本發(fā)明具體涉及羊肚菌、黃精、雪花蓮等真菌與植物活性多糖蛋白及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

糖結(jié)合蛋白是具有與各種糖專一結(jié)合特性的一類結(jié)合蛋白。其中大多數(shù)有血凝活力，有的還具有促細(xì)胞有絲分裂的作用。這些性質(zhì)與凝集素沒有明顯的區(qū)別，因此有人稱這類蛋白質(zhì)為凝集素，也有人稱它為受體(受體可以是蛋白質(zhì)、糖蛋白、糖脂或其它化合物，所以應(yīng)該說是多種受體中的一類)。如哺乳動物肝細(xì)胞膜上對半乳糖專一的結(jié)合蛋白，ashwell等研究者在同一篇文章中又稱它為凝集素和受體，主要根據(jù)其性質(zhì)和功能從不同的角度命名，沒有嚴(yán)格區(qū)分的標(biāo)準(zhǔn)。

糖結(jié)合蛋白存在于所有生物體：病毒、細(xì)菌、真菌、高等植物、動物乃至人的許多組織和器官中。其中有許多是各種細(xì)胞膜的組成成分，包括質(zhì)膜、微粒體膜、高爾基復(fù)合體膜等。目前還陸續(xù)有新的糖結(jié)合蛋白被發(fā)現(xiàn)。經(jīng)過數(shù)億年的生物演化，這類蛋白質(zhì)仍被保留下來，表明它們是生物體內(nèi)不可缺少的成分，并具有重要的功能。至于它們在機(jī)體內(nèi)的作用直至近幾十年才為人們所重視。目前已有許多實(shí)驗(yàn)室對它們在生物體內(nèi)的作用、作用機(jī)理正在進(jìn)行廣泛而深人的研究。

細(xì)胞與細(xì)胞間的粘著如海綿、粘菌的團(tuán)聚、細(xì)菌感染宿主細(xì)胞等；機(jī)體生長發(fā)育和代謝調(diào)節(jié)控制，如體液中的廢物和老化細(xì)胞的清除、分子或離子的傳遞、胚胎發(fā)育、粘菌生長的調(diào)節(jié)等；分子間的識別，如雌蕊受精、精子與卵的結(jié)合，共生固氮、防御病原體的侵襲等，都包含有糖結(jié)合蛋白的作用。糖結(jié)合蛋白主要的一些功能包括胞飲作用、粘著作用、結(jié)合蛋白在共生固氮中的作用。

從具有重要藥用價(jià)值的植物和真菌中開展糖結(jié)合蛋白的研究，具有重要意義。主要的研究方向有：從中選取糖結(jié)合蛋白多肽未被研究的、有重要藥用價(jià)值的植物以及多種藥食兼用的真菌，集成運(yùn)用蛋白質(zhì)化學(xué)、腫瘤的細(xì)胞生物學(xué)、病毒學(xué)、分子生物學(xué)、生物信息學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、蛋白質(zhì)工程和結(jié)構(gòu)生物學(xué)相關(guān)技術(shù)，分離具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗重大常見惡性腫瘤(肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌等)、抗艾滋病、流感和肝炎等病毒活性的新型糖結(jié)合蛋白質(zhì)和多肽類化合物(特別是凝集素、受體等生物活性大分子)；進(jìn)行其生物學(xué)活性和作用機(jī)制研究，揭示糖結(jié)合蛋白多肽藥物與細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白質(zhì)相互作用的規(guī)律，發(fā)現(xiàn)并確立其作用新靶點(diǎn)；進(jìn)行功能基因克隆、結(jié)構(gòu)模擬、表達(dá)和定點(diǎn)突變研究以及空間結(jié)構(gòu)研究等。

我們已研究報(bào)道過屬于真菌糖結(jié)合蛋白的雙孢菇凝集素通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白介導(dǎo)胰島β細(xì)胞增殖。

