專利名稱：一種新的脫氨基神經(jīng)氨酸酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的脫氨基神經(jīng)氨酸酶(deaminoneuraminidase)。本發(fā)明特別涉及一種無唾液酸酶(sialidase)活性的脫氨基神經(jīng)氨酸酶。
背景技術(shù)：
脫氨基神經(jīng)氨酸(deaminoneuraminic acid)(3-脫氧-D-甘油-D-半乳糖-nonulosonic acid或者2-酮-3-脫氧-D-甘油-D-半乳糖-nononic acid，下文中稱做“KDN”)具有與唾液酸(sialic acid)相似的結(jié)構(gòu)，僅在唾液酸5位碳上所連接的N-?；涣u基取代。因此，迄今已發(fā)現(xiàn)KDN廣泛地存在于生物界，是復(fù)合多糖的一種組份，并具有多種多樣的存在形式，這點(diǎn)與唾液酸一致。另一方面，KDN具有與唾液酸不同的特性，例如，現(xiàn)已闡明含有KDN的復(fù)合多糖在受精過程中卵子和精子的相互作用中起著重要的作用。人們對(duì)于含有KDN的糖蛋白和糖脂結(jié)構(gòu)和功能的解析產(chǎn)生了極大的興趣。
另外，那些已知的可裂解含KDN復(fù)合多糖中KDN酮苷鍵(ketosidiclinkage)的酶(脫氨基神經(jīng)氨酸酶，deaminoneuraminidase，如果需要的話在下文中稱為KDNase)，其中包括存在于泥鰍肝臟中的KDN-唾液酸酶(Li，Y.-T.etal.Archives of Biochemistry and Biophysics Vol.310，No.1，pp.243-246(1994))。而本發(fā)明者曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)一種存在于某類組織中如虹鱒魚卵巢中、同時(shí)具有唾液酸酶活性和脫氨基神經(jīng)氨酸酶活性的酶(Angata，T.et al.，Glycobiology，Vol.4，pp.517-523(1994))。
然而，上述的任何一種酶并非特異地裂解KDN酮苷鍵。其中一些酶所具有的唾液酸酶活性與裂解KDN酮苷鍵的活性大小幾乎相同(例如前述的來自泥鰍中的酶)，而且其它一些酶具有的唾液酸酶活性強(qiáng)于裂解KDN酮苷鍵的活性(例如前述的來自虹鱒魚中的酶)。沒有發(fā)現(xiàn)特異性作用于KDN的酶已知來自泥鰍酶的最適pH值約為4.5。而本發(fā)明者所發(fā)現(xiàn)的來自虹鱒魚酶的最適pH值約為4.4。
已知，在pH6附近，來自泥鰍的酶的脫氨基神經(jīng)氨酸酶活性值為最適pH時(shí)脫氨基神經(jīng)氨酸酶活性的65％。另外，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)的來自虹鱒魚的酶在pH6.5附近無脫氨基神經(jīng)氨酸酶的活性。因此，在中性pH條件下，很難獲得脫氨基神經(jīng)氨酸酶的反應(yīng)。另外，上述的任何一種脫氨基神經(jīng)氨酸酶均來自動(dòng)物，所有已知的脫氨基神經(jīng)氨酸酶無一來自微生物。因此，可獲得的酶數(shù)量是有限的。
本發(fā)明說明人們希望有一種脫氨基神經(jīng)氨酸酶，如果有的話，具有高的活性，并且在中性pH范圍內(nèi)具有活性，這對(duì)于分析諸如脫氨基神經(jīng)氨酸的結(jié)構(gòu)和功能非常有用。如果能得到某種高活性的脫氨基神經(jīng)氨酸酶，就有希望通過該酶實(shí)現(xiàn)催化KDN酮苷鍵水解作用的逆反應(yīng)，從而生成諸如新的、含有脫氨基神經(jīng)氨酸的復(fù)合多糖或者糖類。
本發(fā)明已將上述的觀點(diǎn)考慮在內(nèi)，即目的是提供一種KDNase，該酶對(duì)于KDN的酮苷鍵具有很強(qiáng)的特異性，并且甚至在中性pH范圍內(nèi)具有高的KDNase活性，對(duì)任何一種N-?；窠?jīng)氨酸殘基均無作用，而非迄今已知的、具有一定KDNase活性的唾液酸酶。
為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明者努力地篩選出生產(chǎn)KDNase的微生物物種。作為結(jié)果，本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)一種屬于Sphingobacterium類(神經(jīng)鞘菌類)的細(xì)菌種屬可產(chǎn)生一種KDNase。本發(fā)明者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)該KDNase在中性pH范圍內(nèi)具有高的活性，并且不存在唾液酸酶活性。因此實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目標(biāo)。
在此，本發(fā)明的脫氨基神經(jīng)氨酸酶具有以下的酶學(xué)特征(1)作用該脫氨基神經(jīng)氨酸酶作用于含有脫氨基神經(jīng)氨酸的復(fù)合多糖或糖類，它水解由脫氨基神經(jīng)氨酸形成的酮苷鍵，以生成游離的脫氨基神經(jīng)氨酸和完全不含有脫氨基神經(jīng)氨酸的復(fù)合多糖或糖類，以及部分失去脫氨基神經(jīng)氨酸的復(fù)合多糖或糖類。
(2)底物的特異性該脫氨基神經(jīng)氨酸酶作用于含有脫氨基神經(jīng)氨酸的復(fù)合多糖或糖類，但不作用于含有N-乙酰神經(jīng)氨酸或N-乙二醇酰神經(jīng)氨酸(N-acetylneuraminic acid or N-glycolylneuraminic acid)的復(fù)合多糖或糖類中的由N-乙酰神經(jīng)氨酸或N-乙二醇酰神經(jīng)氨酸形成的酮苷鍵。
在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的脫氨基神經(jīng)氨酸酶還具有以下的理化性質(zhì)(I)最適反應(yīng)pH值該脫氨基神經(jīng)氨酸酶的最適反應(yīng)pH值在pH6左右；(II)穩(wěn)定的pH范圍在25℃下，該脫氨基神經(jīng)氨酸酶pH4至9的范圍內(nèi)穩(wěn)定；(III)最適反應(yīng)溫度該脫氨基神經(jīng)氨酸酶的最適反應(yīng)溫度在25℃左右；(IV)熱穩(wěn)定性在25℃下，該脫氨基神經(jīng)氨酸酶至少在48小時(shí)內(nèi)不會(huì)失活；(V)活性抑制和穩(wěn)定化該酶可被游離的脫氨基神經(jīng)氨酸抑制，而該酶在存在有小牛血清白蛋白時(shí)可被穩(wěn)定。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，由Sphingobacterium mOL12-4s產(chǎn)生的本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶具有上述的性質(zhì)。
另外，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)脫氨基神經(jīng)氨酸酶的方法，包括培養(yǎng)屬于Sphingobacterium類的并具有脫氨基神經(jīng)氨酸酶生產(chǎn)能力的細(xì)菌，以及從所獲得的培養(yǎng)物中收集具有上述性質(zhì)脫氨基神經(jīng)氨酸酶的步驟。還有，本發(fā)明提供具有脫氨基神經(jīng)氨酸酶生產(chǎn)能力的SphingobacteriummOL12-4s菌。
還有，本發(fā)明提供了一種方法，用于生產(chǎn)含有脫氨基神經(jīng)氨酸的糖類和/或復(fù)合多糖，包括使得具有上述性質(zhì)的脫氨基神經(jīng)氨酸酶與脫氨基神經(jīng)氨酸、糖和/或復(fù)合多糖共存的步驟。
如果需要的話，本發(fā)明的KDNase偶爾被稱為“本發(fā)明的酶”。術(shù)語(yǔ)“含有KDN的復(fù)合多糖或糖”(“complex carbohydrate orcarbohydrate containing KDN”)指的是KDN經(jīng)酮苷鍵與諸如糖蛋白和糖脂的復(fù)合多糖，或者與單糖、寡糖或聚糖的糖類連接。術(shù)語(yǔ)“含有唾液酸的復(fù)合多糖或糖(包括N-乙酰神經(jīng)氨酸或N-乙二醇酰神經(jīng)氨酸)”指的是唾液酸通過酮苷鍵與復(fù)合多糖或糖類連接。術(shù)語(yǔ)“唾液酸酶的活性”在此所指的是降解含有唾液酸的復(fù)合多糖或糖中、由唾液酸形成的酮苷鍵的活性，而該活性不包括已知的唾液酸酶所具有的KDNase活性。
下面，將對(duì)本發(fā)明加以詳細(xì)的說明。<1>本發(fā)明的KDNase(1)制備本發(fā)明酶的方法本發(fā)明的脫氨基神經(jīng)氨酸酶是一種新的、具有上述性質(zhì)的酶。本發(fā)明的脫氨基神經(jīng)氨酸酶可通過，例如，培養(yǎng)屬于Sphingobactcrium類的細(xì)菌而加以制備，并從所獲得的細(xì)菌培養(yǎng)物中可收集該酶。該細(xì)菌屬于Sphingobacterium類，例如Sphingobacterium multivorum，其中特別的例子是本發(fā)明中分離出的Sphingobacterium mOL12-4s菌。
