專利名稱：一種雞傳染性鼻炎、雞毒支原體二聯(lián)類脂滅活疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸用生物制品制備與禽病防治技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種雞傳染性鼻炎、雞毒支原體二聯(lián)類脂滅活疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
雞傳染性鼻炎是由副雞嗜血桿菌引起的一種急性呼吸系統(tǒng)傳染病，主要特征為面部腫脹、鼻腔有漿液性到粘液性分泌物和結(jié)膜炎，發(fā)病率很高，呈世界性分布。雞毒支原體病(MG)是雞的一種慢性呼吸道傳染病，具有分布廣泛、感染率高的特點(diǎn)，以呼吸道發(fā)生啰音、咳嗽、流鼻液和竇部腫脹為特征。傳染性鼻炎或雞毒支原體單獨(dú)感染可致死雞只，但危害更甚的是常繼發(fā)或并發(fā)感染大腸桿菌病、傳染性支氣管炎等多種細(xì)菌病和病毒病。這兩種病的共同特點(diǎn)是造成育成雞發(fā)育不良、蛋雞產(chǎn)蛋明顯下降(比正常低10 40% )，使用藥物治療時(shí)，極易產(chǎn)生耐藥性，病情常反復(fù)發(fā)作，無法從根本上消除帶菌狀態(tài)。 由于患病雞的飼料利用率和產(chǎn)蛋率的低下以及醫(yī)療費(fèi)用所帶來的經(jīng)濟(jì)損失，使這兩種病成為養(yǎng)禽業(yè)面臨著代價(jià)最高的疾病問題之一。因此研制雞傳染性鼻炎、雞毒支原體二聯(lián)滅活疫苗具有重大現(xiàn)實(shí)意義。目前，國(guó)內(nèi)使用的疫苗為雞傳染性鼻炎、雞毒支原體二聯(lián)油乳劑滅活疫苗，存在粘度大難注射，礦物油難吸收，注射局部易發(fā)生腫脹，免疫產(chǎn)生時(shí)間長(zhǎng)、免疫持續(xù)期短等缺點(diǎn)， 亟待需要尋求一種易吸收、無毒副作用、效果好的新型佐劑疫苗來防治該病。楊樹皮類脂系從楊樹皮中提取的一種橙黃色脂溶性物質(zhì)，具有高度的天然生物學(xué)活性，富含大量的磷脂、留醇、不飽和脂肪酸、糖脂以及多種常量、微量元素、多種維生素、18 種必需氨基酸等。其中楊樹皮類脂中含有的多糖類、有機(jī)酸、留醇、甙類、黃酮類物質(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)協(xié)調(diào)統(tǒng)一，可以大大提高動(dòng)物體的免疫機(jī)能。多糖類具有促胸腺體液反應(yīng)、刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，提高機(jī)體特異性免疫反應(yīng)能力；有機(jī)酸具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用，能夠刺激和促進(jìn)單核吞噬細(xì)胞功能，對(duì)抗免疫抑制對(duì)免疫器官的抑制作用；甙類能夠加速抗體的產(chǎn)生、 促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能等作用。國(guó)內(nèi)也有用類脂做為佐劑制備疫苗的報(bào)道，其中，專利號(hào)為ZL03142556. 9的發(fā)明專利公開了楊樹皮類脂做為疫苗佐劑的使用方法(1) 500 1000轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢枰环N抗原和/或抗原組合物，同時(shí)緩緩加入楊樹皮類脂佐劑， 使楊樹皮類脂佐劑在混合物中的終濃度達(dá)到4 6% (W/V) ； (2)將上述混合物通過乳化壓力為10 15MPa，剪切壓力為45 60MPa的均質(zhì)機(jī)內(nèi)乳化，乳化溫度在20 30°C之間，制得含楊樹皮類脂佐劑的疫苗。