本申請是2016年07月28日遞交的申請?zhí)枮?01610606316.4，發(fā)明名稱為“雞傳染性鼻炎亞單位疫苗及其制備方法”的專利申請的分案申請。

本發(fā)明涉及家禽傳染病防疫領(lǐng)域，尤其涉及一種雞傳染性鼻炎亞單位疫苗及其制備方法。

背景技術(shù)：

雞傳染性鼻炎(avianinfectiouscoryza)是由副雞禽桿菌(avibacteriumparagallinarum，apg)感染引起的最重要的呼吸疾病之一?；加须u傳染性鼻炎的雞主要呈現(xiàn)流鼻涕、眼瞼腫和溢淚等臨床癥狀。雞傳染性鼻炎可以導致雞產(chǎn)蛋的延遲、產(chǎn)蛋量的下降，從而引起大量的經(jīng)濟損失。

apg為巴氏桿菌科的一種短小革蘭氏陰性桿菌，基本特征為無運動性、菌體呈多形性、強毒株帶有莢膜。page等人將apg分為a、b和c三種血清型，研究表明a、b、c三個血清型的apg均有不同程度的致病力，但三者的滅活菌體不存在型間交叉免疫。為了預防雞傳染性鼻炎，目前已經(jīng)廣泛使用了滅活疫苗，這些疫苗是通過以福爾馬林、硫柳汞等滅活副雞禽桿菌的細胞而獲得的。目前國際上普遍使用的滅活疫苗絕大多數(shù)都包含了a型和c型apg，隨著國內(nèi)外陸續(xù)發(fā)現(xiàn)有大量b型apg的流行和發(fā)生，國際上影響較大的疫苗公司已經(jīng)開始提供包含a、b、c三種血清型的三價滅活疫苗。由于副雞禽桿菌屬于苛生菌，培養(yǎng)成本較高導致常規(guī)滅活菌苗成本居高不下；另外，副雞禽桿菌含有l(wèi)ps等毒素物質(zhì)，大量接種所帶來毒副作用也會影響雞的產(chǎn)蛋與生長，在接種的雞中還會形成局灶性壞死斑。雞傳染性鼻炎滅活疫苗對野外雞群感染的預防效果大約為70-80％，在其效力檢驗中由于環(huán)境和評價方法的差異可能會有不同的結(jié)果。

為了開發(fā)更為安全有效的疫苗，有學者研究了通過遺傳重組技術(shù)制備重組疫苗的可行性。例如，ryuichisakamoto等人克隆表達了a型和c型副雞禽桿菌的外膜蛋白，獲得的重組蛋白可用作分別抵抗a型和c型雞傳染性鼻炎感染的保護性抗原。然而，在設(shè)計用于制備疫苗的重組抗原時，由于篩選a，b，c三種血清型apg共有的、具有中和活性的抗原表位十分困難，目前還未見到能夠同時抵抗a，b，c三種血清型的副雞禽桿菌感染的保護性抗原的相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

經(jīng)過發(fā)明人的深入研究，本發(fā)明提供一種新型副雞禽桿菌免疫保護性抗原蛋白，免疫原性強，以該抗原蛋白作為活性成分制備的亞單位疫苗能夠同時有效預防a型、b型和c型副雞禽桿菌的感染。

本發(fā)明請求保護的技術(shù)方案如下：

一種副雞禽桿菌免疫保護性抗原蛋白，其特征在于，包括氨基酸序列如seqidno.1～16所示的16個抗原表位或表位域。

優(yōu)選地，所述副雞禽桿菌免疫保護性抗原蛋白的氨基酸序列選自seqidno.17，18，19和20之一。

編碼所述副雞禽桿菌免疫保護性抗原蛋白的基因。

優(yōu)選地，所述基因的核苷酸序列選自seqidno.22，23，24和25之一。

一種構(gòu)建體，其特征在于，包含所述基因。

一種重組細胞，其特征在于，是由所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受體細胞而得；任選地，所述受體細胞選自細菌、酵母、動物細胞和植物細胞。

一種雞傳染性鼻炎亞單位疫苗，其特征在于，其免疫活性組分包括所述副雞禽桿菌免疫保護性抗原蛋白。

優(yōu)選地，所述副雞禽桿菌免疫保護性抗原蛋白的終濃度為5-100μg/ml。

一種雞傳染性鼻炎亞單位疫苗的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)構(gòu)建所述副雞禽桿菌免疫保護性抗原蛋白的表達載體；

(2)用所述表達載體轉(zhuǎn)化與之匹配的蛋白表達系統(tǒng)，得到重組細胞；

(3)培養(yǎng)所述重組細胞，誘導表達獲得副雞禽桿菌免疫保護性抗原蛋白并純化蛋白；

(4)將純化后的副雞禽桿菌免疫保護性抗原蛋白與輔助試劑混合，調(diào)節(jié)所述抗原蛋白的終濃度為5-100μg/ml，得到雞傳染性鼻炎亞單位疫苗。

優(yōu)選地，所述表達載體選自pet、pqe和pgex系列的載體；所述蛋白表達系統(tǒng)選自大腸桿菌bl21、dh5ɑ、top10和jm109菌株；所述輔助試劑包括免疫增強劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、鹽溶液和/或蒸餾水。

