核苷酸序列,或編碼為氨基酸序列如seqidno.1所示的厚藤iplea蛋白的核苷酸序列。

上述釀酒酵母重組表達(dá)載體在提高工程菌株釀酒酵母對(duì)高鹽和氧化脅迫的耐受性中的應(yīng)用。

插入有iplea基因的大腸桿菌表達(dá)載體,所述iplea基因的cdna為如seqidno.2所示的核苷酸序列,或?yàn)榕cseqidno.2互補(bǔ)配對(duì)的核苷酸序列,或?yàn)榫幋a氨基酸序列如seqidno.1所示的厚藤iplea蛋白的核苷酸序列。

上述大腸桿菌重組表達(dá)載體在提高工程菌大腸桿菌對(duì)高鹽和干旱脅迫耐受性中的應(yīng)用。

此外,本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)了厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白基因iplea在模式植物擬南芥中的超表達(dá)載體及其應(yīng)用,該重組載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序侵染法對(duì)擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)基因,能夠提高擬南芥的耐鹽和抗旱性。

實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下:

本發(fā)明以厚藤幼苗為材料,提取rna,并將rna逆轉(zhuǎn)錄成cdna,并將cdna分別以pdonr222和pyes-dest52為目標(biāo)載體,采用技術(shù)(invitrogen)構(gòu)建cdna表達(dá)文庫(kù),并將文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母對(duì)鹽敏感的突變株axt3,挑取耐鹽酵母克隆,并提取質(zhì)粒,對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序,通過(guò)序列分析(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi),獲得厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白基因iplea的cdna全長(zhǎng),其序列如seqidno.2所示。

將含有iplea的cdna全長(zhǎng)的酵母表達(dá)載體pyes-dest52重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化野生型酵母菌株w303,以轉(zhuǎn)化酵母表達(dá)載體pyes2空載體的w303為對(duì)照,分別在含鹽量5%,7.5%和8.8%的培養(yǎng)基上測(cè)試轉(zhuǎn)基因酵母的耐鹽性。

以含有厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白基因cdna的酵母表達(dá)載體pyes-dest52重組質(zhì)粒為模板,設(shè)計(jì)以下引物分別擴(kuò)增iplea基因的cdna全長(zhǎng)閱讀框序列,用于獲取插入至大腸桿菌蛋白表達(dá)載體pgex6p-1的cdna閱讀框片段。引物如seqidno.3(ipleaeef:5’-ggggcccctgggatccatggcatcgtctgataatcc-3’)和seqidno.4(ipleaeer:5’-ggaattccggggatcctcaatcctcctcatcatcat-3’)所示。

以上pcr采用高保真的taq酶進(jìn)行擴(kuò)增,并將得到的目的dna片段進(jìn)行回收,連接于大腸桿菌蛋白表達(dá)載體pgex6p-1上(bamhi切點(diǎn)),形成重組載體iplea-pgex6p-1,并測(cè)序。

采用cacl2的方法將上述厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白大腸桿菌蛋白表達(dá)重組載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌bl21感受態(tài)菌株中,通過(guò)添加1mm的iptg誘導(dǎo)iplea基因在大腸桿菌中的超表達(dá)。之后檢測(cè)表達(dá)有厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白的大腸桿菌的耐鹽性和抗旱性。

以含有厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白基因cdna的酵母表達(dá)載體pyes-dest52重組質(zhì)粒為模板,設(shè)計(jì)以下引物分別擴(kuò)增iplea基因的cdna全長(zhǎng)閱讀框序列,用于獲取插入至擬南芥轉(zhuǎn)基因超表達(dá)載體pmd1的cdna閱讀框片段,用于構(gòu)建厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白基因轉(zhuǎn)基因超表達(dá)重組載體iplea-pmd1。引物如seqidno.5(ipleaoxf:5’-ggactctagaggatccatggcatcgtctgataatcca-3’)和seqidno.6(ipleaoxr:5’-gtcgacccggggatcctcaatcctcctcatcatcat-3’)所示。

采用cacl2的方法將上述厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白轉(zhuǎn)基因超表達(dá)重組載體iplea-pmd1轉(zhuǎn)化進(jìn)入農(nóng)桿菌gv3101感受態(tài)菌株中,通過(guò)擬南芥花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥植株,通過(guò)kan抗性篩選獲得轉(zhuǎn)基因后代,對(duì)轉(zhuǎn)基因超表達(dá)厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白基因的擬南芥后代進(jìn)行耐鹽性和抗旱性檢測(cè)。

本發(fā)明的有益效果如下:

