本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及蛋白質(zhì)sinadp-me3及其編碼基因在調(diào)控植物抗逆性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：干旱已成為世界范圍內(nèi)農(nóng)作物產(chǎn)量進(jìn)一步提高和穩(wěn)定生長(zhǎng)的主要限制因素。谷子作為我國(guó)傳統(tǒng)的糧草兼用作物，具有耐貧瘠、水分利用效率高和光合作用效率高等優(yōu)良特性，在旱作農(nóng)業(yè)中占有重要地位。隨著水資源的日益匱乏，加強(qiáng)谷子耐旱種質(zhì)資源研究、挖掘新的抗旱基因、進(jìn)一步提高谷子耐旱性，對(duì)促進(jìn)谷子生產(chǎn)水平的提高和其他作物抗旱性的改良具有重要的戰(zhàn)略意義。nadp-me參與植物的防御和脅迫應(yīng)答。非光合型nadp-me涉及各種脅迫因素引起的防御反應(yīng)，例如物理?yè)p傷、病原體侵入和uv-b輻射等。在這些應(yīng)激下，nadp-me活性顯著增加，推測(cè)nadp-me在蘋(píng)果酸代謝過(guò)程中催化還原物質(zhì)nadph的產(chǎn)生，用于木質(zhì)素和其他物質(zhì)合成。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何提高植物抗逆性。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了sinadp-me3蛋白質(zhì)的新用途。本發(fā)明提供了sinadp-me3蛋白質(zhì)在調(diào)控植物抗逆性中的應(yīng)用；所述sinadp-me3蛋白質(zhì)為如下a)或b)或c)或d)的蛋白質(zhì)：a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白質(zhì)；b)在序列2所示的蛋白質(zhì)的n端和/或c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；c)將序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)；d)與序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白質(zhì)。為了使a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1、標(biāo)簽的序列上述c)中的蛋白質(zhì)，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述c)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述c)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過(guò)將序列1所示的dna序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。上述d)中，“同源性”包括與本發(fā)明的序列2所示的氨基酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的氨基酸序列。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了與sinadp-me3蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料的新用途。本發(fā)明提供了與sinadp-me3蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料在調(diào)控植物抗逆性中的應(yīng)用：所述生物材料為下述a1)至a12)中的任一種：a1)編碼sinadp-me3蛋白質(zhì)的核酸分子；a2)含有a1)所述核酸分子的表達(dá)盒；a3)含有a1)所述核酸分子的重組載體；a4)含有a2)所述表達(dá)盒的重組載體；a5)含有a1)所述核酸分子的重組微生物；a6)含有a2)所述表達(dá)盒的重組微生物；a7)含有a3)所述重組載體的重組微生物；a8)含有a4)所述重組載體的重組微生物；a9)含有a1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；a10)含有a2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；a11)含有a3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；a12)含有a4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。上述應(yīng)用中，a1)所述核酸分子為如下1)或2)或3)所示的基因：1)其編碼序列是序列1所示的cdna分子或基因組dna分子；2)與1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼sinadp-me3蛋白質(zhì)的cdna分子或基因組dna分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼sinadp-me3蛋白質(zhì)的cdna分子或基因組dna分子。上述應(yīng)用中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。上述應(yīng)用中，所述微生物可為酵母、細(xì)菌、藻或真菌，如農(nóng)桿菌。上述應(yīng)用中，所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系不包括繁殖材料。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了sinadp-me3蛋白質(zhì)或上述生物材料的新用途。本發(fā)明提供了sinadp-me3蛋白質(zhì)或上述生物材料在培育抗逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了sinadp-me3蛋白質(zhì)或上述生物材料在植物育種中的應(yīng)用。上述應(yīng)用中，所述抗逆性為抗旱性。