特別是，可通過下面所述的方法收集所需純度的酶樣品。即，一種生產(chǎn)本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶的微生物被接種于合適的培養(yǎng)基內(nèi)，進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)過培養(yǎng)后的微生物細(xì)胞(或者是液體培養(yǎng)物的培養(yǎng)液)可通過諸如離心的方法從培養(yǎng)物中加以收集。然后可通過諸如超聲處理的方法裂解微生物細(xì)胞，以獲得細(xì)胞溶液。還可以通過諸如滲透休克(osmoticshock)的方法從微生物細(xì)胞中獲得所需的成份，具有酶活性的成份釋放到微生物細(xì)胞外。之后，細(xì)胞裂解液或是滲透休克處理法所得的成份被當(dāng)做初料，并以KDNase活性作為指標(biāo)，用于普通方法分離酶。
將可生產(chǎn)本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶的微生物，使用有氧培氧的方法，例如振搖培養(yǎng)，通氧和搖動(dòng)培養(yǎng)，在適合該微生物生長(zhǎng)的溫度下，培養(yǎng)幾個(gè)小時(shí)或幾天，所用的培養(yǎng)基包括，例如，碳源(包括諸如含有KDN的寡糖和葡萄糖)，它們可被微生物吸收，氮源(包括諸如酵母提取物、蛋白胨、肉汁提取物、谷物浸出物、豆粉和酪蛋白水解物(casaminoacids)；以及無機(jī)氮源，(如氯化銨、硫酸銨、尿素和硝酸銨)，和無機(jī)鹽類(例如，包括硫酸鹽、磷酸鹽和鈣、鎂、鉀和鈉的鹽酸鹽)。
在培養(yǎng)基中加入KDN或含有KDN酮苷鍵的物質(zhì)，如含KDN的寡糖醇后(如果需要的話，下文中稱為“KDN寡糖醇”)，KDNase被誘導(dǎo)，每個(gè)單位數(shù)量的微生物細(xì)胞內(nèi)酶的活性得以增加。因此，可以通過能夠產(chǎn)生該酶的微生物有效地生產(chǎn)本發(fā)明的酶。當(dāng)培養(yǎng)基中加入的是含KDN酮苷鍵的物質(zhì)如寡糖醇時(shí)，與加入KDN相比將可獲得更明顯的酶誘導(dǎo)作用。加入培養(yǎng)基的含KDN酮苷鍵的物質(zhì)如寡糖醇沒有必要一定是純品，例如，同樣允許使用經(jīng)初步純化制得的上述物質(zhì)。
從培養(yǎng)物中收集的微生物細(xì)胞可通過如超聲處理的方法加以裂解，或者通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄈ鐫B透休克的方法制備含有釋放酶的組份，從中可通過已知的純化酶的方法而需得所需純度酶的樣品，其中包括如使用鹽析法，如使用硫酸銨((NH4)2SO4)或硫酸鈉；透析法；超濾法；吸附色譜法；陰離子交換色譜法；陽(yáng)離子交換色譜法；疏水色譜法；凝膠過濾法和電泳法；以及使用，如連接有含KDN糖蛋白(KDN-gp)的瓊脂糖的親合層析法。
可通過將本發(fā)明的KDNase作用于如含有KDN的復(fù)合多糖或糖，通過水解由KDN形成的酮苷鍵、并定量測(cè)定釋放的KDN，從而測(cè)定該酶的活性。下面的方法是特別的例子，即將本發(fā)明的脫氨基神經(jīng)氨酸酶作用于4-methylumbelliferyl KDN(4-MU-KDN)，以測(cè)定經(jīng)酶催化水解酮苷鍵所釋放的4-甲基馓形酮的熒光。
另外，KDNase的活性也可使用含有KDN糖蛋白的底物加以測(cè)定，該糖蛋白來自虹鱒魚的卵巢液，加入本發(fā)明的脫氨基神經(jīng)氨酸酶進(jìn)行反應(yīng)，再加入cetylpyridinium chloride(CPC)以獲得反應(yīng)液，經(jīng)離心后獲得上清，并以硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid)的方法定量測(cè)定上清液中KDN的含量(Analytical Biochemistrv，Vol.205，pp.244-250(1992))。在CPC存在下，含有KDN的糖蛋白形成復(fù)合物，可被沉淀，而經(jīng)酶作用釋放的KDN不會(huì)被沉淀。因此，未反應(yīng)的含KDN的糖蛋白可通過離心的方法從反應(yīng)體系中除去。上述的方法將在后面的實(shí)施例中加以專門的說明。(2)本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶的理化性質(zhì)用KDNase代表的本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶由SphingobacteriummOLl2-4s菌產(chǎn)生，并具有以下的理化性質(zhì)。1)作用本發(fā)明的脫氨基神經(jīng)氨酸酶作用于含有KDN的復(fù)合多糖或糖，水解連接KDN與復(fù)合多糖或糖之間的酮苷鍵，生成游離的KDN和無KDN的復(fù)合多糖或糖，或者部分失去KDN的復(fù)合多糖或糖。已證明，本發(fā)明的脫氨基神經(jīng)氨酸酶亦作用于KDN與其它非復(fù)合多糖或糖的化合物間的酮苷鍵，例如4-methylumbelliferyl KDN的酮苷鍵。
做為本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶作用于KDN和乳糖混合液的結(jié)果之一，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)液中存在有含KDN的寡糖鏈。因此，這表明本發(fā)明的脫氨基神經(jīng)氨酸酶同樣催化上述水解反應(yīng)的逆反應(yīng)。使用這一逆反應(yīng)，可通過將本發(fā)明的脫氨基神經(jīng)氨酸酶、KDN和糖和/或多糖及其類似物的共同混合而有可能生成含有KDN的糖和/或多糖及其類似物。2)底物特異性本發(fā)明的脫氨基神經(jīng)氨酸酶作用于和裂解由脫氨基神經(jīng)氨酸(KDN)形成的酮苷鍵，但對(duì)N-乙酰神經(jīng)氨酸或N-乙二醇酰神經(jīng)氨酸形成的酮苷鍵無作用。
本發(fā)明的脫氨基神經(jīng)氨酸酶裂解存在于下列含有KDN的復(fù)合多糖或糖及其類似物中的所有KDN殘基。該酶作用于自然界中已知的任何一種含KDN的殘基，即α2→3，α2→6和α2→8酮苷鍵(a)含KDN的糖蛋白與大量糖鏈連接的粘蛋白(mucin)樣糖蛋白，糖鏈上含有3種類型的KDN鍵(KDNα2→3Gal，KDNα2→8KDN和KDNα2→6Gal NAc)；(b)通過將含KDN的糖蛋白與alkaliborohydride處理后獲得的KDN寡糖醇通式為(→8KDNα2→)n→8KDNα2→6[KDNα2→3Galβ1→3GalNAcα1→3]GalNAc-01，其中n為2至9，平均數(shù)為5；(c)KDN二聚體，KDNα2→8KDN；(d)通過α2→3Gal連接的具有兩個(gè)KDN殘基的N-類型糖鏈KDNα2→3Galβ1→4GlcNAcβ1→2Manα1→6[KDNα2→3Galβ1→4GlcNAcβ1→2Manα1→3]Manβ1→4GlcNAcβ1→4GlcNAc；(e)含有KDN的神經(jīng)鞘糖脂(sphingoglycolipid)，含有KDN的神經(jīng)節(jié)苷脂(ganglioside)GM3KDNα2→3Galβ1→4Glcβ1→Cer；以及(f)4-methylumbelliferyl KDN。
另一方面，本發(fā)明的脫氨基神經(jīng)氨酸酶不催化水解在已知的含唾液酸(N-乙酰神經(jīng)氨酸和N-乙二醇酰神經(jīng)氨酸)的復(fù)合多糖或糖中由唾液酸形成的酮苷鍵(見后面的實(shí)施例2)。因此，本發(fā)明的脫氨基神經(jīng)氨酸酶對(duì)脫氨基神經(jīng)氨酸形成的酮苷鍵具有極高的特異性。3)最適反應(yīng)pH值在pH6附近，本發(fā)明的脫氨基神經(jīng)氨酸酶具有最高的反應(yīng)活性。
