本申請(qǐng)是2013年3月19日遞交的國(guó)際申請(qǐng)于2014年11月17日進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段，中國(guó)申請(qǐng)?zhí)枮?01380025049.6，發(fā)明名稱為“制備重組肽的方法”的專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。本發(fā)明涉及制備肽特別是重組肽的方法。在特殊的應(yīng)用中，該方法涉及包含肽的串聯(lián)拷貝的融合多肽的切割。引用參考本專利申請(qǐng)要求2012年3月19日遞交的美國(guó)專利申請(qǐng)no61/612817的優(yōu)選權(quán)。該申請(qǐng)全部?jī)?nèi)容在此引作參考。發(fā)明背景重組制備的肽對(duì)于工業(yè)和臨床都越來越重要。在各種表達(dá)系統(tǒng)，例如細(xì)菌、酵母、昆蟲、植物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中重組產(chǎn)生的真核蛋白質(zhì)代替合成肽制備，提供低成本。但是，重組表達(dá)是不可預(yù)期的并且經(jīng)常有問題，因?yàn)楹芏嘀亟M表達(dá)肽不足夠溶解性，不穩(wěn)定，錯(cuò)折疊或沒有活性，和/或以低產(chǎn)率表達(dá)，因此不經(jīng)常以足夠高的質(zhì)量或有商業(yè)價(jià)值的產(chǎn)率制備。表達(dá)重組表達(dá)的有低分子量的肽能是特別困難的。操作上將肽與合適的肽融合配偶體融合能增強(qiáng)穩(wěn)定性和溶解性；但是，一般不期望為了治療應(yīng)用的肽中存在有融合配偶體。通過大量的肽裂解劑包括酶促裂解劑(即蛋白酶)以及化學(xué)裂解劑能將肽裂解。許多肽裂解劑在肽內(nèi)的特定氨基酸序列或基序處識(shí)別并切割肽。肽通常包含許多不同肽切割位點(diǎn)的多個(gè)拷貝。例如，成熟的人白細(xì)胞介素(il)-1β肽(153個(gè)氨基酸的肽，參見genbank登錄號(hào)aaa74137.1)，據(jù)預(yù)計(jì)被至少20種不同的肽裂解劑裂解。成熟il-1β肽序列包括三個(gè)預(yù)測(cè)的arg-c蛋白酶切割位點(diǎn)，8個(gè)預(yù)測(cè)的asp-n內(nèi)肽酶切割位點(diǎn)，6個(gè)預(yù)測(cè)的溴化氰切割位點(diǎn)，8個(gè)預(yù)測(cè)的甲酸切割位點(diǎn)，3個(gè)預(yù)測(cè)的梭菌蛋白酶切割位點(diǎn)，17個(gè)預(yù)測(cè)的胰蛋白酶切割位點(diǎn)等。因此，在重組制備肽的過程中通常不使用肽裂解劑，因?yàn)殡某３?huì)被裂解成更小的片段，這是不希望的。本發(fā)明人已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，某些肽是不尋常的，在于它們?nèi)狈μ囟ǖ碾牡那懈钗稽c(diǎn)，或包含位于肽的末端的特定的肽的切割位點(diǎn)的單一拷貝。例如，本發(fā)明人已經(jīng)認(rèn)識(shí)到天然血管擴(kuò)張(vsdl)肽異常地包含單一的胰蛋白酶切割位點(diǎn)，其位于所述vsdl肽的c-末端。血管擴(kuò)張肽(vsdl)是一種天然存在的37個(gè)氨基酸(aa)的肽，這是在126氨基酸心房鈉尿肽(anp，也稱為心房利鈉因子(anf))激素原(anp原的；vesely，2003)處理后在體內(nèi)產(chǎn)生的。vsdl由anp激素原的氨基酸31-67組成。vsdl的主要生物活性是通過調(diào)節(jié)排鈉利尿劑、利尿劑和血液動(dòng)力學(xué)效應(yīng)(vesely，2003)來調(diào)節(jié)血壓和維持健康個(gè)體內(nèi)血漿容積。通過臨床前和人體臨床研究?jī)煞N已經(jīng)對(duì)vsdl用于治療心臟疾病，例如充血性心臟衰竭(chf)的用途進(jìn)行了研究。已經(jīng)證明vsdl能顯著提高排鈉利尿劑、利尿劑和血液動(dòng)力學(xué)參數(shù)而沒有任何癥狀副作用。vdsl被認(rèn)為對(duì)于調(diào)節(jié)有益血液動(dòng)力學(xué)效果是安全和有效的治療，帶有另外的有益排鈉利尿劑、利尿劑和腎臟作用，同時(shí)在臨床上可接受的范圍內(nèi)調(diào)節(jié)血漿體積和血壓(bp)而沒有嚴(yán)重的副作用。因此，已經(jīng)提出了對(duì)急性代謝失調(diào)充血性心臟衰竭(adchf)的患者施用vsdl。此外，vdsl也被發(fā)現(xiàn)具有抗癌作用(skelton等，2011)，并已被證明允許在急性腎功能衰竭的治療中(vesely等，2003年)。因此，可以理解，vsdl是用于各種疾病治療的有用候選者?；谔烊籿sdl序列的合成產(chǎn)生的vsdl已被用于臨床試驗(yàn)，并已被有利地證明可用于治療疾??；但是，多肽的合成制備是一個(gè)昂貴的過程，特別是對(duì)于在工業(yè)規(guī)模上所需要的肽。本發(fā)明人設(shè)計(jì)了一種一流的重組制備系統(tǒng)，其利用從融合多肽切割肽。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種制備重組肽的方法，所述方法包括以下步驟：表達(dá)包含所述肽的融合多肽，其中所述肽側(cè)翼是一個(gè)或多個(gè)肽切割位點(diǎn)，并且其中所述肽另外不存在所述肽切割位點(diǎn)；和用在肽切割位點(diǎn)切割的裂解劑在肽切割位點(diǎn)切割融合多肽；其中切割融合多肽的步驟從融合多肽釋放所述肽。在第二方面，本發(fā)明提供了一種制備重組肽的方法，所述方法包括以下步驟：表達(dá)包含所述肽的串聯(lián)拷貝的融合多肽，其中所述肽側(cè)翼是一個(gè)或多個(gè)肽的切割位點(diǎn)，并且其中所述肽特征在于所述肽另外不存在所述肽的切割位點(diǎn)；和用在肽切割位點(diǎn)切割的裂解劑在肽切割位點(diǎn)切割融合多肽。；其中切割融合多肽的步驟從融合多肽釋放所述肽。在一種實(shí)施方案中，所述融合多肽包含2至20個(gè)(或更多)肽的串聯(lián)拷貝。在一種實(shí)施方案中，所述融合多肽包含3個(gè)肽的串聯(lián)拷貝。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述融合多肽包含10個(gè)肽的串聯(lián)拷貝。在一種實(shí)施方案中，所述肽在其一個(gè)末端包含肽的肽切割位點(diǎn)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，肽包含c-末端精氨酸(r)殘基。在另一種實(shí)施方案中，所述肽包含根據(jù)式x1-x2-…xn-1-xn-(r/k)(seqidno:1)的氨基酸序列；其中x是除了精氨酸或賴氨酸的任何氨基酸，r/k為精氨酸或賴氨酸，和n是氨基酸的任何合適的數(shù)目。在一個(gè)實(shí)施例中，所述肽具有天然序列。在另一種實(shí)施方案中，肽包括血管擴(kuò)張(vsdl)肽或其變體。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，vsdl肽包含根據(jù)seqidno：2的氨基酸序列或其變體。在一種實(shí)施方案中，所述融合多肽包括具有c-末端肽切割位點(diǎn)的先導(dǎo)融合配偶體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，先導(dǎo)融合配偶體包含c末端精氨酸殘基。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，先導(dǎo)融合配偶體包括根據(jù)seqidno：3的氨基酸序列。在一種實(shí)施方案中，所述肽的切割位點(diǎn)是胰蛋白酶切割位點(diǎn)。在一種實(shí)施方案中，裂解劑是胰蛋白酶或胰蛋白酶樣酶。在第三方面，本發(fā)明提供了一種制備重組血管擴(kuò)張(vsdl)肽(或其變體或其修飾的肽)的方法，所述方法包括以下步驟：表達(dá)包含至少一種vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)的融合多肽，其中所述肽側(cè)翼是一個(gè)或多個(gè)肽的切割位點(diǎn)，并且其中所述肽特征在于另外不存在胰蛋白酶切割位點(diǎn)；和用在胰蛋白酶切割位點(diǎn)切割的裂解劑在胰蛋白酶切割位點(diǎn)切割融合多肽。；其中切割融合多肽的步驟從融合多肽釋放所述肽。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含與編碼具有c-末端胰蛋白酶切割位點(diǎn)的vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)的至少一個(gè)核苷酸序列操作融合的先導(dǎo)融合配偶體(具有c-末端胰蛋白酶切割位點(diǎn))的核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建體。在一種實(shí)施方案中，編碼先導(dǎo)融合配偶體的核苷酸序列可操作地融合到編碼具有c-末端胰蛋白酶切割位點(diǎn)的vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)的核苷酸序列的2－20個(gè)(或更多)串聯(lián)拷貝。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于重組表達(dá)vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含表達(dá)構(gòu)建體，表達(dá)構(gòu)建體包含編碼與具有c-末端胰蛋白酶切割位點(diǎn)的vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)的至少一個(gè)核苷酸序列操作融合的具有c-末端胰蛋白酶切割位點(diǎn)的先導(dǎo)融合配偶體的核苷酸序列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了一種制備重組血管擴(kuò)張肽的方法，所述方法包括以下步驟：表達(dá)包含所述vsdl肽的串聯(lián)拷貝的融合多肽，其中所述vsdl肽側(cè)翼是位于n-末端的肽切割位點(diǎn)和位于c-末端的肽切割位點(diǎn)，其中所述vsdl肽另外不存在所述肽切割位點(diǎn)；和用在肽切割位點(diǎn)切割的裂解劑在肽切割位點(diǎn)切割融合多肽；其中切割融合多肽的步驟從融合多肽釋放所述vsdl肽；和其中所述vsdl肽由包含天然c末端精氨酸殘基的天然肽序列構(gòu)成；其中所述vsdl肽的每一串連拷貝的位于c-末端的肽切割位點(diǎn)由所述天然c末端精氨酸殘基構(gòu)成；和所述融合多肽中除了最后vsdl肽的每一vsdl肽串聯(lián)拷貝的天然c末端精氨酸殘基還作為下一個(gè)vsdl肽串聯(lián)拷貝的位于n-末端的肽的切割位點(diǎn)；和從所述融合多肽釋放的所述vsdl肽是天然vsdl肽。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了一種表達(dá)構(gòu)建體，包含編碼與編碼具有vsdl肽的2～20個(gè)串聯(lián)拷貝的至少一個(gè)核苷酸序列操作融合的先導(dǎo)融合配偶體的核苷酸序列；其中所述先導(dǎo)融合配偶體具有c－末端胰蛋白酶切割位點(diǎn)；和其中所述vsdl肽側(cè)翼是位于n-末端的肽切割位點(diǎn)和位于c-末端的肽切割位點(diǎn)，和所述vsdl肽另外不存在所述肽的切割位點(diǎn)；所述vsdl肽由包含c末端精氨酸殘基的天然肽序列構(gòu)成；所述vsdl肽的每一串連拷貝的位于c-末端的肽切割位點(diǎn)由所述c末端精氨酸殘基構(gòu)成；和所述融合多肽中除了最后vsdl肽的每一vsdl肽串聯(lián)拷貝的c末端精氨酸殘基還作為下一個(gè)vsdl肽串聯(lián)拷貝的位于n-末端的肽的切割位點(diǎn)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了一種重組表達(dá)肽的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含所述表達(dá)構(gòu)建體。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了一種重組融合多肽，包含與vsdl肽的2～20個(gè)串聯(lián)拷貝連接的先導(dǎo)融合配偶體，其中所述先導(dǎo)融合配偶體具有c－末端胰蛋白酶切割位點(diǎn)，和其中所述vsdl肽側(cè)翼是位于n-末端的肽切割位點(diǎn)和位于c-末端的肽切割位點(diǎn)，和所述vsdl肽另外不存在所述肽的切割位點(diǎn)；所述vsdl肽由包含c末端精氨酸殘基的天然肽序列構(gòu)成；所述vsdl肽的每一串連拷貝的位于c-末端的肽切割位點(diǎn)由所述c末端精氨酸殘基構(gòu)成；和所述融合多肽中除了最后vsdl肽的每一vsdl肽串聯(lián)拷貝的c末端精氨酸殘基還作為下一個(gè)vsdl肽串聯(lián)拷貝的位于n-末端的肽的切割位點(diǎn)。附圖說明圖1提供了包含指定為b72r的先導(dǎo)融合配偶體的vsdl肽的氨基酸序列和vsd1－鏈節(jié)和3－鏈節(jié)融合蛋白的氨基酸序列；斜體序列代表先導(dǎo)融合配偶體(b72r)并且箭頭指示胰蛋白酶切割位點(diǎn)；圖2提供了b72r和b72(q)r-vsdl基因融合體的核苷酸序列，包括側(cè)翼的限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)的核苷酸序列；蛋白質(zhì)編碼區(qū)以粗體表示，其中斜體序列代表先導(dǎo)融合配偶體的核苷酸序列。每個(gè)基因融合體的長(zhǎng)度示于括號(hào)內(nèi)；圖3提供了用于表達(dá)包含3，6，8和10個(gè)vsdl串聯(lián)重復(fù)的以b72r-vsdl和b72r-為基礎(chǔ)的融合多肽的質(zhì)粒的簡(jiǎn)明示意圖。