上述應(yīng)用中，所述調(diào)控為提高，具體體現(xiàn)在：在充分澆水的條件下，轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥的根長(zhǎng)、葉片面積、莖伸長(zhǎng)率、生長(zhǎng)速率、花莖高度高于野生型擬南芥；在水分脅迫條件下，轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥水分散失率和細(xì)胞死亡率均低于野生型擬南芥；在干旱脅迫下，轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥的存活率和總生物量高于野生型擬南芥。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明最后提供了一種培育抗逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明提供的培育抗逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法包括提高受體植物中sinadp-me3蛋白質(zhì)的含量和/或活性，得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性高于所述受體植物。上述方法中，所述抗逆性為抗旱性。上述方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性高于所述受體植物體現(xiàn)在如下(1)-(9)中任一種：(1)轉(zhuǎn)基因植物的葉片面積高于受體植物；(2)轉(zhuǎn)基因植物的根長(zhǎng)長(zhǎng)于受體植物；(3)轉(zhuǎn)基因植物的莖伸長(zhǎng)率和/或生長(zhǎng)速率高于受體植物；(4)轉(zhuǎn)基因植物的花莖高度高于受體植物；(5)轉(zhuǎn)基因植物的抽薹時(shí)間早于受體植物；(6)轉(zhuǎn)基因植物的水分散失率低于受體植物；(7)轉(zhuǎn)基因植物的細(xì)胞死亡率低于受體植物；(8)轉(zhuǎn)基因植物的存活率高于受體植物；(9)轉(zhuǎn)基因植物的總生物量高于受體植物。上述方法中，所述提高受體植物中sinadp-me3蛋白質(zhì)的含量和/或活性的方法為在受體植物中過(guò)表達(dá)sinadp-me3蛋白質(zhì)；所述過(guò)表達(dá)的方法為將sinadp-me3蛋白質(zhì)的編碼基因?qū)胧荏w植物；所述sinadp-me3蛋白質(zhì)的編碼基因的核苷酸序列是序列1所示的dna分子。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述sinadp-me3蛋白質(zhì)的編碼基因通過(guò)含有sinadp-me3基因表達(dá)盒的sinadp-me3基因重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述受體植物中；所述含有sinadp-me3基因表達(dá)盒的sinadp-me3基因重組表達(dá)載體為超表達(dá)載體pcambia1304::35s::sinadp-me3；所述超表達(dá)載體pcambia1304::35s::sinadp-me3為將序列1所示的sinadp-me3基因的cds序列插入pcambia1304骨架載體的ncoi酶切位點(diǎn)中，且保持pcambia1304骨架載體其他序列不變得到的載體。上述方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述sinadp-me3基因轉(zhuǎn)化目的植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。上述應(yīng)用中，所述受體植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述雙子葉植物可為擬南芥，所述擬南芥可為野生型擬南芥(哥倫比亞型)。本發(fā)明在前期的研究中，利用谷子旱敏感材料an04與抗旱品種yugu1間的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析數(shù)據(jù)，結(jié)合谷子抗旱性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析，獲得了一個(gè)與抗旱性相關(guān)的候選基因sinadp-me3。本發(fā)明首先構(gòu)建了超表達(dá)載體pcambia1304::35s::sinadp-me3，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序侵染法將超表達(dá)載體pcambia1304::35s::sinadp-me3轉(zhuǎn)入野生型擬南芥，得到轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明：轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥相較于野生型具有萌發(fā)早、根長(zhǎng)長(zhǎng)、葉面積大和花莖高等特點(diǎn)；水分生理研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥具有更高水分利用效率；抗性實(shí)驗(yàn)則表明轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥具有更高的植物抗旱性。轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥在充分澆水及干旱脅迫下均表現(xiàn)出更高的生物量積累。證明sinadp-me3在植物干旱脅迫下維持產(chǎn)量發(fā)揮著重要的作用，在作物抗旱和水分高效利用方面具有重要的實(shí)踐意義，也為深入理解谷子耐旱性產(chǎn)生的機(jī)理提供了線索。附圖說(shuō)明圖1為超表達(dá)載體pcambia1304::35s::sinadp-me3的構(gòu)建。圖2為轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥的篩選。圖a為轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥的pcr檢測(cè)結(jié)果；圖b為轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥的qrt-pcr分析結(jié)果。圖3為轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥在正常水分供給下的表型分析。