本發(fā)明涉及抗原濃縮純化技術領域，具體涉及一種口蹄疫抗原146s濃縮純化方法。

背景技術：

口蹄疫(footandmouthdisease，fmd)是由口蹄疫病毒引起的偶蹄動物的一種烈性人畜共患的急性接觸性傳染病，在世界許多國家和地區(qū)廣泛流行。由于豬、牛、羊等均可感染此疾病，并能形成全球大規(guī)模流行，所以被國際獸疫局是最重要的動物傳染病，該病在亞洲、非洲、南美洲的流行極大的限制了這些地區(qū)的肉品及其它農(nóng)產(chǎn)品的出口,阻礙了這些地區(qū)的畜牧業(yè)、畜產(chǎn)品加工業(yè)的發(fā)展?？谔阋邍乐匚：π竽翗I(yè)的發(fā)展,給牧區(qū)造成嚴重經(jīng)濟損失，也可使對外貿(mào)易和旅游業(yè)遭受慘重損失。2001年英國暴發(fā)口蹄疫損失約90億英鎊，綿羊是此病的有力傳播者；我國部分地區(qū)于2005年及2009年分別暴發(fā)asiai型和a型fmd，不僅造成了巨大的直接經(jīng)濟損失，而且嚴重危害奶業(yè)的健康發(fā)展以及相關產(chǎn)品的對外貿(mào)易。

接種疫苗是預防該病的重要手段之一，而研制高質量、安全有效的疫苗，不但是決定疫苗免疫效果的關鍵，也是成功預防、控制直至最終消滅口蹄疫的先決條件?？谔阋咭呙缟a(chǎn)工藝復雜，特別是抗原的純化工藝尤其重要，146s抗原是口蹄疫疫苗免疫原性起決定性作用的的抗原，比較脆弱，容易破碎或裂解，會導致免疫原性喪失或下降?？谔阋卟《九囵B(yǎng)液中有效抗原(146s抗原)含量較低，疫苗注射后免疫持續(xù)期短，疫苗免疫效力不穩(wěn)定。為提高疫苗的免疫效力，通常采用對抗原濃縮純化。但濃縮的同時，非目的蛋白也會被濃縮，導致不良反應增加。疫苗中的較高的非目的蛋白成分會造成動物在注苗后出現(xiàn)不同程度的不良反應，輕者減食或停食2-3天或發(fā)生流產(chǎn)，重者發(fā)生死亡。疫苗中的非目的蛋白包括培養(yǎng)細胞時殘留的血清，細胞蛋白和口蹄疫病毒的非結構蛋白，為降低不良反應需要對疫苗進行純化。

目前，對口蹄疫病毒純化主要是通過中空纖維過濾達到除去細胞碎片、非結構蛋白等，氯仿去除非目的蛋白，純化過程口蹄疫抗原損失較大?，F(xiàn)階段對于口蹄疫抗原純化主要通過過濾除去大顆粒蛋白，過濾過程損失較大；氯仿除非目的蛋白工藝中氯仿毒性較大，每立方米可能會對人體產(chǎn)生慢性毒性的最小濃度10毫升。因此，現(xiàn)在常用的口蹄疫抗原濃縮純化的方法已經(jīng)不能適用于口蹄疫疫苗的發(fā)展。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術存在的以上問題，提供一種口蹄疫抗原146s濃縮純化方法，本發(fā)明采用二氯甲烷替純化口蹄疫抗原，純化過程不經(jīng)過過濾抗原損失較小。

為實現(xiàn)上述技術目的，達到上述技術效果，本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)：