質(zhì)粒的功能是復(fù)制(cole1ori)起源，lac阻遏基因(laci)，trc和tac啟動(dòng)子，vsdl基因融合體，轉(zhuǎn)錄終止子(rrnbt1t2)和卡那霉素抗性標(biāo)記(km)；圖4提供了b72r-vsdl和b72r-(vsdl)3表達(dá)的sds-page分析的圖像；分級(jí)培養(yǎng)樣品(p：沉淀球/不溶部分，wcl:全細(xì)胞溶胞產(chǎn)物和s：上清液/可溶性級(jí)分在減少4-12％的nupagemes凝膠公司，加利福尼亞州卡爾斯巴德，美國(guó))上分析，并用simplybluetmsafe(invitrogen)，預(yù)先染色蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物(invitrogen)被用作分子量標(biāo)記；圖5提供的b72(q)r-vsdl融合多肽表達(dá)的sds-page分析的圖像；將指定培養(yǎng)樣品進(jìn)行歸一化并且溶胞產(chǎn)物在用simplybluetmsafe染色的減少4-12％nupagemes凝膠上分析，用預(yù)先染色蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物作為分子量標(biāo)記；圖6提供分批加料培養(yǎng)之后的b72r-vsdl和b72r-(vsdl)3表達(dá)的sds-page分析的圖像；將指定培養(yǎng)樣品進(jìn)行歸一化并且溶胞產(chǎn)物在用simplybluetmsafe染色的減少4-12％nupagemes凝膠上分析，用預(yù)先染色蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物作為分子量標(biāo)記；圖7提供顯示室溫下消化過夜后對(duì)從b72r-(vsdl)3溶胞產(chǎn)物(3g/l融合多肽)產(chǎn)生的一定量vsdl加入(sigma-aldrichco，圣路易斯，mo，美國(guó))的作用的圖形結(jié)果；圖8提供了一個(gè)顯示來自消化的溶胞產(chǎn)物的重組vsdl的色譜分離(amberchromcg300c；rohmandhaascompany，賓夕法尼亞州費(fèi)城，美國(guó))的示蹤圖；實(shí)線＝uv280吸收和虛線＝導(dǎo)電性；圖9提供顯示來自消化的溶胞產(chǎn)物的重組vsdl的色譜分離(fractogeltmae；默克公司，新澤西州懷特豪斯站，美國(guó))的示蹤圖；實(shí)線＝uv280吸收和虛線＝導(dǎo)電性；圖10顯示根據(jù)加里50分光光度計(jì)(瓦里安公司，帕洛阿爾托加利福尼亞州，美國(guó))測(cè)定的合成vsdl肽和重組vsdl(右)的uv280吸收曲線；圖11提供顯示來自消化的溶胞產(chǎn)物的重組vsdl的色譜分離(改進(jìn)的amberchromcg300c方案)的示蹤圖，方框代表匯集的洗脫級(jí)分；和圖12提供顯示chromasorb膜過濾之后的來自消化的溶胞產(chǎn)物的重組vsdl的分離的示蹤圖，其中方塊代表不同的匯集的洗脫級(jí)分。具體實(shí)施方式本發(fā)明人已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，有利地，某些肽的氨基酸序列不同尋常地缺乏特定肽切割位點(diǎn)，除了位于所述肽的一個(gè)末端的單一肽切割位點(diǎn)，或能被工程化成具有這樣的序列。本發(fā)明人還認(rèn)識(shí)到，通過表達(dá)融合多肽前后的肽，可以在肽的另一末端提供另一個(gè)肽切割位點(diǎn)，以使得所表達(dá)的融合多肽的切割從融合多肽釋放肽。這樣的制備系統(tǒng)能夠有利地提供足夠數(shù)量和質(zhì)量的治療應(yīng)用的重組產(chǎn)生感興趣的肽的方法。因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種制備重組肽的方法，所述方法包括以下步驟：表達(dá)包含所述肽的融合多肽，其中所述肽側(cè)翼是一個(gè)或多個(gè)肽切割位點(diǎn)，并且其中所述肽另外不存在所述肽的切割位點(diǎn)；和用在肽切割位點(diǎn)切割的裂解劑在肽切割位點(diǎn)切割融合多肽。；其中切割融合多肽的步驟從融合多肽釋放所述肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解術(shù)語(yǔ)”重組”是指包含或由多于一種起源的遺傳材料產(chǎn)生的生物材料，例如，重組肽通常被理解為是從編碼第一來源的肽的多核苷酸分子產(chǎn)生，所述第一來源的肽在第二來源的合適的宿主細(xì)胞中被表達(dá)或制備。能產(chǎn)生重組肽的寬范圍的表達(dá)系統(tǒng)是已知的，例如，在適合于特殊肽表達(dá)的條件下的細(xì)胞培養(yǎng)物。宿主細(xì)胞能包括細(xì)菌細(xì)胞(例如大腸桿菌(escherichiacoli)，鏈霉菌屬(streptomycessp.)，芽孢桿菌屬(bacillussp.)，假單胞菌屬(pseudomonassp.)，葡萄球菌屬(staphylococcussp.)(例如鼠傷寒沙門氏菌(s.typhimurium)等)等)，真菌細(xì)胞，如酵母細(xì)胞(例如釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)，巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)等)，霉菌或絲狀真菌(例如曲霉(aspergillussp.))，昆蟲細(xì)胞(例如果蠅s2和草地夜蛾(spodopterafrugiperda)(例如夜蛾sf9細(xì)胞)，并包括桿狀病毒輔助系統(tǒng))，哺乳動(dòng)物細(xì)胞(適合的大量細(xì)胞系包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(cho)細(xì)胞，猴腎(cos)細(xì)胞，人胚胎腎(hek)細(xì)胞，幼倉(cāng)鼠腎(bhk)細(xì)胞，鼠黑素瘤細(xì)胞等)，和植物細(xì)胞。重組多肽或者也可以在轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物中表達(dá)。在本發(fā)明中，優(yōu)選的是表達(dá)融合多肽的步驟是使用大腸桿菌作為表達(dá)宿主進(jìn)行的。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解術(shù)語(yǔ)”肽”是指通過肽鍵鍵合在一起的氨基酸的單一線性聚合物鏈，第一個(gè)氨基酸是在氨基(n)端和最后一個(gè)氨基酸是在羧基(c)末端。在本發(fā)明的上下文中，應(yīng)當(dāng)理解本文所用的術(shù)語(yǔ)”肽”是為了指感興趣的肽，其要被表達(dá)，并在融合多肽裂解之后從融合多肽釋放。肽可以是全長(zhǎng)肽(即如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的從編碼核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的全長(zhǎng)肽)。但是肽還可以從較大的肽或多肽衍生，例如，肽可以是前蛋白原的成熟肽部分，或者是能被加工成很多較小肽的多肽的一部分，或者是較大的肽的片段，等。優(yōu)選地，肽可從編碼核苷酸序列翻譯成它的最終形式，即，肽不經(jīng)歷任何附加的翻譯后加工只是被根據(jù)本發(fā)明的裂解劑裂解。但是，本發(fā)明并不打算排除實(shí)施方案，其中肽是一個(gè)較大肽的一部分，如前蛋白原或多肽，其包含能夠被加工成許多較小的肽的氨基酸序列(例如通過表達(dá)后處理(例如裂解)去除較大肽的部分，其中所述處理是除根據(jù)本發(fā)明的裂解之外的)。肽可以是天然肽或如下所述的其經(jīng)修飾的肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的是，與肽相關(guān)聯(lián)使用時(shí)的術(shù)語(yǔ)”氨基端”或“氨基方向”指的是朝向肽的n-末端方向，同樣地，與肽相關(guān)聯(lián)使用時(shí)的術(shù)語(yǔ)”羧基端”或“羧基方向”指的是朝向肽的c-末端方向。如本文所用的術(shù)語(yǔ)”融合多肽”意在指至少兩個(gè)肽通過肽鍵鍵合在一起的氨基酸單一線性聚合物鏈，使得第一肽的c-末端殘基鄰接第二肽的n-末端殘基(任選被一個(gè)短接頭序列分隔)。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，一些肽能以這種方式融合在一起，在這種情況下，所述第二肽的c-末端殘基可以鄰接第三肽的n-末端殘基，等等。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白術(shù)語(yǔ)”肽的切割位點(diǎn)”是指在那里裂解劑切割肽主鏈的位點(diǎn)，其中那個(gè)位點(diǎn)與作為裂解劑的識(shí)別位點(diǎn)的特定氨基酸或氨基酸特定序列相關(guān)。在氨基酸的特定識(shí)別序列的情況下，在那個(gè)序列中的一個(gè)位點(diǎn)，在序列的c-末端或n-末端，或在序列的外部，裂解劑可以切割肽主鏈，即是，一些殘基從序列的羧基或者氨基方向被去除。根據(jù)本發(fā)明，所述肽”側(cè)翼是一個(gè)或多個(gè)肽的切割位點(diǎn)”。這個(gè)短語(yǔ)意指肽的切割位點(diǎn)位于融合多肽內(nèi)，在肽的至少一個(gè)末端，更優(yōu)選地，在肽的兩個(gè)末端(例如針對(duì)肽的每個(gè)復(fù)制體位于一個(gè)n-末端和一個(gè)c-末端，使得用在肽的切割位點(diǎn)切割的裂解劑切割融合多肽時(shí)，從融合多肽能釋放所述肽。裂解劑可以是以特定方式即在與特定的氨基酸或氨基酸的特定序列相關(guān)聯(lián)的特定肽切割位點(diǎn)切割肽的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的裂解劑。裂解劑可以是化學(xué)裂解劑或酶促裂解劑。在本發(fā)明中可以使用的多種裂解劑列在表1中。表1.肽裂解劑和它們各自的肽切割位點(diǎn)在這里，肽切割位點(diǎn)如作為裂解劑識(shí)別位點(diǎn)的單一的特定氨基酸的氨基側(cè)或羧基側(cè)箭頭所示，或者如作為裂解劑識(shí)別位點(diǎn)的氨基酸的特定序列的氨基側(cè)，羧基側(cè)，或序列內(nèi)箭頭所示。與肽切割位點(diǎn)(這里的所有氨基酸序列)相關(guān)使用的三字母或單字母氨基酸代碼如表2所示。表2.氨基酸代碼氨基酸三字母代碼單字母代碼丙氨酸alaa精氨酸argr天冬酰胺asnn天冬氨酸(天冬氨酸鹽)aspd半胱氨酸cysc谷氨酰胺glnq谷氨酸(谷氨酸鹽)glue甘氨酸glyg組氨酸hish異亮氨酸ilei亮氨酸leul賴氨酸lysk甲硫氨酸metm苯丙氨酸phef脯氨酸prop絲氨酸sers蘇氨酸t(yī)hrt色氨酸t(yī)rpw酪氨酸t(yī)yry纈氨酸valv在優(yōu)選的實(shí)施方案中，切割位點(diǎn)是酪氨酸或酪氨酸樣酶(即在酪氨酸切割位點(diǎn)裂解)。但是其他裂解劑也可以適合用于本發(fā)明，包括，例如，半胱天冬酶1，半胱天冬酶2，半胱天冬酶3，半胱天冬酶4，半胱天冬酶5，半胱天冬酶6，半胱天冬酶7，半胱天冬酶8，半胱天冬酶9，半胱天冬酶10，高特異性胰凝乳蛋白酶，低特異性胰凝乳蛋白酶，因子xa，甲酸，谷氨酰肽內(nèi)切酶，顆粒酶b，羥胺，亞碘酰安息香酸，lysc，lysn，ntcb(2-硝基-5-氰硫基苯甲酸)，胃蛋白酶(ph1.3)，胃蛋白酶(ph>2)，脯氨酸-肽內(nèi)切酶，蛋白酶k，葡萄球菌肽酶i，嗜熱菌蛋白酶，反素蛋白酶等。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白其他裂解劑可以根據(jù)本發(fā)明來使用，除了確定用具體的裂解劑切割要求什么條件之外，要知道確定合適的裂解劑的肽切割位點(diǎn)的方法。在一種實(shí)施方案中，在肽的兩端提供肽切割位點(diǎn)，并且可以需要兩種裂解劑從融合多肽釋放肽。本發(fā)明人已經(jīng)認(rèn)識(shí)到融合多肽可有利地包含該肽的串聯(lián)拷貝，其中肽的每個(gè)拷貝側(cè)翼連著一個(gè)或多個(gè)肽切割位點(diǎn)。因此，在第二方面，本發(fā)明提供了一種制備重組肽的方法，所述方法包括以下步驟：表達(dá)包含肽的串聯(lián)拷貝的融合多肽，其中所述肽側(cè)翼是一個(gè)或多個(gè)肽切割位點(diǎn)，并且其中所述肽另外不存在所述肽切割位點(diǎn)；和用在肽切割位點(diǎn)切割的裂解劑在肽切割位點(diǎn)切割融合多肽；其中切割融合多肽的步驟從融合多肽釋放所述肽。短語(yǔ)”肽串聯(lián)拷貝”被理解為是指以串聯(lián)頭-尾排列可操作地連一個(gè)以上的肽，使得第一肽的c-末端殘基相鄰接第二肽的n-末端殘基。在一些實(shí)施方案中，其中包括兩個(gè)以上的多聯(lián)體肽，所述第二肽的c-末端殘基相鄰接第三肽的n-末端殘基，等等。優(yōu)選地，一個(gè)肽的c-末端殘基直接鄰接下一個(gè)肽的n-末端殘基。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是通過能潛在地用來將肽拷貝連接在一起的短連接序列能連接肽。要明白這樣的實(shí)施方案落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。任何數(shù)量的肽的拷貝可以串聯(lián)排列在融合多肽內(nèi)，前提是融合多肽被表達(dá)到令人滿意的水平。在一種實(shí)施方案中，融合多肽包含2至20個(gè)(或更多)的肽的串聯(lián)拷貝。例如，融合多肽可以包含肽的二，三，四，五，六，七，八，九，十，十一，十二，十三，十四，十五，十六，十七，十八，十九個(gè)或二十個(gè)拷貝。在一種實(shí)施方案中，所述融合多肽包含2至10個(gè)串聯(lián)肽。在一種實(shí)施方案中，所述融合多肽包含3個(gè)串聯(lián)肽。在另一種實(shí)施方案中，所述融合多肽包含肽的10個(gè)串聯(lián)拷貝。但是，融合多肽中有特定數(shù)目拷貝的情況下，例如，肽的3個(gè)串聯(lián)拷貝，要理解的是，多肽中總共有三個(gè)所述肽。因此，”肽的3個(gè)串聯(lián)拷貝”不是要指除了所述肽的3個(gè)”拷貝”之外有一個(gè)初始肽。包含多聯(lián)體肽的融合多肽(和編碼所述融合多肽的多核苷酸構(gòu)建體)另外在這里被指作，例如，當(dāng)存在三個(gè)串聯(lián)肽時(shí)，”3-鏈節(jié)”，當(dāng)存在六個(gè)串聯(lián)肽時(shí)，”6-鏈節(jié)”，等。同樣，包含單一肽的融合多肽(和編碼所述融合多肽的多核苷酸構(gòu)建體)另外在這里被指作”1-鏈節(jié)”。根據(jù)本發(fā)明，所述肽”側(cè)翼是一個(gè)或多個(gè)肽的切割位點(diǎn)”。在所述肽的串聯(lián)拷貝前后，這個(gè)短語(yǔ)意指肽切割位點(diǎn)位于融合多肽中，在所述肽的每個(gè)拷貝的至少一個(gè)末端，更優(yōu)選地，在所述肽的兩端(例如就所述肽的每個(gè)拷貝來說一個(gè)位于n-末端和一個(gè)位于c-末端)，使得使用在肽切割位點(diǎn)切割的裂解劑對(duì)融合多肽切割時(shí)所述肽從所述融合多肽被釋放。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在肽的每個(gè)拷貝的兩端提供肽的切割位點(diǎn)，一個(gè)單一肽切割位點(diǎn)位于各個(gè)肽拷貝之間，如此排列，使得在所述位點(diǎn)由單一裂解劑對(duì)肽切割，同時(shí)產(chǎn)生肽的一個(gè)拷貝的c-末端和肽的鄰接拷貝的n-末端。在這個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選單一肽切割位點(diǎn)是肽所有拷貝之間的相同類型(例如r↓)。本發(fā)明第二方面的方法可以特別適合制備特征在于沒有內(nèi)在肽切割位點(diǎn)的任何肽。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽具有天然序列。上下文中術(shù)語(yǔ)”天然”意指肽的序列是自然界發(fā)現(xiàn)的，即沒有經(jīng)修飾的，例如去除肽切割位點(diǎn)或者另外導(dǎo)入氨基酸取代。但是，肽可以具有截短的天然序列或天然變體序列。在一個(gè)可替代實(shí)施方案中，肽可被修改。適用于本發(fā)明中使用的修飾肽可包括天然肽的衍生物，變體或模擬物，其包括氨基酸序列小的變化，前提是這樣的變化不會(huì)導(dǎo)致生物活性任何實(shí)質(zhì)性下降或變化(即相比于天然肽)，并且沒有引入另外的肽切割位點(diǎn)(優(yōu)選地，沒有其它胰蛋白酶切割位點(diǎn))。