本發(fā)明利用生物信息學軟件geneious(biomatters.ltd，網(wǎng)址http://www.geneious.com/)，通過對副雞禽桿菌外膜蛋白hmtp210的基因(genbank:kj867498.1，全長6255bp)及其編碼的蛋白序列(2083個氨基酸殘基)進行抗原表位分析。根據(jù)預測結(jié)果和實驗經(jīng)驗，選取免疫原性強的若干肽段，經(jīng)過多次序列優(yōu)化后，確定了16個核心的抗原表位/表位域，其氨基酸序列如seqidno.1～16所示。

一些實施例中，由上述16個抗原表位/表位域組合而得到若干種重組抗原蛋白。

一些實施例中，獲得了包含上述16個抗原表位多肽，還包括選取的其它氨基酸序列如連接肽或其它抗原表位或表位域，通過序列拼接而獲得了若干種重組抗原蛋白。

實施例列出了5種重組抗原蛋白(氨基酸序列如seqidno.17，18，19，20和21所示，分別命名為p1，p2，p3，p4，p5)的實驗結(jié)果。其余重組抗原蛋白的數(shù)據(jù)與此類似。

對所得的重組抗原蛋白的抗原特性進行實驗分析，westernblotting實驗證明本發(fā)明所得的重組抗原蛋白具有較強的免疫原性；使用該抗原蛋白免疫試驗雞后能保護試驗雞只不受副雞禽桿菌感染。

免疫實驗數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明所得的重組抗原蛋白能夠?qū)︶槍Χ嘀瓴煌逍偷母彪u禽桿菌產(chǎn)生免疫保護作用，如hp8、221、0083、bj、222、668、modesto等a型、b型和c型apg菌株，且保護效果優(yōu)于全菌滅活疫苗。在本發(fā)明的一個實施例中，攻毒實驗表明，采用本發(fā)明所得的重組抗原蛋白(以p1，p4，p5為例)制備的疫苗免疫的雞群在a、b或c型副雞禽桿菌攻毒后，所有雞只沒有出現(xiàn)鼻炎癥狀，保護率為100％；采用p2，p3制備的疫苗免疫的雞群在a型hp8株攻毒后，所有雞只沒有出現(xiàn)鼻炎癥狀，保護率為100％，在用b型bj株和c型modesto株攻毒后，只有10％的雞只出現(xiàn)鼻炎癥狀，保護率為90％；采用全菌滅活疫苗免疫的雞群在攻毒后7天內(nèi)有2-3只雞出現(xiàn)臨床癥狀，保護率為70-80％；而未進行免疫的對照組雞群在攻毒后全部出現(xiàn)鼻炎癥狀，保護率為0。免疫組與非免疫組的保護率有極顯著差異。

因此，本發(fā)明的重組抗原蛋白具有很好的免疫保護活性，其保護效果優(yōu)于全菌滅活疫苗，可以作為副雞禽桿菌亞單位疫苗的候選抗原。

所述構(gòu)建體，可以是克隆載體或表達載體。所述表達載體可以是具有trp啟動子、t7啟動子、cspa啟動子等多種市售的表達載體。這類表達載體包括pet系列的載體，如pet-28a；pqe系列的載體，如pqe30；pgex系列的載體，如pgex-6-1。

所述重組細胞，可以是用于克隆和保存質(zhì)粒的細胞，也可以是用于蛋白表達的細胞。表達系統(tǒng)可以采用原核表達系統(tǒng)或真核表達系統(tǒng)，原核表達系統(tǒng)可以選擇大腸桿菌bl21、dh5ɑ、top10、jm109等菌株，優(yōu)選大腸埃希氏菌bl21(de3)；真核表達系統(tǒng)可以是酵母、動物細胞或植物細胞。相應地，選用與之匹配的表達載體、轉(zhuǎn)化條件、表達條件及蛋白提取方法進行抗原蛋白的制備。

利用本發(fā)明的重組抗原蛋白制備的亞單位疫苗，能夠明顯增強雞對a，b，c三種血清型副雞禽桿菌的抵抗力，有效預防副雞禽桿菌的感染。在一些實施例中，所述亞單位疫苗包括本發(fā)明的1種，2種，3種，4種，5種或多種氨基酸序列的副雞禽桿菌重組抗原蛋白。本發(fā)明的亞單位疫苗可以單獨使用，也可以聯(lián)合一種或多種其他傳染病病原體抗原，制作一針防多病的聯(lián)合疫苗。其他抗原包括引起雞只感染的各種傳染性病原體，例如雞傳染性法氏囊病病毒、雞新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒等病毒；或者由雞沙門氏菌、支原體、雞球蟲等微生物或寄生蟲病。

所述亞單位疫苗中，副雞禽桿菌免疫保護性抗原蛋白的終濃度優(yōu)選為5-100μg/ml，更優(yōu)選為10-50μg/ml，最優(yōu)選為20μg/ml。