如后面的實(shí)施例2所述，將sphingobacteriummOL2-4s菌的細(xì)胞裂解液上清通過50-70％硫酸銨的沉淀作用所得到的初始組份，通過使用Sepharcyls-200(Pharmacia產(chǎn)品)色譜柱純化兩次，再經(jīng)過接有含KDN糖蛋白(KDN-gp)的瓊脂糖凝膠色譜柱(Affi-gel 15，Bio Rad產(chǎn)品)可獲得本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶經(jīng)親合純化的酶組份。圖8顯示了親合純化所得酶組份的酶活性與pH值之間的關(guān)系。如后面實(shí)施例2所述，經(jīng)純化所得酶樣品在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳上呈現(xiàn)出單一的條帶(如果需要的話，在后面稱該酶為“單一純化的酶”)，而該酶是將Sphingobacterium mOL2-4s菌的細(xì)胞裂解液上清經(jīng)過90％硫酸銨沉淀作用所得到的初始組份，通過連續(xù)使用CM-Toyopearl 650M(Toyo Soda產(chǎn)品)、DEAE-Toyopearl 650M(Toyo Soda產(chǎn)品)和CM-Toyopearl650M(Toyo Soda產(chǎn)品)色譜柱而純化所得。圖9顯示了使用單一純化酶的酶活性與pH值之間的關(guān)系。4)最適反應(yīng)溫度對(duì)于本發(fā)明的脫氨基神經(jīng)氨酸酶，在25℃至30℃之間可獲得高的酶反應(yīng)活性。5)穩(wěn)定性在25℃、pH4至9下放置數(shù)小時(shí)后，本發(fā)明的脫氨基神經(jīng)氨酸酶具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性。在25℃下，本發(fā)明的酶至少保持48小時(shí)不失活。然而，無論pH或離子強(qiáng)度如何，本發(fā)明的酶在數(shù)十個(gè)μg/ml或稍低的濃度下是不穩(wěn)的，但是，在存在其它蛋白如牛血清白蛋白時(shí)，可使本發(fā)明的脫氨基神經(jīng)氨酸酶穩(wěn)定。6)酶活性的抑制和活化本發(fā)明的脫氨基神經(jīng)氨酸酶的活性不受1mM鈣離子(Ca2+)、鎂離子(Mg2+)、錳離子(Mn2+)和EDTA(乙二胺四乙酸鈉，Sodiumethylenediaminetetraacetic acid)的影響。
當(dāng)離子強(qiáng)度增加時(shí)，本發(fā)明的脫氨基神經(jīng)氨酸酶的活性迅速增加。例如存在300mM NaCl時(shí)，酶的活性具有最高值，而在低離子強(qiáng)度50mM或更低時(shí)NaCl時(shí)，酶的活性極低。
本發(fā)明的脫氨基神經(jīng)氨酸酶的活性可被游離的KDN抑制(在3mMKDN濃度下)。與此相反，本發(fā)明的KDNase酶活性不被游離的唾液酸抑制，而唾液酸是脫氨基神經(jīng)氨酸(KDN)的結(jié)構(gòu)類似物，亦不被含有N-乙酰神經(jīng)氨酸或N-乙二醇酰神經(jīng)氨酸的復(fù)合多糖或糖抑制，它們不能成為該脫氨基神經(jīng)氨酸酶的底物。本發(fā)明的脫氨基神經(jīng)氨酸酶不被2，3-二羥基-2-脫氧-N-乙酰神經(jīng)氨酸所抑制，而該化合物是已知的、裂解N-酰基神經(jīng)氨酸所形成酮苷鍵的唾液酸酶的特異性抑制劑。
表面活性劑Triton X-100不抑制本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶的活性。該酶在0.5％膽酸鈉(Sodiumcholate)時(shí)活性完全消失，而在0.1％膽酸鈉時(shí)，90％的酶活性得以保持。因此，當(dāng)使用該酶作用于含KDN的糖脂如含KDN的ganglioside時(shí)，可以加入Triton X-100。7)分子量如后面的實(shí)施例2所述，對(duì)于親合純化所得的酶組份，本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶經(jīng)凝膠過濾法測(cè)定的分子量約為50,000(Sephacryl S-200柱，1.8cm×135cm；用20mM Tris-Hcl緩沖液(pH8.0)/0.5M NaCl洗脫)，或者經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定約為57,000；而該親合純化的酶組份是將Sphingobacterium mOL2-4s菌的細(xì)胞裂解液上清通過50-70％硫酸銨的沉淀作用所得到的初始組份，通過使用Sephacryl S-200(Pharmacia產(chǎn)品)色譜柱純化兩次，再經(jīng)過接有含KDN糖蛋白(KDN-gp)的瓊脂糖凝膠色譜柱(Affi-gel15，Bio Rad產(chǎn)品)而獲得的。
如后面的實(shí)施例2所述，對(duì)于單一純化的酶，本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶經(jīng)凝膠過濾法測(cè)得的分子量約為40,000(Sephacryl S-200柱，1.8cm×135cm；使用20mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)/0.2M NaCl)，或經(jīng)SDS聚丙烯酰胺法測(cè)得的分子量約為42,000；而該單一純化的酶是按照Nossal和Heppel的滲透休克法(J.Biol.Chem.，Vol.241，pp.3055至3062(1966)，而且把原方法的經(jīng)過1mM Mg(CH3COO)2處理10分鐘后通過離心獲得上清的操作作了修改，改成經(jīng)過1mM Mg(CH3COO)2處理10分鐘后，加入2倍體積的1M NaCl-1M Tris-HCl(pH7.1)，再離心以獲得上清)，將Sphingobacterium mOLl2-4s菌的微生物細(xì)胞滲出外周質(zhì)(periplasm，peripheral cytoplasm)制備液經(jīng)過90％硫酸銨沉淀作用所得到初始組份，通過連續(xù)使用CM-Toyopearl 650M(ToyoSoda產(chǎn)品)、DEAE-Toyopearl 650M(Toyo Soda產(chǎn)品)和CM-Toyopearl 650M(Toyo Soda產(chǎn)品)色譜柱而純化所得。8)(酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的)Michaelis常數(shù)以4-methylumbelliferyl KDN(4-MU-KDN)做為底物，本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶的Michaelis常數(shù)(Km)和最大酶反應(yīng)速度(Vm)如下。
Km19μMVmax0.19μM/min或7.4mM/min/mg蛋白9)氨基酸組成本發(fā)明的脫氨基神經(jīng)氨酸酶具有以下的氨基酸組成。數(shù)字以摩爾百分率(％)表示。
天門冬酰胺和天門冬氨酸 5.3谷氨酰胺和谷氨酸 5.5絲氨酸 13.6甘氨酸 19.8組氨酸 2.0精氨酸 2.0蘇氨酸 6.7丙氨酸 9.0脯氨酸 3.5酪氨酸 5.6纈氨酸 5.9甲硫氨酸 7.6異亮氨酸 3.5亮氨酸 4.9苯丙氨酸 3.2賴氨酸 2.0<2>本發(fā)明的Sphingobacterium mOL12-4s菌本發(fā)明的微生物，即Sphingobacterium mOL12-4s菌，最初取自魚塘的淤泥，經(jīng)過包括含脫氨基神經(jīng)氨酸(KDN)的寡糖醇做為唯一碳源的豐富培養(yǎng)基的培養(yǎng)而獲得，并經(jīng)過篩選，該細(xì)菌的細(xì)胞裂解液具有水解4-MU-KDN的活性。本發(fā)明微生物的特征在于能夠產(chǎn)生上述的、無唾液酸酶活性的KDNase。
使用與上述內(nèi)容相似的方法，將最初取自魚塘或類似地點(diǎn)的土壤或淤泥，經(jīng)過包括含KDN復(fù)合多糖或糖及其類似物做為唯一碳源的濃縮培養(yǎng)基的培養(yǎng)，亦可獲得本發(fā)明的微生物，并經(jīng)過是否具有KDNase活性作為指標(biāo)篩選。值得注意的是，按本發(fā)明所分離到的SphingobacteriummOL12-4s菌已于1994年5月24存入國(guó)際貿(mào)易和工業(yè)部(Ministryof International Trade and Industry)中工業(yè)科學(xué)和技術(shù)機(jī)構(gòu)(Agency ofIndustrial Science and Technology)的生命科學(xué)和人類技術(shù)國(guó)立研究所(National Institute of Bioscience and Human Technology)，貯藏編號(hào)為FERMP-14325，并于1995年5月26日依照布達(dá)佩斯條約(BudapestTreaty)轉(zhuǎn)入國(guó)際貯存庫(kù)，其貯存編號(hào)為FERM BP-5116。
在下面的實(shí)施例1中，將對(duì)本發(fā)明微生物所具有的微生物學(xué)性質(zhì)加以說明。按照該菌的性質(zhì)，經(jīng)過鑒定，本發(fā)明的微生物可能是屬于Sphingobacterium種屬細(xì)菌的一種，并且極可能是Sphingobacteriummultivorum菌。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示不同培養(yǎng)時(shí)間下對(duì)一定數(shù)量微生物細(xì)胞(1010個(gè))中KDNase活性的測(cè)定結(jié)果，該數(shù)據(jù)來自對(duì)Sphingobacterium mOL12-4s菌在加有0.1％粗提的KDN-OS(虹鱒魚的制備組份，富含KDN寡糖醇(KDNα2→3Galβ1→3GalNAcα1→3[KDNα2→(8KDNα2→)n→6]Ga1Nacol；其中n＝5))培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物。
圖2顯示本發(fā)明酶純化過程中使用第一級(jí)Sephacryl S-200凝膠過濾色譜的洗脫圖。實(shí)線代表酶的活性，虛線為表示蛋白含量的紫外吸收(A280)。