在本發(fā)明中,我們通過(guò)篩選獲得的厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白iplea基因的進(jìn)行應(yīng)用性探索,發(fā)現(xiàn)該基因以下應(yīng)用方式:(1)該基因在釀酒酵母中的超量表達(dá)能夠提高酵母對(duì)高鹽和氧化脅迫的耐受性;(2)通過(guò)誘導(dǎo)厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白在大腸桿菌中表達(dá)后,能夠提高大腸桿菌的耐鹽性和耐旱性;(3)該基因在擬南芥中的超量表達(dá)能夠提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)高鹽和干旱脅迫的耐受性。

本發(fā)明也可推廣至農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域,通過(guò)改變iplea基因在農(nóng)作物中的表達(dá),調(diào)控農(nóng)作物對(duì)高鹽和干旱脅迫的耐受,以及參與農(nóng)作物對(duì)多種逆境脅迫的適應(yīng)性改變。

附圖說(shuō)明

圖1示釀酒酵母重組表達(dá)載體iplea-pyes-dest52示意圖。

圖2示轉(zhuǎn)化iplea-pyes-dest52的轉(zhuǎn)基因酵母對(duì)鹽敏感的突變株axt3對(duì)鹽脅迫的耐受性提高。

圖3示轉(zhuǎn)化iplea-pyes-dest52的轉(zhuǎn)基因野生型酵母w303對(duì)鹽脅迫的耐受性提高。

圖4示轉(zhuǎn)化iplea-pyes-dest52的轉(zhuǎn)基因酵母對(duì)h2o2敏感的突變株yap1δ(a)和skn7δ(b)對(duì)氧化脅迫的耐受性提高。

圖5示大腸桿菌重組蛋白表達(dá)載體iplea-pgex6p-1示意圖。

圖6示轉(zhuǎn)化iplea-pgex6p-1的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌對(duì)高鹽(a)和脫水(b)脅迫的耐受性提高。圖7示模式植物擬南芥轉(zhuǎn)基因超表達(dá)載體iplea-pmd1示意圖。

具體實(shí)施方式

為了便于理解本發(fā)明,下面將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更全面的描述。本發(fā)明可以以許多不同的形式來(lái)實(shí)現(xiàn),并不限于本文所描述的實(shí)施例。相反地,提供這些實(shí)施例的目的是使對(duì)本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容的理解更加透徹全面。

下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件,例如sambrook等人,分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中所用到的各種常用化學(xué)試劑,均為市售產(chǎn)品。

除非另有定義,本發(fā)明所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與屬于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)中所使用的術(shù)語(yǔ)只是為了描述具體的實(shí)施例的目的,不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)“和/或”包括一個(gè)或多個(gè)相關(guān)的所列項(xiàng)目的任意的和所有的組合。

實(shí)施例1:通過(guò)厚藤cdna酵母表達(dá)文庫(kù)篩選獲得厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白基因iplea的cdna全長(zhǎng)

1.1厚藤全長(zhǎng)cdna表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建

厚藤cdna文庫(kù)的構(gòu)建主要參考clonemineriicdnalibraryconstructionkit的說(shuō)明書(shū),采用(invitrogen)技術(shù)進(jìn)行。具體包括以下步驟:總rna提取、mrna的分離、cdna初級(jí)文庫(kù)的構(gòu)建和cdna次級(jí)文庫(kù)的構(gòu)建。各步驟主要概述如下:

(1)總rna提取

取2g等量的厚藤葉片、葉芽、藤及幼根,在預(yù)冷的研缽中用液氮研磨成粉末,將粉末適量移至多個(gè)rnase-free的1.5ml離心管中,每個(gè)離心管加入1mltrizolreagent,迅速震蕩混勻,并按照試劑說(shuō)明書(shū)操作,獲得厚藤不同組織的總rna混合樣。將干燥后的總rna溶于100μlrnase-free的水中。用紫外分光光度計(jì)和1%的瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定總rna的濃度和質(zhì)量。

(2)mrna的分離

取大于500μg的厚藤總rna,按照f(shuō)asttrackmagmrnaisolationkit說(shuō)明書(shū)分離純化mrna,用紫外分光光度法測(cè)定mrna濃度,用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)mrna的質(zhì)量。(3)cdna初級(jí)文庫(kù)的構(gòu)建

取約3μg的厚藤mrna,加入rnase-free的水至總體積為9μl;然后加入biotin-attb2-oligo(dt)primer(30pm)1ul和dntps(10mmeach)1ul混勻,70℃5min,45℃孵育2min;加入superscriptiiifirst-strandsynthesissystemforrt-pcr的5×firststrandbuffer4μl和dtt(0.1m)2μl,最后加入3μl的superscriptiii逆轉(zhuǎn)錄酶至中反應(yīng)體積為20μl,混勻后置于pcr儀上反應(yīng)45℃20min;50℃20min;55℃20min。以上步驟為合成cdna第一鏈。