本發(fā)明還提供一種雞傳染性鼻炎亞單位疫苗的制備方法，在一些實施例中，包括如下步驟：

構(gòu)建表達載體：全基因合成編碼重組抗原蛋白的dna，所述dna編碼seqidno.17～21所示的融合肽或其中刪除、添加或替換了一個或數(shù)個氨基酸的融合肽突變體；設(shè)計pcr的引物大量擴增該dna，為方便和表達載體連接，在上、下游引物的5’末端加上合適的酶切位點。將獲得的編碼重組抗原蛋白的dna片段連接到合適的表達載體中，所述表達載體可以是具有trp啟動子、t7啟動子、cspa啟動子等多種市售的表達載體。這類表達載體包括pet系列的載體，如pet-28a；pqe系列的載體，如pqe30；pgex系列的載體，如pgex-6-1。

導入宿主細胞：將攜帶有重組抗原蛋白編碼基因的表達載體導入宿主中以表達重組抗原蛋白。表達用的宿主可以是細菌、昆蟲細胞、動物細胞、酵母、植物細胞等，例如，可以選擇大腸桿菌bl21、dh5ɑ、top10、jm109菌株進行蛋白的大量表達，操作簡便易行，且生產(chǎn)成本較低。根據(jù)所用的宿主細胞選擇合適的轉(zhuǎn)化方法，可以使用本領(lǐng)域常規(guī)方法，例如電轉(zhuǎn)化，熱激、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等，將表達載體導入宿主細胞。

誘導蛋白表達：培養(yǎng)攜帶重組抗原蛋白表達載體的宿主細胞，加入誘導劑誘導蛋白的表達，通過離心收集誘導表達的宿主細胞，將其懸浮于固定體積的蒸餾水或pbs中，通過超聲裂解將其破碎，并進行離心以收沉淀物和上清液。將回收的固定量的上清液和沉淀物進行sds-page凝膠電泳，以考馬斯亮藍染色后，通過目標條帶相對于蛋白marker的位置大小來確認目標蛋白是否表達。也還可以使用elisa、western-blotting等體外抗原-抗體反應的試驗來驗證。

純化蛋白：對誘導表達后的重組大腸桿菌進行離心，收集細菌沉淀。通過化學物質(zhì)、表面活性劑、溶菌酶或超聲裂解等方法將收集的大腸桿菌進行破碎，從而將重組蛋白釋放到細胞外。利用鎳瓊脂糖親和層析原理處理經(jīng)超聲波裂解后的菌體上清液，如果目標蛋白是包涵體形式存在，則通過離心濃縮將含有包涵體的溶液以沉淀物的形式回收，經(jīng)變性復性后再親和層析純化。包涵體蛋白純化時，將回收的包涵體溶解于含有變性劑的溶液中。涉及到的變性劑可以是4m-8m的脲、或鹽酸胍。溶解變性劑或還原劑的緩沖液可以是ph7-8的磷酸緩沖液、tris緩沖液、甘氨酸緩沖液等。通過透析使重組蛋白復性，恢復正常的空間結(jié)構(gòu)。透析溶液可以使用與用于溶解包涵體相同種類、溫度和ph的緩沖液。用sds-page法測定蛋白的純度，并用分光光度計或?qū)Ｓ迷噭┖袦y定所獲得的蛋白的含量或濃度。

獲得疫苗：將純化后的抗原蛋白與輔助試劑混合，調(diào)節(jié)所述抗原蛋白的終濃度為20μg/ml。所述輔助試劑包括免疫增強劑，例如氫氧化鋁、礦物油或非礦物油；穩(wěn)定劑，例如聚山梨酯80、乳糖以及蔗糖等；以及防腐劑，如福爾馬林、硫柳汞、苯甲醇等。在一些實施例中，將重組抗原蛋白與弗氏完全佐劑或不完全佐劑進行等體積混合乳化，制備副雞禽桿菌亞單位疫苗。本發(fā)明亞單位疫苗的免疫途徑?jīng)]有特別限制，可以通過皮下、皮內(nèi)或肌肉注射等方式。

免疫效果驗證：使用所述亞單位疫苗免疫雞，采集免疫雞的血清，測定血清中副雞禽桿菌的抗體效價；或者用apg強毒菌株攻擊免疫雞并觀察雞的存活和臨床癥狀。

附圖說明

圖1.本發(fā)明典型實施例中使用的pet28a質(zhì)粒圖譜。

圖2.本發(fā)明重組蛋白sds-page分析圖，

其中，m為蛋白分子量標準；1.pet28a-p1誘導后全菌；2.pet28a-p2誘導后全菌；3.pet28a-p3誘導后全菌；4.pet28a-p4誘導后全菌；5.pet28a-p5誘導后全菌。

圖3.本發(fā)明重組蛋白sds-page分析圖，

其中，m為蛋白分子量標準；1.pet28a-p1誘導裂解后沉淀；2.pet28a-p2誘導裂解后沉淀；3.pet28a-p3誘導裂解后沉淀；4.pet28a-p4誘導裂解后沉淀；5.pet28a-p5誘導裂解后沉淀。

圖4.本發(fā)明重組蛋白sds-page分析圖，

其中，m為蛋白分子量標準；1.pet28a-p1誘導裂解后上清；2.pet28a-p2誘導裂解后上清；3.pet28a-p3誘導裂解后上清；4.pet28a-p4誘導裂解后上清；5.pet28a-p5誘導裂解后上清。

