專利名稱：線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒。
背景技術(shù)：
天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶存在兩種同工酶，即線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和細(xì) 胞漿天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶。線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和細(xì)胞漿天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn) 移酶是1950被Hird和Rowsell發(fā)現(xiàn)并在1960年被Fleisher等用電泳確證的，實(shí)驗(yàn)表明 在堿性溶液中，線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶向陰極移動(dòng)，而細(xì)胞漿天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn) 移酶向陽極移動(dòng)。 線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和細(xì)胞漿天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶廣泛存在于人體 各種組織細(xì)胞中，以肝、心細(xì)胞含量最為豐富。其中線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶存在 于線粒體內(nèi)，而細(xì)胞漿天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶則存在于細(xì)胞漿內(nèi)，屬細(xì)胞內(nèi)同工酶。細(xì) 胞作為一個(gè)整體，其中的線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶含量占80%，而細(xì)胞漿天門冬氨 酸氨基轉(zhuǎn)移酶含量只占20 %。線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和細(xì)胞漿天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶這兩種同工酶都 是由兩條相同的多肽亞單位所組成，每個(gè)亞單位的相對(duì)分子量是46,000，整個(gè)酶的分子 量是92,000。這兩種同工酶在相應(yīng)的基因組成上有差異，在氨基酸組成和免疫特性上不 同。在細(xì)胞輕度損害時(shí)，主要是細(xì)胞漿內(nèi)的細(xì)胞漿天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶透過細(xì)胞膜釋 放入血，而線粒體內(nèi)的線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶有兩層線粒體膜的保護(hù)，不易釋放 入血。線粒體內(nèi)的線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶濃度一般比血清中的濃度高數(shù)千倍， 當(dāng)細(xì)胞炎癥、壞死等使細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p害時(shí)，線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶迅速釋放入血， 因此測定線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶作為判定肝臟、心臟的損害程度及預(yù)后的評(píng)價(jià)指 標(biāo)，對(duì)疾病的診斷、治療、療效及護(hù)理有重要價(jià)值。線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶與CK、CK-MB及ALT相比，CK、CK-MB及
ALT均為細(xì)胞質(zhì)酶，當(dāng)缺血、缺氧使細(xì)胞通透性改變時(shí)，即可釋放入血，其增高不完全 說明細(xì)胞壞死損傷，而此時(shí)線粒體中的線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶不釋放入血，故同 時(shí)測定細(xì)胞不同部位的酶可鑒別細(xì)胞損傷的程度。以線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶為細(xì) 胞壞死指示酶，對(duì)肝細(xì)胞壞死的診斷有重要應(yīng)用價(jià)值。如急性肝炎時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)的線粒 子體嚴(yán)重破壞，線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶升高。當(dāng)肝細(xì)胞不再繼續(xù)破壞時(shí)迅速下 降，表示預(yù)后較好；反之，說明肝細(xì)胞仍繼續(xù)壞死，疾病可能趨向慢性化。再如線粒體 天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶在乙醇性肝炎時(shí)明顯增高，說明該病為肝細(xì)胞壞死性損傷；線粒 體AST與總AST的比值有助于鑒別診斷酒精性肝炎與其他肝病。肝臟手術(shù)前測定血清線 粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，對(duì)手術(shù)的成功及預(yù)后有重要意義，對(duì)肝臟手術(shù)術(shù)前指征的 判定有重要應(yīng)用價(jià)值。