這些變化可包括保守的氨基酸取代，如：gly，ala，val，ile，leu，met；asp，glu，asn，gln；ser，thr；lys，arg，his；phe，tyr，trp，his；和pro，nα-烷基氨基酸；和非保守性氨基酸取代。表3詳細(xì)列出普通的保守性氨基酸取代。表3.例示的保守性氨基酸取代保守性氨基酸取代alaval*，leu，ilearglys*asngln*，his，aspaspglu*，asncysserglnasn*，his，gluasp*，γ-羧基谷氨酸(gla)glyprohisasn，gln，ileleu*，val，met，ala，phe，正亮氨酸(nle)leunle，ile*，val，met，ala，phelysarg*，gln，asn，鳥氨酸(orn)metleu*，ile，phe，nlepheleu*，val，ile，alaprogly*，羥基脯氨酸(hyp)，ser，thrserthrthrsertrptyrtyrtrp，phe*，thr，servalile，leu*，met，phe，ala，nle*指優(yōu)選的保守性取代合適的經(jīng)修飾的肽可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法來獲得。例如，肽的模擬物能使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法根據(jù)沒有二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)信息的氨基酸序列進(jìn)行設(shè)計(jì)(kirshenbaum等，1999)。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，它可以有可能工程處理肽以除去現(xiàn)有的內(nèi)部肽切割位點(diǎn)(例如，通過取代或缺失適當(dāng)?shù)陌被?。例如，天然人胰高血糖素樣肽(glp)-1的氨基酸序列(來自于人胰高血糖素前原的氨基酸98至127，它具有ncbi參考np_002045)包含一個(gè)c-末端精氨酸(r)殘基和兩個(gè)內(nèi)部賴氨酸(k)殘基。兩個(gè)內(nèi)部賴氨酸殘基能被修飾為，例如，谷氨酰胺(q)或天冬酰胺(n)，其去除了內(nèi)部胰蛋白酶切割位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施例中，相比細(xì)胞質(zhì)蛋白，一些膜蛋白質(zhì)具有低數(shù)量的精氨酸和賴氨酸殘基，而這樣的殘基可通過修改被移除以創(chuàng)建無內(nèi)部肽切割位點(diǎn)的肽。在一種實(shí)施方案中，肽的每個(gè)串聯(lián)拷貝與所述肽的每一個(gè)其它串聯(lián)拷貝是相同的。然而，在可替代實(shí)施例中，肽的不同變體可在多聯(lián)體內(nèi)被表達(dá)。也就是說，術(shù)語(yǔ)”肽的串聯(lián)拷貝”意在包括與所述肽的另一個(gè)串聯(lián)拷貝相比，所述肽的一個(gè)(或多個(gè))”串聯(lián)拷貝”是其天然變體或其修飾的肽。例如，所述肽的一個(gè)串聯(lián)拷貝可以包括天然序列，而所述肽的另一個(gè)串聯(lián)拷貝包括所述肽的天然變體，等。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述肽的不同串聯(lián)拷貝可以包括不同的天然或修飾的氨基酸序列，使得產(chǎn)生適合作為裂解劑的識(shí)別位點(diǎn)的不同的氨基酸或氨基酸序列。在一種實(shí)施方案中，所述肽的切割位點(diǎn)是一種胰蛋白酶切割位點(diǎn)。術(shù)語(yǔ)”胰蛋白酶切割位點(diǎn)”被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解為是指其中所述肽主鏈由胰蛋白酶切割的位點(diǎn)，其中所述位點(diǎn)與適合作為胰蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的特定氨基酸或特定氨基酸序列相關(guān)。胰蛋白酶傾向于在賴氨酸(k)或精氨酸(r)氨基酸殘基的羧基側(cè)裂解肽，除了當(dāng)它們后面緊跟著脯氨酸(p)。但是，賴氨酸或精氨酸殘基周圍確切的氨基酸殘基可以影響胰蛋白酶裂解的效率。胰蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的例子包括，例如，dr↓e，qr↓e，sk↓n，等，其中箭頭指肽切割位點(diǎn)(即肽主鏈被裂解處的位點(diǎn))。但是本領(lǐng)域技術(shù)人員理解大多數(shù)賴氨酸或精氨酸殘基可以適合作為胰蛋白酶羧基側(cè)切割的位點(diǎn)。切割步驟能通過，例如，用在胰蛋白酶切割位點(diǎn)(即在精氨酸或賴氨酸殘基的羧基端)處切割的裂解劑在適合發(fā)生裂解的條件下溫育融合多肽，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員明白的。在一種實(shí)施方案中，裂解劑是胰蛋白酶。胰蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶并且經(jīng)常在研究實(shí)驗(yàn)室使用以裂解肽。根據(jù)本發(fā)明使用的胰蛋白酶可從許多不同的物種(包括牛，豬，人等)分離，所有這些是可商購(gòu)的和/或重組產(chǎn)生的胰蛋白酶(包括牛，豬等)，這也是容易獲得的，都可以使用。此外，胰蛋白酶能在植物細(xì)胞，例如玉米細(xì)胞中重組產(chǎn)生。(如牛trypzean，sigma-aldrich公司)是植物中制備的重組胰蛋白酶的例子。因此，在一種實(shí)施方案中，裂解劑是植物細(xì)胞重組產(chǎn)生的胰蛋白酶。植物產(chǎn)生的重組胰蛋白酶特別有用于切割用于治療目的的肽，以減少不希望的動(dòng)物來源的污染物存在于最終肽產(chǎn)物的可能性。但是，以一種方式產(chǎn)生使得胰蛋白酶基本上沒有(或者有可接受水平的)動(dòng)物污染物的其他胰蛋白酶產(chǎn)物可以用于治療應(yīng)用而制備的肽。例如，裂解劑可以是酵母細(xì)胞產(chǎn)生的胰蛋白酶。優(yōu)選地，裂解劑是重組胰蛋白酶。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，有許多具有胰蛋白酶或胰蛋白酶樣活性(即在胰蛋白酶切割位點(diǎn)切割的胰蛋白酶樣酶)的其它酶也可以適合用于在按照本發(fā)明在某些情況下在胰蛋白酶切割位點(diǎn)切割肽。例如，凝血酶是胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，其優(yōu)先識(shí)別氨基酸序列的lvpr↓gs(seqidno:7)并且在精氨酸和甘氨酸殘基之間的肽切割位點(diǎn)(即在一個(gè)精氨酸(r)殘基的羧基側(cè))切割。因此，凝血酶將在一些胰蛋白酶切割位點(diǎn)裂解肽。在另一個(gè)實(shí)施例中，梭菌蛋白酶(也稱為蛋白內(nèi)切酶arg-c和梭狀芽胞桿菌肽酶b)主要在精氨酸殘基處切割，但也可以在賴氨酸殘基處切割至較輕程度。因此，梭菌蛋白酶將在胰蛋白酶切割位點(diǎn)切割。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，可以存在也適合于在按照本發(fā)明的胰蛋白酶切割位點(diǎn)裂解肽的其它裂解劑。因此，在一種實(shí)施方案中，裂解劑是胰蛋白酶或胰蛋白酶樣酶。在一種實(shí)施方案中，裂解劑是重組胰蛋白酶或重組胰蛋白酶樣酶。胰蛋白酶消化時(shí)間能根據(jù)需要改變。例如，融合多肽可以被胰蛋白酶或胰蛋白酶樣酶消化5分鐘，1小時(shí)，2小時(shí)，6小時(shí)，或過夜等。在一種實(shí)施方案中，所述肽包含一個(gè)c-末端胰蛋白酶切割位點(diǎn)。在一種實(shí)施方案中，肽包含根據(jù)下式的氨基酸序列：x1-x2-…xn-1-xn-(r/k)(seqidno:1)；其中x是除了精氨酸或賴氨酸的任何氨基酸，r/k是精氨酸或賴氨酸，和n是氨基酸的任何合適的數(shù)目。在一種實(shí)施方案中，制備用于治療用途的肽。因此，肽可包括細(xì)胞因子或激素(包括從激素原分子再釋放的激素)或表位或抗原(如用作疫苗)。所述肽可以是，例如，3～100個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，更優(yōu)選地，長(zhǎng)度為5～50個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選地，長(zhǎng)度為10～45個(gè)氨基酸。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述肽是30至40個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，包括例如，33，34，35，36和37個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的肽。優(yōu)選地，所述肽沒有內(nèi)部胰蛋白酶切割位點(diǎn)。在一種實(shí)施方案中，所述肽選自從心房鈉尿肽(anp)衍生的肽，如果需要的話，作為修改，除去內(nèi)部的肽切割位點(diǎn)。更優(yōu)選地，所述肽是不具有內(nèi)部肽切割位點(diǎn)，并優(yōu)選沒有內(nèi)部胰蛋白酶切割位點(diǎn)(即除c-末端精氨酸之外，所有的精氨酸和賴氨酸殘基已經(jīng)被瞄定進(jìn)行氨基酸取代，優(yōu)選通過用組氨酸(h)的保守性氨基酸取代)的血管擴(kuò)張肽(vsdl)或其變體或其修飾的肽，或修飾的鉀尿肽(kp)。因此，在一種實(shí)施方案中，所述肽是修飾的kp肽(沒有內(nèi)部胰蛋白酶切割位點(diǎn))，并且優(yōu)選地，是包含下列氨基酸序列或由下列氨基酸序列(衍生于人心房利鈉激素原(anp原)的殘基79-98)組成的修飾的人kp:ser-ser-asp-xa-ser-ala-leu-leu-xb-ser-xc-leu-xd-ala-leu-leu-thr-ala-pro-arg(seqidno:20)；其中x是除了精氨酸或賴氨酸的任何氨基酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，肽是vsdl肽或其變體或其修飾的肽。如本文所用，vsdl的變體可以是天然變體。另外變體vsdl可以是改性vsdl肽。修飾的vsdl肽不僅包括變體肽(即非天然變體)，而且還有天然vsdl肽的衍生物和模擬物，其中包括不導(dǎo)致生物學(xué)活性的任何顯著下降或變化(例如根據(jù)美國(guó)專利no5,691,310(這里引作參考)中dlvesely描述的體外血管擴(kuò)張?jiān)囼?yàn)(使用主動(dòng)脈條)測(cè)定的，或者根據(jù)dlvesely(vesely等.1987)描述的用于增強(qiáng)的環(huán)gmp水平的試驗(yàn)測(cè)定的，其從中衍生的vsdl肽的生物學(xué)活性下降或變化不超過10％)的該氨基酸序列中小的改變，并且不包括或引入另一個(gè)被所述裂解劑識(shí)別的肽切割位點(diǎn)(優(yōu)選沒有另外的胰蛋白酶切割位點(diǎn))。這些變化可包括保守的氨基酸取代，如上面表3中詳述的。vsdl肽內(nèi)合適的氨基酸取代的一些具體的例子可包括pro→gln(具體地在proanp的位置41；即vsdl肽的位置10)，thr→ala(具體地在proanp的位置59；即vsdl肽的位置28)，glu→asp(具體地在proanp的位置61；即vsdl肽的位置30)，和ser→asn(具體地在proanp的位置63；即vsdl肽的位置32)。更優(yōu)選地，所述肽是具有天然序列的vsdl肽，如人vsdl的天然氨基酸序列(從人proanp的殘基31-67衍生的如下)：glu-val-val-pro-pro-gln-val-leu-ser-glu-pro-asn-glu-glu-ala-gly-ala-ala-leu-ser-pro-leu-pro-glu-val-pro-pro-trp-thr-gly-glu-val-ser-pro-ala-gln-arg(seqidno:2).其它合適的天然vsdl肽可以包括:婆羅洲猩猩(pongopygmaeus)(普通猩猩)glu-val-val-pro-pro-gln-val-leu-ser-glu-gln-asn-glu-glu-ala-gly-ala-ala-leu-ser-pro-leu-pro-glu-val-pro-pro-trp-thr-gly-glu-val-ser-pro-ala-gln-arg(seqidno:8)；和貓屬(feliscatus)glu-val-val-pro-pro-gln-val-leu-ser-glu-gln-asn-glu-glu-ala-gly-ala-ala-leu-ser-pro-leu-pro-glu-val-pro-pro-trp-ala-gly-glu-val-asn-pro-ala-gln-arg(seqidno:9).最優(yōu)選地，所述肽是包含根據(jù)seqidno2的氨基酸序列或由根據(jù)seqidno2的氨基酸序列構(gòu)成的vsdl肽。然而，在其它實(shí)施方案中，vsdl肽或者可以包含根據(jù)seqidno：8或9的氨基酸序列或由根據(jù)seqidno：8或9的氨基酸序列構(gòu)成。優(yōu)選地，vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)包含c-端精氨酸殘基。例如，這里所描述的天然vsdl肽包含的c-末端精氨酸殘基，但有沒有內(nèi)部的精氨酸或賴氨酸殘基。因此，c-末端精氨酸殘基可適合作為c-末端位置的肽切割位點(diǎn)。即，在精氨酸殘基的羧基端切割的肽裂解劑，如胰蛋白酶和胰蛋白酶樣酶，精確地在c-末端從融合多肽(例如，從vsdl肽或其變體或其修飾的相鄰拷貝肽)裂解vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)。然而，人vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)，除了缺失內(nèi)部的精氨酸殘基，另外缺失天冬氨酸，半胱氨酸，組氨酸，異亮氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸或酪氨酸殘基。因此，有可能利用肽切割位點(diǎn)，其在根據(jù)本發(fā)明的這些位點(diǎn)中的一個(gè)處切割，也就是，例如，就vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)來說在位于n-末端的肽切割位點(diǎn)，如下面所述?；蛘呋蛄硗?，可以用另一個(gè)天門冬氨酸，半胱氨酸，組氨酸，異亮氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸或酪氨酸殘基取代vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)的c-末端精氨酸殘基，使得所述肽能通過這些殘基中的一個(gè)處裂解的裂解劑從融合多肽裂解。本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解，這個(gè)實(shí)施方案作為選擇可被應(yīng)用到其它合適的肽，如本文中所描述的。