在cdna第一鏈反應(yīng)液中依次加入e.colidnaligase,e.colidnapolymerasei,e.colirnaseh和t4dnapolymerase等合成第二鏈,此時(shí)即獲得厚藤雙鏈cdna。將雙鏈cdna純化后與attb1重組接頭連接,連接好接頭的厚藤雙鏈cdna使用clonemineriicdnalibraryconstructionkit的分級(jí)分離層析柱,去除分子量小于500bp的小片段cdna,保留大于500bp的cdna片段用于后續(xù)的cdna文庫(kù)的構(gòu)建。

參照clonemineriicdnalibraryconstructionkit的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行bp重組反應(yīng)構(gòu)建cdna初級(jí)文庫(kù)。具體步驟包括:在潔凈的pcr管中依次添加cdna(100ng/μl)13μl,pdonr222(250ng/μl)2μl,bpiienzymemix5μl至總體積20μl,混合均勻后,置于25℃下進(jìn)行bp重組反應(yīng)16~20h。通過(guò)電穿孔儀將純化后的bp重組反應(yīng)產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌dh10b感受態(tài)細(xì)胞中,電擊后迅速向電轉(zhuǎn)杯中加入2mlsoc培養(yǎng)基,經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后,即為初級(jí)文庫(kù)菌液。

(4)cdna次級(jí)文庫(kù)的構(gòu)建

采用lr重組反應(yīng)進(jìn)行cdna次級(jí)文庫(kù)的構(gòu)建,具體步驟包括:初級(jí)文庫(kù)用lb培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)后,然后用purelinktmhqminiplasmiddnapurificationkit提取質(zhì)粒。初級(jí)cdna文庫(kù)質(zhì)粒使用適量的te溶解,并采用紫外分光光度法測(cè)定濃度。將初級(jí)文庫(kù)質(zhì)粒濃度調(diào)整至300ng/μl,取1μl文庫(kù)質(zhì)粒依次加入pyes-dest52(300ng/ul)1μl,lrclonaseiimix1μl,補(bǔ)加雙蒸水12μl至總體積20μl。置于25℃下進(jìn)行l(wèi)r重組反應(yīng)16~20h。之后使用電穿孔儀將純化后的lr重組反應(yīng)產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌dh10b感受態(tài)細(xì)胞中,電擊后迅速向電轉(zhuǎn)杯中加入2mlsoc培養(yǎng)基,經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后,即為次級(jí)文庫(kù)菌液。

1.2厚藤cdna文庫(kù)的篩選

厚藤cdna文庫(kù)的篩選采用質(zhì)粒文庫(kù)轉(zhuǎn)化酵母鹽敏感的突變株axt3的方法。axt3在含有75mm的nacl的培養(yǎng)基上無(wú)法生長(zhǎng),而野生型酵母則可以正常生長(zhǎng)。axt3經(jīng)轉(zhuǎn)化酵母質(zhì)粒文庫(kù)后,涂布于含有75mm的nacl的培養(yǎng)基上,經(jīng)30℃培養(yǎng)3至7天,可得到若干個(gè)可以恢復(fù)對(duì)鹽敏感的酵母克隆。對(duì)這些克隆擴(kuò)增培養(yǎng)并提取質(zhì)粒,即可獲得多個(gè)厚藤耐鹽基因,其中一個(gè)為編碼厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白基因iplea的cdna全長(zhǎng)序列。詳細(xì)步驟如下:

(1)厚藤cdna文庫(kù)質(zhì)粒的獲取

文庫(kù)質(zhì)粒的獲取采用固體lb培養(yǎng)基平板擴(kuò)增法,即根據(jù)文庫(kù)的總克隆數(shù),將厚藤次級(jí)文庫(kù)菌液涂布于100個(gè)含有amp抗生素14cm的lb平板上過(guò)夜37℃培養(yǎng),確保文庫(kù)的每個(gè)克隆都得到了等量的擴(kuò)增。待長(zhǎng)出菌落后,加液體lb培養(yǎng)基洗脫,堿裂解法提取質(zhì)粒。

(2)厚藤cdna文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母鹽敏感的突變株axt3

調(diào)整純化后的次級(jí)文庫(kù)質(zhì)粒濃度至1μg/μl,采用乙酸鋰法轉(zhuǎn)化酵母對(duì)鹽敏感的突變株axt3。挑取酵母單克隆接種于液體ypd培養(yǎng)基中,30℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。之后按照1:100的比例將酵母菌液轉(zhuǎn)接于新鮮的液體ypd培養(yǎng)基中,30℃震蕩培養(yǎng)至od600為0.5左右,鋰鹽溶液重懸,加適量鮭魚(yú)精載體dna,50%peg。根據(jù)沉淀量稀釋菌體,涂布于含有75mm的nacl的酵母篩選培養(yǎng)基(酵母極限培養(yǎng)基添加腺嘌呤,缺少尿嘧啶)上培養(yǎng),直至出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子。