圖5.純化的重組蛋白sds-page分析圖，

其中，m為蛋白分子量標準；1.p1蛋白；2.p2蛋白；3.p3蛋白；4.p4蛋白；5.p5蛋白。

圖6.本發(fā)明重組抗原蛋白western-blotting檢測結(jié)果，

其中，m為蛋白分子量標準；1.p1蛋白；2.p2蛋白；3.p4蛋白；4.p5蛋白；5.p3蛋白。

圖7.副雞禽桿菌221株外膜蛋白的抗原分析結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明，需要聲明的是，下述實施例僅作為解釋和說明，不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明實施例中未特別說明的生物化學試劑，均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑，可以商購獲得，或通過本領(lǐng)域常規(guī)方法配制而得，規(guī)格為實驗室純級即可。

實施例1、副雞禽桿菌外膜蛋白的抗原表位預測

外膜蛋白：其氨基酸序列如seqidno.27所示，該序列源自genbankno.kj867498.1副雞禽桿菌221株外膜蛋白的編碼基因。

抗原表位預測：使用抗原表位預測軟件geneious(biomatters.ltd，網(wǎng)址http://www.geneious.com/)預測外膜蛋白的抗原表位，分析外膜蛋白的二級結(jié)構(gòu)、親疏水性、抗原性等信息(圖7)。

序列分析與拼接：綜合軟件分析，根據(jù)蛋白序列抗原性，考慮蛋白表達、純化的難易性，避開信號肽區(qū)域，從中選取合適抗原表位序列或抗原表位集中區(qū)域用于序列拼接；根據(jù)預測結(jié)果和積累的實驗經(jīng)驗對選取的抗原表位序列進行多次優(yōu)化，截取部分抗原表位區(qū)域，使拼接所得的抗原蛋白免疫原性強且適合進行蛋白表達和動物免疫。最終確定了16個核心的抗原表位/表位域，其氨基酸序列如seqidno.1～16所示。

由上述16個抗原表位/表位域組合而得到若干種重組抗原蛋白。

還與選取的其它蛋白序列如連接肽或其它抗原表位或表位域，通過序列拼接而獲得了若干種重組抗原蛋白。

其中5種副雞禽桿菌重組抗原蛋白，分別命名為p1，p2，p3，p4，p5，其氨基酸序列如seqidno.17，18，19，20和21所示。

實施例2、副雞禽桿菌重組抗原蛋白的原核表達

1.材料

1.1質(zhì)粒與菌株

本實例采用的pet28a質(zhì)粒(pharmacia公司產(chǎn)品，購自北京百靈克生物技術(shù)有限責任公司)；該pet28a質(zhì)粒圖譜如圖1所示。

大腸埃希氏菌bl21(de3)感受態(tài)購自北京天根生物技術(shù)有限公司。

本發(fā)明所用副雞禽桿菌菌株為hp8、221、0083、bj、222、modesto、668菌株，購自中國北京中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，屬于商業(yè)菌株。

1.2副雞禽桿菌抗原蛋白

實施例1中由生物信息學軟件預測、分析和拼接獲得的5種副雞禽桿菌重組抗原蛋白p1，p2，p3，p4，p5。

1.3主要試劑及耗材

氯化鈉、edta二鈉鹽、乙醇、甲醇、麗春紅s、三氯乙酸(tca)是中國國藥公司產(chǎn)品。

tris堿(tris-hcl)、二硫蘇糖醇(dtt)、甘油、十二烷基磺酸鈉(sds)、丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺(temed)，碳酸鈉、乙酸鈉購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司。

甘氨酸、考馬斯亮藍r-250購自amresco公司。

牛血清白蛋白(bsa)、胰酶、蛋白酶抑制劑(pmsf)、甲醛均為sigma公司產(chǎn)品。

蛋白酶k(貯存液濃度為20mg/ml，使用液濃度為1mg/mi)購自上海華舜生物工程有限公司。

卡那霉素(kanamycin)、胎牛血清、誘導劑iptg(異丙基-β-d-硫代半乳糖苷)均為invitrogen公司產(chǎn)品。

吸頭與離心管是axygen公司產(chǎn)品。

taq酶及10xtaq酶緩沖液、ncoi、xhoi等核酸內(nèi)切酶及相關(guān)緩沖液、t4連接酶及10xt4連接酶緩沖液、rnase、dnamarker(dl-2000、dl-15000)均為寶生物(大連)有限公司產(chǎn)品。

柱式離心式dna凝膠回收試劑盒、辣根過氧化物酶(hrp)標記的兔抗雞igg購自sigma公司。

底物液配制：底物液a：0.006％h2o2緩沖液；底物液b：取na2hpo4.12h2o14.2g，檸檬酸10.5g，用雙蒸水定容至500ml配成0.1磷酸鹽檸檬酸緩沖液(ph5.0)，然后加上聯(lián)苯二胺(tmb)。使用時將a液和b液等體積混合，混合后5分鐘內(nèi)使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

大腸桿菌培養(yǎng)基：lb液體培養(yǎng)液及固體培養(yǎng)基：每升含酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，nacl10g，用10mol/lnaoh調(diào)ph至7.5，121℃高壓滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩Ｔ诿?00毫升lb液體培養(yǎng)基中加入1.5g瓊脂即為固體lb培養(yǎng)基，121℃高壓滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

副雞禽桿菌培養(yǎng)基tsb、tsa，及弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均購自sigma公司。