在一種實(shí)施方案中，融合多肽包含位于vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)n-末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，包括一個(gè)肽切割位點(diǎn)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述融合多肽包含具有c-末端肽切割位點(diǎn)的先導(dǎo)融合配偶體，其向vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)提供了一個(gè)n-末端取位的肽切割位點(diǎn)。在一種實(shí)施方案中，vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)”側(cè)翼有胰蛋白酶切割位點(diǎn)”。這要理解為其含義是，胰蛋白酶切割位點(diǎn)位于所述融合多肽內(nèi)，在vsdl肽或其變體或修飾肽的兩端(即，一個(gè)在vsdl肽的n-末端，一個(gè)在c-末端)，使得該vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)能在胰蛋白酶切割位點(diǎn)用酶消化時(shí)被從融合多肽釋放。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，在胰蛋白酶切割位點(diǎn)的精氨酸或賴氨酸殘基的羧基端上發(fā)生裂解時(shí)，釋放時(shí)從vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)排除精氨酸或賴氨酸殘基，而c-末端取位的胰蛋白酶切割位點(diǎn)意思是精氨酸或賴氨酸在釋放時(shí)將包括vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)中(即釋放時(shí)精氨酸或賴氨酸殘基會(huì)形成vsdl肽的c-末端殘基)。優(yōu)選地，從融合多肽釋放的vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)是完整的(即，全長(zhǎng)vsdl肽)；然而，要明白，該融合多肽可通過改變胰蛋白酶切割位點(diǎn)的位置被設(shè)計(jì)來釋放vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)的截短或延伸的變體。例如，本發(fā)明包括融合多肽在某些情況下的表達(dá)，其中位于n-末端的胰蛋白酶切割位點(diǎn)位于vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)的更上游(即在氨基方向)的vsdl肽的表達(dá)(或其變體或其修飾的肽)，酶促裂解時(shí)產(chǎn)生n-末端延伸的vsdl肽。類似地，c-末端延伸的vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)能被設(shè)計(jì)在c-末端胰蛋白酶切割位點(diǎn)之前包括附加的氨基酸。或者，如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，通過缺失氨基酸能設(shè)計(jì)截短的vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)。在一種實(shí)施方案中，融合多肽包含vsdl肽的串聯(lián)拷貝(即vsdl肽的多聯(lián)體重復(fù))或其變體或其修飾的肽。優(yōu)選地，所述vsdl肽的每個(gè)拷貝(或其變體或其修飾的肽)具有肽切割位點(diǎn)(例如胰蛋白酶切割位點(diǎn))，在每個(gè)vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)的c-末端，以使得肽的切割位點(diǎn)還適合作為多聯(lián)體排列中vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)之后的位于n-末端的肽的切割位點(diǎn)(除了融合多肽中最后vsdl肽)，使得每個(gè)vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)側(cè)翼是根據(jù)本發(fā)明的肽切割位點(diǎn)。這種排列有利地導(dǎo)致各vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)在用裂解劑裂解時(shí)從融合多肽分別釋放。在融合多肽中可以串聯(lián)排列任何數(shù)目的vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)的拷貝，前提是融合多肽被表達(dá)至令人滿意的水平。在一種實(shí)施方案中，以至少0.01g/l表達(dá)融合多肽，但優(yōu)選地，以至少0.5g/l表達(dá)融合多肽，更優(yōu)選地，以至少1g/l，更優(yōu)選至少2g/l，更優(yōu)選5g/l，或更優(yōu)選10g/l。優(yōu)選地，所述融合多肽包含兩個(gè)至20(或更多)的vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)的串聯(lián)拷貝。例如，融合多肽可以包含二，三，四，五，六，七，八，九，十，十一，十二，十三，十四，十五，十六，十七，十八，十九或二十個(gè)vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)的串聯(lián)拷貝。在一種實(shí)施方案中，所述融合多肽包含2至10個(gè)vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)的多聯(lián)體肽。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述融合多肽包含3個(gè)vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)的多聯(lián)體肽。在另一種實(shí)施方案中，所述融合多肽包含肽的10個(gè)vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)的串聯(lián)拷貝。在一些實(shí)施方案中，vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)的不同變體可以被串聯(lián)表達(dá)。包含串聯(lián)vsdl肽(和編碼所述融合多肽的多核苷酸構(gòu)建體)或其變體或其修飾的肽的融合蛋白另外在這里被指作，例如，當(dāng)存在三個(gè)多聯(lián)體vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)時(shí)，”3-鏈節(jié)”，當(dāng)存在六個(gè)多聯(lián)體vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)時(shí)，”6-鏈節(jié)”，等。同樣，包含單一vsdl肽或其變體或其修飾的肽的融合多肽(和編碼所述融合多肽的多核苷酸構(gòu)建體)另外在這里被指作”1-鏈節(jié)”。在其中肽包括c-末端肽切割位點(diǎn)的本發(fā)明的實(shí)施方案中，本發(fā)明意在包括在其范圍內(nèi)這種情況，其中一系列串聯(lián)肽中的第一個(gè)肽不從融合蛋白釋放，因?yàn)樗痪哂衝-末端肽切割位點(diǎn)。同樣，在其中肽包括n-末端肽切割位點(diǎn)的本發(fā)明的實(shí)施方案中，本發(fā)明意在包括在其范圍內(nèi)這種情況，其中一系列串聯(lián)肽中的最后一個(gè)肽不從融合蛋白釋放，因?yàn)樗痪哂衏-末端肽切割位點(diǎn)。但是，優(yōu)選地，融合多肽進(jìn)一步包括肽切割位點(diǎn)(即就包括c-末端肽切割位點(diǎn)的肽的串聯(lián)拷貝來說位于n-末端，或者可替換的，就包括n-末端肽切割位點(diǎn)的肽的串聯(lián)拷貝來說位于c-末端)使得肽的各個(gè)串聯(lián)拷貝能從融合多肽被釋放。在一種實(shí)施方案中，融合多肽可以包含融合配偶體。有利地，融合配偶體還可以提供具有提高的溶解度，穩(wěn)定性，活性(例如，通過減少錯(cuò)折疊)和/或提高表達(dá)產(chǎn)量的融合多肽。優(yōu)選地，融合配偶體提供與相鄰肽的一端鄰接的肽切割位點(diǎn)，使得，當(dāng)肽包括或者在其另一端提供一個(gè)肽切割位點(diǎn)時(shí)，所述肽側(cè)翼是根據(jù)本發(fā)明的肽切割位點(diǎn)。在一種實(shí)施方案中，融合多肽可以包含與所述肽相比不同的肽切割位點(diǎn)。在這種情況下，可能需要兩種裂解劑從融合多肽釋放所述肽。在一種實(shí)施方案中，融合多肽包含一個(gè)示蹤融合配偶體，即，示蹤融合配偶體位于所述肽或肽的串聯(lián)拷貝的c-末端。示蹤融合配偶體可以包括對(duì)肽提供位于c-末端的肽切割位點(diǎn)的n-末端肽切割位點(diǎn)(例如，對(duì)包括位于n-末端的肽切割位點(diǎn)的肽提供，使得肽的側(cè)翼是根據(jù)本發(fā)明的肽切割位點(diǎn))。因此，在一種實(shí)施方案中，示蹤融合肽包含一個(gè)n-末端肽切割位點(diǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，示蹤融合配偶體的這樣的n-末端肽切割位點(diǎn)可適合作為先導(dǎo)肽的位于c-末端的肽切割位點(diǎn)(即，位于示蹤融合配偶體的n-末端)。在另一種實(shí)施方案中，融合多肽包含先導(dǎo)融合配偶體，先導(dǎo)融合配偶體位于所述肽或肽的串聯(lián)拷貝的n-末端。先導(dǎo)融合配偶體可以包括對(duì)肽提供位于n-末端的肽切割位點(diǎn)的c-末端肽切割位點(diǎn)(例如，對(duì)包括位于c-末端的肽切割位點(diǎn)的肽提供，使得肽的側(cè)翼是根據(jù)本發(fā)明的肽切割位點(diǎn))。因此，在一種實(shí)施方案中，先導(dǎo)融合肽包含一個(gè)c-末端肽切割位點(diǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，先導(dǎo)融合配偶體的這樣的c-末端肽切割位點(diǎn)可適合作為后面肽的位于n-末端的肽切割位點(diǎn)(即，位于先導(dǎo)融合配偶體的c-末端)。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何合適的肽可以是融合配偶體，前提是得到的肽以足夠的質(zhì)量和/或產(chǎn)率被表達(dá)。已知的融合配偶體的例子包括泛素，葡萄球菌a蛋白，硫氧還蛋白，麥芽糖結(jié)合蛋白，谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶，凝乳酶原，β-半乳糖苷酶，得自t4的gp55，等。已知的重組標(biāo)簽也可以提供融合配偶體，包括his標(biāo)簽，b標(biāo)簽，flag，c-myc標(biāo)簽，蛋白質(zhì)c標(biāo)簽，s-標(biāo)簽，甲硫氨酸，等。融合配偶體能任選地包含附加的肽切割位點(diǎn)，導(dǎo)致融合配偶體在融合多肽裂解時(shí)被裂解為很多小的肽，其可以有助于期望的肽的純化。在一種實(shí)施方案中，融合多肽包含從白介素(il)-2例如牛il-2衍生的先導(dǎo)融合多肽。更優(yōu)選地，先導(dǎo)融合配偶體是從牛il-2衍生的72氨基酸片段，這里稱為b72r，它具有下面氨基酸序列:met-lys-glu-val-lys-ser-leu-leu-leu-asp-leu-gln-leu-leu-leu-glu-lys-val-lys-asn-pro-glu-asn-leu-lys-leu-ser-arg-met-his-thr-phe-asp-phe-tyr-val-pro-lys-val-asn-ala-thr-glu-leu-lys-his-leu-lys-ala-leu-leu-glu-glu-leu-lys-leu-leu-glu-glu-val-leu-asn-leu-ala-pro-ser-lys-asn-leu-asn-val-asp-arg(seqidno:3).因此，在一種實(shí)施方案中，先導(dǎo)融合配偶體是b72r。在一種實(shí)施方案中，b72r融合配偶體的倒數(shù)第二個(gè)天冬氨酸殘基被取代為谷氨酰胺殘基(這里稱為b72(q)r)，具有下列氨基酸序列:met-lys-glu-val-lys-ser-leu-leu-leu-asp-leu-gln-leu-leu-leu-glu-lys-val-lys-asn-pro-glu-asn-leu-lys-leu-ser-arg-met-his-thr-phe-asp-phe-tyr-val-pro-lys-val-asn-ala-thr-glu-leu-lys-his-leu-lys-ala-leu-leu-glu-glu-leu-lys-leu-leu-glu-glu-val-leu-asn-leu-ala-pro-ser-lys-asn-leu-asn-val-gln-arg(seqidno:10).因此，在一種實(shí)施方案中，先導(dǎo)融合配偶體是b72(q)r。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，先導(dǎo)融合配偶體直接在肽之前，或者可選地，所述肽的第一串聯(lián)拷貝之前。在與多聯(lián)體肽相關(guān)的優(yōu)選實(shí)施方案中，第一個(gè)肽直接在第二個(gè)肽之前(等等)。例如，包含b72r先導(dǎo)融合肽和vsdl肽的融合多肽的氨基酸序列可以是如下：met-lys-glu-val-lys-ser-leu-leu-leu-asp-leu-gln-leu-leu-leu-glu-lys-val-lys-asn-pro-glu-asn-leu-lys-leu-ser-arg-met-his-thr-phe-asp-phe-tyr-val-pro-lys-val-asn-ala-thr-glu-leu-lys-his-leu-lys-ala-leu-leu-glu-glu-leu-lys-leu-leu-glu-glu-val-leu-asn-leu-ala-pro-ser-lys-asn-leu-asn-val-asp-arg(↓)glu-val-val-pro-pro-gln-val-leu-ser-glu-pro-asn-glu-glu-ala-gly-ala-ala-leu-ser-pro-leu-pro-glu-val-pro-pro-trp-thr-gly-glu-val-ser-pro-ala-gln-arg(↓)(seqidno:11).箭頭指示胰蛋白酶切割位點(diǎn)的位置。