本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提取棉花線粒體及其蛋白的方法。

背景技術(shù)：

線粒體蛋白質(zhì)的提取主要分為線粒體分離和蛋白質(zhì)提取兩個(gè)環(huán)節(jié)。目前，用于高等植物線粒體分離提取的方法主要有差速離心法和密度梯度離心法等。差速離心法，雖然操作簡(jiǎn)單，是目前應(yīng)用最廣的方法，但所提取的線粒體純度低、容易受核雜質(zhì)污染，對(duì)后續(xù)的研究工作造成很大困難；密度梯度離心法，得到的線粒體純度高，但操作復(fù)雜、耗時(shí)，長(zhǎng)時(shí)間高速離心對(duì)離心機(jī)要求很高，對(duì)材料的需求量大，同時(shí)線粒體提取產(chǎn)量低。

線粒體具有相對(duì)獨(dú)立的遺傳物質(zhì)，植物細(xì)胞中，線粒體蛋白質(zhì)僅占總蛋白質(zhì)的約5％，因此，分離出高純度的線粒體蛋白質(zhì)，對(duì)于研究線粒體的蛋白組等都是必需的。和其他作物相比，棉花線粒體dna，rna和蛋白質(zhì)的提取都較為困難，目前還沒有關(guān)于棉花線粒體蛋白質(zhì)提取方法的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種提取植物線粒體蛋白的方法。

本發(fā)明提供的提取植物線粒體蛋白的方法包括如下步驟：

(1)將植物樣品進(jìn)行勻漿，過濾，收集濾液；將所述濾液進(jìn)行差速離心，收集沉淀；

(2)洗滌步驟(1)獲得的沉淀，得到體系a，將所述體系a進(jìn)行差速離心，收集沉淀；

(3)向步驟(2)獲得的沉淀中加入bufferb溶液，進(jìn)行蔗糖密度梯度離心，收集梯度36％與梯度52％之間的黃色液體層，即得到線粒體；

所述蔗糖密度梯度離心的蔗糖密度梯度為將60％蔗糖溶液、52％蔗糖溶液、36％蔗糖溶液和20％蔗糖溶液分層制備，得到蔗糖密度梯度；

(4)從步驟(3)獲得的線粒體中提取蛋白。

上述方法中，所述從步驟(3)獲得的線粒體中提取蛋白包括如下步驟：

1)向步驟(3)獲得的線粒體中加入裂解液，裂解反應(yīng)，得到裂解反應(yīng)產(chǎn)物；

2)向所述裂解反應(yīng)產(chǎn)物中加入苯酚抽提液，反應(yīng)，離心，棄沉淀，收集上清液；

3)將步驟2)獲得的上清液與5倍體積的乙酸銨/甲醇溶液混勻，反應(yīng)，離心，棄上清液，收集沉淀；

4)用乙酸銨/甲醇溶液洗滌步驟3)獲得的沉淀，靜置，離心，棄上清液，收集沉 淀；

5)用80％丙酮溶液洗滌步驟4)獲得的沉淀，靜置，離心，棄上清液，收集沉淀；

6)重復(fù)步驟5)；

7)用體積分?jǐn)?shù)為70％乙醇洗滌步驟6)獲得的沉淀，靜置，離心，棄上清液，收集沉淀；并將所述沉淀懸浮于體積分?jǐn)?shù)為80％的丙酮中，靜置過夜；

8)離心步驟7)獲得的產(chǎn)物，棄上清液，收集沉淀，得到的沉淀即為線粒體蛋白。

上述方法中，

所述60％蔗糖溶液、所述52％蔗糖溶液、所述36％蔗糖溶液、所述20％蔗糖溶液的體積比為4:5:5:3；

所述20％蔗糖溶液的溶質(zhì)為蔗糖，溶劑為0.1mph為8.0的tris-hcl，所述蔗糖在所述20％蔗糖溶液中的濃度為0.2g/ml；

所述36％蔗糖溶液的溶質(zhì)為蔗糖，溶劑為0.1mph為8.0的tris-hcl，所述蔗糖在所述36％蔗糖溶液中的濃度為0.36g/ml；

所述52％蔗糖溶液的溶質(zhì)為蔗糖，溶劑為0.1mph為8.0的tris-hcl，所述蔗糖在所述52％蔗糖溶液中的濃度為0.52g/ml；

所述60％蔗糖溶液的溶質(zhì)為蔗糖，溶劑為0.1mph為8.0的tris-hcl，所述蔗糖在所述60％蔗糖溶液中的濃度為0.6g/ml。

上述方法中，所述步驟(3)和步驟(4)間還包括如下純化的步驟：用bufferb⁺溶液洗滌梯度36％與梯度52％之間的黃色液體層，離心，棄上清液，收集沉淀，得到的沉淀即為線粒體。