純化副雞禽桿菌抗原蛋白采用sepharose4b純化柱(amershanpharmacia公司產(chǎn)品)購自北京百靈克生物技術(shù)有限公司。

pbs緩沖液：nacl8.0g，kcl0.2g，kh2po40.24g，na2hpo4·12h2o3.628g，溶于800ml蒸餾水中，用鹽酸調(diào)ph值為7.4，蒸餾水定容至1000ml，121℃高壓滅菌20min，室溫保存。

western-blotting緩沖液：

電轉(zhuǎn)緩沖液：39mmol/l甘氨酸，48mmol/ltris堿，0.037％sds(電泳級)，20％甲醇。配制1000ml轉(zhuǎn)移緩沖液，需稱取2.9g甘氨酸，5.8gtris堿，0.37gsds，加200ml甲醇，加ddh2o至總量為1000ml。

tbs(ph8.0)緩沖液：10mmol/ltris.hcl，150mmol/lnacl。

tbst緩沖液：在上述tbs中加入終濃度為0.05％tween-20即可。

麗春紅s(10×)貯存液：2g麗春紅s，30g三氯乙酸，30g磺基水楊酸，加ddh2o至100ml。

1.4試驗動物：6周齡spf雞，購自北京梅里亞維通spf雞實驗動物中心。

2.序列設(shè)計與合成

抗原蛋白p1，p2，p3，p4，p5(p1-5)的基因編碼序列如seqidno.22，23，24，25，26所示，將基因編碼序列送華大科技(北京)有限公司進行全基因合成。

按照各自的堿基序列分別設(shè)計上、下游引物，并在上、下游引物中分別引入ncoi和xhoi酶切位點，送華大科技(北京)有限公司進行引物合成，引物序列如seqidno.28～37所示。

3.重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

3.1抗原蛋白p1-5編碼基因的pcr擴增

以步驟2得到的合成產(chǎn)物為模板，利用合成的引物進行pcr，

pcr反應體系：

pcr各個成分的用量：(其中引物濃度為1od溶于400μlddh2o)

pcr反應程序：在98℃反應1分鐘后，進行30個循環(huán)的“變性(95℃，10秒)、退火(56℃，15秒)和延伸反應(72℃，120秒)”，然后修復延伸反應(72℃，7分鐘)。

3.2pcr產(chǎn)物的酶切及回收

將上述pcr產(chǎn)物進行ncoi和xhoi酶切，

酶切體系：

pcr產(chǎn)物片段酶切體系(50ul)：

以上體系放入37℃恒溫水浴鍋中反應2h。

將全部的酶切產(chǎn)物通過0.8％的瓊脂糖凝膠電泳分離之后，采用北京天根生化技術(shù)有限公司的普通dna膠回收試劑盒，按照試劑盒說明書的步驟進行dna片段回收?；厥盏哪康膁na片段，可立即使用或保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

3.3表達載體的酶切及回收

對表達載體pet28a進行ncoi和xhoi酶切和酶切產(chǎn)物的回收，方法及步驟同3.2pcr產(chǎn)物的酶切及回收。

3.4目的片段與載體連接

將步驟3.2回收純化的目的dna片段和3.3回收純化的表達載體pet28a進行連接，得到重組質(zhì)粒。

連接體系為：目的dna片段，8ul；表達載體pet28a，4ul；10×t4dna連接酶緩沖液，2ul；t4dna連接酶，1ul(5u/ul)；ddh2o補充至20ul。

連接條件：上述連接體系的混合液放在22℃pcr儀1h即可。

3.5轉(zhuǎn)化并篩選克隆

取大腸桿菌dh5ɑ感受態(tài)細胞100μl加入到1.5mlep管中，將步驟3.4獲得的重組質(zhì)粒pet28a-p1，pet28a-p2，pet28a-p3，pet28a-p4，pet28a-p5各5-10μl分別加入各自的ep管中并混勻。置冰上30min后，42℃熱激90秒，冰浴3-5分鐘。加入400μllb，于37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)45min使其復蘇。復蘇后的重組大腸桿菌懸液于4℃，25000rpm離心10min，棄去400μl上清，用剩余的100μl重懸沉淀并涂布于含有25μg/ml卡那霉素的lb瓊脂平板上。37℃增殖1h，再將平板翻過來，37℃倒置培養(yǎng)14h-16h至菌落出現(xiàn)。

3.6重組質(zhì)粒的酶切鑒定

挑取步驟3.5中平板上長出的單菌落，分別接種于含25μg/ml卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中，于37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)至od600達到0.6～1。

收集菌體，使用普通質(zhì)粒提取試劑盒(天根生化技術(shù)有限公司)提取重組質(zhì)粒，具體操作步驟依照試劑盒說明書進行。利用ncoi+xhoi酶切鑒定重組質(zhì)粒，酶切后出現(xiàn)預期大小的外源片段和載體片斷的，即為正確的重組質(zhì)粒。