使用該方法制得的疫苗效果好，但類脂含量高、制造成本高， 且免疫持續(xù)時(shí)間不長(zhǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有疫苗的缺陷，提供一種雞傳染性鼻炎、雞毒支原體二聯(lián)類脂滅活疫苗的制備方法，依本發(fā)明所制備的疫苗容易吸收、無毒副作用、免疫產(chǎn)生時(shí)間短、免疫持續(xù)期長(zhǎng)，免疫效果好，能有效預(yù)防雞傳染性鼻炎和雞毒支原體病，且制造成本低。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種雞傳染性鼻炎、雞毒支原體二聯(lián)類脂滅活疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(I)A型副雞嗜血桿菌滅活抗原菌液的制備，按照以下步驟制備一級(jí)菌種制備取A型副雞嗜血桿菌菌種劃線接種于雞肉湯瓊脂平板上，在CO2 體積含量為5%、溫度為37°C的環(huán)境中培養(yǎng)16 18h，挑選符合菌株特性的直徑為Imm的 3-5個(gè)典型菌落用IOml滅菌雞肉湯稀釋后接種于6 7日齡SPF雞胚卵黃囊內(nèi)，每胚接種 0. anl，在37°C溫度下繼續(xù)孵化，收集30h內(nèi)死亡胚的卵黃液，經(jīng)純粹檢驗(yàn)確認(rèn)無雜菌后，作為一級(jí)菌種。二級(jí)菌種制備取一級(jí)菌種，按體積為半合成培養(yǎng)基體積1/200的量接種于半合成培養(yǎng)基中，在溫度為37°C條件下培養(yǎng)17 18h，經(jīng)純粹檢驗(yàn)確認(rèn)無雜菌后，即為二級(jí)菌種，并置于2 8°C保存，不得超過6 8h。制苗用菌液的制備將二級(jí)菌種按體積為半合成培養(yǎng)基體積1/40的量接種于半合成培養(yǎng)基中，在37 38°C溫室中靜止培養(yǎng)18 20h，期間每隔6 他搖晃一次，經(jīng)純粹檢驗(yàn)確認(rèn)無雜菌污染，加入體積為半合成培養(yǎng)基體積1/2000的甲醛滅活Mh，得到制苗用菌液。菌液的濃縮與滅活將純粹檢驗(yàn)合格的制苗用菌液進(jìn)行濃縮，濃縮后含菌量不少于50億cfu/ml，通過比濁法測(cè)定含菌量，再分別加入體積為濃縮菌液體積1/1000的甲醛和體積為濃縮菌液體積1/10000的硫柳汞，混勻后在4°C條件下滅活2天，經(jīng)無菌檢驗(yàn)合格得到A型副雞嗜血桿菌滅活抗原菌液。(2) C型副雞嗜血桿菌滅活抗原菌液的制備其制備方法與A型副雞嗜血桿菌滅活抗原菌液的制備方法相同。(3)雞毒支原體抗原液的制備，按照以下步驟進(jìn)行一級(jí)種子繁殖將CM培養(yǎng)基Iml注入凍干菌種瓶使菌種復(fù)原，再將體積為CM培養(yǎng)基體積1/10的雞毒支原體菌種接種于CM培養(yǎng)基中，在溫度為36 37°C條件下培養(yǎng)M 48h，待接種后的CM培養(yǎng)基的PH值與接種前的PH值相比下降0. 5 0. 8時(shí)停止培養(yǎng)，經(jīng)純粹檢驗(yàn)確認(rèn)無雜菌后，作為一級(jí)種子，在_25°C以下保存不超過60天。二級(jí)種子繁殖取一級(jí)種子，按體積為CM培養(yǎng)基體積1/10的量接種于CM培養(yǎng)基， 置36 37°C溫度下培養(yǎng)M 48h，經(jīng)純粹檢驗(yàn)合格后，作為二級(jí)種子，在2-8°C保存不超過 5天。制苗用菌液制備再以純粹檢驗(yàn)合格的二級(jí)種子為基礎(chǔ)、比照二級(jí)種子繁殖方法繁殖出三級(jí)種子，再以純粹檢驗(yàn)合格的三級(jí)種子為基礎(chǔ)、比照二級(jí)種子繁殖方法繁殖出四級(jí)種子，比照二級(jí)種子繁殖方法做種子擴(kuò)大培養(yǎng)，菌種繁殖傳代不超過8代，最后一代純粹檢驗(yàn)合格，經(jīng)活菌計(jì)數(shù)測(cè)定，活菌數(shù)不低于108 5CCU/ml，得到制苗用菌液。