1.3厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白基因iplea的cdna全長(zhǎng)的獲得及序列分析

在含有75mm的nacl的酵母篩選培養(yǎng)基上挑取酵母單克隆,接菌于未添加nacl的液體篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。離心收集酵母菌體后,按照hipureyeastplasmidminikit的說(shuō)明書(shū)提取酵母質(zhì)粒。由于酵母質(zhì)粒含量較低,無(wú)法直接進(jìn)行測(cè)序分析,故將酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中,挑取單克隆擴(kuò)增培養(yǎng)后,采用堿裂解法提取質(zhì)粒,進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序由廣州艾基生物公司完成。

測(cè)序后的cdna核苷酸序列比較、翻譯等在dnastar7.0生物軟件上進(jìn)行,序列同源性分析采用blast程序,在ncbi(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)網(wǎng)站上進(jìn)行。

測(cè)序結(jié)果表明,其中一個(gè)克隆含有編碼厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白的cdna全長(zhǎng),其結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。去掉pyes-dest52載體序列后,厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白的cdna全長(zhǎng)序列為如seqidno.2所示的核苷酸序列,其最長(zhǎng)閱讀框?yàn)榫幋a氨基酸序列如seqidno.1所示的厚藤iplea蛋白。

實(shí)施例2:iplea基因在酵母中超表達(dá)提高酵母的耐鹽性和對(duì)氧化脅迫的耐受性

2.1iplea-pyes-dest52轉(zhuǎn)化酵母菌株

將測(cè)序結(jié)果得到驗(yàn)證的iplea-pyes-dest52重組質(zhì)粒調(diào)整濃度至0.1μg/μl,采用乙酸鋰法的方法分別轉(zhuǎn)化酵母對(duì)鹽敏感的突變株axt3和對(duì)應(yīng)的野生型酵母株系w303,以及轉(zhuǎn)化酵母對(duì)h2o2敏感的突變株yap1δ和skn7δ和對(duì)應(yīng)的野生型酵母株系wt。同時(shí)采用酵母表達(dá)載體空載體pyes2做對(duì)照,分別轉(zhuǎn)化上述酵母株系。

2.2iplea基因在酵母鹽敏感突變株axt3和野生型菌株w303中表達(dá)均可以提高轉(zhuǎn)基因酵母的耐鹽性

挑取酵母菌株axt3轉(zhuǎn)化空載體pyes2和iplea基因超表達(dá)載體iplea-pyes-dest52的單克隆,接種于2ml添加了半乳糖的酵母極限液體培養(yǎng)基中,30℃恒溫?fù)u床(200rpm)培養(yǎng)至菌液od600值達(dá)2。按照1:1、1:10、1:100、1:1000將菌液進(jìn)行逐級(jí)稀釋?zhuān)謩e吸取2μl逐級(jí)稀釋的菌液滴至添加有50mm,75mm和200mmnacl的酵母極限固體培養(yǎng)基平板上。30℃培養(yǎng)7天,觀察酵母生長(zhǎng)情況。

如圖2所示,超表達(dá)iplea基因的轉(zhuǎn)基因酵母相比較于轉(zhuǎn)化空載體pyes2的axt3酵母突變株而言,能夠在添加50mm和75mmnacl的培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng),而在添加200mmnacl的培養(yǎng)基平板上也可以輕微生長(zhǎng);而未表達(dá)厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白iplea的酵母(轉(zhuǎn)化空載體pyes2)則不能生長(zhǎng),表明iplea基因在酵母中的表達(dá)能夠提高酵母鹽敏感突變株axt3對(duì)鹽脅迫的耐受性。

同時(shí),挑取野生型酵母株系w303轉(zhuǎn)化空載體pyes2和iplea基因超表達(dá)載體iplea-pyes-dest52的單克隆,按照上述方法進(jìn)行液體培養(yǎng)基培養(yǎng),并逐級(jí)稀釋后滴至添加有5%,7.5%和8.8%(均為質(zhì)量體積比)nacl的酵母極限固體培養(yǎng)基平板上。30℃培養(yǎng)7天,觀察酵母生長(zhǎng)情況。

如圖3所示,超表達(dá)iplea基因的轉(zhuǎn)基因酵母相比較于轉(zhuǎn)化空載體pyes2的w303酵母突變株而言,能夠在添加5%和7.5%nacl的培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng),且生長(zhǎng)狀況良好,而在添加8.8%nacl的培養(yǎng)基平板上也可以輕微生長(zhǎng);而未表達(dá)厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白iplea的酵母(轉(zhuǎn)化空載體pyes2)則不能生長(zhǎng),表明iplea基因在酵母中的表達(dá)能夠提高野生型酵母株系w303對(duì)鹽脅迫的耐受性。