圖a為8日齡轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥、野生型擬南芥(wt)和轉(zhuǎn)空載體擬南芥(vc)的初生根長(zhǎng)度比較；圖b為18日齡轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥、野生型擬南芥(wt)和轉(zhuǎn)空載體擬南芥(vc)的幼苗葉面積比較；圖c為25-40日齡轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥、野生型擬南芥(wt)和轉(zhuǎn)空載體擬南芥(vc)的平均莖伸長(zhǎng)率比較；圖d為8日齡轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥、野生型擬南芥(wt)和轉(zhuǎn)空載體擬南芥(vc)的初生根長(zhǎng)度的形態(tài)學(xué)比較；圖e為18日齡轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥、野生型擬南芥(wt)和轉(zhuǎn)空載體擬南芥(vc)的幼苗蓮座葉的形態(tài)學(xué)比較；圖f為在充分澆水的條件下生長(zhǎng)的23日齡轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥、野生型擬南芥(wt)和轉(zhuǎn)空載體擬南芥(vc)幼苗的生長(zhǎng)形態(tài)。誤差條表示平均值±se(n＝30)；*表示在p≤0.05和**p≤0.01水平上的顯著差異。圖4為轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥的脫水耐旱性分析。圖a為3周齡的轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥、野生型擬南芥(wt)和轉(zhuǎn)空載體擬南芥(vc)葉片在脫水處理0h、1h和6h的表型圖；圖b為在脫水6h后野生型擬南芥(wt)和轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥的離體葉的臺(tái)盼藍(lán)染色圖；圖c為在脫水處理6h后轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥、野生型擬南芥(wt)和轉(zhuǎn)空載體擬南芥(vc)的離體植株失水率。圖5為轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥的干旱脅迫實(shí)驗(yàn)。圖a為在土壤中生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥、野生型擬南芥(wt)和轉(zhuǎn)空載體植株(vc)的耐旱表型；圖b為復(fù)水后轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥、野生型擬南芥(wt)和轉(zhuǎn)空載體植株(vc)的存活率；圖c為干旱處理后轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥、野生型擬南芥(wt)和轉(zhuǎn)空載體植株(vc)的總生物量。圖6為sinadp-me3基因的表達(dá)模式。圖a為孕穗期sinadp-me3基因qrt-pcr分析結(jié)果；圖b為抽穗期sinadp-me3基因qrt-pcr分析結(jié)果；圖c為孕穗期sinadp-me3基因rt-pcr分析結(jié)果；圖d為抽穗期sinadp-me3基因rt-pcr分析結(jié)果。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。下述實(shí)施例中的谷子品種豫谷1號(hào)(yugu1)在記載于文獻(xiàn)“胡咸廷.豫谷1號(hào)[j].新農(nóng)業(yè),1985,(05):25.”中，公眾可從申請(qǐng)人處獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。下述實(shí)施例中的pcambia1304骨架載體是普如汀生物技術(shù)(北京)有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為biovectorpcambia1304。下述實(shí)施例中的根癌農(nóng)桿菌gv3101是北京天恩澤生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為140384-10。實(shí)施例1、轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥的獲得及抗逆性分析一、轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥的獲得1、pcambia1304::35s::sinadp-me3超表達(dá)載體的構(gòu)建將序列1所示的sinadp-me3基因的cds序列插入pcambia1304骨架載體的ncoi酶切位點(diǎn)中，得到pcambia1304::35s::sinadp-me3超表達(dá)載體。pcambia1304::35s::sinadp-me3超表達(dá)載體表達(dá)sinadp-me3蛋白，sinadp-me3蛋白的氨基酸序列如序列2所示。2、重組菌的制備將pcambia1304::35s::sinadp-me3超表達(dá)載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌gv3101中，得到重組菌pcambia1304::35s::sinadp-me3/gv3101。將pcambia1304轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌根癌農(nóng)桿菌gv3101中，得到重組菌pcambia1304/gv3101。