專(zhuān)利名稱(chēng)：M×a蛋白質(zhì)的多型基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于MxA基因啟動(dòng)子區(qū)域的多型基因，和以使用該多型基因預(yù)測(cè)作為干擾素療法對(duì)象的個(gè)體中的干擾素有效性的預(yù)測(cè)方法。
干撓素是脊椎動(dòng)物細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)，具有抗病毒性作用、免疫調(diào)節(jié)作用和抑制細(xì)胞增殖的作用。因此，干撓素廣泛用于治療丙型肝炎等各種病毒性感染癥和惡性腫瘤等。然而，至今已知存在對(duì)干擾素不顯示感受性的患者，如果對(duì)干擾素療法不顯示效果的感染者持續(xù)進(jìn)行干擾素療法，這不僅僅使患者引起發(fā)熱和貧血等副作用，而且也延誤了其他療法的治療。因此，希望能預(yù)先預(yù)測(cè)干擾素的有效性，使這種非感受性的患者能排除掉干擾素的療法。
另一方面知道，從對(duì)流感病毒具有耐受性的小鼠發(fā)現(xiàn)了干擾素依賴(lài)性的蛋白質(zhì)，即MxA蛋白質(zhì)，在人中也發(fā)現(xiàn)了這種MxA蛋白質(zhì)。還知道這種MxA蛋白質(zhì)對(duì)流感病毒的耐受性有關(guān)，最近報(bào)導(dǎo)在慢性丙型肝炎病毒(以下稱(chēng)HCV)的感染者中，發(fā)現(xiàn)MxAmRNA和MxA蛋白質(zhì)的水平關(guān)連到感染者對(duì)干擾素療法的應(yīng)答。這一事實(shí)暗示出，MxA基因可成為用于在治療前預(yù)測(cè)干擾素療法的有效性的指標(biāo)。
本發(fā)明者們對(duì)關(guān)于HCV感染者對(duì)干擾素療法的應(yīng)答性的MxA基因啟動(dòng)子區(qū)域中多型基因的存在進(jìn)行了調(diào)查研究。結(jié)果知道了僅僅是具有特定多型基因的患者對(duì)干擾素有感受性，干擾素療法才有效。
鑒于上述情況，本發(fā)明的第一個(gè)課題是提供一種對(duì)患者預(yù)測(cè)干擾素療法的有效性有用的MxA基因啟動(dòng)子區(qū)域中的多型基因。
本發(fā)明的第二個(gè)課題是提供用上述MxA基因啟動(dòng)子區(qū)域中的多型基因，預(yù)測(cè)干擾素對(duì)患者有用性的方法。
本發(fā)明的第三個(gè)課題是使用上述MxA基因啟動(dòng)子區(qū)域的多型基因之中作為干擾素感受性原因的多型基因，進(jìn)行使對(duì)干擾素非感受性的患者成為干擾素感受性的基因治療，以及提供用于該目的的載體。
上述課題，通過(guò)以下敘述的本發(fā)明即可達(dá)到。
根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)側(cè)面，提供從下述序列組中選取的，用于預(yù)測(cè)干擾素療法有效性的多核苷酸
(at)下述序列表中序列1所示的多核苷酸、(bt)對(duì)上述(at)中所示多核苷酸中除455位外的1個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸，進(jìn)行缺失、置換、或附加修飾的多核苷酸、(ct)含有序列1的441～455位所示序列的多核苷酸、(dt)含有序列1的449～459位所示序列的多核苷酸、(et)上述的互補(bǔ)鏈。
根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)側(cè)面，提供從下述序列構(gòu)成的組中選取的，用于預(yù)測(cè)干擾素療法有效性的多核苷酸(ag)下述序列表中序列2所示的多核苷酸、(bg)對(duì)在上述(ag)中所示多核苷酸中除455位外的1個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸，進(jìn)行缺失、置換或附加修飾的多核苷酸、(cg)含有序列2的441～455位所示序列的多核苷酸、(dg)含有序列2的449～459位所示序列的多核苷酸、(eg)上述的互補(bǔ)鏈。
根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)側(cè)面，提供從下述序列構(gòu)成的組中選取的、用于預(yù)測(cè)干擾素療法有效性的多核苷酸(aa)下述序列表中序列3中所示多核苷酸、(ba)對(duì)在上述(aa)中所示多核苷酸中除455位外的1個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸進(jìn)行缺失、置換、或附加修飾的多核苷酸、(ca)含有序列3的441～455位所示序列的多核苷酸、(da)含有序列3的449～459位所示序列的多核苷酸、(ea)上述的互補(bǔ)鏈。
根據(jù)本發(fā)明的第四個(gè)側(cè)面，提供從下述序列構(gòu)成的組中選取的，用于預(yù)測(cè)干擾素療法有效性的多核苷酸(ac)下述序列表中序列4中所示的多核苷酸、(bc)對(duì)在上述(ac)中所示多核苷酸中除455位外的1個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸進(jìn)行缺失、置換、或附加修飾的多核苷酸、(cc)含有序列4的441～455位所示序列的多核苷酸、(dc)含有序列4的449～459位所示序列的多核苷酸、(ec)上述的互補(bǔ)鏈。
根據(jù)本發(fā)明的第五個(gè)側(cè)面，是提供一種預(yù)測(cè)給以干擾素個(gè)體干擾素療法有效性的方法，該方法包括以下步驟1)從上述個(gè)體采取至少含有1個(gè)干擾素應(yīng)答序列的多核苷酸試樣的步驟；和2)對(duì)于至少1個(gè)上述干擾素應(yīng)答序列，確定位于自3’末端第2號(hào)位置的核苷酸的步驟。
該方法中，上述核苷酸若是胸腺嘧啶，可以預(yù)測(cè)干擾素療法對(duì)上述個(gè)體是有效的。上述核苷酸若是鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤或胞嘧啶的話(huà)，可以預(yù)測(cè)干擾素療法對(duì)上述個(gè)體無(wú)效的可能性很高。
根據(jù)本發(fā)明的第六個(gè)側(cè)面，提供一種試劑，是預(yù)測(cè)給以干擾素個(gè)體的干擾素療法是否有效的試劑，特征是含有權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)記載的多核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明的第七個(gè)側(cè)面，提供一種探針，是為檢測(cè)MxA基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)多型基因的探針，由權(quán)利要求1～4中任何1項(xiàng)記載的多核苷酸形成的探針。
根據(jù)本發(fā)明的第八個(gè)側(cè)面，提供一種為預(yù)測(cè)干擾素的有效性，而對(duì)上述干擾素的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的第九個(gè)側(cè)面，是提供一種使干擾素非感受性的個(gè)體具有干擾素感受性的載體，其特征是含有上述多核苷酸(at)～(et)中的任一種。