圖3顯示本發(fā)明酶純化過程中使用第二級(jí)Sephacryl S-200凝膠過濾色譜的洗脫圖。實(shí)線代表酶的活性，虛線為表示蛋白含量的紫外吸收(A280)。
圖4顯示本發(fā)明酶純化過程中使用第一級(jí)KDN-gp連接瓊脂糖的親合色譜的洗脫圖。實(shí)線代表酶的活性，虛線為表示蛋白含量的紫外吸收(A230)。
圖5顯示本發(fā)明酶純化過程中使用第二級(jí)KDN-gp連接瓊脂糖的親合色譜的洗脫圖。實(shí)線代表酶的活性，虛線為表示蛋白含量的紫外吸收(A220)。
圖6顯示本發(fā)明酶純化過程中使用第二級(jí)CM-Toyoperal 650M柱色譜的洗脫圖(單一純化的酶組份)。實(shí)線代表酶的活性，虛線代表洗脫時(shí)NaCl的濃度。
圖7顯示親合純化酶組份的10％丙烯酰胺電泳的結(jié)果。經(jīng)銀染后，使用光密度儀分析每個(gè)條帶的位置和染色強(qiáng)度(測(cè)定600nm的吸收)。
圖8顯示了pH-酶活性曲線，提示本發(fā)明酶經(jīng)親合純化酶組份的最適pH值。
圖9顯示了pH-酶活性曲線，提示本發(fā)明酶的單一純化酶樣品的最適pH值。
圖10顯示了離子強(qiáng)度-酶活性曲線，提示本發(fā)明酶的最適離子強(qiáng)度。離子強(qiáng)度用加入的NaCl濃度表示。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方案在下面做為參照的實(shí)施方案中，將對(duì)本發(fā)明做更明確的解釋。然而，實(shí)施方案只是對(duì)本發(fā)明的說明，并非對(duì)本發(fā)明的限制。在實(shí)施方案中，可按照下列的方法測(cè)定KDNase的活性。<測(cè)定酶活性的方法>(1)基于使用4-methylumbelliferyl KDN(4-MU-KDN法)的方法當(dāng)按照下列反應(yīng)式對(duì)4-methylumbelliferyl KDN(4-MU-KDN)的酮苷鍵進(jìn)行酶催化水解時(shí)，具有熒光的4-methylumbelliferone被釋放出來，因此可以測(cè)到熒光。
4-methylumbelliferyl KDN→KDN-4-甲基繖形酮特別是，將該酶溶解在20μl的0.1M Tris-乙酸緩沖液(pH6.0)/0.1M NaCl，并把1.4nmol的4-MU-KDN加入該酶溶液中，并在25℃下進(jìn)行反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)后，將1份體積的反應(yīng)液(20μl)與2.5ml的85mM甘氨酸-碳酸鹽緩沖液(pH9.3)混合，以測(cè)定熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)365nm，測(cè)定波長(zhǎng)450nm)。為測(cè)定熒光強(qiáng)度，請(qǐng)參照Biochemistry，Vol.18，No.13，pp.2783-2787。將按照上述方法、但不加酶進(jìn)行反應(yīng)后所測(cè)得的熒光強(qiáng)度作為對(duì)照。將25℃下，每分鐘水解1nmol4-MU-KDN的酶量定義為1個(gè)單位。
按照下述的Dr.Thomas G.Wamer建立的方法，制備本方法中所使用的4-MU-KDN。本法所用的4-MU-KDN由Dr.Thomas G.Warner惠贈(zèng)。
KDN是按照已知的方法[Auge，C.etal.，Tetrahedron，46，201-214(1990)]，使用Neu 5Ac醛縮酶(aldolase)將D-甘露糖和丙酮酸催化合成而來。將KDN干燥，然后混懸于10ml的乙酸酐和10ml的吡啶中，并繼續(xù)在室溫下反應(yīng)過夜。反應(yīng)液用冰冷卻。加入甲醇終止反應(yīng)，并去除溶劑。殘余物溶于甲醇，上Dowex 50(H+)柱(4×5cm)，用甲醇洗脫。除去溶劑后，往洗脫物中加入過量的溶于乙醚的重氮甲烷(diazomethane)以生成甲酯。完全乙酰化的甲酯，上硅酸柱(2.5×17cm)，并用溶于己烷的乙酸乙酯梯度洗脫，并獲得甲基-2，4，5，7，8，9-六-O-乙酰基KDN(甲基-2，4，5，7，8，9-六-O-乙?；鵎DN，K1)。然后，將K1轉(zhuǎn)入glycosyl Chloride，按照已知的方法[Wamer etal.，Biochemistry，18，2783-2787(1979)]，與4-methylumbelliferone鈉鹽(4MU)反應(yīng)，這樣K1和4-MU聚合形成4-甲基-2-氧代-2H-1-苯并吡喃-7-基4，5，7，8，9-五-O-乙酰KDN(K2)。
將K2(0.5g)加入4ml的甲醇，然后是4ml的0.5N NaOH，K2在其中混懸，并在37℃下維持1小時(shí)。再加入4ml的NaOH，并繼續(xù)在37℃維持90分鐘。然后，加入Dowex 50(H+)樹脂將pH值中和至pH6.0。將樹脂通過過濾而去除，并去除溶劑。往殘余物中加入少量的氨水(10mM)使pH到9，接著用Sephadex G-25凝膠濾過法，將4-MU-KDN純化至很高純度。
另外，4-MU-KDN也可按照Schreiner，E.和Zbiral，E.(1990)Liebigs Ann.chem.，581-586.所述的方法獲得。(2)氯化十六烷基吡啶鎓，CPC法將虹鱒魚卵巢液中取得的含KDN糖蛋白作為底物。按照與上述方法(1)相同的條件，進(jìn)行酶的反應(yīng)。然后，往反應(yīng)液中加入2ml的0.1％cetylpyridinium chlorde(CPC)。在CPC存在條件下，含KDN的糖蛋白會(huì)形成復(fù)合物進(jìn)而沉淀。然而，經(jīng)酶反應(yīng)所釋放的KDN不會(huì)沉淀。該反應(yīng)液放置30分鐘，然后離心(3,000rpm，10分鐘)以獲得上清。按照硫代巴比妥酸的方法，通過定量測(cè)定所得上清中KDN的含量而確定脫氨基神經(jīng)氨酸酶的活性(Analytical Biochemistry，Vol。205，pp.244-250(1992))。將25℃下，每分鐘水解1nmol的含KDN糖蛋白的酶量定義為1個(gè)單位。
實(shí)施例一Sphingobacterium mOL12-4s的獲取將從魚塘中獲得的淤泥接種于M9液體培養(yǎng)基中(在1升體積中含有6.0克的Na2HPO4，3.0克KH2PO4，1.0克的NH4Cl，0.5克的NaCl，1mM MgSO4和0.1mM CaCl2)，加入0.05％KDN寡糖醇(按照J(rèn).Biol.Chem.，265，21811-21819(1990)所述的方法制備)，在25℃下培養(yǎng)48小時(shí)，將所獲得的培養(yǎng)液劃線接種于含KDN寡糖醇的Mg瓊脂培養(yǎng)平皿上，并于25℃下培養(yǎng)48小時(shí)。由此獲得了可在KDN寡糖醇作為唯一碳源的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的66個(gè)微生物克隆。
將所形成克隆中相應(yīng)的微生物分別接種于含有0.05％KDN寡糖醇的M9液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并通過離心的方法收集微生物細(xì)胞。通過超聲處理的方法裂解收獲的微生物細(xì)胞。按照4-MU-KDN的方法測(cè)定KDNase的活性和唾液酸酶的活性。其中，對(duì)于那些具有KDNase活性而無唾液酸酶活性的細(xì)胞裂解液，其來源的微生物克隆被稱為mOL12菌株，并用于下面的篩選。
將mOL 12菌株的克隆劃線接種于含0.05％KDN寡糖醇的M9瓊脂培養(yǎng)基中，從中分離出4個(gè)菌株的克隆，并將它們分別命名為mOL12-1、mOL12-2、mOL12-3和mOL12-4。將克隆分別劃線接種于LB平皿培養(yǎng)基中以獲得單一的克隆，并將單個(gè)克隆接種于含0.05％KDN的寡糖醇液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。從中制備細(xì)胞裂解液，并按照4-MU-KDN法和氯化十六烷基吡啶鎓法分別測(cè)定KDNase的活性和唾液酸酶的活性。劃線接種在LB平皿培養(yǎng)基上而形成的mOL12-4菌株克隆按其大小可分為三種類型，即“大型的”、“中型的”和“小型的”。其中，在所形成的“大型的”克隆和“中型的”克隆菌株中未發(fā)現(xiàn)KDNase的活性。然而，在“小型的”克隆菌株中存在有KDNase活性而且無唾液酸酶活性。從只存在KDNase活性菌株挑選出一種菌株，并將其命名為mOL12-4s。