在另一個(gè)實(shí)施例中，包含b72r先導(dǎo)融合肽和三個(gè)串聯(lián)vsdl肽的融合多肽的氨基酸序列可以是如下：met-lys-glu-val-lys-ser-leu-leu-leu-asp-leu-gln-leu-leu-leu-glu-lys-val-lys-asn-pro-glu-asn-leu-lys-leu-ser-arg-met-his-thr-phe-asp-phe-tyr-val-pro-lys-val-asn-ala-thr-glu-leu-lys-his-leu-lys-ala-leu-leu-glu-glu-leu-lys-leu-leu-glu-glu-val-leu-asn-leu-ala-pro-ser-lys-asn-leu-asn-val-asp-arg(↓)glu-val-val-pro-pro-gln-val-leu-ser-glu-pro-asn-glu-glu-ala-gly-ala-ala-leu-ser-pro-leu-pro-glu-val-pro-pro-trp-thr-gly-glu-val-ser-pro-ala-gln-arg(↓)glu-val-val-pro-pro-gln-val-leu-ser-glu-pro-asn-glu-glu-ala-gly-ala-ala-leu-ser-pro-leu-pro-glu-val-pro-pro-trp-thr-gly-glu-val-ser-pro-ala-gln-arg(↓)glu-val-val-pro-pro-gln-val-leu-ser-glu-pro-asn-glu-glu-ala-gly-ala-ala-leu-ser-pro-leu-pro-glu-val-pro-pro-trp-thr-gly-glu-val-ser-pro-ala-gln-arg(↓)(seqidno:12).本領(lǐng)域技術(shù)人員明白根據(jù)這里所描述的，融合多肽中可以包括多個(gè)多聯(lián)體vsdl肽。例如，包含b72r先導(dǎo)融合肽和10個(gè)串聯(lián)vsdl肽的融合多肽的氨基酸序列如下:met-lys-glu-val-lys-ser-leu-leu-leu-asp-leu-gln-leu-leu-leu-glu-lys-val-lys-asn-pro-glu-asn-leu-lys-leu-ser-arg-met-his-thr-phe-asp-phe-tyr-val-pro-lys-val-asn-ala-thr-glu-leu-lys-his-leu-lys-ala-leu-leu-glu-glu-leu-lys-leu-leu-glu-glu-val-leu-asn-leu-ala-pro-ser-lys-asn-leu-asn-val-asp-arg(↓)glu-val-val-pro-pro-gln-val-leu-ser-glu-pro-asn-glu-glu-ala-gly-ala-ala-leu-ser-pro-leu-pro-glu-val-pro-pro-trp-thr-gly-glu-val-ser-pro-ala-gln-arg(↓)glu-val-val-pro-pro-gln-val-leu-ser-glu-pro-asn-glu-glu-ala-gly-ala-ala-leu-ser-pro-leu-pro-glu-val-pro-pro-trp-thr-gly-glu-val-ser-pro-ala-gln-arg(↓)glu-val-val-pro-pro-gln-val-leu-ser-glu-pro-asn-glu-glu-ala-gly-ala-ala-leu-ser-pro-leu-pro-glu-val-pro-pro-trp-thr-gly-glu-val-ser-pro-ala-gln-arg(↓)glu-val-val-pro-pro-gln-val-leu-ser-glu-pro-asn-glu-glu-ala-gly-ala-ala-leu-ser-pro-leu-pro-glu-val-pro-pro-trp-thr-gly-glu-val-ser-pro-ala-gln-arg(↓)glu-val-val-pro-pro-gln-val-leu-ser-glu-pro-asn-glu-glu-ala-gly-ala-ala-leu-ser-pro-leu-pro-glu-val-pro-pro-trp-thr-gly-glu-val-ser-pro-ala-gln-arg(↓)glu-val-val-pro-pro-gln-val-leu-ser-glu-pro-asn-glu-glu-ala-gly-ala-ala-leu-ser-pro-leu-pro-glu-val-pro-pro-trp-thr-gly-glu-val-ser-pro-ala-gln-arg(↓)glu-val-val-pro-pro-gln-val-leu-ser-glu-pro-asn-glu-glu-ala-gly-ala-ala-leu-ser-pro-leu-pro-glu-val-pro-pro-trp-thr-gly-glu-val-ser-pro-ala-gln-arg(↓)glu-val-val-pro-pro-gln-val-leu-ser-glu-pro-asn-glu-glu-ala-gly-ala-ala-leu-ser-pro-leu-pro-glu-val-pro-pro-trp-thr-gly-glu-val-ser-pro-ala-gln-arg(↓)glu-val-val-pro-pro-gln-val-leu-ser-glu-pro-asn-glu-glu-ala-gly-ala-ala-leu-ser-pro-leu-pro-glu-val-pro-pro-trp-thr-gly-glu-val-ser-pro-ala-gln-arg(↓)glu-val-val-pro-pro-gln-val-leu-ser-glu-pro-asn-glu-glu-ala-gly-ala-ala-leu-ser-pro-leu-pro-glu-val-pro-pro-trp-thr-gly-glu-val-ser-pro-ala-gln-arg(seqidno:13)，等等。因此，在一種實(shí)施方案中，單一的肽切割位點(diǎn)可以位于先導(dǎo)融合配偶體和下面的肽之間(或者，在包含多聯(lián)體肽的融合多肽情況下，在先導(dǎo)融合配偶體和所述第一肽之間，以及在肽的每個(gè)串聯(lián)拷貝之間)。但是，要理解融合多肽有可能在肽的每個(gè)串聯(lián)拷貝之間包含短連接序列，其中連接序列側(cè)翼是肽切割位點(diǎn)，使得在用根據(jù)本發(fā)明的裂解劑裂解時(shí)從融合多肽釋放完整的肽?；蛘呋蛄硗?，要理解融合多肽有可能在各個(gè)肽之間包含短連接序列，其中用裂解劑裂解之后，連接序列保持連接所述肽的一個(gè)末端，使得以接頭延伸形式從融合多肽釋放所述肽，然后通過使用另一個(gè)肽切割位點(diǎn)的第二種裂解劑能從所述肽任選地切割連接序列，使得從連接序列釋放肽。使用編碼本發(fā)明的融合多肽的表達(dá)構(gòu)建體和作為重組宿主細(xì)胞的大腸桿菌，本發(fā)明人能獲得可溶性融合多肽的合適的高水平表達(dá)，包括根據(jù)本發(fā)明帶有一個(gè)vsdl肽和三個(gè)，六個(gè)，八個(gè)和十個(gè)vsdl肽的串聯(lián)拷貝的融合多肽。此外，本發(fā)明人已經(jīng)證明獲得的融合多肽能被完全消化得到適合的高濃度的釋放的vsdl肽。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，釋放出的肽被純化。該肽的純化能有利地減少污染物(例如，細(xì)胞組分，包括宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)，核酸，內(nèi)毒素)，達(dá)到適合于治療用途的可接受水平。用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何合適的技術(shù)能純化肽。在一種實(shí)施方案中，在用裂解劑切割之前對(duì)融合多肽進(jìn)行純化。在一種實(shí)施方案中，在用裂解劑對(duì)融合多肽切割之后對(duì)肽進(jìn)行純化。如果要臨床使用肽，如果純化方法不要求在高濃度無毒、揮發(fā)性或易燃溶劑(例如甲醇)中洗脫肽，則其是有益的。在一種實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括純化從切割的融合多肽釋放的肽的步驟。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道大范圍純化技術(shù)可以適合純化釋放的肽，例如，離子交換技術(shù)和其它分離技術(shù)。適合純化肽的離子交換技術(shù)包括商業(yè)上可獲得樹脂和膜，例如chromasorb膜(merck-millipore，比勒瑞卡(billerica)，ma，美國(guó))，sartobind膜(sartoriousag，哥廷根，德國(guó))，mustang膜(pallcorporation，華盛頓港口，紐約，美國(guó))，cimqamonolith膜(biaseparationsgmbh，非拉赫，奧地利)，反相樹脂，captommc(混合模式樹脂；gehealthcare，瓦克夏，wi，美國(guó))，羥基磷灰石(混合模式樹脂；bioradlaboratories，inc，herculesca，美國(guó))，q和deae巨石(離子交換樹脂；biaseparations)，macroprephq和deae(陰離子交換樹脂；biorad)，poroshq，piandd(陰離子交換樹脂；biosystemsinc，馬薩諸賽州弗雷明翰，美國(guó))，nuviaq(陰離子交換樹脂；biorad)，unosphereq(陰離子交換樹脂；biorad)，qsepharoseff和bb(陰離子交換樹脂；gehealthcare)，spsepharoseff(陽(yáng)離子交換樹脂；gehealthcare)，fractogeltmae(陰離子交換樹脂；merck-millipore)，mephypercel(混合模式樹脂；pallcorporation)，等。適合純化釋放的肽的非離子交換分離技術(shù)的技術(shù)包括bluesepharose(假親和樹脂；gehealthcare)，很多樹脂來源于phenomenex或vydac，等。在vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)的情況下，在一種實(shí)施方案中，用反相色譜法從被消化的融合多肽和其它宿主細(xì)胞雜質(zhì)純化被釋放的vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)。例如，反相色譜法可利用不溶性聚苯乙烯二乙烯基苯聚合物樹脂，例如amberchromcg300c或amberchromxt柱(rohmandhaas)。在一些實(shí)施方案中，用40％至20％異丙醇(體積/體積)從這樣的樹脂能洗脫被釋放的vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)。優(yōu)選地，所述洗脫在乙酸存在下進(jìn)行。例如，在0.5％乙酸存在下用30％異丙醇可以洗脫vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)。在可替代實(shí)施方案中，使用10～20％異丙醇能從這樣的樹脂洗脫被釋放的vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)。優(yōu)選地，所述洗脫發(fā)生在弱堿性ph值下。例如，例如在25mmtrisph8存在下，在緩沖到ph8的15％異丙醇中可以洗脫vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)。有利地，這樣低濃度的異丙醇在大規(guī)模重組蛋白質(zhì)制備中被認(rèn)為是可以接受的。在另一種實(shí)施方案中，使用陰離子交換色譜從被消化融合多肽純化被釋放的vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)。例如，陰離子交換層析可以是利用交聯(lián)的聚甲基丙烯酸酯樹脂例如fractogeltmae柱(merck)的強(qiáng)陰離子交換層析。在一些實(shí)施方案中，用醋酸鈉能以高純度從這樣的樹脂洗脫vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)。優(yōu)選地，所述洗脫發(fā)生在酸性ph下(例如，ph5.0，ph4.0或ph3.5的10mm醋酸鈉)。在其它實(shí)施方案中，用低濃度鹽酸(例如10mmhcl)能以高純度從這樣的樹脂洗脫被釋放的vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)。在另一種實(shí)施方案中，被釋放的vsdl肽(或其變體或其修飾的肽體)是用反相色譜法從經(jīng)消化的融合多肽中純化。使用反相色譜法從被消化融合多肽純化被釋放的vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)。例如，反相色譜法可以利用不溶性聚苯乙烯二乙烯基苯聚合物樹脂，例如amberchromcg300c或amberchromxt柱(rohmandhaas)。在一種實(shí)施方案中，使用10～20％異丙醇能以高產(chǎn)率從這樣的柱子洗脫vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)。優(yōu)選地，所述洗脫發(fā)生在弱堿性ph值下。例如，例如在25mmtrisph8存在下，在緩沖到ph8的15％異丙醇中可以洗脫vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)。另外或可替代地，使用chromasorb膜并且用10mm鹽酸洗脫能純化被釋放的vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)。在另一種實(shí)施方案中，最初利用反相色譜法，例如使用不溶性聚苯乙烯二乙烯基苯聚合物樹脂從被消化的融合多肽純化被釋放的vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)，然后可以利用強(qiáng)陰離子交換色譜法(例如，使用交聯(lián)聚甲基丙烯酸酯樹脂)進(jìn)一步純化。在一種實(shí)施方案中，在選自異丙醇，丁醇和乙腈的有機(jī)溶劑中可以洗脫所述肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白，用裂解劑對(duì)融合多肽切割之后，其它純化方法可適合用于純化vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)。在一種實(shí)施方案中，純化的肽可以被凍干。凍干的肽隨后可以重新構(gòu)成。在一種實(shí)施方案中，純化的多肽可以用藥物或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑或載體配制。在第三方面，本發(fā)明提供了一種制備重組血管擴(kuò)張(vsdl)肽(或其變體或其修飾的肽)的方法，所述方法包括以下步驟：表達(dá)包含至少一種vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)融合多肽，其中所述肽側(cè)翼是一個(gè)或多個(gè)胰蛋白酶切割位點(diǎn)，并且其中所述肽特征在于另外不存在胰蛋白酶切割位點(diǎn)；和用在胰蛋白酶切割位點(diǎn)切割的裂解劑在胰蛋白酶切割位點(diǎn)切割融合多肽；其中切割融合多肽的步驟從融合多肽釋放所述肽。應(yīng)當(dāng)理解，在這個(gè)第三方面中，所述vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)，融合多肽，和胰蛋白酶切割位點(diǎn)中的每個(gè)可以和本發(fā)明的第一或第二方面如上所述的一樣。例如，融合多肽可以包含先導(dǎo)融合配偶體；融合多肽可以包含vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)的串聯(lián)拷貝；和/或vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)可以具有如上所述序列；等等。