本發(fā)明涉及醫(yī)藥化學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種螺旋霉素的純化方法。

背景技術(shù)：

螺旋霉素為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其活性成分為鏈霉菌屬產(chǎn)生的一組混合物。附圖1中記載了螺旋霉素的結(jié)構(gòu)式，其中spiramycini，r＝h；spiramycinii，r＝coch3；spiramyciniii，r＝coch2ch3。本品為白色或微黃色粉末，微有味；微吸濕；易溶于乙醇、丙醇、丙酮和甲醇，難溶于水。本品具有強(qiáng)大的體內(nèi)抗菌作用和抗菌后效應(yīng)(pae)，能夠增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬作用。本品在組織細(xì)胞內(nèi)濃度較紅霉素高，而副作用小于紅霉素。本品可用于治療由革蘭陽性菌和某些革蘭陰性菌引起的耳、鼻、喉和呼吸道感染。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題，在于提供一種成本低廉、回收效率高且適用于廣泛工業(yè)化的純化生產(chǎn)方法。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種螺旋霉素的純化方法，所述的方法包括如下步驟：

1)將胞內(nèi)含螺旋霉素的鏈霉菌發(fā)酵液加入絮凝劑聚合氯化鋁進(jìn)行固液分離，獲得濾液；該步驟中，加入絮凝劑后，菌體發(fā)生自溶，從而釋放出胞內(nèi)螺旋霉素；

2)將步驟1)獲得的濾液調(diào)節(jié)ph為9.0～9.5，再加入醋酸丁酯，離心分離醋酸丁酯層，得分離后的醋酸丁酯相；

其中，采用堿液調(diào)節(jié)ph，堿液為液堿與去離子水體積比1：3配置而成。步驟1)獲得的濾液與醋酸丁酯的混合體積比為2.5：1至3：1；

3)用去離子水洗滌步驟2)所得醋酸丁酯相，攪拌、靜置分離除去洗水；其中，用于洗滌的去離子水的ph用氨水調(diào)節(jié)到7.5至8.5；優(yōu)選的，每次洗滌去離子水的用量為醋酸丁酯相體積的10％至15％，洗滌次數(shù)優(yōu)選為2次；

4)用草酸溶液反萃取步驟3)洗滌后的醋酸丁酯相，攪拌、靜置分離出水相，收集水相得水提液；其中，草酸溶液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5％的草酸溶液，并控制水相ph為4.2至4.8；優(yōu)選的，每次洗滌草酸溶液的用量為醋酸丁酯相體積的10％至15％，洗滌次數(shù)優(yōu)選為2次；

5)調(diào)整步驟4)獲得的水提液ph到5.2至5.5，用二氯甲烷洗滌水提液，攪拌、靜置分離除去二氯甲烷；其中，調(diào)整ph根據(jù)酸堿需要采用濃氨水或者草酸；優(yōu)選的，每次洗滌二氯甲烷的用量為水提液體積的10％至15％，洗滌次數(shù)優(yōu)選為2次；該步驟中分離除去的二氯甲烷指的是二氯甲烷相；

6)將步驟5)洗滌后的水提液減壓蒸發(fā)除溶媒；減壓蒸發(fā)除溶媒主要原理是通過減壓降低有機(jī)溶劑的沸點(diǎn)，同時(shí)可以采用擴(kuò)大液體表面積或者加溫的方法加快蒸發(fā)速度；優(yōu)選的，采用-50至-100帕的負(fù)壓或其他合理的氣壓值，同時(shí)采用常溫下增大表面積的方式提高蒸發(fā)效率；

7)將步驟6)除溶媒后的水提液脫色，攪拌，過濾，得脫色液；

8)將步驟7)脫色后的脫色液加熱結(jié)晶得到結(jié)晶混合物；

所述的加熱結(jié)晶是采用結(jié)晶罐內(nèi)加熱結(jié)晶方式，其中將結(jié)晶罐內(nèi)溫度加熱至65至75℃，將脫色液與氨水在管道內(nèi)混合，結(jié)晶在混合的瞬間進(jìn)行，控制混合時(shí)ph到9.0至9.5，溫度60至65℃，結(jié)晶物經(jīng)過離心機(jī)分離得到。