使用商購(gòu)的試劑盒(Biomeleu生產(chǎn)，API 20NE)對(duì)上述分離的mOL12-4s菌株進(jìn)行鑒定，該試劑盒用于確定腸道桿菌之外的革蘭氏陰性桿狀菌。測(cè)定所得的主要微生物特性如下形狀 桿狀革蘭氏染色 陰性芽胞形成 -活動(dòng)性 -對(duì)氧氣喜好 需氧菌吲哚產(chǎn)生 -葡萄糖發(fā)酵 -尿素降解 +七葉苷降解(esculin degradation)+同化作用葡萄糖 +L-阿拉伯糖 +D-甘露糖+D-甘露糖-麥芽糖 +過氧化氫酶 +過氧化物酶 +β-半乳糖苷酶 +按照上述的結(jié)果，mOL12-4s菌株被鑒定為屬于Sphingobacterium菌屬的一種細(xì)菌，并稱其為Sphingobacterium mOL12-4s菌株。這一菌株已于1994年5月24日存入國(guó)際貿(mào)易和工業(yè)部中工業(yè)科學(xué)和技術(shù)機(jī)構(gòu)的生命科學(xué)和人類技術(shù)國(guó)立研究所，儲(chǔ)存號(hào)為FERMP-14325，并于1995年5月26日依照布達(dá)佩斯條約(Budapest Treaty)轉(zhuǎn)入國(guó)際儲(chǔ)存庫(kù)，編號(hào)為FERMBP-5116。根據(jù)其微生物性質(zhì)，該菌株極可能是Sphingobacterium multivorum。
實(shí)施例2KDNase的制備配制800ml含有Miller′s Luria肉汁(LB，Bibco BRL生產(chǎn))的液體培養(yǎng)基，倒入2升的Erlenmeyer瓶，并高壓滅菌。將SphingobacteriummOL12-4s菌株接種于該培養(yǎng)基中，并在25℃下振搖培養(yǎng)48小時(shí)。<1>KDNase的提取和硫酸銨分離(1)通過對(duì)微生物細(xì)胞裂解而提取KDNase和硫酸銨的分離培養(yǎng)結(jié)束后，通過離心法(15,000xg，40分鐘)，從培養(yǎng)液中收集細(xì)胞細(xì)胞，收獲的細(xì)胞懸浮于冰冷的、含0.1M NaCl的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中，并再次通過離心清洗細(xì)胞。這一清洗操作重復(fù)三次。之后，將細(xì)胞細(xì)胞懸浮于1/2細(xì)胞體積的、0.1M NaCl-20mMTris-HCl緩沖液(pH8.0)中。通過超聲處理(50瓦，5分鐘)的方法裂解細(xì)菌細(xì)胞。
冷卻條件下，將細(xì)胞裂解液離心(17,000xg，40分鐘)以獲取上清。上清中加入硫酸銨至50％飽和度，然后于4℃放置1小時(shí)。將溶液于150,000xg離心1小時(shí)以去除沉淀。獲得的上清中加入硫酸銨至70％的飽和度，然后于4℃放置過夜。溶液再次于150,000xg離心1小時(shí)以獲得沉淀，將沉淀溶于10ml的0.5M NaCl-20mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中，往溶液中加入硫酸銨的飽和水溶液至43％的飽和度，然后于4℃放置1小時(shí)。將溶液于150,000xg離心1小時(shí)經(jīng)獲得上清，并在上清液中加入硫酸銨至85％飽和度，然后于4℃放置過夜。通過150,000xg離心1小時(shí)的方法將生成的沉淀回收，并將收得的沉淀溶于10.9ml的0.5M NaCl-20mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中。所收獲的這一組份稱為50-70％硫酸銨的沉淀組份。(2)滲透休克法提取KDNase的硫酸鹽析分離從細(xì)菌細(xì)胞中提取KDNase的另外一種方法是，通過對(duì)細(xì)菌細(xì)胞應(yīng)用滲透休克，使酶釋放至細(xì)胞外。所獲得的細(xì)胞外溶液被用于硫酸銨鹽析分離，經(jīng)純化KDNase。
按照上述相同方法培養(yǎng)的Sphingobacterium mOL12-4s菌株，通過離心(15,000xg，40分鐘)的方法收集和清洗細(xì)菌細(xì)胞。按照已知的方法[Nossal，N.G.and Heppel，L.A.(1996)J.Biol.Chem.241，3055-3062]對(duì)細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行滲透休克處理，使酶釋放至細(xì)胞外。即，以1克細(xì)菌細(xì)胞加至40ml體積的方法，將細(xì)菌細(xì)胞懸浮于含有20％蔗糖的20mMTris-HCl緩沖液(pH7.1)中，然后放置10分鐘。之后，通過離心(13,000xg，30分鐘)的方法將細(xì)胞沉淀。通過將細(xì)胞懸浮含有1mM氯化鎂的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.1)中，對(duì)細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行滲透休克，并放置10分鐘。
將細(xì)菌細(xì)胞的懸浮液重新離心(13,000xg，30分鐘)以去除細(xì)胞。獲得的上清液迅速加入硫酸銨至90％的飽和度，然后于4℃放置過夜。經(jīng)離心(15,000xg，30分鐘)收集生成的沉淀，將沉淀溶于50％飽和度的硫酸銨溶液，并用離心(15,000xg，30分鐘)的方法將不溶的懸浮物質(zhì)去除。所獲的上清液中加入硫酸銨至70％飽和度，然后于4℃放置過夜。通過對(duì)溶液再次離心(15,000xg，30分鐘)以獲得沉淀組份，并以50-70％的硫酸銨沉淀組份加以收集。(3)Sphingobacterium mOL12-4s菌株中KDNase的誘導(dǎo)(3-1)誘導(dǎo)劑的制備按照已知的方法(Kitajima，K.et al.，J.Biol.Chem.，269，21415-21419(1994))制備KDN和KDN寡糖醇(用KDN α 2→3Gal β1→3GalNAc α 1→3[KDN α 2→(8KDN α 2→)n→6]GalNacol，其中n＝5，如果需要后面將其稱作“KDN-OS”)?？扇缦轮苽涓缓琄DN-OS的組份(如果需要后面將其稱作“粗制KDN-OS”)。將虹鱒魚卵巢液(12.3升)濃縮和凍干，獲得110克的干粉。取凍干粉(50克)，用1.0升的氯仿/甲醇(2∶1，v/v)在室溫下萃取2小時(shí)(見Yu，s.etal.，Biochemistry，32，9221-9229(1993))。將去除脂肪后的殘余物空氣中晾，稱重量為39克。將去脂的卵巢液粉末(10克)懸浮于100ml的1M NaBH4/0.1M NaOH中，并在37℃下攪拌溫育。溫育24小時(shí)后，加入50ml的同樣溶液(1M NaOH4/0.1M NaOH)，然后再溫育24小時(shí)。反應(yīng)地9,000xg下離心20分鐘，然后加入冰醋酸中和pH至6.0左右。之后，使用Sephadex G-25(Pharmacia生產(chǎn))色譜(2.0×150cm，用水洗脫)將上清液脫鹽。脫鹽后的組份富含KDN-OS，并稱為粗制KDN-OS。按照TBA法(Kitajima，K.et al.，Anal.Biochem，205，244-250)定量測(cè)定KDN。(3-2)誘導(dǎo)酶的實(shí)驗(yàn)將Sphingobacterium mOL 12-4s菌細(xì)胞(1×108個(gè))接種于40ml含有1％(w/v)酪蛋白水解物(Casamino acid，Gibco生產(chǎn))和1％(w/v)葡萄糖(Glc)的M9液體培養(yǎng)物基中，并于25℃下44培養(yǎng)物小時(shí)。收集處于生長(zhǎng)期的微生物細(xì)胞(細(xì)菌細(xì)胞)，并用M9液體液體培養(yǎng)物基洗滌兩次。將細(xì)菌細(xì)胞(6.1×1010個(gè)細(xì)胞)接種于2.0ml含有0.1％(w/v)粗制KDN-OS，KDN-OS，KDN，Neu5Ac，多聚乙酰神經(jīng)氨酸的酸性水解物(oligo-Neu5Ac；Kitazume，S.etal.，Anal.Biochem.，202，25-34(1992))，或者Glc的M9液體培養(yǎng)物基，并且于25℃溫育24小時(shí)，以測(cè)定可生長(zhǎng)的細(xì)胞個(gè)數(shù)和KDNase活性。通過稀釋每個(gè)溫育后細(xì)胞培養(yǎng)物液，并將所得的每個(gè)稀釋好的溶液接種于LB瓊脂培養(yǎng)物平皿，并計(jì)數(shù)生長(zhǎng)的克隆數(shù)從而確定原培養(yǎng)物液中的細(xì)胞個(gè)數(shù)(Kitajima，Ket al.，j.Biol.Chem.，269，21415-21419)。為測(cè)定細(xì)胞中KNDase的活性，通過5,000rpm或1,500xg下離心10分鐘收集細(xì)胞。將收集到的細(xì)胞懸浮于0.5ml含有100mM Tris-乙酸緩沖液(pH6.0)中，并用超聲的方法裂解細(xì)胞(50瓦，1分鐘)。將裂解制備物于10,000rpm或6,000xg下離心10分鐘，進(jìn)而獲得可用于測(cè)定KDN活性的上清液。結(jié)果見表1。表1[]中的數(shù)值表示酶活性的比值，并將未加入(誘導(dǎo)劑)前的活性值作為1。
表1加入的物質(zhì)細(xì)胞數(shù)KDNase 一定細(xì)胞中KDNase活性活性 (百萬(wàn)單位/每1010個(gè)細(xì)胞)(百萬(wàn)單位)加入前 6.1×1010[1] 20[1]3.3[1]Glc 1.7×1012[1] 80[4]0.47
KDN-OS 1.5×1012[25] 7500[380]50[15]粗制KDN-OOS 5.7×1012[93] 2300040[12]KDN 3.6×1010