上述方法中，所述洗滌的次數(shù)為4次。

上述方法中，

所述步驟(1)的勻漿過程中使用勻漿緩沖液，所述勻漿緩沖液的溶劑為水，溶質(zhì)及其在勻漿緩沖液中的濃度為：蔗糖100-500mm、edta-na25-10mm、kcl5-20mm、kh2po410-20mm、bsa0.5-1g/l、二硫蘇糖醇0.77-1.54g/l、β-巰基乙醇0.5-1ml/l；所述勻漿緩沖液的ph值為7.5-8.5；

所述步驟(2)的洗滌過程中使用洗滌緩沖液，所述洗滌緩沖液的溶劑為水，溶質(zhì)及其在洗滌緩沖液中的濃度為：蔗糖100-500mm、edta-na25-10mm、kcl5-20mm、kh2po410-20mm、tris-hcl5-20mm；

所述bufferb⁺溶液為在所述洗滌緩沖液中添加bsa得到的溶液；所述bsa在所述bufferb⁺溶液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05-0.1％；

所述步驟(1)中，所述差速離心的步驟為：將濾液進(jìn)行低速離心，棄沉淀，取上清液；將所述上清液進(jìn)行高速離心，棄上清液，收集沉淀；所述低速離心的條件為 500-2000×g離心5-15min；所述高速離心的條件為10000-15000×g離心30-60min；

所述步驟(2)中，所述差速離心的步驟為：將體系a進(jìn)行低速離心，棄沉淀，取上清液；將所述上清液進(jìn)行高速離心，棄上清液，收集沉淀；所述低速離心的條件為500-1000×g離心10-20min，所述高速離心的條件為15000-18000×g離心30-60min；

所述步驟(3)中，所述蔗糖密度梯度離心的條件為50000-100000×g，4℃離心60-120min；

所述純化步驟中，所述離心的條件為50000-100000×g離心25-30min。

上述方法中，

所述勻漿緩沖液的溶劑為水，溶質(zhì)及其在勻漿緩沖液中的濃度為：蔗糖300mm、edta-na27.5mm、kcl10mm、kh2po420mm、bsa1g/l、二硫蘇糖醇1.54g/l、β-巰基乙醇1ml/l；所述勻漿緩沖液的ph值為7.5；

所述洗滌緩沖液的溶劑為水，溶質(zhì)及其在洗滌緩沖液中的濃度為：蔗糖300mm、edta-na25mm、kcl10mm、kh2po420mm、tris-hcl10mm；

所述bufferb⁺溶液為在所述洗滌緩沖液中添加bsa得到的溶液；所述bsa在所述bufferb⁺溶液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％；

所述步驟(1)中，所述差速離心的步驟為：將濾液進(jìn)行低速離心，棄沉淀，取上清液；將所述上清液進(jìn)行高速離心，棄上清液，收集沉淀；所述低速離心的條件為1000×g離心10min；所述高速離心的條件為12000×g離心45min；

所述步驟(2)中，所述差速離心的步驟為：將體系a進(jìn)行低速離心，棄沉淀，取上清液；將所述上清液進(jìn)行高速離心，棄上清液，收集沉淀；所述低速離心的條件為1000×g離心15min，所述高速離心的條件為18000×g離心30min；

所述步驟(3)中，所述蔗糖密度梯度離心的條件為75600×g，4℃離心90min；

所述純化步驟中，所述離心的條件為75600×g離心25min或75600×g離心30min。

上述方法中，

所述裂解液的溶劑為水，溶質(zhì)及其在所述裂解液中的濃度分別為tris-hcl0.005-0.02mol/l、edta-na20.01-0.05mol/l、ctab1.0-3.0g/l、聚乙烯吡咯烷酮1.0-3.0g/l、nacl1.0-1.8mol/l；