4.重組表達菌株的構(gòu)建

取感受態(tài)細胞bl21(de3)100μl加入到1.5mlep管中，將鑒定正確的重組質(zhì)粒pet28a-p1，pet28a-p2，pet28a-p3，pet28a-p4，pet28a-p5各0.5μl加入各自的ep管中并混勻。置冰上30min后，42℃熱激90秒，冰浴3-5分鐘。將其涂布于含有25μg/ml卡那霉素的lb瓊脂平板上。37℃置1h，再將平板翻過來，37℃倒置培養(yǎng)14h-16h至菌落出現(xiàn)。挑取單菌落，按照步驟3.1中的反應體系和反應程序進行菌落pcr并測序比對，鑒定陽性克隆。

5.目的基因在大腸桿菌中的表達及純化

5.1目的基因的誘導表達：將含重組質(zhì)粒pet28a-p1，pet28a-p2，pet28a-p3，pet28a-p4，pet28a-p5的陽性克隆分別接種于含有25μg/ml卡那霉素的3mllb液體培養(yǎng)基，于37℃振蕩培養(yǎng)。從培養(yǎng)好的菌液中取100μl接種于10ml含有25μg/ml卡那霉素的新鮮lb液體培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)約3h，至od600達到0.6-1.0時，加iptg至終濃度為0.8mmol/l，繼續(xù)培養(yǎng)3h后收集菌體。

5.2表達產(chǎn)物的sds-page電泳分析

(1)制膠：sds-page凝膠配制方法如表1所示：

表1sds-page凝膠配制方法

12％的分離膠配制：將各成分加入后迅速混合，加入制膠板中，上面加純化水。然后，再配制5％濃縮膠：將表中相關(guān)各成分加入后迅速混合，加入制膠板的分離膠的上面(先將分離膠上面的純化水倒干凈)，灌滿后插入加樣梳。待濃縮膠凝固后，取下梳子。

(2)page：將凝膠固定于電泳裝置上，加入足夠量的tris-甘氨酸電泳緩沖液，在加樣孔中分別加入各樣品：電泳電壓200v，電流在20ma-40ma范圍內(nèi)，電泳1h，至溴酚藍泳出膠底面，終止電泳。

(3)聚丙烯酰胺凝膠染色與脫色：卸下凝膠，用考馬斯亮藍r250染色液染色30min，再用脫色液進行脫色1min，觀察結(jié)果。

結(jié)果如圖2所示，將含有陽性重組質(zhì)粒的大腸埃希菌以1mmiptg誘導37℃誘導表達后，經(jīng)sds-page檢測，在預期位置出現(xiàn)蛋白目標條帶，預期蛋白大小相一致，未誘導菌沒有此蛋白。

5.3重組蛋白的制備及純化

1)挑取步驟4鑒定正確的陽性克隆，接種于3ml含25μg/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，37℃活化過夜后，1:100稀釋到含25μg/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，37℃、230r/min振搖培養(yǎng)至對數(shù)生長期(od6000.6～1)，加入終濃度為1mmol/l的iptg，于37℃、230r/min振搖誘導培養(yǎng)6-8h。分別于誘導前和誘導后不同時間取出1ml,5,000r/min離心10min收集菌體，棄上清后加入2×sds上樣緩沖液，煮沸10min，用12％的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)進行檢查，并用quantityone-4.3.1(bio-rad)軟件分析表達產(chǎn)量。

2)收集500ml經(jīng)誘導表達6h后的菌液，8000r/min離心10min，沉淀用5ml的10mmol/lpbs溶解，超聲波破碎后，12,000r/min離心10min后，保留上清。包涵體沉淀用8mol/l的尿素溶液溶解，8m尿素在50mmtrisph7.0-8.5左右，1mmedta，10％tritonx-100，二硫鍵還原劑中洗滌。洗滌4～8h，使包涵體變性可溶。包涵體溶解后的上清液，用鎳親和層析柱純化。操作過程參照amershampharmaciabiotech公司提供的操作指南進行。具體過程如下：轉(zhuǎn)移樹脂到柱子，待完全沉淀后，用三蒸水洗滌鎳親和層析柱，以除盡基質(zhì)中的乙醇和空氣，并防止下一步ni²⁺沉淀；5×柱體積的chargebuffer(50mmniso4)充電；20×柱體積的三蒸水洗滌，去盡游離的ni²⁺；10×柱體積的bindingbuffer平衡柱子；手工上樣，根據(jù)蛋白的濃度來確定上樣體積；20×柱體積的bindingbuffer洗滌；6×柱體積的washbuffer洗滌，至檢出無蛋白；elutionbuffer洗脫，每次1ml，收集洗脫流出液，洗脫至檢出無蛋白；然后進行sds-page電泳檢測。

結(jié)果參見圖3和圖4，兩圖為本發(fā)明構(gòu)建的重組質(zhì)粒誘導表達后超聲裂解后的sds-page，圖3是裂解后沉淀，可知p1，p2，p4和p5大部分在沉淀中；圖4是裂解后上清，可知p3蛋白大部分存在于裂解后的上清中。

誘導后裂解上清中的蛋白含量若高于沉淀，純化時可以直接使用裂解上清，省去包涵體變性復性的步驟,利用鎳瓊脂糖親和層析原理處理經(jīng)超聲波裂解后的菌體上清液，具體操作如下：