菌液濃縮與滅活將制得的制苗用菌液作8倍濃縮后，加入體積為濃縮物體積 1/500的甲醛，在溫度為37°C條件下滅活20h，期間每隔他搖動(dòng)1次濃縮物，經(jīng)無菌和滅活檢驗(yàn)合格得到雞毒支原體抗原液，置2-8°C保存不超過20天。(4)疫苗的制備將上述制得的A型副雞嗜血桿菌滅活抗原菌液和C型副雞嗜血桿菌滅活抗原菌液按體積比為1 1的比例混勻，得到副雞嗜血桿菌滅活混合抗原菌液，將副雞嗜血桿菌滅活混合抗原菌液與雞毒支原體抗原液按體積比為1 1 1 1.5的比例混勻后倒入乳化罐內(nèi)，用混合機(jī)以750 850r/min的轉(zhuǎn)速攪拌，同時(shí)緩緩加入楊樹皮類脂， 使楊樹皮類脂在混合物中的最終體積百分比濃度為2. 0 3. 8%，然后將混合機(jī)轉(zhuǎn)速提高到2500 3000r/min繼續(xù)乳化30 60分鐘，即得到疫苗，疫苗中A型副雞嗜血桿菌和C 型副雞嗜血桿菌的最終含菌量均為10億cfu/ml、雞毒支原體的最終含量為108_°CCU/ml。上述雞肉湯瓊脂板是這樣制備的取雞肉汁100ml、酪蛋白胨lg、氯化鈉0. 5g、瓊脂粉1. 5g混合，用4mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)混合溶液的PH至7. 4，116°C滅菌30分鐘，倒板前加入輔酶I (NADH)和過濾除菌的健康雞血清混勻，使得混合溶液中輔酶I(NADH)的質(zhì)量濃度為0. 05%、過濾除菌的健康雞血清的體積百分比濃度為10%，然后將混合溶液倒入直徑為90mm的平皿中，放平冷卻即得到雞肉湯瓊脂板；所述雞肉汁是取雞胸脯肉泥1份加蒸餾水4份，4°C浸泡過夜，煮沸30分鐘，除去肉渣，澄清過濾得到的。上述半合成培養(yǎng)基是這樣制備的取多蛋白胨5g、酪蛋白胨30g、谷氨酸鈉15g、酵母浸粉5g、葡萄糖3g、氯化鈉15g，放入IOOOml純化水中攪均，調(diào)節(jié)所得溶液的PH至7. 2 7. 4，116°C滅菌40分鐘，臨用前加入60ml的滅活健康雞血清和IOml的質(zhì)量百分濃度為 0. 5%的輔酶I (NADH)水溶液。上述CM培養(yǎng)基是這樣制備的將PPLO肉湯21. 0g、葡萄糖5. 0g、去離子水1000ml、 濃度為的酚紅Iml混合溶解后，在溫度為115°C壓力為0. 106MPa條件下滅菌20分鐘， 置2 8°C保存，使用前加入豬血清130ml、25%的酵母浸出液IOOml和80萬單位/ml青霉素溶液1. anl，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值為7. 8 8. 0。上述濃度為的酚紅的制作過程(l)lmol/L氫氧化鈉的制備，取常溫下的澄清的氫氧化鈉飽和溶液56. 0ml，加煮沸過的常溫注射用水IOOOml即制得lmol/L氫氧化鈉； (2)稱取10. Og酚紅粉末加入到20. Oml的lmol/L氫氧化鈉溶液中攪拌后靜置5 10分鐘，將溶解部分倒入IOOOml刻度容器中；(3)向未溶解的酚紅粉末中再加入20ml的lmol/ L氫氧化鈉溶液攪拌后靜置5 10分鐘，將溶解部分倒入IOOOml刻度容器中；(4)如果酚紅粉末未完全溶解，則可再加少量lmol/L氫氧化鈉溶液，但不得超過20. Oml，將溶液倒入 1000ml刻度容器中；( 加煮沸過的常溫注射用水向刻度容器中補(bǔ)足溶液至1000ml，搖勻后分裝小瓶，經(jīng)116°C滅菌15分鐘，置2 8°C保存。上述25%的酵母浸出液的制作過程取新鮮酵母250g加入到1000ml雙蒸水中充分?jǐn)嚢?，使酵母溶解完全，煮?0分鐘，煮完冷卻后，以2800r/min轉(zhuǎn)速離心25分鐘，提取上清液分裝，在溫度為115°C、壓力為0. 106MPa條件下滅菌20分鐘。上述副雞嗜血桿菌菌株為A型C-Hpg-8株(編號(hào)為CVCC 254)和C型Hpg-668株 (編號(hào)為CVCC 256)，雞毒支原體菌株為Ck株(編號(hào)為CVCC 1651)均來源于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，上述佐劑楊樹皮類脂來源于美科爾(河北)生物技術(shù)有限公司。