一種分離提純必特螺旋霉素的工藝方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種分離提純必特螺旋霉素的工藝方法，屬于抗生素分離提純技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素(Macrolides antib1tics)是應(yīng)用最為廣泛的抗菌藥物之一，分子結(jié)構(gòu)母體是14?16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯，內(nèi)酯環(huán)上的羥基通過(guò)糖苷鍵與I?3分子的糖或氨基糖相連。迄今為止發(fā)現(xiàn)的該類(lèi)抗生素達(dá)100余種，臨床上常用的有:14元環(huán)紅霉素(Erythromycin)及其衍生物羅紅霉素(Roxithromycin)、克拉霉素(Clarithromycin)，15元環(huán)紅霉素衍生物阿奇霉素(Azithromycin)，16元環(huán)主要有交沙霉素(Josamycin)、柱晶白霉素(Kitasamycin)、麥迪霉素(Midecamycin)、普拉特霉素(Platenomycin)、泰樂(lè)菌素(Ty 1sin)和螺旋霉素(Spiramycin)及其衍生物等。
[0003]必特螺旋霉素(Bi tespiramy cin )，又稱可利霉素(Keli my cin)、生技霉素(Shengjimycin)，是一種酰化螺旋霉素所組成的多組分混合物，如圖1所示，圖1中，1.螺旋霉素m，2.單乙酰螺旋霉素11，3.單乙酰螺旋霉素111,4.丙酰螺旋霉素11,5.丙酰螺旋霉素III，6.(異)丁酰螺旋霉素11,7.異戊酰螺旋霉素I，8.(異)丁酰螺旋霉素111,9.異戊酰螺旋霉素II，10.異戊酰螺旋霉素III。必特螺旋霉素由工程菌Stmptomyces spiramyceticusWSJ-1產(chǎn)生，是國(guó)內(nèi)首例具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素。必特螺旋霉素的藥效試驗(yàn)表明，其對(duì)支原體及革蘭氏陽(yáng)性菌抑制活性較高，對(duì)臨床耐紅霉素的金葡球菌僅有極少交叉耐藥性，抗菌活性及治療效果優(yōu)于乙酰螺旋霉素、紅霉素、麥迪霉素。
[0004]必特螺旋霉素成品是由極性不同的?；菪顾睾臀粗s質(zhì)所組成的混合物，各組分的極性差異致使雜質(zhì)分布非常復(fù)雜，如圖1。目前必特螺旋霉素的合格標(biāo)準(zhǔn)已明確規(guī)定，其規(guī)格為異戊酰螺旋霉素III > 30%，異戊酰螺旋霉素I+II+III > 60%，總?；菪顾? 80%，螺旋霉素< 1.0%，總未知雜質(zhì)< 5.0%。由于極性接近的有效組分和雜質(zhì)的性質(zhì)極為相似，因此在分離提純的過(guò)程中，極性相近的有效組分和未知雜質(zhì)保持相同程度的去留趨勢(shì)，將總未知雜質(zhì)含量控制在不高于5%這一苛刻范圍內(nèi)已成為生產(chǎn)必特螺旋霉素合格品的難點(diǎn)。
[0005]對(duì)于多組分藥物的分離提純并無(wú)太多可以借鑒的成功案例。必特螺旋霉素作為國(guó)家一類(lèi)新藥，其組分復(fù)雜，目前已報(bào)道的關(guān)于分離提純必特螺旋霉素的研究主要集中在溶媒萃取法、大孔樹(shù)脂吸附法等工藝的研究。例如，中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利CN101921302B公開(kāi)了一種從發(fā)酵液中提取必特螺旋霉素的純化工藝，該純化方法通過(guò)萃取，尤其是通過(guò)緩沖鹽溶液洗滌萃取相，去除了其中殘留的螺旋霉素，優(yōu)化了必特螺旋霉素的組分分配。中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利CN103694295A公開(kāi)了一種優(yōu)化必特螺旋霉素組分的方法，通過(guò)膜分離、大孔樹(shù)脂吸附洗脫、洗滌和萃取操作，采用分步結(jié)晶的方法從水相中提取必特螺旋霉素，可去除弱極性雜質(zhì)并富集異戊酰螺旋霉素III。然而，針對(duì)如何去除組分間雜質(zhì)并提高有效組分的含量，未見(jiàn)有相關(guān)報(bào)道。