3、轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥的獲得及鑒定利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序侵染法用重組菌pcambia1304::35s::sinadp-me3/gv3101侵染野生型擬南芥(哥倫比亞型)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，收集轉(zhuǎn)基因t0代種子并播種于含有60mg/l潮霉素的1/2ms篩選培養(yǎng)基中，大約2周左右觀察發(fā)現(xiàn)多數(shù)種子不能萌發(fā)或發(fā)芽后葉片白化生長(zhǎng)受到抑制，只有極少數(shù)植株生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)良好，將健康株系轉(zhuǎn)移至營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，并利用pcr方法檢測(cè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。按株系收獲t1代轉(zhuǎn)基因種子，然后進(jìn)一步分株系進(jìn)行繁殖培養(yǎng)，直至獲取t3代轉(zhuǎn)基因植株種子。按照上述方法利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序侵染法用重組菌pcambia1304/gv3101侵染野生型擬南芥(哥倫比亞型)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)空載體擬南芥。pcr檢測(cè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株方法如下：提取轉(zhuǎn)基因植株的基因組dna，采用pc1304f：acgcacaatcccactat和pc1304ragagggtgaaggtgat引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增得到大小為1938bp的植株為陽(yáng)性轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥。部分陽(yáng)性轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥株系的pcr檢測(cè)結(jié)果如圖2a所示。從圖中可以看出：陽(yáng)性轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥株系#35、#40、#49均可以擴(kuò)增出目的條帶，而野生型擬南芥沒(méi)有擴(kuò)增出條帶。4、轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥的sinadp-me3表達(dá)量檢測(cè)為了檢測(cè)sinadp-me3在轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥株系中的遺傳穩(wěn)定性，提取t3代陽(yáng)性轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥rna，以反轉(zhuǎn)錄獲得的cdna模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光qrt-pcr檢測(cè)。同時(shí)以sinadp-me3基因在擬南芥中的同源基因atnadp-me3(at1g79750)為參照基因，actin為內(nèi)參基因分析過(guò)表達(dá)植株的表達(dá)量。引物序列如下：sinadp-me3-f：ctcaaggacaagggcaagatcc；sinadp-me3-r：ggccaatgtagaactcgtcgtt；atnadp-me-f：tttgatcatgtccggtgccatt；atnadp-me-r：agattcgatgccagtccgagtt。結(jié)果如圖2b所示。結(jié)果表明：在以actin為內(nèi)參基因和atnadp-me3為參照基因的對(duì)比下，sinadp-me3基因在陽(yáng)性轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥株系#35、#40、#49中均有較高的表達(dá)量，說(shuō)明sinadp-me3已成功整合到擬南芥染色體上并能遺傳到子代中。選取陽(yáng)性轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥株系#35、#40、#49用于下述抗逆性分析實(shí)驗(yàn)。二、轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥的抗逆性分析1、根長(zhǎng)、葉片面積及莖伸長(zhǎng)率檢測(cè)在充分澆水條件下，將陽(yáng)性轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥株系#35、#40、#49、轉(zhuǎn)空載體擬南芥(vc)和野生型擬南芥(wt)的種子同時(shí)播種于1/2ms培養(yǎng)基中。種子萌發(fā)后8d，比較陽(yáng)性轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥株系#35、#40、#49、轉(zhuǎn)空載體擬南芥、野生型擬南芥幼苗的初生根長(zhǎng)。然后分別將幼苗移入土中，比較萌發(fā)后18d的幼苗葉面積，擬南芥萌發(fā)生長(zhǎng)25天后，首次測(cè)量花莖高度，然后每隔3天測(cè)量同一植株的花莖高度，每個(gè)株系至少測(cè)量10株，重復(fù)3次。平均莖伸長(zhǎng)率＝(萌發(fā)n天后花莖高度－萌發(fā)(n-3)天后花莖高度)/3。結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明：在充分澆水的條件下，轉(zhuǎn)空載體擬南芥(vc)的生長(zhǎng)狀態(tài)和野生型擬南芥(wt)沒(méi)有顯著性差異(初生根長(zhǎng)、葉面積和莖伸長(zhǎng)率統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)經(jīng)t檢驗(yàn)后，p值大于0.1，無(wú)顯著性差異)。陽(yáng)性轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥株系#35、#40、#49在發(fā)芽期、幼苗生長(zhǎng)期、抽薹期和成熟期均都表現(xiàn)較明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。其中，陽(yáng)性轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥株系#35、#40、#49的根長(zhǎng)均比轉(zhuǎn)空載體擬南芥(vc)和野生型擬南芥(wt)長(zhǎng)(圖3a和圖3d)。