根據(jù)本發(fā)明的第十個(gè)側(cè)面，提供一種方法，是使干擾素非感受性的個(gè)體具有干擾素感受性的方法，包括向干擾素非感受性的個(gè)體，導(dǎo)入本發(fā)明多核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明的第十一個(gè)側(cè)面，提供一種在制造使干擾素非感受性個(gè)體具有干擾素感受性的醫(yī)藥在中的上述多核苷酸(at)～(ec)中任何一種的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的第十二個(gè)側(cè)面，提供一種導(dǎo)入了上述多核苷酸(at)～(ec)中任何一種的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。


圖1是表示MxA基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)堿基序列圖。
圖2是使用了HhaI的RFLP電泳圖。
圖3～6是將在該啟動(dòng)子的支配下的蟲(chóng)螢光素酶活性作為指標(biāo)，對(duì)各個(gè)具有4種類(lèi)型SNP(T型、G型、A型、C型)的MxA啟動(dòng)子，比較Hela細(xì)胞內(nèi)干擾素α的應(yīng)答性的結(jié)果示意圖。
圖7是導(dǎo)入基因的Ptnk載體結(jié)構(gòu)的模式示意圖。
以下詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
序列1、序列2、序列3、和序列4的多核苷酸是包含了干擾素依賴(lài)性蛋白質(zhì)人MxA基因啟動(dòng)子區(qū)域的多核苷酸，本發(fā)明者們初次發(fā)現(xiàn)存在于這些多核苷酸的455位的單核苷酸多型性(Single nucleotide polymorphism)(以下稱(chēng)SNP)對(duì)干擾素療法效果的應(yīng)答性有關(guān)。
在各種多核苷酸的441～456位上存在著干擾素應(yīng)答序列(interferon-stimulated response element)(以下稱(chēng)ISRE)。
序列1中441～456位的ISRE堿序列是「GGTTTCGTTTCTGCTC」(序列5)，ISRE的第15位(相當(dāng)于序列1的455位，在序列1中的455位，根據(jù)通常將轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)取為+1的表示方法，相當(dāng)于-88位)是胸腺嘧啶。
序列2中的441～456位的ISRE堿基序列是「GGTTTCGTTTCTGG」(序列6)、ISRE的第15位(相當(dāng)于序列2的455位。序列2中455位，根據(jù)通常將轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)取為+1的表示方法，相當(dāng)于-88位)是鳥(niǎo)嘌呤。
序列3中441～456位的ISRE堿基序列是「GGTTTTCGTTTCTGGAC」(序列7)、ISRE的第15位(相當(dāng)于序列3的455位。序列3中455位，根據(jù)通常將轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)取為+1的表示方法，相當(dāng)于-88位)是腺嘌呤。
序列4中的441～456位的ISRE堿基序列是「GGTTTCGTTTCTGCCC」(序列8)、ISRE的第15位(相當(dāng)于序列4的455位。序列4中455位，根據(jù)通常將轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)取為+1的表示方法，相當(dāng)于-88位)是胞嘧啶。
以下在本說(shuō)明書(shū)中，將序列1、序列2、序列3和序列4的455位，稱(chēng)作SNP位點(diǎn)(SNP Site)。
除了這些ISRE的SNP位點(diǎn)以外的區(qū)域。在各個(gè)序列都是一樣的。這些ISRE中，具有15位的核苷酸為胸腺嘧啶的ISRE(序列5)的HCV感染者，對(duì)干擾素療法是有效的，不具有15位的核苷酸為胸腺嘧啶ISRE(序列5)的HCV感染者，干擾素療法是無(wú)效的，本發(fā)明者們已從流行病學(xué)的角度得到證實(shí)。
即，如實(shí)施例中詳述的那樣，具有以純合455位核苷酸為鳥(niǎo)嘌呤的序列1的多核苷酸(以下簡(jiǎn)寫(xiě)為G/G同型)的HCV感染者，與具有以雜合455位核苷酸為胸腺嘧啶的序列1的多核苷酸和455位核苷酸為鳥(niǎo)嘌呤的序列1的啟動(dòng)子區(qū)域(以下記作G/T異型)的HCV感染者，或具有以同型結(jié)合序列1的多核苷酸(以下記作T/T同型)的HCV感染者相比較，證實(shí)干擾素療法是無(wú)效的。
或者，具有以純合455位核苷酸不為胸腺嘧啶的MxA基因啟動(dòng)子區(qū)域的HCV感染者(以下記作非-T/非-T同型)與T/非-T異型或T/T異型的HCV感染者比較，顯示出干擾素療法是無(wú)效的。作為非-T/非-T同型的組合，有G/G、G/A、G/C、A/A、A/C、C/C、作為T(mén)/非-T組合，有T/G、T/A、T/C。
因此，在實(shí)施干擾素療法之前，例如首先確定在包含HCV感染者所具有的人MxA基因啟動(dòng)子區(qū)域的多核苷酸的ISRE中SNP位點(diǎn)的核苷酸可以檢測(cè)知道干擾素療法對(duì)該HCV感染者的有效性。
根據(jù)上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種預(yù)測(cè)干擾素療法有效性的多核苷酸。并提供一種對(duì)要給以干擾素的個(gè)體，預(yù)測(cè)干擾素療法是否有效的方法。為了檢測(cè)被檢者是否具有上述哪一種SNP，根據(jù)本發(fā)明還提供多核苷酸作為探針的應(yīng)用。
另外，還提供一種基因療法，以使干擾素非感受性的個(gè)體獲得干擾素感受性此外，還提供作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有意義的、含有上述核苷酸的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
以下分別對(duì)本發(fā)明的各個(gè)側(cè)面進(jìn)行說(shuō)明。
<用于預(yù)測(cè)干擾素療法有效性的多核苷酸>
本說(shuō)明書(shū)中，所謂的「多核苷酸」是指2個(gè)以上核苷通過(guò)磷酸酯鍵連接而成的物質(zhì)，「核苷」中包括脫氧核糖核苷和核糖核苷，但不限于這些。進(jìn)而本發(fā)明中的所謂「多核苷酸」，也是指肽核酸、嗎啉核酸、甲基磷酸酯核酸、S-寡核酸等人工合成核酸。
本說(shuō)明書(shū)中的所謂「啟動(dòng)子區(qū)域」，不僅指TATA盒等與轉(zhuǎn)錄起始反應(yīng)直接有關(guān)的區(qū)域。也是指包括該區(qū)域附近或較遠(yuǎn)處存在的對(duì)轉(zhuǎn)錄起始反應(yīng)效率有影響的調(diào)節(jié)序列在內(nèi)的序列。因此，對(duì)于形成「啟動(dòng)子區(qū)域」的術(shù)語(yǔ)，必須注意到與轉(zhuǎn)錄起始反應(yīng)有關(guān)的序列、調(diào)節(jié)序列，還包括連接兩者的序列。