2.3iplea基因在酵母對(duì)h2o2敏感突變株yap1δ和skn7δ中表達(dá)均可以提高轉(zhuǎn)基因酵母對(duì)氧化脅迫的耐受性

挑取酵母對(duì)h2o2敏感突變株yap1δ和skn7δ轉(zhuǎn)化空載體pyes2和iplea基因超表達(dá)載體iplea-pyes-dest52的單克隆,同時(shí)也挑取野生型酵母wt轉(zhuǎn)化空載體pyes2的單克隆作為對(duì)照,將上述克隆分別接種于2ml添加了半乳糖的酵母極限液體培養(yǎng)基中,30℃恒溫?fù)u床(200rpm)培養(yǎng)至菌液od600值達(dá)2。按照1:1、1:10、1:100、1:1000將菌液進(jìn)行逐級(jí)稀釋?zhuān)謩e吸取2μl逐級(jí)稀釋的菌液滴至添加有0.75mm的h2o2的酵母極限固體培養(yǎng)基平板上。30℃培養(yǎng)7天,觀察酵母生長(zhǎng)情況。

如圖4所示,超表達(dá)iplea基因的轉(zhuǎn)基因酵母相比較于轉(zhuǎn)化空載體pyes2的yap1δ酵母突變株而言,能夠在添加0.75mmh2o2的培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng);而未表達(dá)厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白iplea的酵母yap1δ(轉(zhuǎn)化空載體pyes2)則幾乎不能生長(zhǎng)(圖4a)。同樣,超表達(dá)iplea基因的轉(zhuǎn)基因酵母skn7δ也能夠在添加0.75mmh2o2的培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng);而未表達(dá)厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白iplea的酵母skn7δ(轉(zhuǎn)化空載體pyes2)則幾乎不能生長(zhǎng)(圖4b)。這些結(jié)果表明iplea基因在h2o2敏感酵母突變株yap1δ和skn7δ中的表達(dá)能夠提高酵母對(duì)氧化脅迫脅迫的耐受性。

seqidno.1

氨基酸序列

>ipleaprotein

massdnpeivergikdkedkeeekggfldkvkdfihdvgekieetigfgkptadvseihiphinleraeivvdvlvknpnpvpiplidinyliesdgrklisglipdagtihahgsetvkipvnliyddikstykdiepgsiipyrikvdlivdvpvfgrltlplektgeipipykpdidlekihferfsfeetvailhlklenmndfdlglnsldyelwlsdvsigsaelekaakiekkgtsyidlpvtfrpkdfgsalwdmirgkgtgytmkghinvdtpfgamklpiskeggttrlkknkedggdddeed

cdna序列(涂陰影部分為cdna閱讀框seqidno.2,上游為5’非翻譯區(qū),下游為3’非翻譯區(qū))

>iplea

ggacaatctcttcgtcttcaccatttgcagccgattatctctcgttagcttgtgagaaggtagctgtgctttacaatgatgtggggaataaactgtcgggttatgatgttgattatgaatccatatttatatcaaggaatttgaactggggtgtcgattttcaaaggcattgagtgtgtgttttagaacaaagacttggaagtatgttatttagttgtgcgtttggtgtttcagacttaaagagagaggctgttgtttaaaccatgagagtgatatgccgacgtgttgtttgtggttatgttcaatagatatatggtaatttatattcgcctcatttggtacatgctcctattttaattttaatgataatgtatatagggtagatggcaaattacaccgaagatcactaataaatgttcatttttaattaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

實(shí)施例3:iplea基因在大腸桿菌中超表達(dá)提高大腸桿菌的耐鹽性和耐脫水性

3.1大腸桿菌重組蛋白表達(dá)載體iplea-pgex6p-1的構(gòu)建

以含有厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白基因cdna的酵母表達(dá)載體pyes-dest52重組質(zhì)粒為模板,以seqidno.3和seqidno.4為引物,采用高保真的taq酶通過(guò)pcr擴(kuò)增iplea基因的cdna閱讀框全長(zhǎng)。采用的pcr體系參考takara公司primestarhsdnapolymerasewithgcbuffer說(shuō)明書(shū)。擴(kuò)增的dna片段依照magen公司hipuregelpurednakits說(shuō)明書(shū)?;厥盏玫降钠斡糜诓迦胫链竽c桿菌重組蛋白表達(dá)載體pgex6p-1中。pgex6p-1質(zhì)粒經(jīng)bamhi單酶切處理,回收線性化質(zhì)粒?;厥蘸蟮膇plea的cdna閱讀框pcr片段和線性化pgex6p-1質(zhì)粒經(jīng)nanodrop公司紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度,采用takara(clontech)公司的hdcloningkit進(jìn)行dna片段和載體的同源重組連接。按照說(shuō)明書(shū)的方法將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌jm109感受態(tài)菌株。挑取單克隆,提取質(zhì)粒,經(jīng)測(cè)序鑒定為正確的陽(yáng)性克隆后,保存質(zhì)粒備用。經(jīng)測(cè)序分析后,iplea的cdna核苷酸序列如seqidno.2所示,所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列如seqidno.1所示。構(gòu)建好的大腸桿菌重組蛋白表達(dá)載體iplea-pgex6p-1如圖5所示。

