本發(fā)明涉及一種分離純化方法，更具體一點(diǎn)說(shuō)，涉及一種蛹蟲(chóng)草活性組分的分離純化方法。

背景技術(shù)：

蛹蟲(chóng)草為子囊菌門(mén)，肉座目，麥角菌科、蟲(chóng)草屬的模式種，學(xué)名為cordycepsmilitaris，又名北蛹蟲(chóng)草。蛹蟲(chóng)草中含有多種化學(xué)成分，具有多種藥用功效，與冬蟲(chóng)夏草的藥理功能和臨床效果相似，但價(jià)格卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于冬蟲(chóng)夏草，因此蛹蟲(chóng)草逐漸成為冬蟲(chóng)夏草的替代品，具有極大的潛在市場(chǎng)。其主要活性成分包括腺苷、蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草多糖等，目前研究最多應(yīng)用最廣的無(wú)疑是蟲(chóng)草素，鑒于蟲(chóng)草素抗腫瘤等活性，人們對(duì)蟲(chóng)草素的需求也越來(lái)越大。

目前獲得蟲(chóng)草素的方式主要是通過(guò)分離提取獲得，蟲(chóng)草素常規(guī)提取方法如水提法，水提醇沉法，醇提法等，提取過(guò)程單一，無(wú)法徹底提取蛹蟲(chóng)草中的有效成分，而輔助提取手段通常有微波、超聲、酶法等，國(guó)內(nèi)關(guān)于蟲(chóng)草素分離的技術(shù)手段主要為層析法，從總體上而言，這些提取方法在保留有效成分，棄除無(wú)效成分方面，仍存在提取不夠充分，有效成分損失大，工序多，周期長(zhǎng)，成本高等缺點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)問(wèn)題，提供具有分離簡(jiǎn)單、純度高、周期短等技術(shù)特點(diǎn)的一種蛹蟲(chóng)草活性組分的分離純化方法。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明一種蛹蟲(chóng)草活性組分的分離純化方法，該方法采用如下步驟：

步驟1)：將蛹蟲(chóng)草置于50-70℃條件下烘干至蛹蟲(chóng)草含水量在8％以下，超微粉碎5-15min，獲得超微蛹蟲(chóng)草粉；

步驟2)：將步驟1)獲得的超微蛹蟲(chóng)草粉加入到濃度為75-100％的乙醇溶液中，充分?jǐn)嚢枞芙?，超?0-60min，靜置1-12h，置于轉(zhuǎn)速為8000-10000rpm離心機(jī)內(nèi)離心獲取上清液，重復(fù)1-2次，合并上清液；

步驟3)：將步驟2)合并的上清液旋干獲得固體，將固體置于燒杯中，緩慢加入蒸餾水溶解，并充分?jǐn)嚢?，獲得濃度為0.9-1.1mg/ml溶液，再將溶液置于轉(zhuǎn)速為8000-10000rpm離心機(jī)內(nèi)離心，獲得初步提取液；

步驟4)：按質(zhì)量份數(shù)，將400-600份偶聯(lián)了oligo(dt)的磁珠用400-600份水洗滌兩次，加入100-300份初步提取液，重置磁珠，置于室溫條件下反應(yīng)5-10min，用磁性分離器進(jìn)行磁性分離，在磁性分離器上用移液器將上清液棄去；再加入100-300份水，混勻磁珠，用磁性分離器進(jìn)行磁性分離，在磁性分離器上用移液器移取上清液棄去，重復(fù)兩次；繼續(xù)加入50-200份水，混勻磁珠，置于65-100℃水浴加熱5-30min，快速置于磁性分離架上，進(jìn)行磁性分離，快速收集上清液，獲得蟲(chóng)草素溶液。

作為一種優(yōu)選，步驟2)中所述微蛹蟲(chóng)草粉與濃度為70-100％乙醇質(zhì)量比為1:5-20。

本發(fā)明一種蛹蟲(chóng)草活性組分的分離純化方法，該方法采用如下步驟：

步驟1)：將蛹蟲(chóng)草置于60℃條件下烘干至蛹蟲(chóng)草含水量在8％以下，超微粉碎8min，獲得超微蛹蟲(chóng)草粉；

步驟2)：將步驟1)獲得的超微蛹蟲(chóng)草粉加入到濃度為85％的乙醇溶液中，充分?jǐn)嚢枞芙?，超?5min，靜置8h，置于轉(zhuǎn)速為9000rpm離心機(jī)內(nèi)離心獲取上清液，重復(fù)1次，合并上清液；