所謂「ISRE」是指因干擾素α、β、γ或ω的刺激誘導(dǎo)的在基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域內(nèi)存在的由約12～15個(gè)核苷酸形成的堿基序列。
本發(fā)明的多核苷酸包括以下(a)～(e)。
(a)序列1，2，3，4中任一個(gè)表示的多核苷酸。
(b)在上述(a)中顯示的多核苷酸中，對(duì)除455位以外的1個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸進(jìn)行缺失、置換、或附加修飾的多核苷酸。
作為缺失的實(shí)例，有128位、133位、152位、508位及543位的缺失，作為置換的實(shí)例，有330位的置換(G→T)、542位的置換(G→G)、作為附加的實(shí)例，有向501位的附加(C)。
作為利用附加修飾的多核苷酸其他實(shí)例，有在上述序列1，2，3，4的多核苷酸或上述多核苷酸的片段上結(jié)合從以下組中選出的至少1個(gè)多核苷酸而形成的多核苷酸，即，包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、上游活化序列、沉默基因、上游游抑制序列、衰減子、聚A尾、核轉(zhuǎn)移信號(hào)、Kozak序列、ISRE、耐藥性因子、信號(hào)肽的基因、跨膜區(qū)域基因、包括螢光素、綠色熒光蛋白、藻菁甙、辣根過(guò)氧化酶在內(nèi)的標(biāo)記蛋白的基因、干擾素應(yīng)答性蛋白質(zhì)的基因、非干擾素應(yīng)答性蛋白質(zhì)的基因。
序列1，2，3，4中顯示的上述多核苷酸的堿基序列中，與干擾素療法有效性有關(guān)的是存在于455位SNP位點(diǎn)的1個(gè)核苷酸，本發(fā)明的多核苷酸也可以是含有上述455位的SNP位點(diǎn)的多核苷酸片段。這種多核苷酸最好是11～30個(gè)核苷酸。當(dāng)多核苷酸片段的長(zhǎng)度過(guò)長(zhǎng)時(shí)，難以識(shí)別1個(gè)核苷酸的不同。另一方面，在基體中，多核苷酸的長(zhǎng)度過(guò)短時(shí)，難以確定試樣中所含多核苷酸的堿基序列。
作為特別適宜的多核苷酸有下述(c)～(e)。
(c)是包括上述455位的SNP位點(diǎn)的序列1、序列2、序列3、序列4的多核苷酸片段，包括具有相當(dāng)于序列1、序列2、序列3、序列4中的441～456位的序列5、序列6、序列7、序列8所表示的序列的多核苷酸(即上述ISRE)在內(nèi)的片段。
(d)是包括上述455位的SNP位點(diǎn)的序列1、序列2、序列3、序列4的多核苷酸片段，包括相當(dāng)于序列1～4的449～459位的序列9、10、11、12的多核苷酸在內(nèi)的片段。特別是(d)大致以上述SNP為中心，由于含有前后同等長(zhǎng)度的堿基序列，所以可以高精度進(jìn)行堿基序列的確定。為了進(jìn)行更高精度的檢測(cè)，最好是含有相當(dāng)于序列1～4的447～461位的多核苷酸的片段。
進(jìn)而作為本發(fā)明適用的多核苷酸，也可以是(e)在上述(a)～(d)中顯示的多核苷酸的互補(bǔ)鏈。
由上述序列5、序列6、序列7、序列8表示的序列(即上述ISRE)的互補(bǔ)鏈?zhǔn)切蛄?3、14、15、16表示的序列。
上述序列9、序列10、序列11、序列12表示的序列的互補(bǔ)鏈，是分別以序列17、序列18、序列19、序列20表示的序列。
<預(yù)測(cè)干擾素療法是否有效的方法>
根據(jù)本發(fā)明，在實(shí)施干擾素療法之前，首先確定某HC感染者的上述SNP核苷酸，可預(yù)測(cè)干擾素療法對(duì)該HCV感染者是否有效。到此，由于以往還不能事前判斷干擾素療法對(duì)某個(gè)個(gè)體是否有效，所以這種預(yù)測(cè)成為可能，其意義極大。
故此，本發(fā)明是對(duì)要給以干擾素的感染HCV的個(gè)體，預(yù)測(cè)干擾素療法是否有效的方法。所提供的方法包括以下步驟。
1)從上述個(gè)體采取試樣的步驟，該試樣含有序列1的多核苷酸、或具有441～456位堿基序列的該多核苷酸片段，2)對(duì)位于上游側(cè)的上述ISRE，確定從3’末端起2號(hào)位點(diǎn)的核苷酸的步驟，和3)如果上述核苷酸是胸腺嘧啶，預(yù)測(cè)干擾素療法對(duì)上述個(gè)體是有效的步驟。
本發(fā)明提供了方法，還包括代替該方法的步驟3)，上述核苷酸若是鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤或胞嘧啶的話(huà)，預(yù)測(cè)干擾素療法對(duì)上述個(gè)體無(wú)效可能性很高的預(yù)測(cè)步驟。
由于干擾素療法的適應(yīng)癥不限于丙型肝炎，所以本發(fā)明是對(duì)要給以干擾素的個(gè)體，預(yù)測(cè)干擾素療法是否有效的方法。提供的方法包括以下步驟。
1)從上述個(gè)體采取試樣的步驟，該試樣含有至少含有1個(gè)干擾素應(yīng)答序列的多核苷酸，2)對(duì)至少1個(gè)上述干擾素應(yīng)答序列，確定從3’末端起2號(hào)位點(diǎn)的核苷酸的步驟，和3)上述多核苷酸若是胸腺嘧啶，預(yù)測(cè)對(duì)上述個(gè)體干擾素療法是有效的步聚。
本發(fā)明提供的方法，還包括替代該方法的步驟3)，上述核苷酸若是鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤或胞嘧啶的話(huà)，預(yù)測(cè)干擾素療法對(duì)上述個(gè)體無(wú)效可能性很高的預(yù)測(cè)步驟。
可適用本發(fā)明的個(gè)體，是患有干擾素療法有效的疾病的患者，最好是患有干擾素α，β或ω有效的疾病的患者。上述個(gè)體也可以是健康者。對(duì)于干擾素α，β或ω有效的疾病，除了丙型肝炎外，還有膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、髓瘤、星細(xì)胞瘤、皮膚惡性黑色素瘤、乙型肝炎、腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、毛細(xì)胞白血病、慢性骨髓性白血病、亞急性硬化性全腦炎、病毒性腦炎、免疫抑制患者全身性帶狀皰疹及水痘、上咽頭未分化癌、伴有聽(tīng)力低下的病毒性?xún)?nèi)耳感染癥、皰疹性角膜炎、偏平濕疣、尖銳濕疣、腺病毒及皰疹病毒感染引發(fā)的結(jié)膜炎、生殖器皰疹、口唇皰疹、子宮頸癌、癌性胸水癥、角化棘皮瘤、基底細(xì)胞癌、δ型慢性活動(dòng)性肝炎，但并不僅限于這些。
為了實(shí)施本發(fā)明的方法，首先從適用本方法的個(gè)體采取含有多核苷酸的試樣，該多核苷酸含有干擾素應(yīng)答序列。成為本發(fā)明方法的對(duì)象「?jìng)€(gè)體」，可以是包括人、犬、貓、牛、山羊、豬、綿羊及猴在內(nèi)的任意哺乳動(dòng)物，人是最合適的個(gè)體。
「含有干擾素應(yīng)答序列的多核苷酸」，可以是含有對(duì)干擾素應(yīng)答性蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因上游處存在的控制序列(啟動(dòng)子區(qū)域等)的多核苷酸，但并不限于此。最好的「含干擾素應(yīng)答序列的多核苷酸」，是序列1-4的多核苷酸，或者含有那些441～456位多核苷酸的多核苷酸片段。