進(jìn)一步的，結(jié)晶物可以裝盤置于烘箱內(nèi)烘干，烘箱進(jìn)風(fēng)溫度控制在60至80℃，烘干時(shí)間為16至40小時(shí)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有點(diǎn)以及有益效果：

本發(fā)明的工藝方法控制指標(biāo)明確，可控性強(qiáng)，是對工業(yè)上溶媒法的改進(jìn)，可應(yīng)用于大批量生產(chǎn)螺旋霉素的過程中；

本發(fā)明所使用的純化方法，使螺旋霉素在水相和酯相中的轉(zhuǎn)移，根據(jù)螺旋霉素的溶解特性，通過控制ph值，先在酯層中富集發(fā)酵液中的螺旋霉素有效成分，水洗后再通過調(diào)節(jié)ph，用草酸反萃取酯層，有效去除雜質(zhì)，提高螺旋霉素的純度，反萃取后再用二氯甲烷去除部分極性較小的脂溶性的有機(jī)物，進(jìn)而提高有效成分螺旋霉素的含量。

本發(fā)明螺旋霉素純化工藝，以雜質(zhì)的去除和有效成分含量的提高作為整個(gè)工藝的重點(diǎn)，對提取工藝各個(gè)環(huán)節(jié)的操作參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，大大提高了螺旋霉素成品的合格率。

附圖說明

圖1為螺旋霉素的結(jié)構(gòu)式；

圖2為未經(jīng)本發(fā)明處理的螺旋霉素hplc圖表；

圖3為經(jīng)本發(fā)明處理的螺旋霉素hplc圖表。

具體實(shí)施方式

對本專利所使用的術(shù)語解釋如下：

1)減壓蒸發(fā)：指在蒸發(fā)器內(nèi)形成一定真空度，使溶液的沸點(diǎn)降低而進(jìn)行蒸發(fā)的方法，該方法具有濕度低、蒸發(fā)速度快等優(yōu)點(diǎn)；

2)結(jié)晶：指固體溶質(zhì)從熱的飽和溶液中析出的過程；

3)反萃取：指用反萃取劑使被萃取物從有機(jī)相返回水相的過程；

4)抗菌后效應(yīng)：指細(xì)菌與抗生素接觸一定時(shí)間后，當(dāng)抗生素消失后，細(xì)菌的生長受到持續(xù)性抑制的效應(yīng)；

5)自溶：指細(xì)胞內(nèi)溶酶體膜破裂，釋放的水解酶使細(xì)胞裂解，釋放內(nèi)容物的現(xiàn)象。

6)溶媒：指能夠溶解氣體、固體和液體而形成的均勻混合物液體。

為詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實(shí)現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實(shí)施方式并配合附圖詳予說明。

實(shí)施例1：一種螺旋霉素的純化方法，其包括如下步驟：

1)將胞內(nèi)含螺旋霉素的鏈霉菌發(fā)酵液加入絮凝劑聚合氯化鋁進(jìn)行固液分離，獲得濾液；

2)將步驟1)獲得的濾液用堿液調(diào)節(jié)ph到9.0，堿液為液堿與去離子水體積比1：3配置而成，再加入醋酸丁酯，步驟1)獲得的濾液與醋酸丁酯的混合體積比為3：1，離心分離醋酸丁酯層，得分離后的醋酸丁酯相；

3)用去離子水洗滌步驟2)所得醋酸丁酯相，攪拌、靜置分離除去洗水；其中，用于洗滌的去離子水的ph用氨水調(diào)節(jié)至7.5，每次洗滌去離子水的用量為醋酸丁酯相體積的15％；

4)用草酸溶液反萃取步驟3)洗滌后的醋酸丁酯相，攪拌、靜置分離出水相，收集水相得水提液；其中，草酸溶液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5％的草酸溶液，并控制水相ph為4.2，每次洗滌草酸溶液的用量為醋酸丁酯相體積的15％；