不過，如何從一些中藥中獲得具有重要藥用活性的多糖蛋白，目前還未形成統(tǒng)一的認(rèn)識。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和本領(lǐng)域的需求，本發(fā)明的目的之一在于提供一種活性多糖蛋白的制備方法，所述方法包括如下步驟：

(1)將原料進(jìn)行超微粉碎至300目，然后加入氯化鈉溶液進(jìn)行浸提，過濾離心后，獲得沉淀和上清液；

(2)向所得上清液加入硫酸銨，使飽和度至40％，靜置處理后離心，棄去沉淀；

(3)利用超濾膜對步驟(2)所得物進(jìn)行超濾，濃縮至原體積的20～30％；

(4)向步驟(3)所得物加入乙醇，進(jìn)行沉淀處理后離心，取沉淀；

(5)對步驟(4)所得物進(jìn)行凍干，獲得所述活性多糖蛋白；

所屬原料為羊肚菌、黃精、雪花蓮中的至少一種。

在本發(fā)明中，屬于植物糖結(jié)合蛋白的黃精凝集素、雪花蓮凝集素家族，是從傳統(tǒng)中藥黃精根莖、雪花蓮中分離出的一種甘露糖/唾液酸結(jié)合凝集素，具有抗腫瘤作用。

本發(fā)明通過前期研究的積累，整合優(yōu)化了諸如羊肚菌、黃精、雪花蓮等真菌和植物的多糖結(jié)合蛋白分離流程，形成了簡便高效的真菌和植物多糖蛋白分離制備工藝。

作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所述原料為羊肚菌和黃精的混合物；優(yōu)選的，羊肚菌和黃精的重量比為1:1。

作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所述原料為羊肚菌、黃精和雪花蓮的混合物；優(yōu)選的，羊肚菌、黃精和雪花蓮的重量比為1:1:1。

優(yōu)選的，步驟(1)中，利用氯化鈉溶液進(jìn)行浸提時(shí)，采取兩次浸提的方式；第一次浸提時(shí)，氯化鈉溶液的濃度為0.1～0.5m，加入量為10～20ml/g·原料，浸提時(shí)間為4～8小時(shí)；第二次浸提時(shí)，取第一次浸提后所得物，進(jìn)行離心，取沉淀，加入濃度為0.1～0.5m的氯化鈉溶液，加入量為5～10ml/g·所述沉淀，浸提時(shí)間為2～4小時(shí)。

優(yōu)選的，步驟(2)中，靜置處理的時(shí)間為4～6小時(shí)，和/或，步驟(3)中，超濾時(shí)，超濾膜的截留分子量為5000～6000道爾頓。

優(yōu)選的，步驟(4)中，乙醇與步驟(3)所得物的體積比為6:4～9:1；沉淀處理時(shí)，時(shí)間為4～6小時(shí)。

優(yōu)選的，在整個(gè)制備過程中，溫度不高于42℃，各步驟中進(jìn)行離心時(shí)于4℃下進(jìn)行。

本發(fā)明的另外一個(gè)目的在于提供由上述制備方法制備得到的活性多糖蛋白。

本發(fā)明的另外一個(gè)目的在于提供含有上述活性多糖蛋白的制劑，所述制劑包括口服制劑或者注射制劑。

本發(fā)明的另外一個(gè)目的在于提供所述的活性多糖蛋白在抗腫瘤、抗病毒、增強(qiáng)免疫力中至少一個(gè)方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：

(1)本發(fā)明獲得的活性多糖蛋白的純度高且得率較大；

(2)與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所得活性多糖蛋白的抑制氧自由基、清除羥自由基及抑制腫瘤細(xì)胞的活性有很大提高。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所得活性多糖蛋白對于hela細(xì)胞的抑制情況結(jié)果圖；

圖2為利用mtt分析法進(jìn)行本發(fā)明所得活性多糖蛋白對a549細(xì)胞的抑制情況的結(jié)果圖；

圖3位利用mtt分析法進(jìn)行本發(fā)明所得活性多糖蛋白對hela細(xì)胞的抑制情況的結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行具體描述，有必要在此指出的是以下實(shí)施例只是用于對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員根據(jù)上述發(fā)明內(nèi)容所做出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