上述菌液的濃縮采用高速離心、中空纖維過濾、超濾濃縮方式中的任一種。本發(fā)明中，優(yōu)選的濃縮采用超濾濃縮方式。純粹檢驗(yàn)、無菌檢驗(yàn)和滅活檢驗(yàn)，均按《中華人民共和國(guó)獸藥典》方法進(jìn)行。本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明制備的雞傳染性鼻炎、雞毒支原體二聯(lián)類脂滅活疫苗，給雞注射后在機(jī)體內(nèi)能夠被很好的吸收，無殘留，對(duì)注射局部無任何不良反應(yīng)，可同時(shí)預(yù)防雞傳染性鼻炎和雞毒支原體2種疾病。因注射應(yīng)激小，產(chǎn)蛋高峰期注射不會(huì)影響產(chǎn)蛋率。采用超濾濃縮方法，可最大程度的降低對(duì)菌體的損傷和減少菌體的損失。本發(fā)明得到制備疫苗時(shí)楊樹皮類脂的最佳含量，與現(xiàn)有技術(shù)相比，減少了楊樹皮類脂的用量，降低了疫苗生產(chǎn)成本，采用混合機(jī)制備疫苗，減化了生產(chǎn)工藝流程，提高了疫苗的物理穩(wěn)定性，延長(zhǎng)了疫苗的保存期。與傳統(tǒng)的油乳劑疫苗相比，用本發(fā)明所制備的疫苗的免疫持續(xù)期由原來的 120天左右延長(zhǎng)到180天左右，免疫持續(xù)期延長(zhǎng)了 50% ；與依照ZL03142556. 9的發(fā)明公開的類脂使方法制備的疫苗相比，本發(fā)明所制備的疫苗的免疫持續(xù)期延長(zhǎng)了 80天，免疫持續(xù)期延長(zhǎng)了 80%，使用本發(fā)明所制備的雞傳染性鼻炎類脂滅活疫苗可以減少疫苗接種次數(shù)， 拉長(zhǎng)接種時(shí)間間距，減少了接種疫苗的開支，可大大節(jié)約養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)成本。另外由于本疫苗中含有大量的Ve等可提高產(chǎn)蛋率的營(yíng)養(yǎng)成分，注射后會(huì)不同程度地提高產(chǎn)蛋雞的產(chǎn)蛋率。以礦物油為佐劑加入雞傳染性鼻炎和雞毒支原體抗原按常規(guī)方法制備油乳劑苗 (雞傳染性鼻炎、雞毒支原體二聯(lián)油乳劑滅活疫苗)、依照ZL03142556. 9的方法制備的雞傳染性鼻炎、雞毒支原體二聯(lián)疫苗，與本發(fā)明制備的雞傳染性鼻炎和雞毒支原體二聯(lián)類脂滅活疫苗進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。對(duì)比項(xiàng)目及結(jié)果如下表所示
權(quán)利要求
1. 一種雞傳染性鼻炎、雞毒支原體二聯(lián)類脂滅活疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)A型副雞嗜血桿菌滅活抗原菌液的制備，按照以下步驟制備一級(jí)菌種制備取A型副雞嗜血桿菌菌種劃線接種于雞肉湯瓊脂平板上，在(X)2體積含量為5%、溫度為37°C的環(huán)境中培養(yǎng)16 18h，挑選符合菌株特性的直徑為Imm的3_5個(gè)典型菌落用IOml滅菌雞肉湯稀釋后接種于6 7日齡SPF雞胚卵黃囊內(nèi)，每胚接種0. 