①取5mlni-ida，用10倍柱床體積的bindingbuffer清洗平衡柱子，流速5ml/min。

②樣品(裂解液上清)上柱，流速為2ml/min，收集穿透液。

③10倍柱床體積的bindingbuffer清洗柱子,流速10ml/min。

④washbuffer洗雜,流速5ml/min，收集洗脫液。

⑤elutionbuffer洗脫,流速2ml/min，收集洗脫液。

⑥將純化后的蛋白置于透析袋中，在pbs，緩沖液(ph＝7.4)中緩慢透析，收集透析后的樣品進行sds-page分析。

注：bindingbuffer(pbs，0.5％tritonx-100，ph＝7.4)

washbuffer-10(pbs，10mm咪唑，ph＝7.4)

elutionbuffer-500(pbs，500mm咪唑，ph＝7.4)

結(jié)果參見圖5，經(jīng)純化，獲得了較純的目的蛋白p1，p2，p3，p4和p5。

實施例3、重組抗原蛋白的特性分析

1.用western-blot方法分析重組抗原蛋白的抗原性

將上述純化的重組抗原蛋白p1，p2，p3，p4，p5按照常規(guī)方法進行sds-page電泳，其步驟是：

1)轉(zhuǎn)移：切出6張whatman3m濾紙和1張硝酸纖維膜(nc膜)，濾紙和膜的大小要和凝膠的大小完全相等或略小于凝膠，用鉛筆在濾膜一角作標記，確保轉(zhuǎn)印后膜與凝膠的相對方向；將硝酸纖維膜在純化水中浸泡5min；在另一淺托盤中加入少量轉(zhuǎn)移緩沖液，將6張whatman3m濾紙浸泡于其中。然后按照如下步驟安裝轉(zhuǎn)移電泳槽：平放石墨電極的底座(陽極)，依次放3層3m濾紙、硝酸纖維膜、聚丙烯酰胺凝膠和3層3m濾紙。徹底排除各層間的氣泡：將轉(zhuǎn)移電泳槽的上蓋扣到石墨電極一轉(zhuǎn)移膜膠復合體上；連接電源，根據(jù)凝膠板面積按照0.65ma/cm²-1.0ma/cm²的參數(shù)接通電流，電泳轉(zhuǎn)移0.5h-2h。

2)麗春紅染色：轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取下nc膜，于去離子水中漂洗2-3次后，轉(zhuǎn)移至麗春紅染色液中染色5min-10min，觀察轉(zhuǎn)印效果，并用鉛筆標出蛋白marker位置；室溫下用去離子水漂洗硝酸纖維膜直至顏色褪去；將nc膜置于5％的脫脂奶粉中，室溫封閉2h；洗膜：棄封閉液，用1×tbst洗nc膜3遍，每次5min。

3)一抗孵育：將nc膜放入用5％的脫脂奶粉稀釋(體積比1:50)的雞抗apg型菌陽性血清，37℃孵育1h。洗膜：取出nc膜，用1×tbst洗膜3次，每次10min。

所述陽性血清由本實驗室用apghp8\bj\668菌株制備的三價滅活疫苗免疫spf雞制備而得，可對外提供用于驗證實驗。

4)二抗孵育：將膜轉(zhuǎn)入5％的脫脂奶粉稀釋(體積比1：5000)的hrp標記的羊抗雞igg抗體，37℃孵育2h；洗膜：取出nc膜，用1×tbst洗膜3次，每次10min。

5)顯色：將nc膜置于新配制的dab顯色液中，置暗處顯色，待蛋白帶的顏色深度達到要求后，用1×tbst、沖洗以終止反應。

2.重組蛋白抗血清的制備

1)疫苗的制備及免疫試驗

重組抗原蛋白疫苗的制備：將重組抗原蛋白p1，p2，p3，p4，p5分別與弗氏完全佐劑等體積混合乳化，使疫苗中抗原蛋白終濃度為20μg/ml。第二次免疫用疫苗采用弗氏不完全佐劑，其余組分及濃度與首次免疫相同。

免疫方法：給所述的42日齡試驗spf雞胸部肌肉注射弗氏完全佐劑乳化的重組抗原蛋白疫苗(接種量為0.5ml/只)；2周后胸部肌肉注射弗氏不完全佐劑乳化的重組蛋白疫苗(接種量為0.5ml/只)；間隔10天后于翅靜脈采血，收集血清。

血清特異性抗體的檢測：采用elisa方法，具體步驟為：

使用純化的重組抗原蛋白p1，p2，p3，p4，p5各1μg/100μl于4℃過夜包被酶聯(lián)板，1％bsa37℃封閉1h，洗滌液洗板1次后封裝，于-20℃保存。

將加強免疫一周后的雞采血分離血清，倍比稀釋后取100μl加入酶聯(lián)板，同時設(shè)佐劑對照和空白對照。

37℃反應30min。

洗板3次后加入體積比1:5,000稀釋的兔抗雞igy(h+l)-hrp，37℃反應30min。

洗板5次后加100μl底物液，避光顯色10min后加入2％h2so4終止反應，于630nm讀數(shù)。

樣品與對照組od值之比大于2的血清判為血清elisa抗體陽性。

重組抗原蛋白p1，p2，p3，p4，p5的western-blotting檢測結(jié)果如圖6所示，雞傳染性鼻炎陽性雞血清與各重組抗原蛋白均發(fā)生了反應，與預期結(jié)果相符。由此表明，本發(fā)明的重組抗原蛋白具有良好的抗體結(jié)合活性。