將幼苗移入土中后，陽(yáng)性轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥株系#35、#40、#49均表現(xiàn)出較大的總?cè)~面積(圖3b和圖3e)，陽(yáng)性轉(zhuǎn)sinadp-me3植株的葉片面積是野生型擬南芥和轉(zhuǎn)空載體擬南芥的2-2.5倍。而且在擬南芥抽薹時(shí)間上，陽(yáng)性轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥在萌發(fā)22天后抽薹，野生型擬南芥萌發(fā)24天后抽薹，陽(yáng)性轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥要比野生型提前1-2天。在生長(zhǎng)前期(萌發(fā)后24-37d)陽(yáng)性轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥株系#35、#40、#49的平均莖伸長(zhǎng)率均高于野生型擬南芥和轉(zhuǎn)空載體擬南芥，均有較快的生長(zhǎng)速率(圖3c和圖3f)，在萌發(fā)后37d時(shí)，轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥的花莖高度為29.3-31.6cm，而野生型擬南芥的花莖高度為23.4-25.6cm。2、水分脅迫的耐受性檢測(cè)(1)脫水處理為了進(jìn)一步探究陽(yáng)性轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥株系對(duì)水分脅迫的耐受性，將發(fā)芽后生長(zhǎng)3周的野生型擬南芥、轉(zhuǎn)空載擬南芥以及陽(yáng)性轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥株系#35、#40、#49放置于干燥的濾紙上在干旱培養(yǎng)箱(溫度為25℃，濕度為30％，光照強(qiáng)度為150μmol·m-2·s-1，光照周期為16h光照/8h黑暗的)內(nèi)進(jìn)行脫水處理試驗(yàn)，分別在脫水處理1h、3h和6h后檢測(cè)植株的失水程度。結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明：隨著處理時(shí)間的增長(zhǎng)，野生型擬南芥和轉(zhuǎn)空載擬南芥葉片的萎蔫速度更快，而陽(yáng)性轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥株系#35、#40、#49水分散失較慢，保水性較強(qiáng)，當(dāng)脫水處理時(shí)間達(dá)到6h后，野生型擬南芥的葉片萎蔫更加嚴(yán)重(圖4a)。(2)臺(tái)盼藍(lán)染色對(duì)脫水處理6h后的植株葉片進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色。具體步驟如下：將脫水處理6h后的各株系植物進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色，鑒定細(xì)胞膜的破壞程度。臺(tái)盼藍(lán)染液配方：1ml的乳酚溶液加入2.5mg曲利苯藍(lán)，50ml乳酚溶液體系即25％乳酸、23％水溶苯酚、25％甘油，無(wú)菌水定容至50ml。將待檢測(cè)的株系分別放入臺(tái)盼藍(lán)染液中沸水浴10min，室溫染色12h后，2.5mg/ml的水合氯醛脫色3-4d，期間需要更換脫色液，脫色后觀察是否有藍(lán)斑，并照相留證。染色后的葉片可在50％的甘油中保存。結(jié)果表明：野生型擬南芥和轉(zhuǎn)空載體擬南芥的顏色均比陽(yáng)性轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥深，說(shuō)明野生型擬南芥和轉(zhuǎn)空載體擬南芥的細(xì)胞死亡率均高于陽(yáng)性轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥(圖4b)。(3)水分散失率由于陽(yáng)性轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥相較于同時(shí)期的野生型擬南芥有較強(qiáng)的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，采取面積失水率的計(jì)算方式排除葉片面積的大小對(duì)于失水率的影響計(jì)算水分散失率。具體步驟如下：將在正常條件下生長(zhǎng)3周的陽(yáng)性轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥、野生型擬南芥和轉(zhuǎn)空載擬南芥整株剪下后放在裝有干燥的濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)稱(chēng)重并拍照測(cè)量植株的表面積；將樣品連同培養(yǎng)皿一起放置在溫度為21-25℃，濕度為45-50％的培養(yǎng)箱內(nèi)，在指定的時(shí)間內(nèi)稱(chēng)重并拍照。植株的葉片面積失水率＝(植株鮮重－風(fēng)干后重量)/(風(fēng)干時(shí)間×葉片面積)。結(jié)果表明：陽(yáng)性轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥株系#35、#40、#49的水分散失率均低于野生型擬南芥和轉(zhuǎn)空載擬南芥(圖4c)。上述結(jié)果表明：陽(yáng)性轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥確實(shí)可以提高其耐旱能力。3、抗旱性檢測(cè)將在1/2ms培養(yǎng)基上正常條件下萌發(fā)生長(zhǎng)10d的野生型擬南芥、轉(zhuǎn)空載擬南芥以及陽(yáng)性轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥株系#35、#40、#49的幼苗移栽到營(yíng)養(yǎng)土中，恢復(fù)生長(zhǎng)2d。然后將幼苗移入溫度為25℃，濕度為30％，光照強(qiáng)度為150μmol·m-2·s-1，光照周期為16h光照/8h黑暗的干旱培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。