3.2厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白iplea蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

采用堿裂解法提取iplea-pgex6p-1重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌bl21感受態(tài)菌株中,挑取單克隆至液體lb培養(yǎng)基中,通過(guò)添加1mm的iptg誘導(dǎo)iplea基因在大腸桿菌中的超表達(dá)。

3.3表達(dá)有厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白iplea的大腸桿菌的耐鹽性檢測(cè)

挑取轉(zhuǎn)化厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白表達(dá)載體iplea-pgex6p-1的大腸桿菌單克隆,以轉(zhuǎn)化pgex6p-1空載體的大腸桿菌單克隆為對(duì)照,分別接種于液體lb培養(yǎng)基中(添加終濃度為50μg/ml的氨芐青霉素),在恒溫?fù)u床(37℃,200rpm)中培養(yǎng)12小時(shí)。之后按照1:100的比例轉(zhuǎn)接于新鮮的液體lb培養(yǎng)基(添加終濃度為100μg/ml的氨芐青霉素)中,培養(yǎng)2到4小時(shí)至od600值達(dá)0.5,之后添加終濃度為0.2mm的iptg誘導(dǎo)培養(yǎng)2到4小時(shí)至od600值達(dá)1。按照1:1、1:10、1:100、1:1000將菌液進(jìn)行逐級(jí)稀釋?zhuān)謩e吸取2μl逐級(jí)稀釋的菌液滴至添加有1%nacl(對(duì)照,145mmnacl)和4%nacl(高鹽脅迫,680mmnacl)的lb培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中添加終濃度為0.2mm的iptg和100μg/ml的氨芐青霉素)上,37℃培養(yǎng)12至24小時(shí),觀察大腸桿菌生長(zhǎng)情況。

如圖6的a所示,在添加低濃度nacl(lb培養(yǎng)基,1%nacl)的正常生長(zhǎng)條件下,轉(zhuǎn)化空載體pgex6p-1和表達(dá)iplea蛋白(轉(zhuǎn)化iplea蛋白表達(dá)載體iplea-pgex6p-1)的大腸桿菌的生長(zhǎng)狀況一致,但在高鹽濃度(lb培養(yǎng)基,4%nacl)的正常生長(zhǎng)條件下,轉(zhuǎn)化表達(dá)iplea蛋白載體(iplea蛋白表達(dá)載體iplea-pgex6p-1)的大腸桿菌的生長(zhǎng)狀況要遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于僅轉(zhuǎn)化空載體pgex6p-1的大腸桿菌,表明厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白iplea在大腸桿菌中能夠提高大腸桿菌的耐鹽性。

3.4表達(dá)有厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白iplea的大腸桿菌的耐脫水性檢測(cè)

挑取轉(zhuǎn)化厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白表達(dá)載體iplea-pgex6p-1的大腸桿菌單克隆,以轉(zhuǎn)化pgex6p-1空載體的大腸桿菌單克隆為對(duì)照,分別接種于液體lb培養(yǎng)基中(添加終濃度為50μg/ml的氨芐青霉素),在恒溫?fù)u床(37℃,200rpm)中培養(yǎng)12小時(shí)。之后按照1:100的比例轉(zhuǎn)接于新鮮的液體lb培養(yǎng)基(添加終濃度為100μg/ml的氨芐青霉素)中,培養(yǎng)2到4小時(shí)至od600值達(dá)0.5,之后添加終濃度為0.2mm的iptg誘導(dǎo)培養(yǎng)2到4小時(shí)至od600值達(dá)1。分別取1μl的菌液各六份,三份為對(duì)照,另外三份置于37℃干燥培養(yǎng)箱中干燥1小時(shí)至菌體完全干燥,之后再加入1ml的新鮮液體培養(yǎng)基恢復(fù)培養(yǎng)0.5小時(shí),涂布至lb培養(yǎng)基平板上,對(duì)照則直接涂布于lb培養(yǎng)基平板上,37℃培養(yǎng)12至24小時(shí),觀察大腸桿菌的克隆數(shù)。