口蹄疫抗原146s濃縮純化方法，包括以下步驟：

s101先將口蹄疫病毒培養(yǎng)液離心至澄清，在無菌條件下加二氯甲烷，攪拌均勻，在低溫下沉降，過夜，取上清液；

s102將上清液過第一中空纖維進行過濾，收集透過液；

s103將透過液過第二中空纖維進行過濾，所述第二中空纖維的孔徑比所述第一中空纖維的孔徑小，收集回收液；

s104將s103中收集的回收液進行層析；

s105按照濃度為7-15％的比例加入peg，攪拌；

s106停止攪拌后靜置；

s107提取上清液并棄去，將沉淀后的抗原攪拌均勻，在無菌條件下灌裝至離心桶內(nèi)，沉降離心；

s108棄去上清液，沉淀物用ph值為7.6±0.2的pbs緩沖液稀釋，重懸；

s109重懸液用分散機充分勻漿；

s110純化離心，收集上清液，上清液為純化抗原；

s111純化抗原用0.1μm或0.2μm孔徑濾器過濾除菌。

優(yōu)選地，s101中在無菌條件下加入1-7％的二氯甲烷，攪拌均勻后，在2-8℃下沉降。

優(yōu)選地，所述第一中空纖維的孔徑為0.1-0.5μm。

優(yōu)選地，所述第二中空纖維的孔徑為100kda-300kda。

優(yōu)選地，s104層析為sephawse6ff層析、sephawse4ff層析、toyopearl、tskgel離子交換層析。

優(yōu)選地，s105中peg為peg-2000、peg-4000、peg-6000中的一種或幾種。

優(yōu)選地，s105中加入peg的攪拌方式為：在連續(xù)攪拌的狀態(tài)下加入peg，在攪拌速度為100-200r/min的狀態(tài)下持續(xù)攪拌4小時；

或者加入peg，在攪拌速度為100-200r/min的狀態(tài)下持續(xù)攪拌4小時。

優(yōu)選地，s106中停止攪拌后靜置4-20h，靜置全過程中，抗原液溫度保持在2-8℃。

優(yōu)選地，s107中在連續(xù)流離心機或者冷凍離心機中進行沉降離心，溫度為2-8℃，在8000-10000r/min的速度下，離心15-20min。

優(yōu)選地，s109中重懸液用分散機充分勻漿，分散機轉速為3000-6000r/min；s110中采用連續(xù)流離心機或冷凍離心機純化離心，離心機的轉速為8000r/min，離心5-20min。

本發(fā)明的有益效果是:

本發(fā)明采用二氯甲烷濃縮純化口蹄疫抗原，比傳統(tǒng)的氯仿安全性更好，二氯甲烷每立方米可能會對人體產(chǎn)生慢性毒性的最小濃度為50毫升，而氯仿對人體產(chǎn)生慢性毒性的最小濃度為10毫升。

本發(fā)明采用二氯甲烷和peg聯(lián)合作用來濃縮純化口蹄疫抗原，首先采用二氯甲烷把較大的雜蛋白除去，peg只抓取目標物(口蹄疫抗原)，相當于二次除去雜蛋白結構，純化后雜蛋白含量較低，使得口蹄疫抗原濃縮純化的效果更好。

本發(fā)明采用大孔徑中空纖維進將大顆粒蛋白與目的蛋白分離，然后采用小孔徑中空纖維進一步將小顆粒蛋白與目的蛋白分離；層析進一步提高目的蛋白純度。

本發(fā)明采用sephawse6ff層析、sephawse4ff層析、toyopearl、tskgel離子交換層析進一步將蛋白分離純化，可以得到更高的純化效果。

上述說明僅是本發(fā)明技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術手段，并可依照說明書的內(nèi)容予以實施，本發(fā)明的具體實施方式由以下實施例詳細給出。

具體實施方式

下面將對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例1

實施例1中公開了一種口蹄疫抗原146s濃縮純化方法，具體包括以下步驟：

(1)口蹄疫病毒培養(yǎng)液離心澄清后，在無菌條件下，加1％的二氯甲烷，攪拌均勻，在2-8℃下沉降，過夜，取上清液。沉降時保持低溫，能夠防止目標產(chǎn)物降解，采用二氯甲烷濃縮純化口蹄疫抗原，比傳統(tǒng)的氯仿安全性更好，二氯甲烷每立方米可能會對人體產(chǎn)生慢性毒性的最小濃度為50毫升，而氯仿對人體產(chǎn)生慢性毒性的最小濃度為10毫升。

(2)將上清液過0.1μm的中空纖維進行過濾，收集透過液。

(3)將透過液經(jīng)100kda的中空纖維進行過濾，收集回收液。

(4)將回收液經(jīng)sephawse6ff層析。

(5)層析回收液在連續(xù)攪拌的狀態(tài)下，按最終濃度為7-10％(w/v)的比例加入peg-6000，持續(xù)攪拌4小時，攪拌速度控制在100-200r/min。

首先采用二氯甲烷把較大的雜蛋白除去，中控纖維去除特定大小的蛋白顆粒，sephawse6ff層析進一步去除特定大小蛋白進一步提高目標蛋白純度，peg只抓取目標物(口蹄疫抗原)，相當于再次除去雜蛋白結構，使得口蹄疫抗原濃縮純化的效果更好。