[0006]在工業(yè)生產(chǎn)中，分離提純必特螺旋霉素的工藝主要來(lái)源于生產(chǎn)螺旋霉素的工藝方法，即溶媒萃取法，該方法的基本原理為:必特螺旋霉素在不同的PH溶液中以不同的化學(xué)狀態(tài)存在，基于這種特性，使必特螺旋霉素在不同溶媒中發(fā)生相轉(zhuǎn)移，進(jìn)而達(dá)到濃縮和提純的目的。然而，溶媒萃取法對(duì)必特螺旋霉素單個(gè)組分沒(méi)有選擇特異性，加之其組分及雜質(zhì)種類(lèi)多、發(fā)酵液不穩(wěn)定等因素，生產(chǎn)合格的必特螺旋霉素成品有很大的難度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種分離提純必特螺旋霉素的工藝方法，以制得必特螺旋霉素合格品。
[0008]本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):
[0009]—種分離提純必特螺旋霉素的工藝方法，該工藝方法包括以下步驟:
[0010](I)三級(jí)逆流洗滌:用磷酸鹽溶液三級(jí)逆流洗滌含有必特螺旋霉素的酯提取液，得到含有必特螺旋霉素的洗后酯溶液；
[0011](2)第一次反萃:用磷酸鹽溶液反萃含有必特螺旋霉素的洗后酯溶液，靜置分液，得含有必特螺旋霉素的一次水提液；
[0012](3)酯萃取:用酯萃取含有必特螺旋霉素的一次水提液，靜置分液，得到濃縮必特螺旋霉素的酯萃取液；
[0013](4)第二次反萃:用磷酸鹽溶液反萃濃縮必特螺旋霉素的酯萃取液，靜置分液，得含有必特螺旋霉素的二次水提液；
[0014](5)結(jié)晶:向含有必特螺旋霉素的二次水提液中，加入乙醇，滴加堿液結(jié)晶，得到必特螺旋霉素成品。
[0015]本發(fā)明中，用酯提取必特螺旋霉素發(fā)酵液得到含有必特螺旋霉素的酯提取液，含有必特螺旋霉素的酯提取液效價(jià)為7000-11000u/ml。
[0016]步驟(I)所述的三級(jí)逆流洗滌步驟中，三級(jí)逆流洗滌的溫度為15?25°C，優(yōu)選為20°C，洗滌相比為水相:酯相=1:1?1:2，優(yōu)選為1:1.5;
[0017]逆流洗滌所用磷酸鹽溶液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.7%-1%的NaH2PO4溶液；
[0018]含有必特螺旋霉素的洗后酯溶液效價(jià)為5000-9000u/ml。
[0019]步驟(2)所述的第一次反萃步驟中，反萃相比為水相:酯相=1:3.5-1:4.5，并調(diào)整水相pH至3.5-4.0，靜置分液，使含有必特螺旋霉素的一次水提液效價(jià)為20000-26000u/mlu/ml ；
[°02°]第一次反萃步驟中，所用磷酸鹽溶液為pH=2.0-2.3、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5-1.0%的NaH2PO4溶液。調(diào)節(jié)水相pH值采用磷酸溶液。
[0021]步驟(3)所述的酯萃取步驟中，用酯萃取前，調(diào)節(jié)含有必特螺旋霉素的一次水提液pH至6.8-7.0，酯萃取時(shí)萃取相比為水相:酯相=3:1-5:1，使?jié)饪s必特螺旋霉素的酯萃取液效價(jià)為 75000-98000u/ml。
[0022]步驟(3)所述的酯萃取步驟中，所用的酯為乙酸丁酯。