下述實(shí)施例中所述的“質(zhì)量體積比”值得是g/ml。如“質(zhì)量體積比15倍”則意為15ml/g。

實(shí)施例1

將羊肚菌、黃精、雪花蓮干燥材料各取10g混合共30g，用超微粉碎機(jī)粉碎至300目，然后加入質(zhì)量體積比15倍體積的0.1m氯化鈉溶液，攪拌均勻，浸提6小時(shí)，2層紗布過濾，離心(4℃,5,000g,30min)，獲得上清和沉淀。

取上述沉淀，加入質(zhì)量體積比5倍體積的0.5m氯化鈉溶液，攪拌均勻，浸提2小時(shí)，2層紗布過濾，離心(4℃,5,000g,30min)，獲得上清和沉淀。

將所得全部上清合并，得到提取液。

向提取液中添加硫酸按達(dá)40％飽和度，放置5小時(shí)，離心(4℃,10,000g,20min)去沉淀；

取上清，采用超濾濃縮脫鹽，超濾膜的截留分子量為6000道爾頓；體積濃縮至原來的25％，加入無水乙醇(60％)，沉淀6小時(shí)后離心(4℃,5,000g,30min)，獲得沉淀；

將所述沉淀凍干，得灰白色粉末，即為活性多糖蛋白，整個(gè)提取過程在42℃以下。

實(shí)施例2

將羊肚菌、黃精干燥材料各取20g混合共40g，用超微粉碎機(jī)粉碎至300目，然后加入質(zhì)量體積比10倍體積的0.3m氯化鈉溶液，攪拌均勻，浸提6小時(shí)，2層紗布過濾，離心(4℃,5,000g,30min)，獲得上清和沉淀。

取上述沉淀，加入質(zhì)量體積比8倍體積的0.3m氯化鈉溶液，攪拌均勻，浸提4小時(shí)，2層紗布過濾，離心(4℃,5,000g,30min)，獲得上清和沉淀。

將所得全部上清合并，得到提取液。

向提取液中添加硫酸按達(dá)40％飽和度，放置6小時(shí)，離心(4℃,10,000g,20min)去沉淀；

取上清，采用超濾濃縮脫鹽，超濾膜的截留分子量為5000道爾頓；體積濃縮至原來的20％，加入無水乙醇(85％)，沉淀5小時(shí)后離心(4℃,5,000g,30min)，獲得沉淀；

將所述沉淀凍干，得灰白色粉末，即為活性多糖蛋白，整個(gè)提取過程在42℃以下。

實(shí)施例3

將羊肚菌干燥材料取50g，用超微粉碎機(jī)粉碎至300目，然后加入質(zhì)量體積比20倍體積的0.2m氯化鈉溶液，攪拌均勻，浸提4小時(shí)，3層紗布過濾，離心(4℃,5,000g,30min)，獲得上清和沉淀。

取上述沉淀，加入質(zhì)量體積比10倍體積的0.2m氯化鈉溶液，攪拌均勻，浸提3小時(shí)，3層紗布過濾，離心(4℃,5,000g,30min)，獲得上清和沉淀。

將所得全部上清合并，得到提取液。

向提取液中添加硫酸按達(dá)40％飽和度，放置4小時(shí)，離心(4℃,10,000g,20min)去沉淀；

取上清，采用超濾濃縮脫鹽，超濾膜的截留分子量為5000道爾頓；體積濃縮至原來的30％，加入無水乙醇(90％)，沉淀4小時(shí)后離心(4℃,5,000g,30min)，獲得沉淀；