實施例4、重組抗原蛋白對spf雞免疫效力試驗

1.重組抗原蛋白疫苗制備及免疫方法

1.1重組抗原蛋白疫苗的制備

將重組抗原蛋白p1，p2，p3，p4，p5分別與montanide^tmisa71vg佐劑(seppic公司產(chǎn)品)按3:7重量比(30％重量的抗原，70％重量的佐劑)混合乳化(操作方法見seppic公司產(chǎn)品使用方法介紹)，使疫苗中抗原蛋白終濃度為20μg/ml(不同地區(qū)雞傳染性鼻炎流行威脅程度不同，不同雞種對免疫原的敏感度也有差異，可根據(jù)實際需要調(diào)整所述抗原蛋白終濃度為5-100μg/ml)。所制備的疫苗依次命名為vp1，vp2，vp3，vp4，vp5。

全菌滅活疫苗制備：分別將a、b、c型副雞禽桿菌hp8株、bj株和668株菌經(jīng)純培養(yǎng)后，挑取單個菌落8～10個，涂于tsa平板上(含10％滅活牛血清)。37℃培養(yǎng)16h～18h后，用滅菌的0.01mol/lpbs將平板上的菌苔洗下，稀釋至7.5×10⁹cfu/ml，用甲醛滅活(3‰)4h～48h，然后等體積混合?；旌暇号c10號工業(yè)白油(杭州煉油廠)佐劑按1：1體積混合，膠體磨乳化，所得的三價滅活疫苗抗原終濃度達到1.0×10⁹cfu/ml。

1.2免疫方法

42日齡spf試驗雞210只，分為亞單位疫苗組、常規(guī)滅活疫苗組和pbs對照組。其中疫苗組再分為vp1，vp2，vp3，vp4，vp5五小組，每組30只；常規(guī)三價滅活疫苗組和pbs對照組各30只。各組亞單位疫苗組試驗雞分別用vp1，vp2，vp3，vp4，vp5進行免疫，常規(guī)三價滅活疫苗組試驗雞用常規(guī)滅活疫苗免疫，對照組試驗雞接種pbs。采用胸部肌肉注射，0.5ml/只；4周后相同劑量、相同途徑加強免疫。期間每兩周翅靜脈取血，用于血清特異性抗體的監(jiān)測。

血清抗體的檢測采用elisa方法，步驟同實施例3。

1.3免疫雞攻毒試驗

對加強免疫4周后的試驗雞全部進行攻毒試驗。各試驗組內(nèi)再分別用a型(hp8株)，b型(bj株)和c型(668株)apg進行攻毒，每組10只，眶下竇接種，劑量依次是a型(hp8株)1×10⁶cfu，b型(bj株)5×10⁵cfu，c型(668株)1×10⁶cfu。連續(xù)觀察一周，記錄試驗雞的臨床發(fā)病情況，包括流鼻涕，眼瞼腫，溢淚等。評價重組亞單位疫苗的免疫保護力，結(jié)果參見表2。

表2本發(fā)明雞傳染性鼻炎亞單位疫苗免疫雞對apg菌株攻毒的保護效果

注：攻毒劑量a型hp8株1×10⁶cfu，b型bj株5×10⁵cfu，c型668株1×10⁶cfu。

*亞單位疫苗免疫組獲得免疫保護的試驗雞數(shù)與pbs對照組比較，差異顯著。

表2列出了a型hp8株、b型bj株和c型668株的攻毒實驗結(jié)果。實驗時，分別用本發(fā)明優(yōu)選的5個重組蛋白制備的5種亞單位疫苗免疫試驗雞，2次免疫后用a，b，c三個血清型的apg強毒攻擊，非免疫對照組所有試驗雞陸續(xù)發(fā)病。亞單位疫苗免疫組攻毒后只有個別試驗雞表現(xiàn)出鼻炎癥狀，保護率為90％～100％；全菌三價滅活疫苗免疫組在攻毒后3天內(nèi)有2-3只雞出現(xiàn)臨床癥狀，保護率為70～80％；而非免疫對照組所有試驗雞都表現(xiàn)出嚴重的鼻炎癥狀。

利用a型221株、0083株，b型222株和c型modesto株的apg進行攻毒實驗的結(jié)果與hp8株、bj株和668株的攻毒實驗結(jié)果相似，vp1，vp4和vp5實驗組的保護率為100％，vp2，vp3實驗組的保護率為90％～100％。由此可見，采用本發(fā)明提供的重組抗原蛋白制備的疫苗免疫效果顯著，能夠同時有效預防雞感染a，b，c三個血清型的apg。

此外，蛋白亞單位疫苗的保護率優(yōu)于全菌三價滅活疫苗的保護效果，與非免疫組相比，有極顯著差異。由于純化蛋白不含全菌體所攜帶的脂多糖等成分，本發(fā)明制備的亞單位疫苗沒有副反應，而全菌滅活疫苗會有一過性食欲下降，精神萎靡等副反應。從制備成本上說，亞單位疫苗由于培養(yǎng)誘導容易，培養(yǎng)基便宜，容易純化等特點，也低于常規(guī)滅活菌苗。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。

sequencelisting

<110>北京市農(nóng)林科學院

<120>雞傳染性鼻炎亞單位疫苗及其制備方法

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