以線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶為細(xì)胞壞死指示酶，對(duì)急性心肌梗死的診斷也 具有重要應(yīng)用價(jià)值。線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性峰與總CK、CK-MB或細(xì)胞漿天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的活性峰略相關(guān)，因此，可疑急性心肌梗死患者測定線粒體AST， 能提供這類患者通常測定的酶及同工酶所不能提供的新信息。在缺氧階段細(xì)胞膜通 透性 改變，CK酶和其他細(xì)胞漿酶就從細(xì)胞釋放了，即使此時(shí)尚無細(xì)胞壞死。這些酶釋放不 是細(xì)胞壞死的標(biāo)志。另一方面，CK和其他細(xì)胞漿酶反映心肌組織損害的面積，線粒體 AST的釋放更多地反映亞細(xì)胞壞死損傷的嚴(yán)重程度。心臟手術(shù)前測定血清線粒體天門冬 氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，對(duì)手術(shù)的成功及預(yù)后有重要意義，對(duì)心臟手術(shù)術(shù)前指征的判定有重要 應(yīng)用價(jià)值。目前，血清中線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的測定主要有電泳、層析法以及免 疫學(xué)方法包括酶免、放免，免疫抑制法等。電泳、層析法測定時(shí)費(fèi)時(shí)，難于自動(dòng)化測 定，不能用于臨床大規(guī)模標(biāo)本的應(yīng)用。由于上述方法學(xué)的缺陷導(dǎo)致線粒體天門冬氨酸氨 基轉(zhuǎn)移酶的測試長期不能在臨床上的到廣泛開展，因而肝臟和心臟等臟器損傷的嚴(yán)重程 度缺乏直接的指標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種不受細(xì)胞漿天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的干擾，結(jié)果準(zhǔn)確 的線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒，以彌補(bǔ)上述缺陷。本發(fā)明的所提供的線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒，含有試劑1和試 劑2，所述試劑1含有天門冬氨酸蛋白酶、α-酮戊二酸、L-天門冬氨酸、蘋果酸脫氫 酶、乳酸脫氫酶、防腐劑和PEG6000;所述試劑2含有NADH、防腐劑和EDTA · 2Na。所述試劑1中的天門冬氨酸蛋白酶、蘋果酸脫氫酶和乳酸脫氫酶的酶活力比 為(0.1-50) (0.1-50) (0.1-10)，α -酮戊二酸與蘋果酸脫氫酶的比為(0.5-60) g (0.1-50) KU； α-酮戊二酸、L-天門冬氨酸、防腐劑和PEG6000的質(zhì)量比為(0.5-6 0) (5-200) (0.2-10) (1-100)。所述試劑2中的NADH、 防腐劑和EDTA · 2Na的質(zhì)量比為 (0.5-10) (0.2-10) (1-50)。試劑1中所述α -酮戊二酸和試劑2中所述NADH的質(zhì)量比為 (0.5-60) (0.5-10)。所述防腐劑為PC300或NaN3。所述試劑1和2都為溶液，其溶劑也都為水。所述試劑1和所述試劑2還含有三羥甲基氨基甲烷和鹽酸。所述三羥甲基氨基甲烷的濃度為(1-25) g/L，所述鹽酸的濃度為(1-20)ml/L。所述天門冬氨酸蛋白酶的濃度為0.1KU/L-50KU/L。本發(fā)明的線粒天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒，不受高細(xì)胞漿天門冬氨酸氨 基轉(zhuǎn)移酶的干擾，結(jié)果準(zhǔn)確；可用全自動(dòng)生化分析儀，亦可手工或半自動(dòng)測定，適用于 大、中、小各層次醫(yī)院。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的測定使用本發(fā)明的線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒測定線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，該試劑盒包括試劑1和試劑2，并且試劑1和試劑2均為液體制劑，在測定 時(shí)試劑1和2結(jié)合使用。其中，試劑1的溶劑為水，其溶質(zhì)如表1所示表1.試劑1中的溶質(zhì)
三羥甲基氨基甲烷(Tris) lg/L HCllml/L
蘋果酸脫氫酶0.1KU/L
乳酸脫氫酶0.1KU/L
PC3000.2g/L
天門冬氨酸蛋白酶0.1KU/L
peg6oooijtl
α-酮戊二酸0.5g/L
L-天門冬氨酸5^/1試劑2的溶劑為水，溶質(zhì)如表2所示表2.試劑2中的溶質(zhì)
Trislg/L
HCllml/L~
NaN30.2g/L
NADH0.5g/L~
EDTA · 2Na lg/L待測樣品人的不溶血的血清或肝素抗凝血漿樣品7份，用免疫學(xué)方法測定7份 樣品的線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，結(jié)果如表3所示。表3.免疫學(xué)測定線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)果編號(hào)線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(U/L) 1 5^2 ~2 L3 ~3 6^2 ~4 15A ~5 2Λ ~6 58^5兩步法測定線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性的方法如下設(shè)置空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測定管，按照表4所示的反應(yīng)體系加入反應(yīng)物表4.測定線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)體系