[0023]步驟(4)所述的第二次反萃步驟中，反萃相比為酯相:水相=1:3-1:5，并調(diào)節(jié)水相的pH至2.8-3.0，靜置分液，使含有必特螺旋霉素的二次水提液效價(jià)為13000u/ml-18000u/
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[0024]第二次反萃步驟中，所用磷酸鹽溶液為pH=2.0-2.3，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5-1.0 %的NaH2PO4溶液。調(diào)節(jié)水相pH值采用磷酸溶液。
[0025]步驟(5)所述的結(jié)晶步驟中，首先調(diào)節(jié)含有必特螺旋霉素的二次水提液的pH至4.5-5.5，得到必特螺旋霉素的結(jié)晶液，此處由于結(jié)晶液的嚴(yán)格pH控制，使得雜質(zhì)更多的留在母液中，提高結(jié)晶產(chǎn)品的純度，然后向必特螺旋霉素的結(jié)晶液中加入乙醇，滴加堿液結(jié)晶，得到必特螺旋霉素成品。
[0026]調(diào)節(jié)pH值可以選用0.8?1.2mo I/1的NaOH溶液，在調(diào)節(jié)pH值以后，優(yōu)選設(shè)置去除溶于其中微量酯的步驟，去除微量酯的方法可以采用向含有必特螺旋霉素的二次水提液中持續(xù)鼓入空氣的方法。
[0027]向結(jié)晶液中加入乙醇的量為結(jié)晶液質(zhì)量的6%_10%。
[0028]結(jié)晶過(guò)程中首先使用0.8?1.2(優(yōu)選為1.0)mol/l的堿液滴定結(jié)晶液至剛出現(xiàn)沉淀，然后改用濃度為0.05?0.15(優(yōu)選為0.1 )mol/l的堿液繼續(xù)滴加結(jié)晶，控制結(jié)晶終點(diǎn)pH值為 7.5-8.0。
[0029]結(jié)晶完成后，進(jìn)行抽濾，干燥，得到必特螺旋霉素成品。
[0030]本發(fā)明工藝方法中，所述的酯優(yōu)選為乙酸丁酯。
[0031]本發(fā)明工藝方法，對(duì)含有必特螺旋霉素的料液進(jìn)行三級(jí)逆流洗滌，利用兩次水相萃取與一次酯相萃取，提取酯相中必特螺旋霉素至水相中，向水相中加入少量乙醇，利用低濃度氫氧化鈉進(jìn)行結(jié)晶。
[0032]本發(fā)明利用必特螺旋霉素在高pH值時(shí)溶于酯相，低pH值時(shí)溶于水相的特性，嚴(yán)格控制洗滌、萃取、結(jié)晶過(guò)程中的PH值等一系列關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)，制備出異戊酰螺旋霉素III 230%、異戊酰螺旋霉素I+II+III > 60%、總?；菪顾? 80%、螺旋霉素< 1.0%、未知雜質(zhì)< 5.0 %的必特螺旋霉素合格品。
[0033]本發(fā)明綜合三級(jí)逆流洗滌、溶媒萃取、結(jié)晶液中加入少量乙醇、低濃度NaOH結(jié)晶的工藝操作，并嚴(yán)格控制各步驟包括PH在內(nèi)的操作條件，可以得到總未知雜質(zhì)含量低而有效組分含量高的必特螺旋霉素合格品，目前還未見(jiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)及公開(kāi)專(zhuān)利報(bào)道。
[0034]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果:
[0035]I)本發(fā)明的工藝方法控制指標(biāo)明確，可控性強(qiáng)，是對(duì)工業(yè)上溶媒萃取法的改進(jìn)，可應(yīng)用于大批量生產(chǎn)必特螺旋霉素的過(guò)程中。
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