由于體內(nèi)廣泛含有多核苷酸，所以從個(gè)體采取的任意試樣都可以成為「含有含干擾素應(yīng)答序列的多核苷酸的試樣」。最好的試樣是血液。
從個(gè)體采取試樣后，通常的操作是從該試樣中提取多核苷酸。作為從生物體成分中提取多核苷酸的方法，例如，除了酚提取、乙醇沉淀外，還可使用任意的提取方法。提取mRNA時(shí)，也可以用寡dT柱。
當(dāng)多核苷酸的量很少時(shí)，根據(jù)需要，可進(jìn)行多核苷酸擴(kuò)增的操作。擴(kuò)增操作，例如按照包括逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)在內(nèi)的聚合酶鏈反應(yīng)(以下記作PCR)進(jìn)行。
根據(jù)需要，進(jìn)行提取操作和/或擴(kuò)增操作后，確定從至少1個(gè)干擾素應(yīng)答序列的3’末端起2號(hào)位點(diǎn)的核苷酸種類(lèi)。
在確定核苷酸的種類(lèi)中，最一般的是使用一對(duì)夾帶含有所要確定核苷酸的干擾素應(yīng)答序列的引物，將干擾素應(yīng)答序列擴(kuò)增后，或可以不擴(kuò)增，確定該干擾素應(yīng)答序列的堿基序列。
所要確定的核苷酸，存在于限制酶的識(shí)別位點(diǎn)中時(shí)，也可用限制酶片段長(zhǎng)多型法。例如，確定上述MxA基因啟動(dòng)子區(qū)域的多型時(shí)，455位的核苷酸是鳥(niǎo)嘌呤的序列3的ISRE，通過(guò)可特異性識(shí)別并切斷堿基序列GCGC的限制酶HhaI進(jìn)行切割，與此相反，455位的核苷酸不是鳥(niǎo)嘌呤時(shí)，不會(huì)被HhaI切割。因此，在鑒定序列1的455位核苷酸時(shí)，可使用采用HhaI的RFLP法。
除此之外，作為確定多型的方法，可以使用PCR-SSP(PCR-特異序列引物法、PCR-Specific Sequence Primers)法、點(diǎn)印跡法與PCR組合的PCR-SSO法(PCR-序列特異寡核苷酸法，PCR-Sequeme Specitic Oligonucleotide)，及PCR-SSCP法等公知的方法，對(duì)此沒(méi)有限定。
所謂點(diǎn)印跡法是使用已知序列的探針核酸鏈，檢測(cè)試樣中所含具有特定序列的核酸鏈的一種方法。該方法是將單鏈核酸的試樣固定在基板上的有機(jī)薄膜上，接著使用以熒光物質(zhì)等標(biāo)記的單鏈的探針核酸鏈溶液與該薄膜上的試樣接觸。若試樣具有和探針核酸鏈互補(bǔ)的序列的話(huà)，和探針核酸鏈發(fā)生雜交，形成雙鏈，而固定在基板上。因此，利用洗滌除去未反應(yīng)的核酸鏈后，通過(guò)檢測(cè)付在探針上的標(biāo)記，即可檢測(cè)出與探針相對(duì)具有互補(bǔ)序列的試樣核酸鏈。因此，本發(fā)明也包括在MxA蛋白質(zhì)的多型基因的檢測(cè)中，本發(fā)明的多核苷酸作為探針的應(yīng)用。以含有權(quán)利要求1～4中任何1項(xiàng)記載的多核苷酸作為特征的，預(yù)測(cè)干擾素療法對(duì)要給以干擾素的個(gè)體是否有效的試劑也包含在本發(fā)明內(nèi)。
根據(jù)上述方法，確定從干擾素應(yīng)答序列的3’末端起2號(hào)位點(diǎn)的核苷酸種類(lèi)，該核苷酸若是胸腺嘧啶的話(huà)，可以預(yù)測(cè)干擾素療法是有效的?；蛘?，根據(jù)這種方法，該核苷酸若是鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤或胞嘧啶的話(huà)，可以預(yù)測(cè)干擾素療法對(duì)上述個(gè)體無(wú)效的可能性很高。
<基因治療>
如上述，為了使干擾素療法對(duì)個(gè)體有效，該個(gè)體必須具有從下述序列組中選出的多核苷酸，(at)下述序列表中序列1顯示的多核苷酸、(bt)對(duì)上述(at)顯示多核苷酸中除455位外的1個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸進(jìn)行缺失、置換或附加修飾的多核苷酸、(ct)含有序列1的441～455位表示序列的多核苷酸、(dt)含有序列1的449～459位表示序列的多核苷酸、(et)上述的互補(bǔ)鏈。
因此，上述核苷酸(at)～(et)可用于使干擾素療法有效的基因治療，對(duì)于干擾素療法無(wú)效的個(gè)體，通過(guò)導(dǎo)入這些多核苷酸，使該個(gè)體獲得干擾素感受性。
即，本發(fā)明中使干擾素非感受性個(gè)體獲得干擾素感受性的方法，包括對(duì)干擾素非感受性的個(gè)體，導(dǎo)入上述多核苷酸(at)～(et)中任何一種的方法。另外，還包括含有權(quán)利要求1中記載的多核苷酸，使干擾素非感受性的個(gè)體獲得干擾素感受性的載體。另外還包括權(quán)利要求1記載的多核苷酸在使干擾素非感受性個(gè)體獲得干擾素感受性的醫(yī)藥制造中的應(yīng)用。
上述本發(fā)明的載體也可以用于轉(zhuǎn)化合適的宿主進(jìn)行表達(dá)，制造付與干擾素感受性的蛋白質(zhì)時(shí)。
<轉(zhuǎn)基因動(dòng)物>
若使用本發(fā)明的多核苷酸，按常規(guī)方法，可制作非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。這種非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可用作研究干擾素功能的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。
以下根據(jù)實(shí)施例更詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例1在本實(shí)施例中，具有以雜合型或純合型MxA基因啟動(dòng)子區(qū)域-88位(在序列1的堿基序列中相當(dāng)于455位)的核苷酸是胸腺嘧啶的基因(以下記作MxA(T))的HCV感染者，與具有以純合該核苷酸為鳥(niǎo)嘌呤的基因(以下記作MxA(G))的HCV感染者行比較，證實(shí)對(duì)干擾素療法的應(yīng)答性很好。
<受驗(yàn)人>
從組織學(xué)上證明是慢性丙型肝炎的，進(jìn)行干擾素療法的115名患者，和抗HCV陰性的健康者42名參加了本次研究。這些參加者全是日本人，相互間無(wú)血緣關(guān)系。
115名患者中，52名患者干擾素療法結(jié)束后，在至少6個(gè)月的追蹤觀察期間，血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的水平處于正常范圍，而且是HCV的RNA一直處于陰性的持續(xù)應(yīng)答者(以下記作SR)，63名患者與ALT水平無(wú)關(guān)，追蹤觀察中，HCV的RNA仍是處于陽(yáng)性，或者是丙型肝炎復(fù)發(fā)的非應(yīng)答者(以下記作NR)。所有患者均給以總量超過(guò)300萬(wàn)單位的干擾素α和/或β。
<MxA基因分析>