將所述沉淀凍干，得灰白色粉末，即為活性多糖蛋白，整個(gè)提取過程在42℃以下。

實(shí)施例4

將羊肚菌、雪花蓮干燥材料各取25g混合共50g，用超微粉碎機(jī)粉碎至300目，然后加入質(zhì)量體積比10倍體積的0.5m氯化鈉溶液，攪拌均勻，浸提6小時(shí)，2層紗布過濾，離心(4℃,5,000g,30min)，獲得上清和沉淀。

取上述沉淀，加入質(zhì)量體積比5倍體積的0.1m氯化鈉溶液，攪拌均勻，浸提4小時(shí)，2層紗布過濾，離心(4℃,5,000g,30min)，獲得上清和沉淀。

將所得全部上清合并，得到提取液。

向提取液中添加硫酸按達(dá)40％飽和度，放置4小時(shí)，離心(4℃,10,000g,20min)去沉淀；

取上清，采用超濾濃縮脫鹽，超濾膜的截留分子量為5000道爾頓；體積濃縮至原來的20％，加入無水乙醇(75％)，沉淀6小時(shí)后離心(4℃,5,000g,30min)，獲得沉淀；

將所述沉淀凍干，得灰白色粉末，即為活性多糖蛋白，整個(gè)提取過程在42℃以下。

實(shí)驗(yàn)例

總抗氧化能力的測定采用磷鉬酸銨比色法；還原力的測定采用普魯士藍(lán)法；清除超氧陰離子自由基能力的測定采用鄰苯三酚自氧化法；清除羥基自由基能力的測定采用水楊酸比色法。總抗氧化能力和還原力的測定中，吸光度值越大表明活性越強(qiáng)；對超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除能力的測定中，清除率越大，表明活性越強(qiáng)。清除率按式(1)計(jì)算。

r＝(d0－d)/d0×100％。(1)

式中，r表示清除率；d0表示對照管的吸光度；d表示樣品管的吸光度。

所有試驗(yàn)均以vc作陽性對照，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算樣品和vc的ic50(總抗氧化能力和還原力為吸光度值為0.5時(shí)對應(yīng)的樣品濃度；其他為清除率50％時(shí)對應(yīng)的樣品濃度)，并計(jì)算樣品的vc當(dāng)量(每克多糖蛋白相當(dāng)于vc的毫克數(shù)，即vc的ic50除以多糖蛋白的ic50)。

表1提取活性多糖蛋白的抗氧化活性

實(shí)驗(yàn)例2

活性多糖蛋白抑制腫瘤細(xì)胞試驗(yàn)

細(xì)胞采用hela細(xì)胞；培養(yǎng)條件為：在含有10％胎牛血清(fbs)，1％谷氨酰胺(200mmo1/l)，青霉素(100iu/ml)和鏈霉素(100mg/l)的rpmi1640培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，co2濃度為5％。hela細(xì)胞在24孔板培養(yǎng)，培養(yǎng)基500μl，培養(yǎng)24h后，加入藥物質(zhì)量為10μg、20μg、40μg、80μg的提取物蒸餾水溶液100μl，繼續(xù)培養(yǎng)24h，觀察。結(jié)果見圖1。

體外抗腫瘤活性采用mtt法評價(jià)

hela細(xì)胞，人肺癌細(xì)胞(a549)培養(yǎng)條件為：在含有10％胎牛血清(fbs)，1％谷氨酰胺(200mmo1/l)，青霉素(100iu/ml)和鏈霉素(100mg/l)的rpmi1640培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，co2濃度為5％。提取的活性多糖蛋白對hela和a549細(xì)胞生長的影響效果采用mtt法進(jìn)行評價(jià)。hela細(xì)胞或a549細(xì)胞在96孔板的培養(yǎng)密度為5×10⁴cell/ml。固定時(shí)間添加含有培養(yǎng)基的多糖蛋白樣品溶液。24h去除培養(yǎng)液。然后采用mtt法測定細(xì)胞抑制效果。

根據(jù)以下公式計(jì)算:

細(xì)胞活性(％)＝實(shí)驗(yàn)組吸光值/空白組吸光值×100％。

結(jié)果如圖2和圖3所示。