在第四方面，本發(fā)明提供了一種制備重組血管擴(kuò)張(vsdl)肽(或其變體或其修飾的肽)的方法，所述方法包括以下步驟：表達(dá)包含一個(gè)先導(dǎo)融合配偶體和至少一個(gè)vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)的融合多肽，其中所述肽側(cè)翼是一個(gè)或多個(gè)胰蛋白酶切割位點(diǎn)；用胰蛋白酶或胰蛋白酶樣酶切割融合多肽；將切割的融合多肽的ph調(diào)節(jié)至低于5；利用陰離子交換技術(shù)從消化的融合多肽純化所述肽。要明白，在這個(gè)第四方面中，所述vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)，融合多肽，先導(dǎo)融合配偶體，胰蛋白酶切割位點(diǎn)，胰蛋白酶或胰蛋白酶樣酶等中的每個(gè)可以和本發(fā)明的第一或第二方面如上所述的一樣。例如，融合多肽可以包含vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)的串聯(lián)拷貝；和/或vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)可以具有如上所述序列；等等。在第五方面，本發(fā)明提供了一種表達(dá)構(gòu)建體，其包含本發(fā)明第一至第四方面任一方面中定義的編碼融合多肽的多核苷酸序列。優(yōu)選地，所述表達(dá)構(gòu)建體包含與至少一個(gè)編碼具有c-末端胰蛋白酶切割位點(diǎn)的vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)的核苷酸序列操作融合的編碼具有c-末端胰蛋白酶切割位點(diǎn)的先導(dǎo)融合配偶體的核苷酸序列。如本文所用，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解術(shù)語(yǔ)”操作融合”意思是指在不存在任何中止密碼子存在下所述核苷酸序列在同一閱讀框內(nèi)編碼整個(gè)融合多肽，使得融合多肽的肽的每一個(gè)被翻譯。在一種實(shí)施方案中，編碼具有c-末端的胰蛋白酶切割位點(diǎn)的先導(dǎo)融合配偶體的核苷酸序列可以操作融合到編碼具有c-末端的胰蛋白酶切割位點(diǎn)的vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)的核苷酸序列。在另一種實(shí)施方案中，編碼具有c-末端胰蛋白酶切割位點(diǎn)的先導(dǎo)融合配偶體的核苷酸序列可以操作融合任何數(shù)目的核苷酸序列，所述任何數(shù)目的核苷酸序列的每一個(gè)編碼具有c-末端的胰蛋白酶切割位點(diǎn)的vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)。優(yōu)選地，編碼具有c-末端胰蛋白酶切割位點(diǎn)的先導(dǎo)融合配偶體的核苷酸序列可以操作融合2－20個(gè)(或更多)核苷酸序列，所述核苷酸序列的每一個(gè)編碼具有c-末端的胰蛋白酶切割位點(diǎn)的vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)。也就是說，所述核苷酸序列可以優(yōu)選地編碼融合多肽，所述融合多肽包含具有c-末端的胰蛋白酶切割位點(diǎn)的先導(dǎo)融合配偶體，所述先導(dǎo)融合配偶體與具有c-末端的胰蛋白酶切割位點(diǎn)的vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)的二，三，四，五，六，七，八，九，十，十一，十二，十三，十四，十五，十六，十七，十八，十九，或二十個(gè)串聯(lián)拷貝操作融合。優(yōu)選地，c-末端胰蛋白酶切割位點(diǎn)是c-末端精氨酸殘基。在一種實(shí)施方案中，所述核苷酸序列編碼一種融合多肽，其包含seqidno：11，seqidno：12和seqidno：13的氨基酸序列或由選自seqidno：11，seqidno：12和seqidno：13構(gòu)成的組的氨基酸序列組成。表達(dá)構(gòu)建體可以位于表達(dá)質(zhì)粒內(nèi)，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。在第六方面，本發(fā)明提供了一種用于重組表達(dá)肽的包含第五方面的表達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，所述肽是一種vsdl肽(或其變體或其修飾的肽)。能制備重組肽的寬范圍的表達(dá)系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。此外，本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是任何合適的宿主細(xì)胞，如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的。宿主細(xì)胞可以包括細(xì)菌細(xì)胞(例如大腸桿菌(escherichiacoli)，鏈霉菌屬(streptomycessp.)，芽孢桿菌屬(bacillussp.)，假單胞菌屬(pseudomonassp.)，葡萄球菌屬(staphylococcussp.)(例如鼠傷寒沙門氏菌(s.typhimurium)等)等)，真菌細(xì)胞，如酵母細(xì)胞(例如釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)，巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)等)，霉菌或絲狀真菌(例如曲霉(aspergillussp.))，昆蟲細(xì)胞(例如果蠅s2和草地夜蛾(spodopterafrugiperda)(例如夜蛾sf9細(xì)胞)，并包括桿狀病毒輔助系統(tǒng))，哺乳動(dòng)物細(xì)胞(適合的大量細(xì)胞系包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(cho)細(xì)胞，猴腎(cos)細(xì)胞，人胚胎腎(hek)細(xì)胞，幼倉(cāng)鼠腎(bhk)細(xì)胞，鼠黑素瘤細(xì)胞等)，和植物細(xì)胞。重組多肽或者也能在轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物中表達(dá)。因此，宿主細(xì)胞可以是合適的植物或動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了一種重組融合多肽，其包含連接于具有c-末端胰蛋白酶切割位點(diǎn)的肽的串聯(lián)拷貝(例如肽的2到20個(gè)或更多串聯(lián)拷貝)的先導(dǎo)融合配偶體。優(yōu)選地，所述先導(dǎo)融合配偶體具有c-末端胰蛋白酶切割位點(diǎn)。優(yōu)選地，所述肽沒有內(nèi)部胰蛋白酶切割位點(diǎn)。優(yōu)選地，所述肽是vsdl肽或者其變體或者其修飾的肽，更優(yōu)選地，是包括seqidno:2的氨基酸序列或由根據(jù)seqidno:2的氨基酸序列構(gòu)成的vsdl肽。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了一種重組融合多肽，其包含或由具有c-末端胰蛋白酶切割位點(diǎn)的肽的串聯(lián)拷貝(例如肽的2到20個(gè)或更多串聯(lián)拷貝)構(gòu)成。優(yōu)選地，所述先導(dǎo)融合配偶體具有c-末端胰蛋白酶切割位點(diǎn)。優(yōu)選地，所述肽沒有內(nèi)部胰蛋白酶切割位點(diǎn)。優(yōu)選地，所述肽是vsdl肽或者其變體或者其修飾的肽，更優(yōu)選地，包括或由根據(jù)seqidno:2的氨基酸序列構(gòu)成的vsdl肽。優(yōu)選地，所述多肽包含所述肽的3－10個(gè)串聯(lián)拷貝。優(yōu)選地，所述肽沒有內(nèi)部胰蛋白酶切割位點(diǎn)。優(yōu)選地，所述肽是vsdl肽或者其變體或者其修飾的肽，更優(yōu)選地，是包含seqidno:2的氨基酸序列或由根據(jù)seqidno:2的氨基酸序列構(gòu)成的vsdl肽。本發(fā)明下文通過參考以下非限制性實(shí)施例和附圖進(jìn)行描述。實(shí)施例實(shí)施例1在大腸桿菌中制備vsdl人vsdl(在實(shí)施例中指定vsdl)的氨基酸序列是:glu-val-val-pro-pro-gln-val-leu-ser-glu-pro-asn-glu-glu-ala-gly-ala-ala-leu-ser-pro-leu-pro-glu-val-pro-pro-trp-thr-gly-glu-val-ser-pro-ala-gln-arg(seqidno:2).在該實(shí)施例中，利用融合多肽途徑，以試圖嘗試多肽序列中不存在內(nèi)部精氨酸(r)和賴氨酸(k)殘基，以及便利地提供胰蛋白酶切割位點(diǎn)的存在c-末端精氨酸(r)的策略，對(duì)在大腸桿菌中重組表達(dá)vsdl進(jìn)行研究(圖1)。表達(dá)構(gòu)建體的制備首先，設(shè)計(jì)兩個(gè)融合多肽:(i)與指定為b72r的73氨基酸融合配偶體融合的單一vsdl序列(指定為b72r-vsdl并且這里還稱作”1-鏈節(jié)”)，和(ii)與b72r融合的三個(gè)vsdl重復(fù)(指定為b72r-(vsdl)3并且這里還稱作”3-鏈節(jié)”)。這些融合多肽的氨基酸序列示于圖1。然后制備第二輪基因融合體，其中用谷氨酰胺殘基(q)置換融合配偶體的倒數(shù)第二個(gè)天冬氨酸殘基(d)(指定為b72(q)r)，并且編碼的融合多肽包括vsdl肽序列的3，6，8和10個(gè)串聯(lián)拷貝。預(yù)期天冬氨酸殘基的取代可能導(dǎo)致融合配偶體/vsdl連接處改進(jìn)的切割。以puc57載體亞克隆(genscriptusainc，新澤西州皮斯卡塔維，美國(guó))獲得vsdl融合多肽基因?；蛉诤象w的核苷酸序列如圖2所示。通過用限制酶ndei和hindiii(rochediagnosticscorporation，印第安納州波利斯，美國(guó))消化，從各puc57亞克隆切離vsdl基因融合體。將質(zhì)粒消化物脫鹽，然后通過在t4dna連接酶(roche)存在下在16℃下溫育過夜直接連接pbre508表達(dá)載體(hospiraadelaideptyltd，thebartonsa，澳大利亞)。連接反應(yīng)用來轉(zhuǎn)化xl1-blue電子感受態(tài)細(xì)胞(agilenttechnologiesinc，加利福尼亞州圣克拉拉，美國(guó))，并且在含有卡那霉素(30μg/ml)va平板上選擇陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體。使用qiaprepspinminiprep試劑盒(qiagennv，venlo，荷蘭)，根據(jù)廠商說明，從各個(gè)轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒dna。然后用ndei/hindiii消化純化的質(zhì)粒，來鑒定成功的候選克隆。對(duì)于不同vsdl基因融合體表現(xiàn)出預(yù)期的泳帶圖案的質(zhì)?？寺”恢付閜bre601至pbre606。圖3a-f描述vsdl表達(dá)構(gòu)建體的圖。小規(guī)模表達(dá)研究以10ml搖瓶規(guī)模進(jìn)行最初的表達(dá)實(shí)驗(yàn)。將vsdl表達(dá)構(gòu)建體pbre601(1-鏈節(jié))和pbre602(3-鏈節(jié))轉(zhuǎn)化到e.coli宿主株br067(hospiraadelaide；mm294ompt缺失)中并且在含有卡那霉素(30μg/ml)va平板上選擇轉(zhuǎn)化體。通過將單一菌落從轉(zhuǎn)化板無菌轉(zhuǎn)移到有卡那霉素(30μg/ml)的3mlc2-定義培養(yǎng)基培養(yǎng)物中建立過夜3ml培養(yǎng)物。通過旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)盤攪動(dòng)下將培養(yǎng)物在37℃溫育16小時(shí)。通過將0.875ml的各培養(yǎng)物與0.125ml80％丙三醇混合來制備丙三醇原種，接著在-80℃下貯存。關(guān)于表達(dá)實(shí)驗(yàn)，將過夜培養(yǎng)物(1ml)在含有卡那霉素(30μg/ml)的10mlc2-定義培養(yǎng)基中無菌繼代培養(yǎng)。這些培養(yǎng)物在搖動(dòng)下在37℃溫育2.5小時(shí)，然后用iptg(0.25mm終濃度)誘導(dǎo)。進(jìn)一步溫育3小時(shí)后，制備sds-page樣品。對(duì)分級(jí)的br067(pbre601)和br067(pbre602)培養(yǎng)物樣品的sds-page分析(圖4)顯示br72r-vsdl和b72r-(vsdl)3融合多肽高水平可溶性表達(dá)。接著，用編碼包含3，6，8和10個(gè)vsdl串聯(lián)拷貝的b72(q)r融合多肽的構(gòu)建體進(jìn)行相等表達(dá)實(shí)驗(yàn)。如圖5所示，培養(yǎng)物也證明了融合多肽的高水平可溶性表達(dá)。但是，注意到，因?yàn)関sdl序列拷貝數(shù)增加，融合多肽表現(xiàn)出異常移動(dòng)行為(表4)。這是vsdl肽序列高負(fù)電荷性質(zhì)最可能的結(jié)果。表4.vsdl融合多肽預(yù)測(cè)和表觀分子量表達(dá)構(gòu)建體vsdl拷貝預(yù)測(cè)mr(kda)表觀mr(kda)pbre601112.717pbre602/pbre603320.335pbre604631.953pbre605839.762pbre6061047.480補(bǔ)料分批發(fā)酵在連接biostatqplus生物方法控制器(sartorius)的1l反應(yīng)器中進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)。分別從細(xì)胞系br067(pbre601)和br067(pbre602)的冷凍丙三醇原種開始試驗(yàn)。以批量模式在37℃生長(zhǎng)過夜后開始輸送營(yíng)養(yǎng)物。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到od600為40-50時(shí)，通過加入iptg對(duì)它們誘導(dǎo)并且繼續(xù)培養(yǎng)5小時(shí)。用每個(gè)細(xì)胞系實(shí)現(xiàn)的最后od600是～70，并且最后生物量是～80g/l。最終培養(yǎng)物樣品的sds-page分析，如圖6所示，證明在這些條件下實(shí)現(xiàn)br72-vsdl和b72r-(vsdl)3的高水平表達(dá)。通過離心回收兩個(gè)細(xì)胞系的發(fā)酵生物質(zhì)，并且重新懸浮于25mmtrishclph8.0。然后將收集的細(xì)胞高壓分裂(在920巴下3次)并且離心(8000rpm離心15分鐘)得到澄清的溶胞產(chǎn)物。將溶胞產(chǎn)物分成等份并且在-80℃儲(chǔ)存，這種材料用于下文描述的裂解和純化研究。融合多肽的裂解將含有b72r-vsdl和b72r-(vsdl)3融合多肽的溶胞產(chǎn)物解凍。