從患者和健康對(duì)照采集的PBMC提取核酸。將該核酸進(jìn)行PCR，擴(kuò)增包含MxA基因啟動(dòng)子區(qū)域的599核苷酸的DNA。
PCR的概況如下將0.05μg核酸與Taq-Gold(PerkinElner)、序列5的寡核苷酸引物#MXAF01(正向引物，-569～-540位)、和序列6的寡核苷酸引物#MXAF02(反向引物、+30～+1位)混合后(-560～-540位相當(dāng)于序列1的堿基序列47～76位)，在[95℃10分鐘]、[95℃10秒鐘、68℃60秒鐘]×55、[72℃7分鐘]的循環(huán)條件下，進(jìn)行反應(yīng)。通過(guò)直接譯碼PCR產(chǎn)物，確定157個(gè)試樣中12個(gè)的序列。
根據(jù)序列確定，同時(shí)確定擴(kuò)增區(qū)域中SNP位點(diǎn)后，構(gòu)建用于可識(shí)別地檢出等位基因核苷酸的RFLP系統(tǒng)。用HhaI(GCG↓C)消化所有患者的599核苷酸的PCR產(chǎn)物，在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，研究是生成482核苷酸的帶，還是生成533核苷酸的帶，還是兩者都生成。
<統(tǒng)計(jì)分析>
進(jìn)行イエ一ツ補(bǔ)正，或不進(jìn)行補(bǔ)正，根據(jù)費(fèi)希爾的概率試驗(yàn)比較小組數(shù)據(jù)。將P＜0.05視為統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性的。
<結(jié)果>
通過(guò)12個(gè)樣品的序列確定，同時(shí)確定MxA基因啟動(dòng)子區(qū)域中的多型位點(diǎn)。在該啟動(dòng)子區(qū)域的-88位上存在SNP(G和T)、該SNP包含在類(lèi)似圖1所示的ISRE區(qū)域中。
接著，用HhaI進(jìn)行的RFLP，對(duì)全部157個(gè)樣品確定MxA基因的基因型。在該分析中，在多型位點(diǎn)上有鳥(niǎo)嘌呤的試樣，在電泳凝膠中顯示出482核苷酸的帶。與此相反，當(dāng)鳥(niǎo)嘌呤換成胸腺嘧啶時(shí)，由于HhaI識(shí)別的限制位點(diǎn)消失，而顯示出533核苷酸的帶。在具有以雜合多型位點(diǎn)為鳥(niǎo)嘌呤的啟動(dòng)子區(qū)域和多型位點(diǎn)為胸腺嘧啶的啟動(dòng)子區(qū)域時(shí)，會(huì)同時(shí)檢測(cè)出482核苷酸的帶和533核苷酸的帶(見(jiàn)圖2)。
如表1所示在NR組中，62％的患者具有以純合上述多型位點(diǎn)為鳥(niǎo)嘌呤的啟動(dòng)子區(qū)域(G·G同型)、在SR組中，31％的患者是G·G同型(p＝0.0009；SR對(duì)NR)。與此相反，在NR組中，35％的患者具有以雜合多型位點(diǎn)為鳥(niǎo)嘌呤的啟動(dòng)子區(qū)域和多型位點(diǎn)為胸腺嘧啶的啟動(dòng)子區(qū)域(G·T雜異)、在SR組中，60％的患者是G·T異型(p＝0.0082；SR對(duì)NR)。T·T同型的患者，在NR組中為3.2％，在SR組中為10％(p＝0.2956；SR對(duì)NR)。
具有多型位點(diǎn)為鳥(niǎo)嘌呤的啟動(dòng)子區(qū)域的等位基因頻率，在SR組中為0.606，在NR組中為0.794(p＝0.0018；SR對(duì)NR)。
表1MxA啟動(dòng)子-88 SR患者 NR健康對(duì)照 p位的多型 (n＝52)(n＝63) (n＝42) SR對(duì)NR等位基因頻率G 0.606 0.794 0.714 0.0018T 0.394 0.296 0.286 0.0018接合型G·G同型 16(31％) 39(62％)20(48％)0.0009G·T異型 31(60％) 22(35％)20(48％)0.0082T·T同型 5(10％)2(3.2％)2(4.8％)0.2956**進(jìn)行イエ一ツ補(bǔ)正。
與NR組相比，SR組中，G·G相同的個(gè)體可以說(shuō)是顯著的要少，上述結(jié)果，也明確了患者不依賴(lài)于感染的HCV的基因型。
表2位于MxA啟動(dòng)子-88SR患者 NR患者 p位的SNP接合型 SR對(duì)NR基因型為1b的HCV感 n＝18 n＝42染患者G·G同型 5(28％) 26(6％)0.0321*G·T異型 12(67％)14(33％) 0.0170T·T同型 1(5.6％)2(4.8％) 0.6051*基因型為2a或2b的n＝34 N＝21HCV感染患者G·G同型 11(32％)13(62％) 0.0318G·T異型 19(56％) 8(38％) 0.1999T·T同型 4(12％) 0.2722**進(jìn)行イエ一ツ補(bǔ)正。
從表2可明確，在基因型為1b的HCV感染患者組中(HCV 1b組)和基因型為2a或2b的HCV感染患者組中(HCV2a/2b)，與在NR組中都是62％的G·G同型的個(gè)體相對(duì)，在SR組中、G·G同型的個(gè)體分別為28％和32％。從表2所示結(jié)果可知，不管患者感染的HCV基因型如何，在SR組中，G·G同型的個(gè)體顯著的要少(HCV 1b組；p＝0.0321、HCV 2a/2b組，p＝0.0318)。
以上由本實(shí)施例證實(shí)，具有以雜合或純合上述多型位點(diǎn)為胸腺嘧啶的MxA啟動(dòng)子區(qū)域的HCV感染者，與感染的HCV基因型無(wú)關(guān)，對(duì)干擾素療法顯示出很高的應(yīng)答性。
本實(shí)施例也暗示出，具有以雜合或純合上述多型位點(diǎn)不為鳥(niǎo)嘌呤MxA啟動(dòng)子區(qū)域的HCV感染者，對(duì)干擾素療法也顯示出很高的應(yīng)答性。
由于上述多型位點(diǎn)存在于ISRE中，所以可以說(shuō)，這些情況也適合于除丙型肝炎以外的其他疾病。
實(shí)施例2正如從實(shí)施例1明確的，MxA啟動(dòng)子的SNNP為T(mén)型的HCV感染者，通過(guò)給以干擾素，對(duì)肝炎的治療效果很高。另一方面，其SNP為G型時(shí)治療效果很低、可以以這種理由進(jìn)行解釋?zhuān)瑸橥瓿蒊SRE功能的堿基序列是T型，對(duì)于干擾素的刺激做出正確應(yīng)答，但G型與其序列僅之1個(gè)堿基的差異，對(duì)于干擾素的刺激就沒(méi)有應(yīng)答MxA蛋白質(zhì)的生成量很低。
從這種狀況考慮時(shí)，可以推測(cè)MxA啟動(dòng)子的SNP為C型及A型的HCV肝炎患者，和G型的一樣，MxA啟動(dòng)子對(duì)干擾素沒(méi)有應(yīng)答，其治療效果很低為證明這些事實(shí)，在MxA啟動(dòng)子的下流構(gòu)建具有螢光素酶基因的質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)感染人細(xì)胞(HeLa細(xì)胞、及卵巢癌細(xì)胞)。對(duì)于具有4種SNP(T型、G型、A型、C型)的MxA啟動(dòng)子，分別研究作為它們對(duì)干擾素應(yīng)答的結(jié)果，即產(chǎn)生螢光素酶活性。