(6)停止攪拌后靜置4-20小時，靜置全過程，抗原液溫度保持在2-8℃范圍內(nèi)。

(7)提取上清液并棄去，將沉降后的抗原攪拌混勻(不加pbs液)，在無菌條件下灌裝至50ml離心桶內(nèi)，沉降離心，采用連續(xù)流離心機或普通的冷凍離心機，離心條件為：8000～10000r/min、15～20min，2-8℃。此處控制低溫離心，目的是防止目標產(chǎn)物降解，并且離心速度在8000～10000r/min離心效果較好，如果離心速度較低，離心不徹底，如果離心速度較快，達到離心的條件要求較高，不易操作。

(8)棄去上清液，沉淀物用ph值為7.6±0.2的0.04mpbs緩沖溶液稀釋，重懸。在ph值為7.6±0.2時，目標產(chǎn)物的溶解性最好。

(9)重懸液用分散機充分勻漿，分散機轉速控制在3000～6000r/min，7-15min。

(10)純化離心，采用連續(xù)流離心機或普通的冷凍離心機，離心條件為：8000r/min，5～20min，收集上清液即純化抗原。

(11)純化抗原用0.22um孔徑濾器過濾除菌。

實施例2

(1)口蹄疫病毒培養(yǎng)液離心澄清后，在無菌條件下，加7％的二氯甲烷，攪拌均勻，在2-8℃下沉降，過夜，取上清液。

(2)將上清液過0.2μm的中空纖維進行過濾，收集透過液。

(3)將透過液經(jīng)200kda的中空纖維進行過濾，收集回收液。

(4)將回收液經(jīng)sephawse4ff層析。

(5)按最終濃度為7-10％(w/v)的比例加入peg-4000，持續(xù)攪拌4小時，攪拌速度控制在100-200r/min，在其它實施例中peg還可以是peg-2000。

(6)停止攪拌后靜置4-20小時，靜置全過程，抗原液溫度保持在2-8℃范圍內(nèi)。

(7)提取上清液并棄去，將沉降后的抗原攪拌混勻(不加pbs液)，在無菌條件下灌裝至50ml離心桶內(nèi)，沉降離心，采用連續(xù)流離心機或普通的冷凍離心機，離心條件為：8000～10000r/min、15～20min，2-8℃。

(8)棄去上清液，沉淀物用ph值為7.6±0.2的0.04mpbs緩沖溶液稀釋，重懸。

(9)重懸液用分散機充分勻漿，分散機轉速控制在3000～6000r/min。

(10)純化離心，采用連續(xù)流離心機或普通的冷凍離心機，離心條件為：8000r/min，5～20min，收集上清液即純化抗原。

(11)純化抗原用0.22um孔徑濾器過濾除菌。

實施例3

(2)口蹄疫病毒培養(yǎng)液離心澄清后，在無菌條件下，加4％的二氯甲烷，攪拌均勻，在2-8℃下沉降，過夜，取上清液。

(2)將上清液過0.5μm的中空纖維進行過濾，收集透過液。

(3)將透過液經(jīng)300kda的中空纖維進行過濾，收集回收液。

(4)將回收液經(jīng)toyopearl、tskgel離子交換層析層析。

(5)按最終濃度為7-10％(w/v)的比例加入peg-6000，持續(xù)攪拌4小時，攪拌速度控制在100-200r/min，在其它實施例中peg還可以是peg-2000。

(6)停止攪拌后靜置4-20小時，靜置全過程，抗原液溫度保持在2-8℃范圍內(nèi)。

(7)提取上清液并棄去，將沉降后的抗原攪拌混勻(不加pbs液)，在無菌條件下灌裝至50ml離心桶內(nèi)，沉降離心，采用連續(xù)流離心機或普通的冷凍離心機，離心條件為：8000～10000r/min、15～20min，2-8℃。