如圖6的b所示,未經(jīng)脫水干燥處理的菌液,對(duì)照(轉(zhuǎn)化pgex6p-1空載體)和表達(dá)iplea蛋白的大腸桿菌(轉(zhuǎn)化iplea-pgex6p-1)1μl原始菌液形成的單克隆菌落(cfu)介于6x106和7x106之間,兩者并不具備顯著性差異。1μl原始菌液經(jīng)脫水干燥后,表達(dá)iplea蛋白的大腸桿菌(轉(zhuǎn)化iplea-pgex6p-1)形成的單克隆菌落數(shù)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于僅轉(zhuǎn)化pgex6p-1空載體的大腸桿菌,兩者有極顯著的差異,表明厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白iplea在大腸桿菌中能夠提高大腸桿菌的耐脫水性(耐旱性)。實(shí)施例4:iplea基因在擬南芥中超表達(dá)提高擬南芥的耐鹽性和耐旱性

4.1擬南芥轉(zhuǎn)基因超表達(dá)載體iplea-pmd1的構(gòu)建

以含有厚藤胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白基因cdna的酵母表達(dá)載體pyes-dest52重組質(zhì)粒為模板,以seqidno.5和seqidno.6為引物,采用高保真的taq酶通過(guò)pcr擴(kuò)增iplea基因的cdna閱讀框全長(zhǎng)。采用的pcr體系參考takara公司primestarhsdnapolymerasewithgcbuffer說(shuō)明書(shū)。擴(kuò)增的dna片段依照magen公司hipuregelpurednakits說(shuō)明書(shū)?;厥盏玫降钠斡糜诓迦胫翑M南芥轉(zhuǎn)基因超表達(dá)載體pmd1中。pmd1質(zhì)粒經(jīng)bamhi單酶切處理,回收線性化質(zhì)粒?;厥蘸蟮膇plea的cdna閱讀框pcr片段和線性化pmd1質(zhì)粒經(jīng)nanodrop公司紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度,采用takara(clontech)公司的hdcloningkit進(jìn)行dna片段和載體的同源重組連接。按照說(shuō)明書(shū)的方法將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌jm109感受態(tài)菌株。挑取單克隆,提取質(zhì)粒,經(jīng)測(cè)序鑒定為正確的陽(yáng)性克隆后,保存質(zhì)粒iplea-pmd1備用。

4.2擬南芥轉(zhuǎn)基因超表達(dá)植株的獲取

采用凍融法將植物轉(zhuǎn)基因超表達(dá)載體iplea-pmd1轉(zhuǎn)化進(jìn)入農(nóng)桿菌gv3101中,得到重組農(nóng)桿菌。

然后利用重組農(nóng)桿菌,通過(guò)花浸泡法(cloughsj,bentaf.1998.floraldip:asimplifiedmethodforagrobacterium-mediatedtransformationofarabidopsisthaliana.plantj.16:735-743)將iplea基因?qū)敫鐐惐葋喩鷳B(tài)型(col)擬南芥,得到t1代種子。

t1代種子收獲后在ms培養(yǎng)基(含有50mg/l卡那霉素)中篩選抗性植株,將抗性植株移栽到土中,收獲t2代種子。將t2代種子培育為植株(t2代植株),提取葉片的基因組dna,用引物對(duì)seqidno.5和seqidno.6進(jìn)行pcr鑒定,pcr鑒定為陽(yáng)性的植株即為t2代轉(zhuǎn)基因植株。t2代轉(zhuǎn)基因植株自交產(chǎn)生t3代種子,對(duì)t3代種子進(jìn)行卡那霉素抗性篩選,全部具有卡那霉素抗性的即為純合體。隨機(jī)選取三個(gè)轉(zhuǎn)基因純合體株系的t3代種子進(jìn)行耐鹽和耐旱性的鑒定。

4.3擬南芥轉(zhuǎn)基因超表達(dá)植株后代的耐鹽性和耐旱性檢測(cè)

隨機(jī)選取三個(gè)轉(zhuǎn)基因植株純合株系(ox1、ox2、ox3)的t3代種子(每個(gè)株系50粒),以野生型擬南芥(wt)的種子(50粒)為對(duì)照,分別進(jìn)行如下耐鹽性鑒定:將各個(gè)株系植株的種子同時(shí)播種在含有300mm的nacl的ms培養(yǎng)基平板上,置于22光照培養(yǎng)箱(16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)中,萌發(fā)6天后,統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。與野生型相比,轉(zhuǎn)基因超表達(dá)iplea基因的轉(zhuǎn)基因株系種子的萌發(fā)率均高于野生型擬南芥對(duì)照的種子,表明轉(zhuǎn)基因超表達(dá)iplea的擬南芥種子萌發(fā)過(guò)程能夠提高對(duì)鹽脅迫耐受性。