其結(jié)果示于圖3～圖6。圖3是用干擾素α在Hela細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行誘導(dǎo)的實(shí)例，圖4是用干擾素α在卵巢癌細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行誘導(dǎo)的實(shí)例，圖5是用干擾素β在Hela細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行誘導(dǎo)的實(shí)例，圖6是用干擾素β在卵巢癌細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行誘導(dǎo)的實(shí)例。這些圖中，+號(hào)表示添加干擾素時(shí)的螢光素酶活性，-號(hào)表示沒(méi)有添加干擾素時(shí)的螢光素酶活性。這些結(jié)果均為3次試驗(yàn)的平均值，其標(biāo)準(zhǔn)差以條線(xiàn)棒表示。
從圖中可知，任何一種情況，T型的MxA啟動(dòng)子均呈現(xiàn)出最高的值。具有A型和C型SNP的HCV肝炎患者和G型的情況一樣，干擾素及對(duì)干擾素的應(yīng)答很低。因此，可預(yù)測(cè)利用干擾素的治療效果很低。
實(shí)施例3在本實(shí)施例中，對(duì)利用導(dǎo)入MxA基因的胚性干細(xì)胞(以下記作ES細(xì)胞)生成MxA蛋白質(zhì)進(jìn)行說(shuō)明。
按照PCR法，使用引物#MXAF01(序列5)、#MXAR02(序列6)，對(duì)含有MxA基因啟動(dòng)子區(qū)域的-88堿基為T(mén)的基因(MxA(T))和G的基因(MxA(G))的區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。
接著，將擴(kuò)增產(chǎn)物以磷酸鈣法分別轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞。反應(yīng)條件全部按照已知的條件。使IFN-α作用于這些細(xì)胞，以Northern印跡對(duì)MxA蛋白質(zhì)的產(chǎn)生量進(jìn)行比較。
從結(jié)果可知，導(dǎo)入MxA(G)基因的細(xì)胞，與沒(méi)導(dǎo)入基因的細(xì)胞比較，可以確認(rèn)MxA蛋白質(zhì)的生成量約為1.2倍。另一方面，導(dǎo)入MxA(T)基因的細(xì)胞中，約為對(duì)照細(xì)胞的2.5倍，與導(dǎo)入MxA(G)基因的細(xì)胞比較，顯示出約2倍的MxA蛋白質(zhì)量。
根據(jù)本實(shí)施例可明確，通過(guò)在ES細(xì)胞中導(dǎo)入MxA(T)基因，可大量生成MxA蛋白質(zhì)。
從本實(shí)施例的結(jié)果暗示出，通過(guò)使用導(dǎo)入MxA(T)基因的ES細(xì)胞，可以對(duì)干擾素有效的疾病進(jìn)行基因治療。
利用導(dǎo)入MxA基因的ES細(xì)胞，可制成嵌合性動(dòng)物。進(jìn)而使嵌合性動(dòng)物進(jìn)行交配，可得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
實(shí)施例4向ES細(xì)胞導(dǎo)入基因?qū)S細(xì)胞在ES/LIF培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)后，利用電穿孔法進(jìn)行基因?qū)?。電穿孔法的條件如下。
<液組成>20mmol/L-HEPES(pH7.3)、137mmol/L-NaCl、5mmol/L-KCl、0.7mmol/L-Na2HPO4、6mmol/L-葡萄糖、0.1mmol/L-2-巰基乙醇。
<條件>450V、250μF、10分鐘，室溫、4mm比色杯。
電穿孔法處理后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到ES/LIF培養(yǎng)基內(nèi)，按照已報(bào)導(dǎo)的，使用200μg/L的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(G418)和2μmol/L的更昔洛韋(GANC)，選取導(dǎo)入基因的細(xì)胞。從得到的細(xì)胞提取DNA，用Southern雜交確認(rèn)導(dǎo)入的目的片段。
根據(jù)本實(shí)施例可以明確，使用電穿孔法，可在ES細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入基因。
實(shí)施例5
本實(shí)施例中，對(duì)向載體中導(dǎo)入MxA基因進(jìn)行說(shuō)明。
以PCR法，使用引物#MXAF01(序列5)、#MXAR02(序列6)，對(duì)含有MxA基因啟動(dòng)子區(qū)域-88堿為胸腺嘧啶的基因(MxA(T))和鳥(niǎo)嘌呤的基因(MxA(G))的區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。接著將擴(kuò)增產(chǎn)物導(dǎo)入pNTK載體中(圖7)。反應(yīng)條件按照已報(bào)導(dǎo)的條件。用限制酶將載體切斷成直鏈后，用于向細(xì)胞導(dǎo)入。
使用導(dǎo)入MxA基因的載體，向靶細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入MxA基因，可改進(jìn)對(duì)干擾素的應(yīng)答性。
實(shí)施例6本實(shí)施例中，說(shuō)明用導(dǎo)入MxA基因的ES細(xì)胞生成MxA蛋白質(zhì)。使IFN-α作用于導(dǎo)入MxA(T)或MxA(G)基因的這些細(xì)胞，比較MxA蛋白質(zhì)的產(chǎn)生量。以Northern印跡法進(jìn)行比較，結(jié)果可知在導(dǎo)入MxA(G)基因的細(xì)胞中，與沒(méi)進(jìn)行任何作用的細(xì)胞比較，約生成1.5倍的MxA蛋白質(zhì)。另一方面，在導(dǎo)入MxA(T)基因的細(xì)胞中，約為控制細(xì)胞的4.5倍，和導(dǎo)入MxA(G)基因的細(xì)胞比較，顯示出3倍的值。
從以上結(jié)果暗示出，使用導(dǎo)入MxA(T)基因的ES細(xì)胞，可對(duì)干擾素有效的疾病實(shí)施基因治療。
序列表<110>株式會(huì)社東芝<120>MxA蛋白質(zhì)的多型基因及其應(yīng)用<130>A000001162<140><141><160>22<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>581<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1atgagccaga ctccagggag gcctagaagt gggcaagggg aaacgggaaa ggaggaagat 60ggtatgggtg tgcctggtta ggggtgggag tgctggacgg agttcgggac aagaggggct 120ctgcagccat tggcacacaa tgcctgggag tccctgctgg tgctgggatc atcccagtga 180gccctgggag ggaactgaag acccccaatt accaatgcat ctgttttcaa aaccgacggg 240gggaaggaca tgcctaggtt caaggatacg tgcaggcttg gatgactccg