所述苯酚抽提液是將ph8.0的tris飽和酚與等體積提取緩沖液混勻得到的溶液；

所述提取緩沖液的溶劑為水，溶質(zhì)及其在所述提取緩沖液中的濃度分別為tris-hcl0.05-0.1mol/l、sds15-25g/l、蔗糖200-400g/l、β-巰基乙醇1-2ml/l；

所述乙酸銨/甲醇溶液的溶劑為甲醇，溶質(zhì)為乙酸銨，所述乙酸銨在所述甲醇中的濃度為0.05-0.2mol/l；

所述步驟1)中，所述裂解反應(yīng)的條件為65℃裂解10-30min；

所述步驟2)中，所述反應(yīng)的條件為4℃反應(yīng)30min；所述離心的條件為2000-5000×g，4℃離心20-40min；

所述步驟3)中，所述反應(yīng)條件為-20℃過夜；所述離心的條件為2000-5000×g，4℃離心20-40min；

所述步驟4)、5)和7)中，所述靜置的條件為-20℃靜置20min；所述離心的條件為8000-12000×g，4℃下離心20-40min；

所述步驟8)中，所述離心的條件為18000-20000×g離心2-10min。

上述方法中，

所述裂解液的溶劑為水，溶質(zhì)及其在所述裂解液中的濃度分別為tris-hcl0.01mol/l、edta-na20.02mol/l、ctab2.0g/l、聚乙烯吡咯烷酮2.0g/l、nacl1.4g/l；

所述提取緩沖液的溶劑為水，溶質(zhì)及其在所述提取緩沖液中的濃度分別為tris-hcl0.05mol/l、sds20g/l、蔗糖300g/l、β-巰基乙醇2ml/l；

所述乙酸銨/甲醇溶液的溶劑為甲醇，溶質(zhì)為乙酸銨，所述乙酸銨在所述甲醇中的濃度為0.1mol/l；

所述步驟1)中，所述裂解反應(yīng)的條件為65℃裂解10min；

所述步驟2)中，所述反應(yīng)的條件為4℃反應(yīng)30min；所述離心的條件為3000×g，4℃離心30min；

所述步驟3)中，所述反應(yīng)條件為-20℃過夜；所述離心的條件為3000×g，4℃離心30min；

所述步驟4)、5)和7)中，所述靜置的條件為-20℃靜置20min；所述離心的條件為12000×g，4℃下離心20min；

所述步驟8)中，所述離心的條件為20000×g離心2min。

上述方法中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述雙子葉植物具體為棉花，所述棉花具體為棉花黃化苗；所述棉花黃化苗具體為蘇棉20黃化苗。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明改進(jìn)了傳統(tǒng)的差速離心法提取棉花線粒體的過程，通過更改試劑、利用蔗糖密度梯度層、調(diào)整離心次數(shù)和時(shí)間、增加抽提洗滌次數(shù)等優(yōu)化提取條件，分離得到高純度的線粒體；

(2)本發(fā)明利用ctab-苯酚抽提法提取蛋白質(zhì)，有效的除掉了多糖、dna等雜質(zhì)的污染，得到了高純度的線粒體蛋白。

本發(fā)明針對(duì)目前分離線粒體的方法中存在的不足以及缺乏線粒體蛋白提取方法的現(xiàn)狀，通過更改試劑、利用蔗糖密度梯度層、調(diào)整離心次數(shù)和時(shí)間、增加抽提洗滌次 數(shù)等優(yōu)化分離和提取條件，提供了一種分離高純度的棉花線粒體及其蛋白的方法。該方法的具體步驟為：結(jié)合差速離心法以及蔗糖密度梯度法，分離出高純度的棉花線粒體；并利用ctab裂解線粒體，提取其線粒體蛋白，填補(bǔ)了植物線粒體蛋白提取的空缺。本發(fā)明的方法對(duì)線粒體機(jī)械損傷程度最小，可以有效的除去線粒體以外的核組分、質(zhì)體組分，以及酚類、多糖類物質(zhì)，降低污染率，提高線粒體蛋白質(zhì)的純度和質(zhì)量。滿足了棉花基因組研究、線粒體蛋白組及代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等研究工作的實(shí)驗(yàn)技術(shù)需求，拓寬了相關(guān)研究工作的領(lǐng)域。