干旱處理15d后，觀察植株的生長(zhǎng)狀態(tài)。復(fù)水8d后統(tǒng)計(jì)植株的存活率和生物量。生物量的計(jì)算方法為：取成熟后相同株數(shù)的植株烘干后稱(chēng)重，所得重量即為總生物量。結(jié)果表明：干旱處理15d后所有野生型擬南芥和轉(zhuǎn)空載體擬南芥葉片均出現(xiàn)嚴(yán)重的萎蔫和枯死，而陽(yáng)性轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥株系#35、#40、#49均只少數(shù)葉片出現(xiàn)干枯的現(xiàn)象(圖5a)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性轉(zhuǎn)sinadp-me3植株相較于野生型擬南芥和轉(zhuǎn)空載體擬南芥的生長(zhǎng)狀態(tài)有明顯的優(yōu)勢(shì)。所有植株復(fù)水處理8d后，陽(yáng)性轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥株系#35、#40、#49的存活率均顯著高于野生型植株(圖5b)，能夠很快恢復(fù)生長(zhǎng)，并能正常開(kāi)花結(jié)果，形成的總生物量更大(圖5c)。綜上所述，轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥相較于野生型擬南芥具有萌發(fā)早、根長(zhǎng)長(zhǎng)、葉面積大和花莖高等特點(diǎn)；水分生理研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明陽(yáng)性轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥具有更高水分利用效率；抗性實(shí)驗(yàn)則表明陽(yáng)性轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥具有更高的植物耐旱性。轉(zhuǎn)sinadp-me3擬南芥在充分澆水及干旱脅迫下均表現(xiàn)出更高的生物量積累。證明sinadp-me3在植物干旱脅迫下維持產(chǎn)量發(fā)揮著重要的作用。實(shí)施例2、sinadp-me3基因在谷子中的組織特異性表達(dá)為了驗(yàn)證sinadp-me3基因在谷子中的組織特異性表達(dá)特征，采用實(shí)時(shí)熒光qrt-pcr和半定量rt-pcr的方法分析yugu1在正常生長(zhǎng)條件下孕穗期以及抽穗期sinadp-me3基因的組織特異性表達(dá)。具體步驟如下：1、植物組織rna的提取用trizol(catno.15596-026，invitrogen，scotland，uk)法提取組織(根、莖、葉和穗)rna，然后用purelinkrnakit(catno.12183018，invitrogen，scotland，uk)進(jìn)行純化，去除雜質(zhì)及dna片段。具體步驟如下：(1)將研缽、研杵、剪刀和鑷子等提取rna專(zhuān)用工具至于托盤(pán)內(nèi)，淋上95％酒精火中煅燒約5min中，除去rnase，稍冷卻后浸入液氮中預(yù)冷。rna提取專(zhuān)用操作臺(tái)先用75％的酒精擦拭干凈后噴灑rnasezap除去rnase。整個(gè)rna提取操作過(guò)程中需穿潔凈實(shí)驗(yàn)服，戴手套和口罩，避免唾液和汗液中的rnase進(jìn)入樣品使rna被降解。(2)快速稱(chēng)取0.1-0.15g葉片或其他組織，放入盛有液氮的研缽中迅速冷凍，待其變脆后快速研磨1-2次，使材料破碎成粉狀，研磨充分。過(guò)程中需不斷補(bǔ)充液氮以保持低溫，降低rna的降解。(3)將研磨充分的材料轉(zhuǎn)移到已經(jīng)加入1mltrizol試劑的2mlrnase-free離心管中，充分振蕩后至于冰上，待所有樣品加入trizol后，渦旋振蕩15s，室溫靜置5min。(4)每1ml的trizol加200μl的氯仿，渦旋振蕩15s，室溫放置2-3min，4℃12000rpm條件下離心15min。(5)轉(zhuǎn)移上清液到新的1.5mlrnase-free的離心管中，加等體積70％酒精，充分混勻并使產(chǎn)生的沉淀溶解。(6)吸取700μl混勻的樣品加入purelinkrnaminikit試劑盒的柱子中，室溫12000rpm離心15s，重復(fù)3-4次，直至所有樣品過(guò)完柱子。(7)向過(guò)濾柱中加入700μlwbⅰ室溫12000rpm離心15s，清洗柱子，棄去濾液。(8)向過(guò)濾柱中加入500μlwbⅱ室溫12000rpm離心15s，清洗柱子，棄去濾液，重復(fù)操作一次，室溫12000rpm離心2min，使柱子干燥。(9)將過(guò)濾柱轉(zhuǎn)移至新的1.5mlrnase-free的離心管中，加入30-100μlrnase-freewater，室溫放置1min，溶解rna。(10)室溫12000rpm離心2min，收集rna。提取的rna可立即反轉(zhuǎn)成cdna，-20℃保存，也可直接放于-80℃保存。(11)取少量rna用nanodrop1000測(cè)定樣品的od260、od280、od320、od260/od280及其濃度進(jìn)行鑒定。只有rna樣品的od260/od280比值在1.9-2.1之間，od260/od230比值≥2.0，才能用于后續(xù)試驗(yàn)。(12)用1％瓊脂糖凝膠電泳，快速電泳檢測(cè)rna質(zhì)量。高質(zhì)量的rna應(yīng)具有28s和18s兩條明亮且清晰的帶，并且28s的亮度是18s的兩倍以上。2、rna反轉(zhuǎn)成cdna使用takaraprimerscriptⅱ1ststandcdnasynthesiskit(catno.6210a，takara，otsushiga，japan)反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將rna反轉(zhuǎn)成cdna。具體步驟如下：(1)在200μl的rnase-free離心管中加入下列試劑：oligodt(500μg/ml)1μl、dntpmixture1μl、總rna5μg、rnasefreedh2o至總體積為10μl。(2)離心管放置于pcr上，65℃反應(yīng)5min，然后于冰上迅速冷卻。(3)在上述離心管中加入以下反應(yīng)液：5×primescripttmbuffer4μl、rnaseinhibitor(40u/μl)0.5μl(20u)、primescripttmrtase(200u/μl)1μl(200u)、rnasefreedh2o4.5μl。