ggccattagg 300gagcctccgg agcaccttga tcctcagacg ggcctgatga aacgagcatc tgattcagca 360ggcctgggtt cgggcccgag aacctgcgtc tcccgcgagt tcccgcgagg caagtgctgm 420aggtgcgggg ccaggagcta ggtttcgttt ctgctcccgg agccgccctc agcacagggt 480ctgtgagttt catttcttcg ccggcgcggg gcggggctgg gcgcggggtg aaagaggcga 540accgagagcg gaggccgcac tccagcactg cgcagggacc g 581<210>2<211>581<212>DNA<213>Homo sapiens<400>2atgagccaga ctccagggag gcctagaagt gggcaagggg aaacgggaaa ggaggaagat 60ggtatgggtg tgcctggtta ggggtgggag tgctggacgg agttcgggac aagaggggct 120ctgcagccat tggcacacaa tgcctgggag tccctgctgg tgctgggatc atcccagtga 180gccctgggag ggaactgaag acccccaatt accaatgcat ctgttttcaa aaccgacggg 240gggaaggaca tgcctaggtt caaggatacg tgcaggcttg gatgactccg ggccattagg 300gagcctccgg agcaccttga tcctcagacg ggcctgatga aacgagcatc tgattcagca 360ggcctgggtt cgggcccgag aacctgcgtc tcccgcgagt tcccgcgagg caagtgctgm 420aggtgcgggg ccaggagcta ggtttcgttt ctgcgcccgg agccgccctc agcacagggt 480ctgtgagttt catttcttcg ccggcgcggg gcggggctgg gcgcggggtg aaagaggcga 540accgagagcg gaggccgcac tccagcactg cgcagggacc g 581<210>3<211>581<212>DNA<213>Homo sapiens<400>3atgagccaga ctccagggag gcctagaagt gggcaagggg aaacgggaaa ggaggaagat 60ggtatgggtg tgcctggtta ggggtgggag tgctggacgg agttcgggac aagaggggct 120ctgcagccat tggcacacaa tgcctgggag tccctgctgg tgctgggatc atcccagtga 180gccctgggag ggaactgaag acccccaatt accaatgcat ctgttttcaa aaccgacggg 240gggaaggaca tgcctaggtt caaggatacg tgcaggcttg gatgactccg ggccattagg 300gagcctccgg agcaccttga tcctcagacg ggcctgatga aacgagcatc tgattcagca 360ggcctgggtt cgggcccgag aacctgcgtc tcccgcgagt tcccgcgagg caagtgctgm 420aggtgcgggg ccaggagcta ggtttcgttt ctgcacccgg agccgccctc agcacagggt 480ctgtgagttt catttcttcg ccggcgcggg gcggggctgg gcgcggggtg aaagaggcga 540accgagagcg gaggccgcac tccagcactg cgcagggacc g 581<210>4<211>581<212>DNA<213>Homo sapiens<400>4atgagccaga ctccagggag gcctagaagt gggcaagggg aaacgggaaa ggaggaagat 60ggtatgggtg tgcctggtta ggggtgggag tgctggacgg agttcgggac aagaggggct 120ctgcagccat tggcacacaa tgcctgggag tccctgctgg tgctgggatc atcccagtga 180gccctgggag ggaactgaag acccccaatt accaatgcat ctgttttcaa aaccgacggg 240gggaaggaca tgcctaggtt caaggatacg tgcaggcttg gatgactccg ggccattagg 300gagcctccgg agcaccttga tcctcagacg ggcctgatga aacgagcatc tgattcagca 360ggcctgggtt cgggcccgag aacctgcgtc tcccgcgagt tcccgcgagg caagtgctgm 420aggtgcgggg ccaggagcta ggtttcgttt ctgcccccgg agccgccctc agcacagggt 480ctgtgagttt catttcttcg ccggcgcggg gcggggctgg gcgcggggtg aaagaggcga 540accgagagcg gaggccgcac tccagcactg cgcagggacc g 581<210>5<211>16<212>DNA<213>Homo sapiens<400>5ggtttcgttt ctgctc 16<210>6<211>16<212>DNA<213>Homo sapiens<400>6ggtttcgttt ctgcgc 16<210>7<211>16<212>DNA<213>Homo sapiens<400>7ggtttcgttt ctgcac 16<210>8<211>16<212>DNA<213>Homo sapiens<400>8ggtttcgttt ctgccc 16<210>9<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>9ttctgctcccg 10<210>10<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>10ttctgcgcccg 10<210>11<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>11ttctgcacccg 10<210>12<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>12ttctgcccccg 10<210>13<211>16<212>DNA<213>Homo sapiens<400>13gagcag aaacgaaacc 16<210>14<211>16<212>DNA<213>Homo sapiens<400>14gcgcag aaacgaaacc 16<210>15<211>16<212>DNA<213>Homo sapiens<400>15gtgcag aaacgaaacc 16<210>16<211>16<212>DNA<213>Homo sapiens<400>16gggcag aaacgaaacc 