步驟3)：將步驟2)合并的上清液旋干獲得固體，將固體置于燒杯中，緩慢加入蒸餾水溶解，并充分?jǐn)嚢?，獲得濃度為1.0mg/ml溶液，再將溶液置于轉(zhuǎn)速為9000rpm離心機(jī)內(nèi)離心，獲得初步提取液；

步驟4)：按質(zhì)量份數(shù)，將500份偶聯(lián)了oligo(dt)的磁珠用500份水洗滌兩次，加入200份初步提取液，重置磁珠，置于室溫條件下反應(yīng)8min，用磁性分離器進(jìn)行磁性分離，在磁性分離器上用移液器將上清液棄去，加入200份水，混勻磁珠，用磁性分離器上進(jìn)行磁性分離，在磁性分離器上用移液器移取上清棄去，重復(fù)兩次，加入125份水，混勻磁珠，置于80℃水浴加熱18min，快速置于磁性分離架上，進(jìn)行磁性分離，快速收集上清液，獲得蟲(chóng)草素溶液。

作為一種優(yōu)選，步驟2)中所述微蛹蟲(chóng)草粉與濃度為85％乙醇質(zhì)量比為1:8。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明開(kāi)始通過(guò)酒精將蛹蟲(chóng)草中的核酸類(lèi)物質(zhì)去除，避免了后續(xù)過(guò)程中的核酸污染；通過(guò)親和層析來(lái)分離純蟲(chóng)草素，吸附性強(qiáng)，特異性高。避免了有效損失，提高了有效成分的純度；生產(chǎn)周期短，成本低，對(duì)設(shè)備要求低，操作簡(jiǎn)單，易于推廣市場(chǎng)潛力大；分離純化過(guò)程避開(kāi)了有害溶劑的污染，使最終所獲得的提取物安全無(wú)毒，綠色環(huán)保；采用試劑儀器均為國(guó)產(chǎn)，成本低。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)具體的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受以下實(shí)施例的限制。

實(shí)施例1本發(fā)明一種蛹蟲(chóng)草活性組分的分離純化方法，該方法采用如下步驟：

步驟1)：將蛹蟲(chóng)草置于50℃條件下烘干至蛹蟲(chóng)草含水量在8％以下，超微粉碎5min，獲得超微蛹蟲(chóng)草粉；

步驟2)：將步驟1)獲得的超微蛹蟲(chóng)草粉加入到濃度為75％的乙醇溶液中，充分?jǐn)嚢枞芙?，超?0min，靜置1h，置于轉(zhuǎn)速為8000rpm離心機(jī)內(nèi)離心獲取上清液，重復(fù)1次，合并上清液，微蛹蟲(chóng)草粉與濃度為70％乙醇質(zhì)量比為1:5；

步驟3)：將步驟2)合并的上清液旋干獲得固體，將固體置于燒杯中，緩慢加入蒸餾水溶解，并充分?jǐn)嚢?，獲得濃度為0.9mg/ml溶液，再將溶液置于轉(zhuǎn)速為8000rpm離心機(jī)內(nèi)離心，獲得初步提取液；

步驟4)：按質(zhì)量份數(shù)，將400份偶聯(lián)了oligo(dt)的磁珠用400份水洗滌兩次，加入100份步驟3)獲得的初步提取液，重置磁珠，置于室溫條件下反應(yīng)5min，用磁性分離器進(jìn)行磁性分離，使得磁珠沉淀，固液分離，在磁性分離器上用移液器將上清液棄去；再加入100份水，混勻磁珠，用磁性分離器進(jìn)行磁性分離，在磁性分離器上用移液器移取上清液棄去，重復(fù)兩次；繼續(xù)加入50份水，混勻磁珠，置于65℃水浴加熱5min，快速置于磁性分離架上，進(jìn)行磁性分離，快速用移液器移取上清液棄去，獲得蟲(chóng)草素溶液，蒸干溶液，可以獲得粉末狀高純度蟲(chóng)草素。