附圖說明

圖1為蔗糖密度梯度。

圖2為sds-page圖。

圖3為sds-page圖。

圖4為sds-page圖。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的離心，如果沒有注明溫度，均4℃條件下離心。

下述實(shí)施例中的1.5mtris-hcl的制備方法如下：將tris18.17g加入到80mlddh2o中，用濃hcl調(diào)ph到8.0，用水定容至100ml。

下述實(shí)施例中的0.1mph為8.0的tris-hcl的制備方法如下：將tris1.211g加入到80mlddh2o中，用濃hcl調(diào)ph到8.0，用水定容至100ml。

下述實(shí)施例中的體積分?jǐn)?shù)為80％丙酮溶液的制備方法如下：將400ml丙酮加入無菌三角瓶，用ddh2o定容至500ml，混勻后-20℃保存。

下述實(shí)施例中的體積分?jǐn)?shù)為70％乙醇溶液的制備方法如下：350ml無水乙醇加入無菌三角瓶，用ddh2o定容至500ml，混勻-20℃保存。

下述實(shí)施例中的sdssamplebuffer的制備方法如下：將1ml1mtris-hcl(ph6.8)，4ml10％(w/v)sds和2ml甘油用水定容至10ml，4℃保存。

實(shí)施例1、一種棉花線粒體及其蛋白質(zhì)的方法

一、棉花線粒體的分離

1、將100g徐244(蘇棉20)黃化苗與1000mlbuffera溶液混勻，進(jìn)行勻漿，用4-6層紗布過濾，收集濾液；將濾液在1000×g下低速離心10min，棄沉淀，取上清液；將上清液在12000×g下高速離心45min，棄上清液，收集沉淀。

上述buffera溶液的溶劑為水，溶質(zhì)及其在buffera溶液中的濃度為：蔗糖300 mm、edta-na27.5mm、kcl10mm、kh2po420mm、bsa1g/l、二硫蘇糖醇1.54g/l、β-巰基乙醇1ml/l；ph值為7.5，其中bsa、二硫蘇糖醇和β-巰基乙醇為高溫高壓滅菌后加入。

2、向步驟1獲得的沉淀中加入40mlbufferb溶液，刷起沉淀后轉(zhuǎn)移到100ml離心管中，繼續(xù)用約80mlbufferb溶液洗滌，在1000×g下離心15min，棄沉淀，取上清液；將上清液轉(zhuǎn)移到新的50ml離心管中，在18000×g下離心30min，棄上清液，收集沉淀。

上述bufferb溶液的溶劑為水，溶質(zhì)及其在bufferb溶液中的濃度為：蔗糖300mm、edta-na25mm、kcl10mm、kh2po420mm、tris-hcl10mm，高溫高壓滅菌。

3、向步驟2的沉淀中加入1mlbufferb溶液，刷起沉淀后轉(zhuǎn)移到4℃預(yù)冷的蔗糖密度梯度中，再貼壁緩慢勻速加入1mlbufferb溶液洗滌，在4℃，75600×g下離心90min，收集梯度36％與梯度52％之間的黃色液體層(圖1)。黃色液體層中即為分離得到的線粒體。

上述蔗糖密度梯度的制備方法如下：將質(zhì)量與體積百分比為60％蔗糖溶液、質(zhì)量與體積百分比為52％蔗糖溶液、質(zhì)量與體積百分比為36％蔗糖溶液和質(zhì)量與體積百分比為20％蔗糖溶液進(jìn)行70℃水浴溶解；將8ml的質(zhì)量與體積百分比為60％蔗糖溶液、10ml的質(zhì)量與體積百分比為52％蔗糖溶液、10ml的質(zhì)量與體積百分比為36％蔗糖溶液和6ml的質(zhì)量與體積百分比為20％蔗糖溶液混勻，得到蔗糖密度梯度；