38[1.9] 11[3.3]Neu5Ac 2.5×1010
15
6.0[1.8]Oligo-Neu5Ac3.0×1010
12
4.0[1.2]在加入0.1％粗制KDN-OS后，測(cè)定了隨著培養(yǎng)的變化、一定數(shù)量(1010個(gè))細(xì)胞中KDNase的活性。結(jié)果見圖1。
作為結(jié)果，KDN，KDN-OS和粗制KDN-OS誘導(dǎo)了KDNase，然而，其它的單糖和寡糖對(duì)酶的誘導(dǎo)沒有作用。游離的KDN同樣可誘導(dǎo)KDNase，但是未見與KDN-OS和粗制KDN-OD等強(qiáng)的誘導(dǎo)作用。據(jù)此，我們建議優(yōu)選含有KDN形成酮苷鍵的物質(zhì)作為誘導(dǎo)劑。
圖1表明，當(dāng)把增殖的細(xì)菌細(xì)胞(6.0×1010個(gè))接種于含有0.1％KDN-OS的M9培養(yǎng)基中，在溫育24小時(shí)至43小時(shí)后，每個(gè)細(xì)胞中的KDNase活性與培養(yǎng)開始時(shí)的活性相比增加到一個(gè)非常高的水平。<2>KDNase的純化將全部的、按照前文(1)中所得到的5-70％硫酸銨沉淀組份用于Sephacryl S-200(Phamacia生產(chǎn))柱(1.8×135cm)，并用含0.5M NaCl的20mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)洗脫。因此通過凝膠過濾進(jìn)行了組份分離(圖2)。按照4-MU-KDN法測(cè)定了每個(gè)洗脫組份的KDNase活性。收集有活性的組份，并加入硫酸銨至90％飽和度，然后放置物過夜。將該溶液于150,000xg離心1小時(shí)，得到的沉淀溶于4.7ml的20mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)/0.5M NaCl并按照上述使用Sephacryl S-200柱相同的方法再次進(jìn)行凝膠過濾，以收集KDNase的活性組合物(圖3)。
將收集到的KDNase活性組份中加入硫酸銨至90％飽和度，然后放置過夜。將該溶液于150,000xg離心1小時(shí)，得到的沉淀溶于4.8ml的20mM Tris-乙酸緩沖液(pH6.0)/0.05M NaCl。該溶液用于填充了連接有含KDN糖蛋白(KDN-gp)的瓊脂糖凝膠(Affe-gel 15，Bio Rad生產(chǎn))柱(2.0×15cm)，并連續(xù)使用90ml 20mM Tris-乙酸緩沖液(pH6.0)/0.05M NaCl和135ml 20mM Tris-乙酸緩沖液(pH6.0)/0.5MNaCl洗脫(圖4)。有一部分的活性組份未被吸附，是由于樣品負(fù)載超過了柱子的吸附能力。在前面所得到的凝膠柱上，將活性組份中未被洗脫的部分再次上柱和吸附，然后用20mM Tris-乙酸緩沖液(pH6.0)/0.5M NaCl洗脫(圖5)。因此收集到了所有吸附于連接有KDN-gp瓊脂糖凝膠的、可被高離子強(qiáng)度洗脫的酶組份(15ml)。使用超濾(Centriflow CF25，Amicon生產(chǎn))的方法將所收集到的酶組份濃縮至最多為2ml，并稱為親合純化的酶組份。
測(cè)定了每一純化步驟中所獲酶組份的酶活性、蛋白含量、產(chǎn)率和純度。按照4-MU-KDN法測(cè)定了KDNase的活性，其中25℃下、每分鐘每產(chǎn)生1nmol 4MU的酶量被定義為1個(gè)單位，按照修改了的Lowry法定量測(cè)定蛋白的的含量(BCA試劑，Pierce，U.S.A)，其中使用牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定230nm的吸收，結(jié)果見表2。
表2組份 活性 蛋白 比活 產(chǎn)率純化度(單位) (mg) (單位/mg)(％)(倍數(shù))細(xì)胞裂解液 153 2070.737 100 1.050-70％ 113 1031.11 74.2 1.5(NH4)2SO4組份第一級(jí) 76.1 57.3 1.33 49.8 1.8SephacrylS-200第二級(jí) 57.4 26.6 2.16 37.6 2.9SephacrylS-200KDN-gp 52.2 0.410 12734.2 173瓊脂糖吸附組份將親合純化的酶組份進(jìn)行10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后使用銀染試劑盒(Wako Pure Chemical生產(chǎn))對(duì)凝膠進(jìn)行染色，使用光密度掃描儀(測(cè)定600nm的吸收)對(duì)所染的5或6個(gè)條帶的位置和光密度進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見圖7。
使用Sephacryl S-200凝膠過濾柱對(duì)上述酶組份作進(jìn)一步的分離，并在Kav 0.3-0.4時(shí)洗脫獲得7個(gè)具有KDNase活性的組份，并且對(duì)于這7個(gè)組份的KDNase活性與其在SDS聚丙烯凝膠電泳上所測(cè)得的帶行為間的關(guān)系作了細(xì)致的研究。作為結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了對(duì)應(yīng)單-組份的一個(gè)條帶，該條帶所顯示的類型與其活性值相符，因此判斷它是KDNase的條帶。與分子量標(biāo)記物(Seikagaku公司產(chǎn)品)比較，該條帶的表觀分子量計(jì)算為57,000。另外，通過凝膠濾過色譜法所得到的活性組分，經(jīng)過與分子量標(biāo)記物(Seikagaku公司產(chǎn)品)比較，算出的分子量為50,000，這與SDS-PAGE所得的結(jié)果基本一致。圖7顯示了親合純化酶組份SDS-PAGE的類型，其中所示的條帶位置被認(rèn)為是KDNase。
通過上述的純化步驟無法將KDNase完全純化。然而，粗制的酶溶液，如細(xì)胞裂解液，以及親合純化的酶組份都可以用作具有無唾液酸酶活性的KDNase。如果需要的話，可按照普通酶純化的方法對(duì)該酶作進(jìn)一步的純化。在那些純化過程中，KDNase的活性和估計(jì)出的分子量可作為指標(biāo)。
本發(fā)明者使用下列的方法將KDNase成功地純化至SDS-PAGE上的均一水平，在適度攪拌的同時(shí)，向滲透休克法獲得的細(xì)胞裂解液上清中一點(diǎn)點(diǎn)地加入硫酸銨至90％的飽和度，然后于4℃放置過夜。通過在17,000xg下離心30分鐘的方法回收沉淀。將回收的沉淀溶于10ml的0.1MNaCl-100mM Tris-乙酸緩沖液(pH6.0)中，并用0.1M NaCl-0.25M蔗糖-20mM Tris-乙酸緩沖液(pH6.0)進(jìn)行透析。透析后，溶液上CM-Toyopearl 650M柱(2.2×11cm，42ml；Toyo Soda生產(chǎn))，該柱已用相同透析緩沖液(0.1M NaCl-0.25M蔗糖-20mM Tris-乙酸緩沖液(pH6.0))平衡，柱子先用60ml相同的緩沖液(0.1M NaCl-0.25M蔗糖-20mM Tris-乙酸緩沖液(pH6.0))洗脫，然后用400ml含線性濃度梯度NaCl(0.1M至0.6M)的0.25M蔗糖-20mM Tris-乙酸緩沖液(pH6.0)洗脫。將通過的組份(pass-through fractions)合并成一個(gè)溶液，用超濾(YM10，Amicon生產(chǎn))的方法濃縮至15ml。濃縮的溶液用于DEAE-Toyopearl 650M柱(2.2×11cm，42ml；ToyoSoda生產(chǎn))，柱子用0.1M NaCl-0.25M蔗糖-20mM Tris-緩沖液(pH8.0)平衡，然后先用相同的平衡緩沖液(0.1M NaCl-0.25M蔗糖-20mM Tris-緩沖液(pH8.0))60ml洗脫，再用60ml的0.5M NaCl-0.25M蔗糖-20mM Tris-緩沖液(pH8.0)洗脫。未被柱子吸附的組份匯集得到匯集溶液，并用超濾的方法濃縮至13ml。濃縮液上CM-Toyopearl 650M柱，柱子用0.1M NaCl-0.25M蔗糖-20mM Tris-緩沖液(pH8.0)平衡，柱子先用0.1M NaCl-0.25M蔗糖-20mM Tris-緩沖液(pH8.0)洗脫。然后用含線性濃度梯度NaCl(0.1M至0.6M)的0.25M蔗糖-20mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)洗脫，以收集具有KDNase活性的組份(0.17至0.2M NaCl附近)。將收集到的組份合并后上SDS-PAGE電泳，作為結(jié)果，可確定有單一的條帶。