實(shí)施例2本發(fā)明一種蛹蟲(chóng)草活性組分的分離純化方法，該方法采用如下步驟：

步驟1)：將蛹蟲(chóng)草置于60℃條件下烘干至蛹蟲(chóng)草含水量在8％以下，超微粉碎10min，獲得超微蛹蟲(chóng)草粉；

步驟2)：將步驟1)獲得的超微蛹蟲(chóng)草粉加入到濃度為85％的乙醇溶液中，充分?jǐn)嚢枞芙猓?5min，靜置8h，置于轉(zhuǎn)速為9000rpm離心機(jī)內(nèi)離心獲取上清液，重復(fù)1次，合并上清液，所述微蛹蟲(chóng)草粉與濃度為85％乙醇質(zhì)量比為1:8；

步驟3)：將步驟2)合并的上清液旋干獲得固體，將固體置于燒杯中，緩慢加入蒸餾水溶解，并充分?jǐn)嚢瑁@得濃度為1.0mg/ml溶液，再將溶液置于轉(zhuǎn)速為9000rpm離心機(jī)內(nèi)離心，獲得初步提取液；

步驟4)：按質(zhì)量份數(shù)，將500份偶聯(lián)了oligo(dt)的磁珠用500份水洗滌兩次，加入200份步驟3)獲得的初步提取液，重置磁珠，置于室溫條件下反應(yīng)8min，用磁性分離器進(jìn)行磁性分離，使得磁珠沉淀，固液分離，在磁性分離器上用移液器將上清液棄去；再加入200份水，混勻磁珠，用磁性分離器進(jìn)行磁性分離，在磁性分離器上用移液器移取上清液棄去，重復(fù)兩次；繼續(xù)加入125份水，混勻磁珠，置于80℃水浴加熱18min，快速置于磁性分離架上，進(jìn)行磁性分離，快速用移液器移取上清液棄去，獲得蟲(chóng)草素溶液，蒸干溶液，可以獲得粉末狀高純度蟲(chóng)草素。

實(shí)施例3本發(fā)明一種蛹蟲(chóng)草活性組分的分離純化方法，該方法采用如下步驟：

步驟1)：將蛹蟲(chóng)草置于70℃條件下烘干至蛹蟲(chóng)草含水量在8％以下，超微粉碎15min，獲得超微蛹蟲(chóng)草粉；

步驟2)：將步驟1)獲得的超微蛹蟲(chóng)草粉加入到濃度為100％的乙醇溶液中，充分?jǐn)嚢枞芙猓?0min，靜置12h，置于轉(zhuǎn)速為10000rpm離心機(jī)內(nèi)離心獲取上清液，重復(fù)2次，合并上清液，所述微蛹蟲(chóng)草粉與濃度為100％乙醇質(zhì)量比為1:20；

步驟3)：將步驟2)合并的上清液旋干獲得固體，將固體置于燒杯中，緩慢加入蒸餾水溶解，并充分?jǐn)嚢瑁@得濃度為1.1mg/ml溶液，再將溶液置于轉(zhuǎn)速為10000rpm離心機(jī)內(nèi)離心，獲得初步提取液；

步驟4)：按質(zhì)量份數(shù)，將600份偶聯(lián)了oligo(dt)的磁珠用600份水洗滌兩次，加入300份步驟3)獲得的初步提取液，重置磁珠，置于室溫條件下反應(yīng)10min，用磁性分離器進(jìn)行磁性分離，使得磁珠沉淀，固液分離，在磁性分離器上用移液器將上清液棄去；再加入300份水，混勻磁珠，用磁性分離器進(jìn)行磁性分離，在磁性分離器上用移液器移取上清液棄去，重復(fù)兩次；繼續(xù)加入200份水，混勻磁珠，置于100℃水浴加熱30min，快速置于磁性分離架上，進(jìn)行磁性分離，快速用移液器移取上清液棄去，獲得蟲(chóng)草素溶液，蒸干溶液，可以獲得粉末狀高純度蟲(chóng)草素。

最后，需要注意的是，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有很多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容中直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。