(4)將離心管放置于pcr儀上，按照42℃反應(yīng)40min，70℃反應(yīng)15min，4℃停止反應(yīng)的程序反轉(zhuǎn)成cdna，將反轉(zhuǎn)成功的cdna稀釋10倍后放置于-20℃保存。3、通過(guò)qrt-pcr的方法檢測(cè)sinadp-me3基因表達(dá)量差異性(1)根據(jù)sinadp-me3基因的cds序列使用ncbi引物設(shè)計(jì)網(wǎng)頁(yè)設(shè)計(jì)引物，并用常規(guī)pcr的方法檢測(cè)引物的保守性，選擇擴(kuò)增片端單一的引物。引物序列如下：seita.3g109300：cgcatccttccatctgta和ccatctccgacgacatat；actin：tatgggtcatcaacagcttgtc和gtagtccctcgtgatgagatcc。(2)使用faststartuniversalsybrgreenmasterkit(catno.04913914001，roche，mannheim，germany)進(jìn)行qrt-pcr實(shí)驗(yàn)，將配置好體系加入標(biāo)準(zhǔn)96孔qrt-pcr板。(3)用appliedbiosystems7300analyzer(appliedbiosystems，fostercity，ca，usa)熒光定量pcr儀器運(yùn)行qrt-pcr程序。qrt-pcr每個(gè)樣品均進(jìn)行三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)。反應(yīng)體系如表1。表1、pcr反應(yīng)體系反應(yīng)液成分體積最終濃度f(wàn)aststartuniversalsybr25.0μl1×primers:f+r(30μm)各0.5μl300nmcdna(100ng/μl)5μl200ngddh2o19μl表2、pcr反應(yīng)程序程序名稱(chēng)溫度時(shí)間預(yù)變性95℃2min變性95℃1min退火60℃1min延伸72℃1min總延伸72℃7min4、通過(guò)rt-pcr的方法檢測(cè)sinadp-me3基因特異性表達(dá)使用上述設(shè)計(jì)的熒光引物，以yugu1品種抽穗期的根、莖、葉和穗的cdna為模板檢測(cè)sinadp-me3基因的特異性表達(dá)，首先用actin引物將各組織的模板亮度調(diào)成一致，記錄此時(shí)各組織模板的用量，然后再用sinadp-me3基因引物擴(kuò)增各組織模板。kodfx酶(codeno.kfx-101toyobojapan)反應(yīng)體系及程序如表3和表4所示。表3、pcr擴(kuò)增體系成分加入量dna模板nμl2×primegcbuffer12.5μlprimerf/r各0.75μl2mmdntp5μlkodfx酶0.5μlddh2oupto25μl表4、pcr反應(yīng)程序(注：循環(huán)數(shù)為30個(gè)循環(huán))結(jié)果如圖6所示。圖a和圖b分別為孕穗期和抽穗期的qrt-pcr檢測(cè)結(jié)果：由圖可看出在孕穗期，sinadp-me3基因在莖部具有較高的表達(dá)量；而在抽穗期，該基因在莖部中有較高的表達(dá)量；圖c和圖d分別為孕穗期和抽穗期的rt-pcr檢測(cè)結(jié)果：在孕穗期，sinadp-me3基因在莖部有較高的表達(dá)量，而在抽穗期，該基因在根部中有較高的表達(dá)量?？傮w來(lái)看，sinadp-me3基因在根和莖中都有較高的表達(dá)量。根系和莖是作為吸收和傳輸?shù)V質(zhì)元素水分等的主要組織，sinadp-me3基因大量表達(dá)可以調(diào)控其細(xì)胞的滲透勢(shì)、ph和離子吸收平衡等，在逆境脅迫時(shí)幫助植物體抵御逆境脅迫，提高植物抗逆性。序列表<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所<120>蛋白質(zhì)sinadp-me3及其編碼基因在調(diào)控植物抗逆性中的應(yīng)用<160>2<210>1<211>1731bp<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1atgtcgtcggagatggagatggctggcggcggcgtcgaggacgcgtacggcgaggaccgc60gccaccgaggagcatctcgtcacgccgtgggccttctccgtcgccagcggctacaccctg120ctccgcgacccgcggcacaacaagggcctggccttctcggaggcggagcgcaacgcgcac180tacctgcgcggcctgctcccgcccgcgctggcgtcgcaggagctccaggagaagaagatc240atgcacaacctgcgccagtacacggtgcccctgcagcgctacatcgccatgatggacctg300caggagcgcaacgagcgtctcttctacaagctcctcatcgacaacgtcgaggagctgctc360cccgtcgtctacacgcccaccgtcggcgaggcgtgccagaagtacggcagcatctacagg420cgcccgcaggggctctacatcagcctcaaggacaagggcaagatccttgaggtgctcaag480aactggccggagaggagcatccaggtcatcgtcgtcaccgacggcgagcgcatcctgggg540ctcggggacctgggctgccaggggatggggatccccgttggcaagctgtctctctacacc600gccctcggaggcgttcgcccatccgcttgcctgccgatcacaatcgatgttggcaccaac660aacgagaccttgctcaacgacgagttctacattggcctccgccaaagacgtgccaccggc720caggaataccacgagcttctcgaagagttcatgaccgccgtcaagcaaaactacggcgag780aaagtcctaacccagttcgaggactttgccaaccacaatgcttttgacttgcttgccaag840tacagcaagagccatctcgtgttcaacgacgatatccagggaacagcctcggtggtcctc900gcaggtctcttggcggcgctcaaggtggtcggtggcactcttgctgaccacacctacctg960ttccttggtgccggcgaggctggaactggtattgctgacctcattgctcttgagatgtca1020aaacattcggagactccgatcgacgattgccgcaagaagatctggcttgtggactccaag1080ggcctgatcgtggagtcgcgcaaggagtcgctgcagcacttcaagcagccgtgggcgcac1140gatcacgagcccctcaagaccctgctggaggccgtggagtccatcaagccgacggtgctg1200atcggcacctccggcgtgggccgcaccttcaccaaggaggtggtggaggccatggcgtcc1260ttcaacgagaggcccgtcatcttcgcgctgtccaacccgacgtcgcactcggagtgcacg1320gcggaggaggcttacacctggtcccagggccgcgccgtgttcgccagcggcagccccttc1380gacgccgtcgagcacgaaggcaaggtgtacgtgccggggcagtccaacaacgcctacata1440ttccctgggttcggcctcggcgtggtcatctccggcgccatccgcgtccacgacgacatg1500ctgctggcggcgtcggaggcgctggcggagcaggtcaccgacgagcacttcgccaagggg1560ctcatcttcccgccgttcaccaacatccgcaccatctcggcgcgcatcgccgccaaggtg1620gccgaaaaggcctacgagctcggcctcgccagccgcctgccgcgccccgacgaccttgtc1680aagtacgcccagagctgcatgtacaccccaacctaccgcagctaccggtaa1731<210>2<211>576<212>prt<213>人工序列<220><223><400>2metserserglumetglumetalaglyglyglyvalgluaspalatyr151015glygluaspargalathrglugluhisleuvalthrprotrpalaphe202530servalalaserglytyrthrleuleuargaspproarghisasnlys354045glyleualapheserglualagluargasnalahistyrleuarggly505560leuleuproproalaleualaserglngluleuglnglulyslysile65707580methisasnleuargglntyrthrvalproleuglnargtyrileala859095metmetaspleuglngluargasngluargleuphetyrlysleuleu100105110ileaspasnvalglugluleuleuprovalvaltyrthrprothrval115120125glyglualacysglnlystyrglyseriletyrargargproglngly130135140leutyrileserleulysasplysglylysileleugluvalleulys145150155160asntrpprogluargserileglnvalilevalvalthraspglyglu165170175argileleuglyleuglyaspleuglycysglnglymetglyilepro180185190valglylysleuserleutyrthralaleuglyglyvalargproser195200205alacysleuproilethrileaspvalglythrasnasngluthrleu210215220leuasnaspgluphetyrileglyleuargglnargargalathrgly225230235240glnglutyrhisgluleuleuglugluphemetthralavallysgln245250255asntyrglyglulysvalleuthrglnphegluaspphealaasnhis260265270asnalapheaspleuleualalystyrserlysserhisleuvalphe275280285asnaspaspileglnglythralaservalvalleualaglyleuleu290295300alaalaleulysvalvalglyglythrleualaasphisthrtyrleu305310315320pheleuglyalaglyglualaglythrglyilealaaspleuileala325330335leuglumetserlyshissergluthrproileaspaspcysarglys340345350lysiletrpleuvalaspserlysglyleuilevalgluserarglys355360365gluserleuglnhisphelysglnprotrpalahisasphisglupro370375380leulysthrleuleuglualavalgluserilelysprothrvalleu385390395400ileglythrserglyvalglyargthrphethrlysgluvalvalglu405410415alametalaserpheasngluargprovalilephealaleuserasn420425430prothrserhisserglucysthralagluglualatyrthrtrpser435440445glnglyargalavalphealaserglyserpropheaspalavalglu450455460hisgluglylysvaltyrvalproglyglnserasnasnalatyrile465470475480pheproglypheglyleuglyvalvalileserglyalaileargval485490495hisaspaspmetleuleualaalaserglualaleualagluglnval500505510thraspgluhisphealalysglyleuilepheproprophethrasn515520525ileargthrileseralaargilealaalalysvalalaglulysala530535540tyrgluleuglyleualaserargleuproargproaspaspleuval545550555560lystyralaglnsercysmettyrthrprothrtyrargsertyrarg565570575當(dāng)前第1頁(yè)12