5)根據(jù)實(shí)際情況采用濃氨水或者草酸調(diào)整步驟4)獲得的水提液ph到5.2，用二氯甲烷洗滌水提液，攪拌、靜置分離除去二氯甲烷，每次洗滌二氯甲烷的用量為水提液體積的15％，洗滌2次；

6)將步驟5)洗滌后的水提液除溶媒；其中，洗滌后的水提液減壓蒸發(fā)除溶媒；

7)將步驟6)除溶媒后的水提液脫色，攪拌，過濾，得脫色液；

8)將步驟7)脫色后的脫色液采用結(jié)晶罐內(nèi)加熱結(jié)晶方式，其中將結(jié)晶罐內(nèi)溫度加熱至75℃，將脫色液與氨水在管道內(nèi)混合，結(jié)晶在混合的瞬間進(jìn)行，控制混合時(shí)ph到9.0，溫度65℃，結(jié)晶物經(jīng)過離心機(jī)分離得到；

結(jié)晶物裝盤置于烘箱內(nèi)烘干，烘箱進(jìn)風(fēng)溫度控制在60℃，烘干時(shí)間為40小時(shí)。

實(shí)施例2：一種螺旋霉素的純化方法，其包括如下步驟：

1)將胞內(nèi)含螺旋霉素的鏈霉菌發(fā)酵液加入絮凝劑聚合氯化鋁進(jìn)行固液分離，獲得濾液；

2)將步驟1)獲得的濾液用堿液調(diào)節(jié)ph到9.5，堿液為液堿與去離子水體積比1：3配置而成，再加入醋酸丁酯，步驟1)獲得的濾液與醋酸丁酯的混合體積比為2.5：1，離心分離醋酸丁酯層，得分離后的醋酸丁酯相；

3)用去離子水洗滌步驟2)所得醋酸丁酯相，攪拌、靜置分離除去洗水；其中，用于洗滌的去離子水的ph用氨水調(diào)節(jié)至8.5，每次洗滌去離子水的用量為醋酸丁酯相體積的10％，洗滌2次；

4)用草酸溶液反萃取步驟3)洗滌后的醋酸丁酯相，攪拌、靜置分離出水相，收集水相得水提液；其中，草酸溶液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5％的草酸溶液，并控制水相ph為4.8，每次洗滌草酸溶液的用量為醋酸丁酯相體積的10％，洗滌2次；

5)根據(jù)實(shí)際情況采用濃氨水或者草酸調(diào)整步驟4)獲得的水提液ph到5.5，用二氯甲烷洗滌水提液，攪拌、靜置分離除去二氯甲烷，每次洗滌二氯甲烷的用量為水提液體積的10％，洗滌2次；

6)將步驟5)洗滌后的水提液減壓蒸發(fā)除溶媒；

7)將步驟6)除溶媒后的水提液脫色，攪拌，過濾，得脫色液；

8)將步驟7)脫色后的脫色液采用結(jié)晶罐內(nèi)加熱結(jié)晶方式，其中將結(jié)晶罐內(nèi)溫度加熱至65℃，將脫色液與氨水在管道內(nèi)混合，結(jié)晶在混合的瞬間進(jìn)行，控制混合時(shí)ph到9.5，溫度60℃，結(jié)晶物經(jīng)過離心機(jī)分離得到；

結(jié)晶物裝盤置于烘箱內(nèi)烘干，烘箱進(jìn)風(fēng)溫度控制在80℃，烘干時(shí)間為16小時(shí)。

實(shí)施例3：一種螺旋霉素的純化方法，其包括如下步驟：

1)將胞內(nèi)含螺旋霉素的鏈霉菌發(fā)酵液加入絮凝劑聚合氯化鋁進(jìn)行固液分離，獲得濾液；

2)將步驟1)獲得的濾液用堿液調(diào)節(jié)ph到9.3，堿液為液堿與去離子水體積比1：3配置而成，再加入醋酸丁酯，步驟1)獲得的濾液與醋酸丁酯的混合體積比為2.8：1，離心分離醋酸丁酯層，得分離后的醋酸丁酯相；