16<210>17<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>17cgggagcagaa 10<210>18<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>18cgggcgcagaa 10<210>19<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>19cgggtgcagaa 10<210>20<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>20cgggggcagaa 10<210>21<211>30<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>對(duì)人工合成序列的描述引物<400>21acacacccgt ttccaccctg gagaggccag 30<210>22<211>30<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>對(duì)人工合成序列的描述引物<400>22tgcgcagtgc tggagtgcgg cctccgctct 30
權(quán)利要求
1.一種預(yù)測(cè)干擾素療法有效性的多核苷酸，是從下述序列組中選取的(at)下述序列表中序列1表示的多核苷酸、(bt)對(duì)上述(at)所示多核苷酸中除455位外的1個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸進(jìn)行缺失、置換、或附加修飾的多核苷酸、(ct)含有序列1的441～455位表示的序列的多核苷酸、(dt)含有序列1的449～459位表示的序列的多核苷酸、(et)上述的互補(bǔ)鏈。
2.一種預(yù)測(cè)干擾素療法有效性的多核苷酸，是從下述序列組中選取的，(ag)下述序列表中序列2表示的多核苷酸、(bg)對(duì)上述(ag)所示多核苷酸中除455位外的1個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸進(jìn)行缺失、置換或附加修飾的多核苷酸、(cg)含有序列2的441～455位表示的序列的多核苷酸、(dg)含有序列2的449～459位表示的序列的多核苷酸、(eg)上述的互補(bǔ)鏈。
3.一種預(yù)測(cè)干擾素療法有效性的多核苷酸，是從下述序列組中選取的，(aa)下述序列表中序列3表示的多核苷酸、(ba)對(duì)上述(aa)表示的多核苷酸中除455位外的1個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸進(jìn)行缺失、置換或附加修飾的多核苷酸、(ca)含有序列3的441～455位表示的序列的多核苷酸、(da)含有序列3的449～459位表示的序列的多核苷酸、(ea)上述的互補(bǔ)鏈。
4.一種預(yù)測(cè)干擾素療法有效性的多核苷酸，是從下述序列組中選取的，(ac)下述序列表中序列4表示的多核苷酸、(bc)對(duì)上述(ac)所示多核苷酸中除455位外的1個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸進(jìn)行缺失、置換或附加修飾的多核苷酸、(cc)含有序列4的441～455位表示的序列的多核苷酸、(dc)含有序列4的449～459位表示的序列的多核苷酸、(ec)上述的互補(bǔ)鏈。
5.一種多核苷酸，是權(quán)利要求1～4中任1項(xiàng)記載的多核苷酸，進(jìn)而包含至少1個(gè)增加的與該多核苷酸連接的選自以下基因組成的組的多核苷酸，即啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、上游活化序列、沉默基因、上游抑制序列、衰減子、聚A尾、核轉(zhuǎn)移信號(hào)、Kozak序列、ISRE、耐藥性因子、信號(hào)肽的基因、跨膜區(qū)域的基因、標(biāo)記蛋白的基因、干擾素應(yīng)答性蛋白質(zhì)的基因、非干擾素應(yīng)答性蛋白質(zhì)的基因。
6.一種預(yù)測(cè)干擾素療法有效性的方法，是對(duì)要給以干擾素的個(gè)體，預(yù)測(cè)干擾素療法有效性的方法，其特征在于包括以下步驟，1)從上述個(gè)體采取含有多核苷酸試樣的步驟，該多核苷酸至少含有1個(gè)干擾素應(yīng)答序列、2)對(duì)至少1個(gè)上述干擾素應(yīng)答序列，確定從位于3’末端起2號(hào)位點(diǎn)核苷酸的步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求6記載的方法，其特征是還包括3)的預(yù)測(cè)步聚，即，上述核苷酸若是胸腺嘧啶的話(huà)，預(yù)測(cè)干擾素療法對(duì)上述個(gè)體是有效的。
8.根據(jù)權(quán)利要求6記載的方法，其特征是還包括3)的預(yù)測(cè)步驟，即，上述核苷酸若是鳥(niǎo)嘌呤，腺嘌呤或胞嘧啶的話(huà)，預(yù)測(cè)干擾素療法對(duì)上述個(gè)體無(wú)效的可能性很高。
9.根據(jù)權(quán)利要求6記載的方法，其特征是上述個(gè)體是感染了丙型肝炎病毒的個(gè)體。
10.根據(jù)權(quán)利要求6～9中任1項(xiàng)記載的方法，其特征是至少含有1 個(gè)干擾素應(yīng)答序列的上述多核苷酸是權(quán)利要求1-4中任1項(xiàng)記載的多核苷酸。
11.一種試劑，是對(duì)要給以干擾素的個(gè)體預(yù)測(cè)干擾素療法是否有效的試劑，其特征在于含有權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)記載的多核苷酸。
12.一種探針，是用于檢測(cè)MxA基因啟動(dòng)子區(qū)域中多型的探針，由 1～4中任1項(xiàng)記載的多核苷酸形成。
13.權(quán)利要求1～5中任何一項(xiàng)記載的多核苷酸在用于預(yù)測(cè)干擾素療法的有效性的應(yīng)用。
14.一種方法，是使干擾素非感受性的個(gè)體具有干擾素感受性的方法，包含向干擾素非感受性的個(gè)體，導(dǎo)入權(quán)利要求1中記載的多核苷酸。
15.一種載體，含有權(quán)利要求1記載的多核苷酸，用于使干擾素非感受性個(gè)體具有干擾素感受性。
16.權(quán)利要求1記載的多核苷酸在制造使干擾素非感受性個(gè)體具有干擾素感受性的醫(yī)藥中的應(yīng)用。
17.導(dǎo)入了權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)記載多核苷酸的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于預(yù)測(cè)干擾素療法有效性的作為具有可形成有用指標(biāo)的多型位點(diǎn)的多核苷酸,是具有序列1－4堿基序列的多核苷酸。
文檔編號(hào)A61P25/00GK1333339SQ01122058
公開(kāi)日2002年1月30日 申請(qǐng)日期2001年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月22日
發(fā)明者土方美奈子, 三代俊治, 太田裕彥, 橋本幸二 申請(qǐng)人:株式會(huì)東芝