2ml，在 37°C溫度下繼續(xù)孵化，收集30h內(nèi)死亡胚的卵黃液，經(jīng)純粹檢驗(yàn)確認(rèn)無雜菌后，作為一級(jí)菌種；二級(jí)菌種制備取一級(jí)菌種，按體積為半合成培養(yǎng)基體積1/200的量接種于半合成培養(yǎng)基中，在溫度為37°C條件下培養(yǎng)17 18h，經(jīng)純粹檢驗(yàn)確認(rèn)無雜菌后，即為二級(jí)菌種，并置于2 8°C保存，不得超過6 8h ；制苗用菌液的制備將二級(jí)菌種按體積為半合成培養(yǎng)基體積1/40的量接種于半合成培養(yǎng)基中，在37 38°C溫室中靜止培養(yǎng)18 20h，期間每隔6 他搖晃一次，經(jīng)純粹檢驗(yàn)確認(rèn)無雜菌污染，加入體積為半合成培養(yǎng)基體積1/2000的甲醛滅活Mh，得到制苗用菌液；菌液的濃縮與滅活將純粹檢驗(yàn)合格的制苗用菌液進(jìn)行濃縮，濃縮后含菌量不少于50 億cfu/ml，通過比濁法測(cè)定含菌量，再分別加入體積為濃縮菌液體積1/1000的甲醛和體積為濃縮菌液體積1/10000的硫柳汞，混勻后在4°C條件下滅活2天，經(jīng)無菌檢驗(yàn)合格得到A 型副雞嗜血桿菌滅活抗原菌液；(2)C型副雞嗜血桿菌滅活抗原菌液的制備其制備方法與A型副雞嗜血桿菌滅活抗原菌液的制備方法相同；(3)雞毒支原體抗原液的制備，按照以下步驟進(jìn)行一級(jí)種子繁殖將CM培養(yǎng)基Iml注入凍干菌種瓶使菌種復(fù)原，再將體積為CM培養(yǎng)基體積1/10的雞毒支原體菌種接種于CM培養(yǎng)基中，在溫度為36 37°C條件下培養(yǎng)M 48h， 待接種后的CM培養(yǎng)基的PH值與接種前的PH值相比下降0. 5 0. 8時(shí)停止培養(yǎng)，經(jīng)純粹檢驗(yàn)確認(rèn)無雜菌后，作為一級(jí)種子，在_25°C以下保存不超過60天；二級(jí)種子繁殖取一級(jí)種子，按體積為CM培養(yǎng)基體積1/10的量接種于CM培養(yǎng)基，置 36 37°C溫度下培養(yǎng)M 48h，經(jīng)純粹檢驗(yàn)合格后，作為二級(jí)種子，在2-8°C保存不超過5 天；制苗用菌液制備再以純粹檢驗(yàn)合格的二級(jí)種子為基礎(chǔ)、比照二級(jí)種子繁殖方法繁殖出三級(jí)種子，再以純粹檢驗(yàn)合格的三級(jí)種子為基礎(chǔ)、比照二級(jí)種子繁殖方法繁殖出四級(jí)種子，比照二級(jí)種子繁殖方法做種子擴(kuò)大培養(yǎng)，菌種繁殖傳代不超過8代，最后一代純粹檢驗(yàn)合格，經(jīng)活菌計(jì)數(shù)測(cè)定，活菌數(shù)不低于108 5CCU/ml，得到制苗用菌液；菌液濃縮與滅活將制得的制苗用菌液作8倍濃縮后，加入體積為濃縮物體積1/500的甲醛，在溫度為37°C條件下滅活20h，期間每隔他搖動(dòng)1次濃縮物，經(jīng)無菌和滅活檢驗(yàn)合格得到雞毒支原體抗原液，置2-8°C保存不超過20天；(4)疫苗的制備將上述制得的A型副雞嗜血桿菌滅活抗原菌液和C型副雞嗜血桿菌滅活抗原菌液按體積比為1 1的比例混勻，得到副雞嗜血桿菌滅活混合抗原菌液，將副雞嗜血桿菌滅活混合抗原菌液與雞毒支原體抗原液按體積比為1 1 1 1.5的比例混勻后倒入乳化罐內(nèi)，用混合機(jī)以750 850r/min的轉(zhuǎn)速攪拌，同時(shí)緩緩加入楊樹皮類脂，使楊樹皮類脂在混合物中的最終體積百分比濃度為2. 0 3. 8%，然后將混合機(jī)轉(zhuǎn)速提高到 2500 3000r/min繼續(xù)乳化30 60分鐘，即得到疫苗，疫苗中A型副雞嗜血桿菌和C型副雞嗜血桿菌的最終含菌量均為10億cfu/ml、雞毒支原體的最終含量為108_°CCU/ml ；所述雞肉湯瓊脂板是這樣制備的取雞肉汁100ml、酪蛋白胨lg、氯化鈉0. 5g、瓊脂粉 1. 5g混合，用4mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)混合溶液的PH至7. 4，116°C滅菌30分鐘，倒板前加入輔酶I (NADH)和過濾除菌的健康雞血清混勻，使得混合溶液中輔酶I(NADH)的質(zhì)量濃度為0. 05%、過濾除菌的健康雞血清的體積百分比濃度為10%，然后將混合溶液倒入直徑為 90mm的平皿中，放平冷卻即得到雞肉湯瓊脂板；所述雞肉汁是取雞胸脯肉泥1份加蒸餾水4 份，4°C浸泡過夜，煮沸30分鐘，除去肉渣，澄清過濾得到的；所述半合成培養(yǎng)基是這樣制備的取多蛋白胨5g、酪蛋白胨30g、谷氨酸鈉15g、酵母浸粉5g、葡萄糖3g、氯化鈉15g，放入IOOOml純化水中攪均，調(diào)節(jié)所得溶液的PH至7. 