3)用去離子水洗滌步驟2)所得醋酸丁酯相，攪拌、靜置分離除去洗水；其中，用于洗滌的去離子水的ph用氨水調(diào)節(jié)至8.0，每次洗滌去離子水的用量為醋酸丁酯相體積的13％；

4)用草酸溶液反萃取步驟3)洗滌后的醋酸丁酯相，攪拌、靜置分離出水相，收集水相得水提液；其中，草酸溶液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5％的草酸溶液，并控制水相ph為4.5，每次洗滌草酸溶液的用量為醋酸丁酯相體積的13％；

5)根據(jù)實(shí)際情況采用濃氨水或者草酸調(diào)整步驟4)獲得的水提液ph到5.4，用二氯甲烷洗滌水提液，攪拌、靜置分離除去二氯甲烷，每次洗滌二氯甲烷的用量為水提液體積的13％；

6)將步驟5)洗滌后的水提液除溶媒；

7)將步驟6)除溶媒后的水提液脫色，攪拌，過濾，得脫色液；

8)將步驟7)脫色后的脫色液采用結(jié)晶罐內(nèi)加熱結(jié)晶方式，其中將結(jié)晶罐內(nèi)溫度加熱至70℃，將脫色液與氨水在管道內(nèi)混合，結(jié)晶在混合的瞬間進(jìn)行，控制混合時(shí)ph到9.3，溫度63℃，結(jié)晶物經(jīng)過離心機(jī)分離得到；

結(jié)晶物裝盤置于烘箱內(nèi)烘干，烘箱進(jìn)風(fēng)溫度控制在70℃，烘干時(shí)間為30小時(shí)。

實(shí)施例4：一種螺旋霉素的純化方法，其包括如下步驟：

1)將胞內(nèi)含螺旋霉素的鏈霉菌發(fā)酵液加入絮凝劑聚合氯化鋁進(jìn)行固液分離，獲得濾液；

2)將步驟1)獲得的濾液用堿液調(diào)節(jié)ph到9.4，堿液為液堿與去離子水體積比1：3配置而成，再加入醋酸丁酯，步驟1)獲得的濾液與醋酸丁酯的混合體積比為2.6：1，離心分離醋酸丁酯層，得分離后的醋酸丁酯相；

3)用去離子水洗滌步驟2)所得醋酸丁酯相，攪拌、靜置分離除去洗水；其中，用于洗滌的去離子水的ph用氨水調(diào)節(jié)至8.3，每次洗滌去離子水的用量為醋酸丁酯相體積的11％；

4)用草酸溶液反萃取步驟3)洗滌后的醋酸丁酯相，攪拌、靜置分離出水相，收集水相得水提液；其中，草酸溶液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5％的草酸溶液，并控制水相ph為4.3，每次洗滌草酸溶液的用量為醋酸丁酯相體積的11％；

5)根據(jù)實(shí)際情況采用濃氨水或者草酸調(diào)整步驟4)獲得的水提液ph到5.3，用二氯甲烷洗滌水提液，攪拌、靜置分離除去二氯甲烷，每次洗滌二氯甲烷的用量為水提液體積的11％，洗滌2次；

6)將步驟5)洗滌后的水提液除溶媒；其中，洗滌后的水提液減壓蒸發(fā)除溶媒；

7)將步驟6)除溶媒后的水提液脫色，攪拌，過濾，得脫色液；

8)將步驟7)脫色后的脫色液采用結(jié)晶罐內(nèi)加熱結(jié)晶方式，其中將結(jié)晶罐內(nèi)溫度加熱至73℃，將脫色液與氨水在管道內(nèi)混合，結(jié)晶在混合的瞬間進(jìn)行，控制混合時(shí)ph到9.1，溫度64℃，結(jié)晶物經(jīng)過離心機(jī)分離得到；