上述20％蔗糖溶液為6.0g蔗糖用0.1mph為8.0的tris-hcl定容至30ml；

上述36％蔗糖溶液為18.0g蔗糖用0.1mph為8.0的tris-hcl定容至50ml；

上述52％蔗糖溶液為26.0g蔗糖用0.1mph為8.0的tris-hcl定容至50ml；

上述60％蔗糖溶液為24.0g蔗糖用0.1mph為8.0的tris-hcl定容至40ml。

4、向淡黃色液體層中加入30mlbufferb⁺(bufferb⁺的制備方法如下：bufferb溶液在滅菌后加入0.1％(質(zhì)量/體積)的bsa)，在75600×g下離心30min，棄上清液，收集沉淀；

5、用30mlbufferb⁺洗滌步驟4獲得的沉淀，在75600×g下離心25min，棄上清液，收集沉淀；

6、重復(fù)步驟5兩次后，收集沉淀，得到的沉淀即為純化后的線粒體。

二、棉花線粒體蛋白質(zhì)的提取

1、向?qū)嵤├?獲得的線粒體中加入2.0ml65℃預(yù)熱的裂解液，65℃裂解10min，期間輕柔顛倒2-3次；

上述裂解液的制備方法如下：將0.01moltris-hcl、0.02moledta-na2、2.0g ctab、2.0g聚乙烯吡咯烷酮(pvp)和1.4molnacl用水定容至1升。

2、向步驟1的產(chǎn)物中加入7.0ml苯酚抽提液，在4℃環(huán)境下顛倒混勻30min后，在4℃，3000×g下離心30min，棄沉淀，收集上清液。

上述苯酚抽提液的制備方法如下：將ph8.0的tris飽和酚與等體積提取緩沖液混勻(使用時(shí)加入2％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))β-巰基乙醇)。上述提取緩沖液的制備方法如下：16.7ml1.5mtris-hcl(ph值為8.0)、10.0gsds、150.0g蔗糖、1mlβ-巰基乙醇用水定容至500ml。

3、向步驟2獲得的上清液中加入5倍體積的乙酸銨/甲醇溶液，顛倒混勻后，-20℃過夜；將過夜沉淀后的溶液在4℃，3000×g下離心30min，棄上清液，收集沉淀；

上述乙酸銨/甲醇溶液的制備方法如下：將2.3124g乙酸銨溶于300ml甲醇溶液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4、用-20℃預(yù)冷的乙酸銨/甲醇溶液洗滌步驟3獲得的沉淀，超聲波震蕩(超聲波震蕩的條件：功率300w，10s/次，間隔10s，20min)充分混勻后，-20℃靜置20min，靜置后在4℃，12000×g下離心20min，棄上清液，收集沉淀；

5、用-20℃預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為80％丙酮溶液洗滌步驟4獲得的沉淀，-20℃靜置20min，在4℃，12000×g離心20min，棄上清液，收集沉淀。

6、用體積分?jǐn)?shù)為80％丙酮溶液重復(fù)清洗上述步驟5獲得的沉淀。

7、用-20℃預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為70％乙醇再次洗滌步驟4獲得的重復(fù)清洗后的沉淀，超聲波震蕩(超聲波震蕩的條件：功率300w，10s/次，間隔10s，20min)充分混勻后，-20℃靜置20min，在4℃，12000×g下離心20min，棄上清液，收集沉淀，并將沉淀懸浮于10ml-20℃預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為80％丙酮溶液中，-20℃靜置過夜。

8、振蕩蛋白，使其在丙酮溶液中充分懸浮，取400μl到1.5ml離心管，在常溫，20000×g下離心2min，棄上清液，收集沉淀，即為線粒體蛋白質(zhì)。

9、待丙酮揮發(fā)完全后，加入40μlsdssamplebuffer溶解蛋白。

將獲得的線粒體蛋白質(zhì)進(jìn)行sds-page檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖2、圖3、圖4所示。從圖中可以看出，獲得的線粒體蛋白質(zhì)主條帶大小與總蛋白質(zhì)及葉綠體蛋白質(zhì)主條帶存在明顯差異，說明用本發(fā)明提供的方法提取的線粒體蛋白質(zhì)較純凈，質(zhì)量較高，能滿足繼續(xù)的相關(guān)分子試驗(yàn)。