(8)棄去上清液，沉淀物用ph值為7.6±0.2的0.04mpbs緩沖溶液稀釋，重懸。

(9)重懸液用分散機充分勻漿，分散機轉速控制在3000～6000r/min。

(10)純化離心，采用連續(xù)流離心機或普通的冷凍離心機，離心條件為：8000r/min，5～20min，收集上清液即純化抗原。

(11)純化抗原用0.2um孔徑濾器過濾除菌。

實施例4

實施例3中基于實施例1和實施例2中的方法，將o型口蹄疫抗原進行濃縮純化，具體方法包括：

(1)抗原制備：本品是o型口蹄疫病毒接種bhk21懸浮細胞，收獲細胞培養(yǎng)液所得。

(2)沉降除雜：通過4℃靜置除去細胞培養(yǎng)液中細胞碎片等大顆粒雜質，收集上清液。

(3)將上清液過0.5μm的中空纖維進行過濾，收集透過液。

(4)將透過液經(jīng)300kda的中空纖維進行過濾，收集回收液。

(5)將回收液經(jīng)sephawse6ff層析。

(6)加入二氯甲烷：將已過濾除菌的二氯甲烷通過無菌管路加入裝有口蹄疫病毒液的反應器罐體內(nèi)，補加體積為細胞培養(yǎng)液體積的5％，30rpm攪拌15min后，4℃靜置16h過夜。

(7)排放廢液：通過罐底閥將靜置廢液排出，排出體積在7％左右，乳白色廢液全部排出。

(8)加入peg6000：將已經(jīng)高壓滅菌的50％peg6000通過無菌管路加入裝有口蹄疫病毒液的反應器罐體內(nèi)，補加體積為細胞培養(yǎng)液體積的14％，30rpm攪拌4h后，4℃靜置16h過夜。

(9)收集沉淀物：通過罐底閥將靜置后沉淀排出，將乳白色沉淀物全部排出。

(10)離心：將收集的沉淀物無菌分裝到500ml離心桶內(nèi)，10000rpm冷凍離心20min，棄上清。

(11)勻漿重懸：用ph7.6±0.2的無菌0.04mpbs重懸，重懸液用分散機充分勻漿，分散機轉速控制在6000r/min，10min。

(12)純化離心：普通的冷凍離心機，8000r/min，10min，收集上清液(即純化抗原)；

(13)過濾除菌：純化抗原用0.22um孔徑濾器過濾除菌。

對比例1

對比例的純化方法與實施例4中一致，對比例采用氯仿和peg6000，實施例僅采用二氯甲烷和peg6000純化，具體步驟如下：

(1)抗原制備：本品是o型口蹄疫病毒接種bhk21懸浮細胞，收獲細胞培養(yǎng)液所得。

(2)沉降除雜：通過4℃靜置除去細胞培養(yǎng)液中細胞碎片等大顆粒雜質，收集上清液。

(3)加入氯仿：將已過濾除菌的氯仿通過無菌管路加入裝有口蹄疫病毒液的反應器罐體內(nèi)，補加體積為細胞培養(yǎng)液體積的5％，30rpm攪拌15min后，4℃靜置16h過夜。

(4)排放廢液：通過罐底閥將靜置廢液排出，排出體積在7％左右，乳白色廢液全部排出。

(5)加入peg6000：將已經(jīng)高壓滅菌的50％peg6000通過無菌管路加入裝有口蹄疫病毒液的反應器罐體內(nèi)，補加體積為細胞培養(yǎng)液體積的14％，30rpm攪拌4h后，4℃靜置16h過夜。

(6)收集沉淀物：通過罐底閥將靜置后沉淀排出，將乳白色沉淀物全部排出。

(7)離心：將收集的沉淀物無菌分裝到500ml離心桶內(nèi)，10000rpm冷凍離心20min，棄上清。

(8)勻漿重懸：用ph7.6±0.2的無菌0.04mpbs重懸，重懸液用分散機充分勻漿，分散機轉速控制在6000r/min，10min。

(9)純化離心：普通的冷凍離心機，8000r/min，10min，收集上清液(即純化抗原)；

(10)過濾除菌：純化抗原用0.2um孔徑濾器過濾除菌。

抗原及總蛋白檢測

根據(jù)農(nóng)業(yè)部頒發(fā)文件滅活抗原并進行抗原及總蛋白檢測。實施例4中病毒培養(yǎng)液146s含量7μg/ml、6.6μg/ml、3.8μg/ml，純化后46μg/ml、35.5μg/ml、16μg/ml，總蛋白415μg/ml、391g/ml、382μg/ml。

對比例中的病毒培養(yǎng)液146s含量5.9μg/ml、4.7μg/ml、2.5μg/ml，純化后42μg/ml、33μg/ml、14.2μg/ml，總蛋白753μg/ml、754μg/ml、771μg/ml。