以25μg/ml加入測(cè)序級(jí)改進(jìn)的豬胰蛋白酶(promegav511a；promegacorporation，威斯康星州菲奇堡，美國(guó))并且在室溫下溫育過夜。將樣品1:1與1.0％h3po4/0.2％tfa混合并且離心去除沉淀物。通過在watersalliancehplc分離模塊和uv檢波器(waterscorporation，馬薩諸塞州米爾福德，美國(guó))上進(jìn)行rp-hplc分析上清液。在phenomenexjupiterc4，250x2.1mm，5μm，300a柱(#302)上用empower2軟件(phenomenex，inc，加州托蘭斯，美國(guó))控制進(jìn)行分析。使用5，10和20μg的vsdl合成肽(即化學(xué)合成的vsdl)三個(gè)注射量構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，其被用來定量測(cè)定裂解溶胞產(chǎn)物中產(chǎn)生的重組vsdl的量。在38分鐘保留時(shí)間時(shí)洗脫兩種融合多肽，而在28分鐘保留時(shí)間時(shí)洗脫vsdl。重組vsdl和合成vsdl保留時(shí)間是可比較的。在試驗(yàn)條件下消化融合多肽。前面的研究已經(jīng)揭示部分消化的(n-末端延伸的)變體的存在，指定為nlnvdr-vsdl，其通過rp-hplc在較后保留時(shí)間洗脫。通過減慢的梯度分析消化產(chǎn)物并且證實(shí)顯著量的這種變體被保留；與3－鏈節(jié)消化產(chǎn)物相比，在1－鏈節(jié)消化產(chǎn)物中存在更大比例的變體。通過rp-hplc測(cè)定b72r-vsdlandb72r-(vsdl)3消化產(chǎn)物中vsdl濃度分別是0.58g/l和1.49g/l。如果消化作用已經(jīng)完全，即，直到不存在n-末端延伸的變體nlnvdr-vsdl，則1－鏈節(jié)和3－鏈節(jié)消化產(chǎn)物中vsdl濃度分別增加至0.91g/l和1.76g/l?？紤]到vsdl和融合配偶體的相對(duì)分子量，估計(jì)1－鏈節(jié)和3－鏈節(jié)溶胞產(chǎn)物中融合多肽濃度分別為2.91g/l和3.04g/l。但是，在樣品制備期間，酸性導(dǎo)致顯著量可見沉淀物，因?yàn)楣烙?jì)沒有消化的溶胞產(chǎn)物中rp-hplc測(cè)定的融合多肽的濃度顯著小于上述提出的數(shù)據(jù)，認(rèn)為顯著量的b72r-vsdl和b72r-(vsdl)3融合多肽對(duì)粗溶胞產(chǎn)物中存在的其他大腸桿菌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)旁的沉淀敏感。對(duì)氨基酸序列的檢查揭示，當(dāng)在融合配偶體b72r的c-末端的vdr↓e切割位點(diǎn)，和vsdl序列的c-末端的aqr↓e切割位點(diǎn)(其中↓指示肽切割位點(diǎn)的位置)發(fā)生裂解時(shí)，產(chǎn)生”可信的”vsdl(即從任一個(gè)1－鏈節(jié)和3－鏈節(jié)融合多肽)。通過比較，n-末端延伸變體(nlnvdr-vsdl)的肽切割位點(diǎn)是psk↓n。vdr↓e處較低的裂解效率可能是由于精氨酸(r)切割位點(diǎn)之前緊接著存在天冬氨酸殘基(d)，其可能減小胰蛋白酶對(duì)于該位點(diǎn)的親和力。因?yàn)関sdl和nlnvdr-vsdl之間的物理化學(xué)性質(zhì)相對(duì)小的差異有可能增加從終產(chǎn)物去除變體的純化難度，假設(shè)融合配偶體的c-末端處切割位點(diǎn)從vdr↓e改變?yōu)関qr↓e(使得融合配偶體的c-末端處末端和倒數(shù)第二個(gè)氨基酸殘基與vsdl肽的c-末端處的那些相同)會(huì)提高總的裂解效率，此外，vsdl序列增加的數(shù)目也可以減少變體的出現(xiàn)，而隨著融合配偶體與融合多肽質(zhì)量比降低而進(jìn)一步提高產(chǎn)率。在制備rp-hplc柱(phenomenexjupiterc4，250x10mm，5μm，)上通過加載4ml溶胞產(chǎn)物純化3-鏈節(jié)融合多肽(即b72r-(vsdl)3)。在0.1％tfa存在下用5-60％乙腈梯度經(jīng)60分鐘洗脫融合多肽。用離心凍干機(jī)從蛋白質(zhì)蒸發(fā)乙腈和tfa，然后將蛋白質(zhì)重新配制至0.5mg/ml，在50mmtris，1mmcacl2ph8.0中。將10mg小瓶的重組牛(sigma-aldrich)重新懸浮至5mg/ml，在50％丙三醇/50mm乙酸中，并且在-20℃下儲(chǔ)存。以1:120質(zhì)量比向融合多肽加入并且在室溫下發(fā)生消化作用過夜。10分鐘之后用1％乙酸酸化樣品以終止消化作用。通過lc-ms對(duì)消化的和沒有消化的樣品分析。樣品還通過zorbaxc3柱(agilent)進(jìn)行色譜，用1％存在下的乙腈梯度洗脫，與brukerhctultraion-trap質(zhì)譜儀連接。沒有消化的樣品得到20091.4da物質(zhì)，其與3-鏈節(jié)融合多肽的理論質(zhì)量(即20091.0da)相當(dāng)。消化的樣品得到3877.8da物質(zhì)，其與vsdl的理論質(zhì)量(即3878.3da)相當(dāng)。檢測(cè)到的其它肽相應(yīng)于融合配偶體部分消化片段。顯著地，沒有vsdl多聯(lián)體或者與融合配偶體連接的證據(jù)。通過rp-hplc證明沒有nlnvdr-vsdl變體，并且指示通過使用和/或在消化之前純化融合多肽提高裂解效率。用溶胞產(chǎn)物接下來的裂解試驗(yàn)表明在1:120(w/w)裂解比例不留殘余的nlnvdr-vsdl。通過向固定量的b72r-(vsdl)3溶胞產(chǎn)物(3g/l融合多肽)加入不同量并且在室溫下溫育過夜來確定對(duì)于的需求。通過rp-uplc在shimadzucbm-20a(shimadzucorporation，京都，日本)使用restekpinnacledbc8，100x2.1mm，和1.9μm柱測(cè)定裂解的vsdl的量。使用5，10和20μg的合成vsdl肽三個(gè)注射量構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，其被用來定量測(cè)定重組vsdl。高于6mg/l1:480(w/w)與融合多肽比例等價(jià)產(chǎn)生的重組vsdl開始平穩(wěn)(圖7).。純化這個(gè)實(shí)驗(yàn)的目的是證明純化方法:(1)得到每升發(fā)酵物大于0.25g的純化vsdl產(chǎn)率，(2)證明與合成vsdl肽相當(dāng)?shù)募兓€，(3)將內(nèi)毒素減小至低水平，(4)在10mmhcl中配制vsdl，(5)使用與大規(guī)模制備相匹配的有機(jī)溶劑量，(6)使用低壓色譜步驟，和(7)可升級(jí)。初始方法在前期工作中，開展了純化方法，其應(yīng)用下面步驟：(1)胰蛋白酶例解，(2)通過酸化沉淀宿主細(xì)胞雜質(zhì)，(3)使用酸/甲醇反相分離，(4)ph調(diào)節(jié)至8，和(5)用nacl陰離子交換。通過在1mlamberchromxt30柱(rohmandhaas)接著在1mlqsepharosehp柱(gehealthcare，littlechalfont，buckinghamshire，英國(guó))上加載15ml消化的3-鏈節(jié)溶胞產(chǎn)物重復(fù)該方法。用q柱純化大約10mg的vsdl，每升發(fā)酵物產(chǎn)率是1.23g。通過rp-hplc使用合成vsdl肽有利地比較純化的vsdl的洗脫位置和雜質(zhì)分布圖，并且不存在n-末端延伸的nlnvdr-vsdl變體。但是，這種純化方法使用100％甲醇從柱子洗脫被結(jié)合的vsdl，因此甲醇的揮發(fā)性、易燃性和毒性意味著這種純化方法對(duì)于大規(guī)模制備是不期望的。有機(jī)溶劑使用的減少還研究了使用amberchrom反相樹脂在純化期間減少有機(jī)溶劑的潛在性。在amberchromcg300c(rohmandhaas)上加載消化的3-鏈節(jié)溶胞產(chǎn)物并用甲醇梯度洗脫。對(duì)于xt30，要求用100％甲醇洗脫vsdl。但是，在下面的實(shí)驗(yàn)中，用異丙醇代替甲醇并且發(fā)現(xiàn)在0.5％乙酸存在下用30％異丙醇能以高純度洗脫vsdl。在vsdl洗脫之前用15％異丙醇能從柱子洗脫核酸污染物。沒有調(diào)節(jié)ph的溶胞產(chǎn)物也被加載到柱子上并且在25mmtrisph8而不是0.5％乙酸存在下進(jìn)行異丙醇洗脫。出乎意料地，發(fā)現(xiàn)在15％異丙醇較高ph下洗脫vsdl。顯著地，15％異丙醇的可燃性顯著小于30％異丙醇，而且確實(shí)類似于20％乙醇(nb.閃點(diǎn)是相同的-35℃)，其在大規(guī)模重組蛋白制備中普遍應(yīng)用。用1:120質(zhì)量比的在室溫下將溶胞產(chǎn)物消化過夜。在第二天用1m乙酸將ph調(diào)節(jié)至4.4來沉淀宿主細(xì)胞雜質(zhì)。然后離心沉積沉淀并且將13ml上清液加載到1mlamberchromcg300c柱上，所述柱子已經(jīng)用0.5％乙酸預(yù)平衡過。用0.5％乙酸，15％異丙醇/0.5％乙酸和25mmtrisph8(figure8)沖洗柱子。用15％異丙醇/25mmtrisph8洗脫一個(gè)大的峰。該峰中肽含量是18.5mg，其翻譯為一步驟回收率為81％。接著用25mmtrisph8將1mlfractogeltmae柱子預(yù)先平衡，并且加載6.9mg這種材料。然后用25mmtrisph8和10mm乙酸鈉ph4.5沖洗柱子(圖9)。用10mmhcl洗脫出一個(gè)大峰，肽含量是5.8mg，其證明一步回收率是84％。每升發(fā)酵物純化產(chǎn)率是1.37g。amberchromcg300c和fractogeltmae對(duì)于vsdl的結(jié)合能力分別是～20mg/ml和～7mg/ml。通過rp-uplc分析將大的峰與合成vsdl相比較并且分別測(cè)得純度是97.0％和93.7％。相對(duì)于合成vsdl肽來說對(duì)于vsdl沒有新的明顯雜質(zhì)峰。此外，合成vsdl肽和重組vsdluv曲線幾乎相同(圖10)。此外，fractogelvsdl峰的內(nèi)毒素含量，以相同方式純化，是低的(5eu/mg)。結(jié)論實(shí)施例中顯示的結(jié)果證明以好的產(chǎn)率表達(dá)作為穩(wěn)定融合多肽的vsdl的開發(fā)的細(xì)胞系，和與大規(guī)模制備相匹配的方式純化vsdl的方法。本發(fā)明涉及融合多肽的設(shè)計(jì)，開發(fā)作為胰蛋白酶切割位點(diǎn)的vsdl的c-末端精氨酸殘基(r)，胰蛋白酶是很好表征的酶，作為非來自動(dòng)物的重組蛋白質(zhì)是可獲得的。最初，設(shè)計(jì)兩個(gè)融合多肽:與b72r融合的單一vsdl序列(1-鏈節(jié))和與b72r融合的三個(gè)vsdl重復(fù)序列(3-鏈節(jié))，其以可溶形式被表達(dá)，從而避免從分離的包函體純化表達(dá)的蛋白質(zhì)的需要。進(jìn)一步的工作確認(rèn)vsdl還能以高水平被表達(dá)為6-鏈節(jié)，8-鏈節(jié)和10-鏈節(jié)。使用實(shí)驗(yàn)級(jí)豬胰島素源的初步胰蛋白酶裂解研究證明融合多肽能被完全消化得到vsdl肽，接著用包括下面步驟的純化方法將其回收:(1)用1:120融合多肽(w/w)消化過夜，(2)ph調(diào)節(jié)至4.4，(3)離心，(4)amberchromcg300c反相色譜，和(5)fractogeltmae陰離子交換色譜。通過rp-uplc分析將fractogel物質(zhì)與合成vsdl制備相比較，并且測(cè)得純化分別是97.0％和93.7％。重要地，對(duì)于重組vsdl沒有新的明顯雜質(zhì)峰(相對(duì)于合成vsdl肽)，并且重組和合成vsdl肽的uv曲線幾乎相同。此外，純化的重組vsdl的內(nèi)毒素含量估計(jì)是5eu/mg。因此，發(fā)現(xiàn)純化方法:(1)每升發(fā)酵物給出純化重組vsdl產(chǎn)率1.2-1.4g，(2)證明與合成vsdl制備相比較的純化曲線，(3)將內(nèi)毒素降低至低水平，(4)在10mmhcl中配制vsdl，(5)使用與大規(guī)模制備相匹配的有機(jī)溶劑量，(6)應(yīng)用低壓色譜步驟，和(7)是可升級(jí)的。實(shí)施例2大腸桿菌中vsdl10－鏈節(jié)的重組制備根據(jù)實(shí)施例1”加料分批發(fā)酵”部分中描述的，從實(shí)施例1描述的包含pbre606表達(dá)構(gòu)建體的br067大腸桿菌菌株的發(fā)酵物產(chǎn)生溶胞產(chǎn)物，其編碼具有vsdl肽的10個(gè)串聯(lián)拷貝的b72r-(vsdl)10融合多肽(即10－鏈節(jié))。將275ml的10－鏈節(jié)溶胞產(chǎn)物解凍，并且用1mnaoh將ph調(diào)節(jié)到ph8.0。(如實(shí)施例1所述)以1:120質(zhì)量比被加給融合多肽，消化作用在室溫下進(jìn)行2小時(shí)。用1m乙酸將消化的溶胞產(chǎn)物的ph調(diào)節(jié)至ph4.4以沉淀雜質(zhì)，然后用millistak+podlabscaled0hc過濾器(md0hc027h2)0.027m2深度過濾。通過直接加載到反相amberchromcg300c樹脂柱上純化濾液。用大約15柱體積的0.5％乙酸，然后大約10柱體積的0.5％乙酸/15％異丙醇；然后大約15柱體積的25mmtrisph8沖洗柱子。用25mmtris/15％異丙醇洗脫柱子直到uv吸光率達(dá)到主峰的10％。然后將洗脫物加載到chromasorb膜(merck-millipore)上，用10mm乙酸鈉ph5洗脫，直到獲得uv基線，然后用10mm乙酸鈉/50mm氯化鈉ph5沖洗。然后用10mm乙酸鈉/200mm氯化鈉將膜洗提，直到獲得uv基線。然后將chromasorb洗脫物加載回到過濾器上，用10mm乙酸鈉ph5洗滌直到獲得uv基線，然后用10mmhcl洗提直到獲得uv基線。以大約1mg/ml溶胞產(chǎn)物的產(chǎn)率回收vsdl肽。將chromasorb洗脫物等份分成數(shù)個(gè)試管/小瓶，并且在-70℃下干燥大約30分鐘，然后轉(zhuǎn)移給labconco旋轉(zhuǎn)式干燥器用于如下凍干。樣品在labconco中在-25℃下冷凍30分鐘，然后將樣品抽真空。第一次干燥發(fā)生在-15℃進(jìn)行24hr。第二次干燥發(fā)生在+17℃過夜。然后將凍干的在-20℃冰柜中儲(chǔ)存。凍干物質(zhì)在0.9％(w/v)nacl中重新配制并且利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過平行試驗(yàn)進(jìn)行分析(表5)。表5.再生凍干的重組vsdl的分析分析結(jié)果純度(sec)99.2％hmw雜質(zhì)(sec)0.1％純度(rp-uplc)98.8％最高單一雜質(zhì)(rp-uplc)0.3％內(nèi)毒素<0.6eu/mg宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(elisa)<12ng/mgdna<2600pg/mgn-末端測(cè)序正確序列*nbsec是尺寸排阻色譜法的首字母，hmw是高分子量的首字母，rp-uplc是反相超高壓液相色譜的首字母。