加入物__空白管__測定管
蒸餾水__50ul__二_ 標(biāo)準(zhǔn)液__-__-_標(biāo)本_50ul
試劑 1__400ul400ul
_混勻，37°C恒溫180-300秒_
試劑 2IOOulIOOul延遲時(shí)間60秒，然后用生化分析儀比色測定，測定時(shí)間180秒，主波長
340nm,副波長405nm，以空白管調(diào)零，測定各管ΔΑ/min。按照如下公式計(jì)算線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的活性線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的活性(U/L)=八人(測定管-空白管)/1^11*3376測定后的結(jié)果如表5所示。表5.實(shí)施例1的線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒的測定結(jié)果
編號(hào) 八八(測定管-空白管)/1^11|線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(1；/0 " 0.00165A
權(quán)利要求
1.一種線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒，含有試劑1和試劑2，所述試劑1 含有天門冬氨酸蛋白酶、α-酮戊二酸、L-天門冬氨酸、蘋果酸脫氫酶、乳酸脫氫酶、 防腐劑和PEG6000 ；所述試劑2含有NADH、防腐劑和EDTA · 2Na。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒，其特征在 于所述試劑1中的天門冬氨酸蛋白酶、蘋果酸脫氫酶和乳酸脫氫酶的酶活力比為 (0.1-50) (0.1-50) (0.1-10)，α -酮戊二酸的質(zhì)量與蘋果酸脫氫酶的比為(0.5-60) g (0.1-50) KU； α-酮戊二酸、L-天門冬氨酸、防腐劑和PEG6000的質(zhì)量比為(0.5-6 0) (5-200) (0.2-10) (1-100)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒， 其特征在于所述試劑2中的NADH、防腐劑和EDTA · 2Na的質(zhì)量比為 (0.5-10) (0.2-10) (1-50)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒，其特征在于 所述α-酮戊二酸和NADH的質(zhì)量比為(0.5-60) (0.5-10)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒，其特征在于 所述防腐劑為PC300或NaN3。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒，其特征在于 所述試劑1和2都為溶液，其溶劑也都為水。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒，其特征在于 所述試劑1和試劑2進(jìn)一步包括三羥甲基氨基甲烷和鹽酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒，其特征在于 所述三羥甲基氨基甲烷的濃度為l_25g/L，所述鹽酸的濃度為l-20ml/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒，其特征在于 所述天門冬氨酸蛋白酶的濃度為0.1KU/L-50KU/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒，含有試劑1和試劑2，所述試劑1含有天門冬氨酸蛋白酶、α-酮戊二酸、L-天門冬氨酸、蘋果酸脫氫酶、乳酸脫氫酶、防腐劑和PEG6000。所述試劑1中的天門冬氨酸蛋白酶、蘋果酸脫氫酶和乳酸脫氫酶的酶活力比為(0.1-50)∶(0.1-50)∶(0.1-10)，α-酮戊二酸與蘋果酸脫氫酶的比為(0.5-60)g∶(0.1-50)KU；α-酮戊二酸、L-天門冬氨酸、防腐劑和PEG6000的質(zhì)量比為(0.5-60)∶(5-200)∶(0.2-10)∶(1-100)。所述試劑2中的NADH、防腐劑和EDTA·2Na的質(zhì)量比為(0.5-10)∶(0.2-10)∶(1-50)。本發(fā)明的線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒測定線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的活性，不受高細(xì)胞漿天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的干擾，結(jié)果準(zhǔn)確。
文檔編號(hào)C12Q1/52GK102010890SQ20091009243
公開日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2009年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月8日
發(fā)明者徐士峰, 楊玉軍 申請(qǐng)人:北京迪邁醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)有限公司