按照上述方法獲得的單一純化的酶，在SDS-PAGE電泳上與分子標(biāo)志比較，其表觀分子量計(jì)算約為42,000。通過凝膠濾過色譜法(Sephacryl S-200柱，1.8cm×135cm；用20mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)/0.2M NaCl洗脫)評(píng)估分子量，與分子量標(biāo)志比較，計(jì)算值約為40,000左右<3>本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶的性質(zhì)使用前述方法所獲得的親合純化酶組份，研究了本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸的性質(zhì)。(1)底物特異性研究了本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶對(duì)于不同的含KDN復(fù)合多糖和糖類，以及含唾液酸復(fù)合多糖和糖類的反應(yīng)活性。
其中所使用的含KDN復(fù)合多糖和糖類，以及含唾液復(fù)合多糖和糖類的獲取方法和來源如下KDN二聚體，N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)二聚體，N-乙二醇酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc)二聚體Anal.Biochem.，202，25-34(1992)。
含KDN的雙鏈N-型糖鏈Biochemistry，33，6495-6502(1994)。
KDN寡糖醇含KDN糖蛋白J.Biol.Chem.，265，21811-21819(1990)。
含KDN神經(jīng)節(jié)苷脂(ganglioside)GM3J.Biol.Chem.，266，21929-21935(1991)。
4-Methylumbelliferyl Neu5Ac，多聚乙酰神經(jīng)氨酸購(gòu)自NakaraiChemical。
N-乙酰神經(jīng)氨酸乳糖，人轉(zhuǎn)鐵蛋白(Huamn transferrin)，胎牛血清胎球蛋白購(gòu)自Sigma。
含Neu5Ac的雙鏈N-型糖鏈J.Biol.Chem.，264，18520-18526(1989)。
豬頜下腺粘蛋白Arch.Biochem.Biophys.，129，49-56(1969)。
湖鱒魚多糖蛋白，虹鱒魚多糖蛋白，arctic char多糖蛋白J.Biol.Chem.，268，23675-23684(1993)。
含Neu5Ac神經(jīng)節(jié)苷脂GM3、Neu5Ac神經(jīng)節(jié)苷脂GM1Biochem.J.，441，488-497(1976)。
Neu5Ac α 2→6(Gal β 1→3)GalNAcol，蟾蜍卵巢狀糖蛋白Enr.J.Biochem.，223，223-231(1994)。
在10μl含0.1N NaCl的0.1M Tris-乙酸緩沖液(pH6.0)中，將相當(dāng)于5μg KDN或N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)或N-乙二醇酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc)的、每個(gè)上述含KDN唾液酸的復(fù)合多糖或糖類，與本發(fā)明的脫氨酸神經(jīng)氨酸酶(80個(gè)百萬(wàn)單位)在25℃下共存20小時(shí)。
將反應(yīng)液點(diǎn)樣于硅膠薄層板上(Merck生產(chǎn))，用1-丙醇∶25％氨水∶水＝6∶1∶2.5(體積比)展開7個(gè)小時(shí)。展開后，將平板干燥，噴10％硫酸乙醇溶液。平板在120℃加熱，使展開的復(fù)合多糖或糖類、以及釋放的KDN、Neu5Ac或Neu5Gc變色。作為對(duì)照，進(jìn)行反應(yīng)時(shí)不加入酶。結(jié)果見表3。其中有KDN、Neu5Ac或Neu5Gcc釋放的表為“+”，而無KDN、Neu5Ac或Neu5Gcc釋放的表為“-”。
根據(jù)這一結(jié)果，表明本發(fā)明的脫氨基神經(jīng)氨酸酶不僅把4-MU-KDN作為合成的底物，而且作用于任何一種、自然存在并已知的、由KDN殘基形成的α2→3、α2→6、α2→8鍵形式的酮苷鍵。
對(duì)于表3所示的含有N-乙酰神經(jīng)氨酸或N-乙二醇酰神經(jīng)氨酸的各種復(fù)合多糖和糖類，本發(fā)明的脫氨基神經(jīng)氨酸酶不能水解由N-乙酰神經(jīng)氨酸或N-乙醇酰神經(jīng)氨酸形成的酮苷鍵、因此，本發(fā)明的脫氨基神經(jīng)氨酸酶對(duì)于脫氨基神經(jīng)氨酸具有高度的特異性。
表3復(fù)合 鍵 存在或無裂解4-MU-KDN+KDN二聚體 KDNα2→8KD +含KDN的雙鏈N-型糖鏈 KDNα2→3Gal+KDN寡糖醇 KDNα2→8KDN，KDNα2→3Gal +KDNα2→6GalNAcol含KDN糖蛋白 KDNα2→8KDN，KDNα2→3Gal +KDNα2→6GalNA含KDN的神經(jīng)節(jié)苷脂GM3KDNα2→3Gal+4MU-Neu5AcNeu5Ac二聚體Neu5Acα2→8Neu5Ac -Neu5Gc二聚體Neu5Gcα2→8Neu5Gc -Neu5Ac半乳糖Neu5Acα2→3(6)Gal -含Neu5Ac的雙鏈N-型糖鏈 Neu5Acα2→3Gal -Neu5Acα2→6(Galβ→3)GalNAcol Neu5Acα2→6GalNAcol-人轉(zhuǎn)鐵蛋白 Neu5Acα2→6Gal -胎牛血清胎球蛋白Neu5Acα2→3(6)Gal -豬頜下腺粘蛋白 Neu5Acα2→6GalNAc -蟾蜍卵巢膠狀糖蛋白 Neu5Acα2→6GalNAc -多聚乙酰神經(jīng)氨酸(→8Neu5Acα2→)n-湖鱒魚多糖蛋白 (→8Neu5Acα2→)n-虹鱒魚多糖蛋白 (→8Neu5Acα2→)n-arctic char多糖蛋白 (→8Neu5Acα2→，→8Neu5Gcα2→)n-含Neu5Ac的神經(jīng)節(jié)Neu5Acα2→3Gal -含NEu5Ac的神經(jīng)節(jié)苷脂GM1 Neu5Acα2→3(GalNAcβ1→4)Gal -(2)最適pH使用上述獲得的、本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶的親和純化酶組份和單一純化酶組份測(cè)定最適pH。除了使用0.1 M Tris-乙酸緩沖液作為緩沖液外，按照上述的4-MU-KDN法進(jìn)行酶反應(yīng)，在pH4.0至9.0范圍內(nèi)，在每個(gè)pH下進(jìn)行酶反應(yīng)，以測(cè)定每個(gè)pH條件下的酶活性。作為結(jié)果，圖8(親和純化酶組份)和圖9(單一純化酶組份)顯示，在pH6左右可獲得最高的反應(yīng)活性。(3)最適反應(yīng)溫度除了溫度變化外，按照上述的4-MU-KDN法測(cè)定本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶的活性。作為結(jié)果，本發(fā)明的脫氨基神經(jīng)氨酸酶在25℃至30℃左右具有較高的反應(yīng)活性。(4)穩(wěn)定性將本發(fā)明的脫氨基神經(jīng)氨酸酶在25℃和pH4至9條件下放置數(shù)小時(shí)。之后，按照4-MU-KDN法測(cè)定KDNase的活性。在這一pH范圍內(nèi)本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶是相對(duì)穩(wěn)定的。
將本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶溶于0.1 M Tris-乙酸緩沖液(pH6.0)/0.1 M NaCl至70μg/ml的濃度，在不同溫度下放置預(yù)定的一段時(shí)間。之后，按照4-MU-KDN法測(cè)定KDNase的活性。作為結(jié)果，在25℃下，本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶至少48小時(shí)內(nèi)不會(huì)失活。
無論pH或離子強(qiáng)度如何，本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶在數(shù)十個(gè)μg/ml或稍低的濃度下是不穩(wěn)定的。純化了的酶可在存在蛋白如牛血清白蛋白時(shí)被穩(wěn)定。(5)本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶的抑制和活化為了研究諸如離子強(qiáng)度的EDTA(乙二胺四乙酸)對(duì)本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶活性的影響，將這些化合物加入按照4-MU-KDN法進(jìn)行酶反應(yīng)的反應(yīng)溶液中。作為結(jié)果，在這些用于研究的加入物濃度為1mM時(shí)，酶活性不受任何一種二價(jià)陽(yáng)離子，即鈣離子(Ca2+)、鎂離子(Mg2+)、錳離子(Mn2+)，以及EDTA的影響。
研究了離子強(qiáng)度對(duì)本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶活性的影響。結(jié)果見圖10。當(dāng)離子強(qiáng)度增加時(shí)，本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶的活性迅速增加。在300mM NaCl時(shí)可得到最大的反應(yīng)值。而在低離子強(qiáng)度50mM或者更低時(shí)，酶的活性極低。
本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶可被游離的KDN(3mM)抑制，另外，本發(fā)明酶不被游離、作為KDN結(jié)構(gòu)類似物的唾液酸所抑制。本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶同樣不被含有N-乙酰神經(jīng)氨酸或N-乙二醇酰神經(jīng)氨酸的復(fù)合多糖和糖類所抑制，已證明它們不是本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶的底物。本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶不被2，3-二羥基-2-脫氧-N-乙酰神經(jīng)氨酸所抑制。而2，3-二羥基-2-脫氧-N-乙酰神經(jīng)氨酸是已知的、可裂解N-?；窠?jīng)氨酸所形成酮苷鍵的唾液酸酶的特異性抑制劑。
本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶不被作為表面活性劑的Triton X-100所抑制。存在有0.5％膽酸鈉時(shí)，本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶的活性基本消失，而在0.1％膽酸鈉時(shí)，約有90％的酶活性得以保持。(6)(酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的)Michaelis常數(shù)的測(cè)定在使用4-methylumbelliferyl KDN(4-MU-KDN)作為本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶底物的條件下，測(cè)定了Michaelis常數(shù)(Km)和最大酶反應(yīng)速度(Vmax)。在25℃下，將本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶(32個(gè)百萬(wàn)單位)和底物(4-MU-KDN，4.7μM)于216μl的反應(yīng)液(含有0.1mg/ml的牛血清白蛋白的0.1 Mtris-乙酸緩沖液(pH6.0)/0.1M NaCl)中反應(yīng)。作為結(jié)果，在1小時(shí)內(nèi)可線性釋放4-methylumbelliferyl(4-MU)。
在25℃，正這一酶濃度下，在與上述相同的反應(yīng)液中，4-MU-KDN的濃度改變?yōu)?1至167μM，反應(yīng)進(jìn)行30分鐘，以測(cè)定初反應(yīng)速度。得到Lineweaver-Burk曲線，并由此計(jì)算Michaelis常數(shù)。作為結(jié)果，本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶催化水解4-MU-KDN時(shí)的Vmax為0.19μM/min或者7.4mM/min/mg蛋白，Km為μM。(7)氨基酸分析使用6N鹽酸，在105℃下水解24小時(shí)，以研究純化了的KDNase(單一純化酶)的氨基酸組成。結(jié)果如下，數(shù)字以摩爾百分率％表示。
天門冬酰胺和天門冬氨酸5.3谷氨酸5.5絲氨酸13.6甘氨酸19.8組氨酸2.0
精氨酸2.0蘇氨酸6.7丙氨酸9.0脯氨酸3.5酪氨酸5.6纈氨酸5.9甲硫氨酸 7.6異亮氨酸 3.5亮氨酸4.0苯丙氨酸 3.2賴氨酸2.0實(shí)施例3合成含KDN的糖鏈將本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶(1個(gè)單位)加入40mM KDN和40mM乳糖的混和溶液(50μl)，然后在25℃下于0.1 M Tris-乙酸緩沖液(pH6.0)中放置。作為結(jié)果，確定30分鐘后在反應(yīng)溶液中存在有含KDN的乳糖工業(yè)可應(yīng)用性本發(fā)明的微生物可生產(chǎn)新的KDNase，該KDNase對(duì)于已知的、作為唾液酸酶作用點(diǎn)的N-?；窠?jīng)氨酸殘基無反應(yīng)活性。另外，該KDNase可作用于已知的唾液酸酶極難裂解的脫氨基神經(jīng)氨酸殘基，并且該KDNase可水解由脫氨基神經(jīng)氨酸殘基形成的酮苷鍵。
本發(fā)明的脫氨基神經(jīng)氨酸酶有希望作為研究上有用的試劑，例如對(duì)脫氨基神經(jīng)氨酸結(jié)構(gòu)和功能的分析。本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶對(duì)于KDN形成的酮苷鍵具有極高的特異性。因此，本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶有希望用于檢測(cè)KDN形成的酮苷鍵。
可使用本發(fā)明脫氨基神經(jīng)氨酸酶進(jìn)行水解反應(yīng)的逆反應(yīng)，以生成新的含脫氨基神經(jīng)氨酸的復(fù)合多糖或糖類。這些新的含脫氨基神經(jīng)氨酸的復(fù)合多糖或糖類可以作為類似物，從而有可能修飾含有N-乙酰神經(jīng)氨酸的復(fù)合多糖或糖類，或者有希望用作新的生理活性物質(zhì)。
權(quán)利要求
1.一種具有下列酶學(xué)性質(zhì)的脫氨基神經(jīng)氨酸酶(1)作用該脫氨基神經(jīng)氨酸酶作用于含有脫氨基神經(jīng)氨酸的復(fù)合多糖或糖類，并且水解由脫氨基神經(jīng)氨酸形成的酮苷鍵(ketosidic linkage)，以生成游離的脫氨基神經(jīng)氨酸和不含有脫氨基神經(jīng)氨酸的復(fù)合多糖或糖類，或者部分去除脫氨基神經(jīng)氨酸的復(fù)合多糖或糖類。(2)底物特異性該脫氨基神經(jīng)氨酸酶作用于含有脫氨基神經(jīng)氨酸的復(fù)合多糖或糖類，但不作用于含有N-乙酰神經(jīng)氨酸或N-乙二醇酰神經(jīng)氨酸復(fù)合或糖類中、由N-乙酰神經(jīng)氨酸或N-乙二醇酰神經(jīng)氨酸形成的酮苷鍵。
2.權(quán)利要求1的脫氨基神經(jīng)氨酸酶，該酶具有以下的理化性質(zhì)(i)最適反應(yīng)pH；該脫氨基神經(jīng)氨酸酶在pH6附近具有最適的反應(yīng)pH值；(ii)穩(wěn)定的pH范圍在25℃下，該脫氨基神經(jīng)氨酸酶在pH4至9范圍內(nèi)穩(wěn)定；(iii)最適反應(yīng)溫度在25℃左右，該脫氨基神經(jīng)氨酸酶具有最適的反應(yīng)溫度；(iv)熱穩(wěn)定性在25℃下，該脫氨基神經(jīng)氨酸酶至少48小時(shí)不會(huì)失活；(v)抑制和穩(wěn)定化作用該脫氨基神經(jīng)氨酸酶被游離的脫氨基神經(jīng)氨酸抑制，并且存在蛋白時(shí)，如牛血清蛋白，該脫氨基神經(jīng)氨酸酶可被穩(wěn)定。
3.權(quán)利要求1或2的脫氨基神經(jīng)氨酸酶，該酶由SphingobacteriummOL 12-4s菌株產(chǎn)生。
4.一種用于生產(chǎn)脫氨基神經(jīng)氨酸酶的方法，包括培養(yǎng)屬于Sphingobacterium菌屬并具有生產(chǎn)脫氨基神經(jīng)氨酸酶能力的細(xì)菌，以及從所得培養(yǎng)物中收集該酶的步驟，該脫氨基神經(jīng)氨酸酶由權(quán)利要求1所定義。
5.Sphingobacterium mOL 12-4s菌株具有生產(chǎn)脫氨基神經(jīng)氨酸酶的能力。
6.一種用于生產(chǎn)含有脫氨基神經(jīng)氨酸復(fù)合多糖或糖類的方法，包括權(quán)利要求1所定義的脫氨基神經(jīng)氨酸酶與脫氨基神經(jīng)氨酸和復(fù)合多糖和/或糖類進(jìn)行共反應(yīng)的步驟。
全文摘要
將屬于Sphingobacterium菌屬的一種菌、如Sphingobacterium mOL12-4S菌株，進(jìn)行培養(yǎng)后從得到的培養(yǎng)物中收集菌，一種作用于含有脫氨基神經(jīng)氨酸復(fù)合多糖或糖類的脫氨基神經(jīng)氨酸酶，該酶可水解由脫氨基神經(jīng)氨酸形成的酮苷鍵，以生成游離的脫氨基神經(jīng)氨酸和不含有脫氨基神經(jīng)氨酸的復(fù)合多糖或糖類，以及部分去除脫氨基神經(jīng)氨酸的復(fù)合多糖或糖類，該脫氨基神經(jīng)氨酸酶不作用于有關(guān)的、含有N-乙酰神經(jīng)氨酸或N-乙醇酰神經(jīng)氨酸復(fù)合多糖或糖類中、由N-乙酰神經(jīng)氨酸或N-乙醇酰神經(jīng)氨酸形成的酮苷鍵。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1156480SQ95194792
公開日1997年8月6日 申請(qǐng)日期1995年6月19日 優(yōu)先權(quán)日1994年6月28日
發(fā)明者井上康男, 井上貞子, 北島健 申請(qǐng)人:生化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社