同樣,隨機(jī)選取三個(gè)轉(zhuǎn)基因植株純合株系(ox1、ox2、ox3)的t3代幼苗(每個(gè)株系20株),以野生型擬南芥幼苗(20株)為對(duì)照,栽種于營(yíng)養(yǎng)土中并于溫室中(22℃,16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)正常培養(yǎng)20天,之后進(jìn)行干旱處理(不澆水)20天,隨后復(fù)水處理后7天統(tǒng)計(jì)存活率。與野生型相比,轉(zhuǎn)基因超表達(dá)iplea基因的轉(zhuǎn)基因株系復(fù)水后的存活率顯著高于野生型對(duì)照,表明轉(zhuǎn)基因超表達(dá)iplea的擬南芥植株具有較強(qiáng)的耐旱性。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式,其描述較為具體和詳細(xì),但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專(zhuān)利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是,對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō),在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下,還可以做出若干變形和改進(jìn),這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此,本發(fā)明專(zhuān)利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。

sequencelisting

<110>中國(guó)科學(xué)院華南植物園

<120>厚藤iplea基因及其編碼蛋白和應(yīng)用

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>313

<212>prt

<213>厚藤ipleaprotein

<400>1

metalaserseraspasnprogluilevalgluargglyilelysasp

151015

lysgluasplysglugluglulysglyglypheleuasplysvallys

202530

asppheilehisaspvalglyglulysileglugluthrileglyphe

354045

glylysprothralaaspvalsergluilehisileprohisileasn

505560

leugluargalagluilevalvalaspvalleuvallysasnproasn

65707580

provalproileproleuileaspileasntyrleuilegluserasp

859095

glyarglysleuileserglyleuileproaspalaglythrilehis

100105110

alahisglysergluthrvallysileprovalasnleuiletyrasp

115120125

aspilelysserthrtyrlysaspilegluproglyserileilepro

130135140

tyrargilelysvalaspleuilevalaspvalprovalpheglyarg

145150155160

leuthrleuproleuglulysthrglygluileproileprotyrlys

165170175

proaspileaspleuglulysilehisphegluargpheserpheglu

180185190

gluthrvalalaileleuhisleulysleugluasnmetasnaspphe

195200205

aspleuglyleuasnserleuasptyrgluleutrpleuseraspval

210215220

serileglyseralagluleuglulysalaalalysileglulyslys

225230235240

glythrsertyrileaspleuprovalthrpheargprolysaspphe

245250255

glyseralaleutrpaspmetileargglylysglythrglytyrthr

260265270

metlysglyhisileasnvalaspthrpropheglyalametlysleu

275280285

proileserlysgluglyglythrthrargleulyslysasnlysglu

290295300

aspglyglyaspaspaspglugluasp

305310

<210>2

<211>942

<212>dna

<213>厚藤ipleacdna閱讀框

<400>2

atggcatcgtctgataatccagagatagtggaaaggggtatcaaggacaaggaagacaag60

gaggaagaaaagggtgggttcttggacaaggtgaaagattttatccatgatgtaggggag120

aagatagaggagacaatcgggtttggaaaaccaactgcagatgtgtccgagattcatatt180

cctcatatcaatcttgaaagggcagaaatagttgttgatgtgcttgtgaagaatccaaat240

cctgttccaatccctctcattgacataaactacttaattgagagtgatggaaggaagctg300

atctcggggctgatccctgatgctggaacgatacatgcacatggttcagaaactgtcaag360

ataccagttaatctgatttatgatgacattaagagtacatataaagatatagagcctgga420

agcataattccatataggataaaggtggacctcatagtggatgtgcctgtttttggtagg480

ttaactctgcctctggagaaaactggtgaaattcccatcccttacaagccagatattgat540

cttgagaaaattcatttcgagaggttctcttttgaagaaactgttgctattcttcacttg600

aaattggaaaacatgaatgactttgatctgggtctcaactcacttgactatgagctttgg660

ctgtctgatgtgagcattgggagtgcagaacttgagaaggcagccaaaattgagaaaaaa720

ggaactagctacattgatcttcccgtcaccttcaggcccaaggactttggctctgctcta780

tgggacatgattagaggtaaaggcactggctacacaatgaaaggacatatcaatgtggat840

acaccgtttggagcaatgaagttacccatcagcaaggagggtggtaccacccgtcttaag900

aagaataaggaagatggaggagatgatgatgaggaggattga942

<210>3

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ggggcccctgggatccatggcatcgtctgataatcc36

<210>4

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ggaattccggggatcctcaatcctcctcatcatcat36

<210>5

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

ggactctagaggatccatggcatcgtctgataatcca37

<210>6

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

gtcgacccggggatcctcaatcctcctcatcatcat36

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