通過檢測結果可知，采用上述實施例中測得的總蛋白含量較低，總蛋白含量越低，說明雜蛋白越少。

對比例2

對比例的純化方法與實施例4中一致，對比例采用氯仿，具體步驟如下：1)抗原制備：本品是o型口蹄疫病毒接種bhk21懸浮細胞，收獲細胞培養(yǎng)液所得。

(2)將上清液過0.5μm的中空纖維進行過濾，收集透過液。

(3)將透過液經(jīng)300kda的中空纖維進行過濾，收集回收液。

(4)將回收液經(jīng)sephawse6ff層析。

(5)沉降除雜：通過4℃靜置除去細胞培養(yǎng)液中細胞碎片等大顆粒雜質，將上清液轉移至另一個高壓滅菌的反應器罐體。

(6)加入氯仿：將已過濾除菌的氯仿通過無菌管路加入裝有口蹄疫病毒液的反應器罐體內(nèi)，補加體積為細胞培養(yǎng)液體積的5％，30rpm攪拌15min后，4℃靜置16h過夜。

(7)排放廢液：通過罐底閥將靜置廢液排出，排出體積在7％左右，乳白色廢液全部排出。

(8)加入peg6000：將已經(jīng)高壓滅菌的50％peg6000通過無菌管路加入裝有口蹄疫病毒液的反應器罐體內(nèi)，補加體積為細胞培養(yǎng)液體積的14％，30rpm攪拌4h后，4℃靜置16h過夜。

(9)收集沉淀物：通過罐底閥將靜置后沉淀排出，將乳白色沉淀物全部排出。

(10)離心：將收集的沉淀物無菌分裝到500ml離心桶內(nèi)，10000rpm冷凍離心20min，棄上清。

(11)勻漿重懸：用ph7.6±0.2的無菌0.04mpbs重懸，重懸液用分散機充分勻漿，分散機轉速控制在6000r/min，10min。

(12)純化離心：普通的冷凍離心機，8000r/min，10min，收集上清液(即純化抗原)；

(13)過濾除菌：純化抗原用0.2um孔徑濾器過濾除菌后用適量pbs液沖洗濾器及管路。

抗原及總蛋白檢測

根據(jù)農(nóng)業(yè)部頒發(fā)文件滅活抗原并進行抗原及總蛋白檢測。實施例4中病毒培養(yǎng)液146s含量7μg/ml、6.6μg/ml、3.8μg/ml，純化后44.5μg/ml、33.4μg/ml、15.6μg/ml，總蛋白276μg/ml、240.4g/ml、197μg/ml。

對比例中的病毒培養(yǎng)液146s含量5.9μg/ml、4.7μg/ml、2.5μg/ml，純化后32μg/ml、13μg/ml、14.2μg/ml，總蛋白287.3μg/ml、254μg/ml、208μg/ml。

通過檢測結果可知，采用上述實施例中測得的總蛋白含量較低，總蛋白含量越低，說明雜蛋白越少。

綜合上述實施例1-4和對比例1-2，采用二氯甲烷濃縮純化口蹄疫抗原，比傳統(tǒng)的氯仿安全性更好，二氯甲烷每立方米可能會對人體產(chǎn)生慢性毒性的最小濃度為50毫升，而氯仿對人體產(chǎn)生慢性毒性的最小濃度為10毫升。

采用二氯甲烷和peg聯(lián)合作用來濃縮純化口蹄疫抗原，首先采用二氯甲烷把較大的雜蛋白除去，peg只抓取目標物(口蹄疫抗原)，相當于二次除去雜蛋白結構，純化后雜蛋白含量較低，使得口蹄疫抗原濃縮純化的效果更好。

采用大孔徑中空纖維進將大顆粒蛋白與目的蛋白分離，然后采用小孔徑中空纖維進一步將小顆粒蛋白與目的蛋白分離；層析進一步提高目的蛋白純度。

采用sephawse6ff層析、sephawse4ff層析、toyopearl、tskgel離子交換層析進一步將蛋白分離純化，可以得到更高的純化效果。

對所公開的實施例的上述說明，使本領域專業(yè)技術人員能夠實現(xiàn)或使用本發(fā)明。對這些實施例的多種修改對本領域的專業(yè)技術人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會被限制于本文所示的這些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的最寬的范圍。