結(jié)晶物裝盤置于烘箱內(nèi)烘干，烘箱進(jìn)風(fēng)溫度控制在65℃，烘干時(shí)間為35小時(shí)。

實(shí)施例5：一種螺旋霉素的純化方法，其包括如下步驟：

1)將胞內(nèi)含螺旋霉素的鏈霉菌發(fā)酵液加入絮凝劑聚合氯化鋁進(jìn)行固液分離，獲得濾液；

2)將步驟1)獲得的濾液用堿液調(diào)節(jié)ph到9.1，堿液為液堿與去離子水體積比1：3配置而成，再加入醋酸丁酯，步驟1)獲得的濾液與醋酸丁酯的混合體積比為2.9：1，離心分離醋酸丁酯層，得分離后的醋酸丁酯相；

3)用去離子水洗滌步驟2)所得醋酸丁酯相，攪拌、靜置分離除去洗水；其中，用于洗滌的去離子水的ph用氨水調(diào)節(jié)至7.7，每次洗滌去離子水的用量為醋酸丁酯相體積的14％；

4)用草酸溶液反萃取步驟3)洗滌后的醋酸丁酯相，攪拌、靜置分離出水相，收集水相得水提液；其中，草酸溶液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5％的草酸溶液，并控制水相ph為4.7，每次洗滌草酸溶液的用量為醋酸丁酯相體積的14％；

5)根據(jù)實(shí)際情況采用濃氨水或者草酸調(diào)整步驟4)獲得的水提液ph到5.1，用二氯甲烷洗滌水提液，攪拌、靜置分離除去二氯甲烷，每次洗滌二氯甲烷的用量為水提液體積的14％，洗滌2次；

6)將步驟5)洗滌后的水提液除溶媒；其中，洗滌后的水提液減壓蒸發(fā)除溶媒；

7)將步驟6)除溶媒后的水提液脫色，攪拌，過濾，得脫色液；

8)將步驟7)脫色后的脫色液采用結(jié)晶罐內(nèi)加熱結(jié)晶方式，其中將結(jié)晶罐內(nèi)溫度加熱至67℃，將脫色液與氨水在管道內(nèi)混合，結(jié)晶在混合的瞬間進(jìn)行，控制混合時(shí)ph到9.4，溫度61℃，結(jié)晶物經(jīng)過離心機(jī)分離得到；

結(jié)晶物裝盤置于烘箱內(nèi)烘干，烘箱進(jìn)風(fēng)溫度控制在75℃，烘干時(shí)間為20小時(shí)。

實(shí)施例6：一種螺旋霉素的純化方法，其包括如下步驟：

1)將胞內(nèi)含螺旋霉素的鏈霉菌發(fā)酵液加入絮凝劑聚合氯化鋁進(jìn)行固液分離，獲得濾液；

2)將步驟1)獲得的濾液用堿液調(diào)節(jié)ph到9.2，堿液為液堿與去離子水體積比1：3配置而成，再加入醋酸丁酯，步驟1)獲得的濾液與醋酸丁酯的混合體積比為2.7：1，離心分離醋酸丁酯層，得分離后的醋酸丁酯相；

3)用去離子水洗滌步驟2)所得醋酸丁酯相，攪拌、靜置分離除去洗水；其中，用于洗滌的去離子水的ph用氨水調(diào)節(jié)至7.6，每次洗滌去離子水的用量為醋酸丁酯相體積的12％；

4)用草酸溶液反萃取步驟3)洗滌后的醋酸丁酯相，攪拌、靜置分離出水相，收集水相得水提液；其中，草酸溶液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5％的草酸溶液，并控制水相ph為4.4，每次洗滌草酸溶液的用量為醋酸丁酯相體積的12％；

5)根據(jù)實(shí)際情況采用濃氨水或者草酸調(diào)整步驟4)獲得的水提液ph到5.1，用二氯甲烷洗滌水提液，攪拌、靜置分離除去二氯甲烷，每次洗滌二氯甲烷的用量為水提液體積的12％，洗滌2次；