2 7. 4， 116°C滅菌40分鐘，臨用前加入60ml的滅活健康雞血清和IOml的質(zhì)量百分濃度為0. 5%的輔酶I (NADH)水溶液；所述CM培養(yǎng)基是這樣制備的將PPLO肉湯21. 0g、葡萄糖5. 0g、去離子水1000ml、濃度為的酚紅Iml混合溶解后，在溫度為115°C壓力為0. 106MPa條件下滅菌20分鐘，置 2 8°C保存，使用前加入豬血清130ml、25%的酵母浸出液IOOml和80萬單位/ml青霉素溶液1. anl，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值為7. 8 8. 0 ；所述濃度為的酚紅的制作過程(l)lmol/L氫氧化鈉的制備，取常溫下的澄清的氫氧化鈉飽和溶液56. 0ml，加煮沸過的常溫注射用水IOOOml即制得lmol/L氫氧化鈉；(2)稱取10. Og酚紅粉末加入到20. Oml的lmol/L氫氧化鈉溶液中攪拌后靜置5 10分鐘，將溶解部分倒入IOOOml刻度容器中；( 向未溶解的酚紅粉末中再加入20ml的lmol/L氫氧化鈉溶液攪拌后靜置5 10分鐘，將溶解部分倒入1000ml刻度容器中；(4)如果酚紅粉末未完全溶解，則可再加少量lmol/L氫氧化鈉溶液，但不得超過20. 0ml，將溶液倒入1000ml刻度容器中；( 加煮沸過的常溫注射用水向刻度容器中補(bǔ)足溶液至1000ml，搖勻后分裝小瓶，經(jīng)116°C滅菌15分鐘，置2 8°C保存；所述25%的酵母浸出液的制作過程取新鮮酵母250g加入到1000ml雙蒸水中充分?jǐn)嚢瑁菇湍溉芙馔耆?，煮?0分鐘，煮完冷卻后，以2800r/min轉(zhuǎn)速離心25分鐘，提取上清液分裝，在溫度為115°C、壓力為0. 106MPa條件下滅菌20分鐘。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雞傳染性鼻炎、雞毒支原體二聯(lián)類脂滅活疫苗的制備方法，其特征在于，所述菌液的濃縮采用高速離心、中空纖維過濾、超濾濃縮方式中的任一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種雞傳染性鼻炎、雞毒支原體二聯(lián)類脂滅活疫苗的制備方法，其特征在于，所述菌液的濃縮采用超濾濃縮方式。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種雞傳染性鼻炎、雞毒支原體二聯(lián)類脂滅活疫苗的制備方法發(fā)明，屬于獸用生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，制備好A型和C型副雞嗜血桿菌滅活抗原菌液、雞毒支原體抗原液，A型和C型副雞嗜血桿菌滅活抗原菌液按體積比為1∶1的比例混勻，得到副雞嗜血桿菌滅活混合抗原菌液，將副雞嗜血桿菌滅活混合抗原菌液與雞毒支原體抗原液按體積比為1∶1～1∶1.5的比例混勻后倒入乳化罐內(nèi)攪拌，同時(shí)緩緩加入楊樹皮類脂，使楊樹皮類脂在混合物中的最終體積百分比濃度為2.0～3.8％，繼續(xù)攪拌乳化30～60分鐘。疫苗容易吸收、無毒副作用、免疫產(chǎn)生時(shí)間短、免疫持續(xù)期長(zhǎng)，免疫效果好，能有效預(yù)防雞傳染性鼻炎和雞毒支原體病。
文檔編號(hào)A61K39/02GK102406925SQ20101028958
公開日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2010年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月25日
發(fā)明者呂茂杰, 李香云, 楊靈芝, 董新榮, 賈紅梅, 陳申秒 申請(qǐng)人:山東濱州博萊威生物技術(shù)有限公司