6)將步驟5)洗滌后的水提液除溶媒；其中，洗滌后的水提液減壓蒸發(fā)除溶媒；

7)將步驟6)除溶媒后的水提液脫色，攪拌，過濾，得脫色液；

8)將步驟7)脫色后的脫色液采用結(jié)晶罐內(nèi)加熱結(jié)晶方式，其中將結(jié)晶罐內(nèi)溫度加熱至68℃，將脫色液與氨水在管道內(nèi)混合，結(jié)晶在混合的瞬間進(jìn)行，控制混合時(shí)ph到9.2，溫度62℃，結(jié)晶物經(jīng)過離心機(jī)分離得到；

結(jié)晶物裝盤置于烘箱內(nèi)烘干，烘箱進(jìn)風(fēng)溫度控制在73℃，烘干時(shí)間為25小時(shí)。

實(shí)施例7：一種螺旋霉素的純化方法，其包括如下步驟：

1)將胞內(nèi)含螺旋霉素的鏈霉菌發(fā)酵液加入絮凝劑聚合氯化鋁進(jìn)行固液分離，獲得濾液；

2)將步驟1)獲得的濾液用堿液調(diào)節(jié)ph到9.2，堿液為液堿與去離子水體積比1：3配置而成，再加入醋酸丁酯，步驟1)獲得的濾液與醋酸丁酯的混合體積比為2.7：1，離心分離醋酸丁酯層，得分離后的醋酸丁酯相；

3)用去離子水洗滌步驟2)所得醋酸丁酯相，攪拌、靜置分離除去洗水；其中，用于洗滌的去離子水的ph用氨水調(diào)節(jié)至8.2，每次洗滌去離子水的用量為醋酸丁酯相體積的12％；

4)用草酸溶液反萃取步驟3)洗滌后的醋酸丁酯相，攪拌、靜置分離出水相，收集水相得水提液；其中，草酸溶液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5％的草酸溶液，并控制水相ph為4.6，每次洗滌草酸溶液的用量為醋酸丁酯相體積的12％；

5)根據(jù)實(shí)際情況采用濃氨水或者草酸調(diào)整步驟4)獲得的水提液ph到5.1，用二氯甲烷洗滌水提液，攪拌、靜置分離除去二氯甲烷，每次洗滌二氯甲烷的用量為水提液體積的12％，洗滌2次；

6)將步驟5)洗滌后的水提液除溶媒；其中，洗滌后的水提液減壓蒸發(fā)除溶媒；

7)將步驟6)除溶媒后的水提液脫色，攪拌，過濾，得脫色液；

8)將步驟7)脫色后的脫色液采用結(jié)晶罐內(nèi)加熱結(jié)晶方式，其中將結(jié)晶罐內(nèi)溫度加熱至72℃，將脫色液與氨水在管道內(nèi)混合，結(jié)晶在混合的瞬間進(jìn)行，控制混合時(shí)ph到9.2，溫度62℃，結(jié)晶物經(jīng)過離心機(jī)分離得到；

結(jié)晶物裝盤置于烘箱內(nèi)烘干，烘箱進(jìn)風(fēng)溫度控制在73℃，烘干時(shí)間為25小時(shí)。

實(shí)驗(yàn)例：hplc分析

采用kromasilc18柱(4.5mm×150mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇∶磷酸二氫鈉溶液(體積比53∶47)；檢測波長：231nm；流速：1.0ml·min-1；柱溫25℃；進(jìn)樣量：10-20μl。hplc檢測以峰高法計(jì)算螺旋霉素的含量。

將實(shí)施例1待處理的發(fā)酵液調(diào)ph至8.5，用等量乙酸乙酯提取，濃縮乙酸乙酯提取液至干，溶于甲醇，采用上述方法進(jìn)行hplc分析結(jié)果見圖2。

將實(shí)施例1純化后的干燥結(jié)晶物，溶于甲醇，采用上述方法進(jìn)行hplc分析結(jié)果見圖3。

由此可見，本發(fā)明純化方法能夠有效的去除雜質(zhì)，快速提高有效成分含量。

以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利保護(hù)范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。