實(shí)施例3大腸桿菌中vsdl3－鏈節(jié)的重組制備和每個(gè)實(shí)施例2一樣獲得vsdl溶胞產(chǎn)物，除了使用實(shí)施例1中描述的包含pbre602表達(dá)構(gòu)建體的br067大腸桿菌菌株，其編碼具有vsdl肽的3個(gè)串聯(lián)拷貝的b72r-(vsdl)3融合多肽(即3－鏈節(jié))。將b72r-(vsdl)3溶胞產(chǎn)物(175ml)解凍達(dá)到15和25℃之間的溫度。用1mnaoh將溶胞產(chǎn)物的ph調(diào)節(jié)至8.0±0.1。以25μg/ml溶胞產(chǎn)物加入重新配制的trypzean。將消化物輕輕混合5分鐘，然后在室溫下靜置過夜。用1m將消化液的ph調(diào)節(jié)至4.4±0.1。使用磁子攪拌器輕輕攪拌溶液。然后通過millistak+podlabscaled0hc過濾器(md0hc027h2)0.027m2以4.2ml/min將溶胞產(chǎn)物深度過濾，然后直接加載到amberchromcg300c柱上(16mmid柱，床高7.0cm)。用0.5％乙酸以4.2ml/min大約50分鐘，然后0.5％乙酸/15％異丙醇以4.2ml/min大約25分鐘，然后25mmtris以4.2ml/min大約35分鐘，和然后25mmtris/3％異丙醇以4.2ml/min沖洗柱子。當(dāng)uv吸光率從最大開始降低時(shí)，沖洗變?yōu)?5mmtris/15％異丙醇。用25mmtris/15％異丙醇以4.2ml/min洗提柱子直到uv吸光率達(dá)到主峰的10％。圖11圖示從消化的溶胞產(chǎn)物分離vsdl。實(shí)施例4b72qr作為先導(dǎo)融合配偶體的新的構(gòu)建體發(fā)酵分析對(duì)用谷氨酰胺殘基對(duì)b72r融合配偶體的倒數(shù)第二個(gè)天冬氨酸殘基的取代研究先導(dǎo)肽的c-末端精氨酸殘基處增強(qiáng)的胰蛋白酶裂解。有所述取代作用的先導(dǎo)融合肽在這里被指作b72(q)r(指作seqidno:10)。利用與實(shí)施例1所述相似的技術(shù)制備與b72(q)r先導(dǎo)肽融合的新的vsdl6-鏈節(jié)，8-鏈節(jié)和10-鏈節(jié)構(gòu)建體。得到的構(gòu)建體被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株br067中并且如實(shí)施例1所述進(jìn)行篩選。根據(jù)實(shí)施例1所述培養(yǎng)b72r-(vsdl)3，b72qr-(vsdl)6，b72qr-(vsdl)8，和b72qr-(vsdl)10菌株。使用1:120摩爾比的typzean室溫下將細(xì)胞溶胞產(chǎn)物溫育過夜。如實(shí)施例1所述通過rp-uplc定量測(cè)定vsdl肽。如表6所示，以b72qr為先導(dǎo)融合配偶體的vsdl8－鏈節(jié)10－鏈節(jié)記錄高濃度的vsdl(2.5mg/ml)。表6.與b72r3-鏈節(jié)構(gòu)建體相比較的b72qr6-鏈節(jié)，8-鏈節(jié)或10-鏈節(jié)構(gòu)建體的rp-uplc分析vsdl拷貝數(shù)目vsdl濃度(mg/ml)31.9661.5382.54102.54預(yù)言實(shí)施例1glp的重組制備對(duì)編碼天熱人胰高血糖素樣肽(glp，從人胰高血糖素前蛋白質(zhì)原的氨基酸98至127衍生，其具有ncbi參考號(hào)np_002045)的核苷酸序列進(jìn)行修飾，從相應(yīng)的氨基酸序列去除兩個(gè)內(nèi)部賴氨酸(k)殘基，使得賴氨酸殘基被轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺(q)殘基。天然氨基酸序列天然具有一個(gè)c-末端精氨酸(r)殘基。在標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌載體中構(gòu)建編碼與修飾的glp核苷酸序列的三個(gè)或八個(gè)串聯(lián)拷貝操作連接的后面接著一個(gè)精氨酸殘基(提供胰蛋白酶切割位點(diǎn))的n-末端his標(biāo)記的表達(dá)構(gòu)建體。表達(dá)載體被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中并且選擇轉(zhuǎn)化體，然后根據(jù)實(shí)施例1所述進(jìn)行培養(yǎng)。通過用1:120摩爾比的trypzean過夜培養(yǎng)裂解溶胞產(chǎn)物。根據(jù)實(shí)施例1－4所述能評(píng)價(jià)從融合肽分離重組glp。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)能確定glp的最佳純化。貫穿本說明書，詞匯”包括”，或者變化形式”包含”或”含有”，被理解意味著包含陳述元件，整數(shù)或步驟，或者元件組，整數(shù)或步驟，但是不排除任何其它元件，整數(shù)或步驟，或者元件組，整數(shù)或步驟。本說明書中提到的所有的出版物在這里引作參考。本申請(qǐng)說明書中已經(jīng)包括的文獻(xiàn)、行為、材料、裝置、物品等等的任何討論只是為了提供本發(fā)明上下文的目的。不要承認(rèn)因?yàn)槠湓诒旧暾?qǐng)各項(xiàng)權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日之前在澳大利亞或其他地方存在就認(rèn)為這些技術(shù)方案中的任何或全部構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的一部分并且是與本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域中的公知常識(shí)。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白對(duì)具體實(shí)施方案中所示的本發(fā)明可以進(jìn)行許多改變和/或修改，而不脫離廣泛描述的本發(fā)明的精神或范圍。本實(shí)施例實(shí)施方案因此被認(rèn)為在所有方面是說明性的而不是限制性。參考文獻(xiàn)depaloef等，《臨床化學(xué)》(clinchem)46:843-847(2000)franzm等，《腎臟詮釋》(kidneyint)58:374-378(2000)franzm等，《腎臟詮釋》(kidneyint)59:1928-1934(2001)hunterefm等，《掃描臨床實(shí)驗(yàn)室投資》(scanjclinlabinvest)58:205-216(1998)kirshenbaumk等，《結(jié)構(gòu)生物學(xué)最新見解》(curropinstructbiol)9:530-535(1999)skeltonwp4th等，《抗癌研究》(anticancerres)(2)395-402(2011)(abstract)veselydl等，《生物化學(xué)和生物物理研究通訊》(biochembiophysrescommun)148:1540-1548(1987)veselydl等，《生物醫(yī)學(xué)快報(bào)》(procsocexpbiolmed)192:230-235(1989)veselydl，《美國(guó)生理學(xué)雜志》(am.j.physiology)285:f167-f177(2003)winterscj，《循環(huán)》(circulation)80:438-449(1989)序列表<110>麥德林制藥私人有限公司<120>制備重組血管擴(kuò)張肽的方法、表達(dá)構(gòu)建體、宿主細(xì)胞及重組融合多肽<130>39357pct<160>20<170>patentin版本3.5<210>1<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>其中xaa是除了精氨酸或賴氨酸的任意氨基酸；xbb為精氨酸或賴氨酸。<220><221>misc_特征<222>(1)..(3)<223>xaa可以是任意天然存在的氨基酸。<220><221>misc_特征<222>(5)..(5)<223>xaa可以是任意天然存在的氨基酸。<400>1xaaxaaxaaasnxaaasnxbb15<210>2<211>37<212>prt<213>智人<400>2gluvalvalproproglnvalleusergluproasngluglualagly151015alaalaleuserproleuprogluvalproprotrpthrglygluval202530serproalaglnarg35<210>3<211>73<212>prt<213>原牛<400>3metlysgluvallysserleuleuleuaspleuglnleuleuleuglu151015lysvallysasnprogluasnleulysleuserargmethisthrphe202530aspphetyrvalprolysvalasnalathrgluleulyshisleulys354045alaleuleuglugluleulysleuleuglugluvalleuasnleuala505560proserlysasnleuasnvalasparg6570<210>4<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>腸激酶（腸激酶）的肽的切割位點(diǎn)。<400>4aspaspaspasplys15<210>5<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>煙草蝕紋病毒蛋白酶肽切割位點(diǎn)。其中x是任意氨基酸。<220><221>misc_特征<222>(2)..(3)<223>xaa可以是任意天然存在的氨基酸。<220><221>misc_特征<222>(5)..(5)<223>xaa可以是任意天然存在的氨基酸。xbb為gly或ser。<400>5gluxaaxaatyrxaaglnxbb15<210>6<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>煙草蝕紋病毒蛋白酶肽切割位點(diǎn)。其中x是任何氨基酸。<220><221>misc_特征<222>(1)..(1)<223>xaa可以是任意天然存在的氨基酸。<220><221>misc_特征<222>(3)..(3)<223>xaa可以是任意天然存在的氨基酸。.xbb為gly或ser。<400>6xaatyrxaaglnxbb15<210>7<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>凝血酶切割位點(diǎn)。<400>7leuvalproargglyser15<210>8<211>37<212>prt<213>猩猩<400>8gluvalvalproproglnvalleusergluglnasngluglualagly151015alaalaleuserproleuprogluvalproprotrpthrglygluval202530serproalaglnarg35<210>9<211>37<212>prt<213>feliscatus<400>9gluvalvalproproglnvalleusergluglnasngluglualagly151015alaalaleuserproleuprogluvalproprotrpalaglygluval202530asnproalaglnarg35<210>10<211>73<212>prt<213>人工序列<220><223><400>10metlysgluvallysserleuleuleuaspleuglnleuleuleuglu151015lysvallysasnprogluasnleulysleuserargmethisthrphe202530aspphetyrvalprolysvalasnalathrgluleulyshisleulys354045alaleuleuglugluleulysleuleuglugluvalleuasnleuala505560proserlysasnleuasnvalglnarg6570<210>11<211>110<212>prt<213>人工序列<220><223><400>11metlysgluvallysserleuleuleuaspleuglnleuleuleuglu151015lysvallysasnprogluasnleulysleuserargmethisthrphe202530aspphetyrvalprolysvalasnalathrgluleulyshisleulys354045alaleuleuglugluleulysleuleuglugluvalleuasnleuala505560proserlysasnleuasnvalasparggluvalvalproproglnval65707580leusergluproasngluglualaglyalaalaleuserproleupro859095gluvalproprotrpthrglygluvalserproalaglnarg100105110<210>12<211>184<212>prt<213>人工序列<220><223><400>12metlysgluvallysserleuleuleuaspleuglnleuleuleuglu151015lysvallysasnprogluasnleulysleuserargmethisthrphe202530aspphetyrvalprolysvalasnalathrgluleulyshisleulys354045alaleuleuglugluleulysleuleuglugluvalleuasnleuala505560proserlysasnleuasnvalasparggluvalvalproproglnval65707580leusergluproasngluglualaglyalaalaleuserproleupro859095gluvalproprotrpthrglygluvalserproalaglnarggluval100105110valproproglnvalleusergluproasngluglualaglyalaala115120125leuserproleuprogluvalproprotrpthrglygluvalserpro130135140alaglnarggluvalvalproproglnvalleusergluproasnglu145150155160glualaglyalaalaleuserproleuprogluvalproprotrpthr165170175glygluvalserproalaglnarg180<210>13<211>443<212>prt<213>人工序列<220><223><400>13metlysgluvallysserleuleuleuaspleuglnleuleuleuglu151015lysvallysasnprogluasnleulysleuserargmethisthrphe202530aspphetyrvalprolysvalasnalathrgluleulyshisleulys354045alaleuleuglugluleulysleuleuglugluvalleuasnleuala505560proserlysasnleuasnvalasparggluvalvalproproglnval65707580leusergluproasngluglualaglyalaalaleuserproleupro859095gluvalproprotrpthrglygluvalserproalaglnarggluval100105110valproproglnvalleusergluproasngluglualaglyalaala115120125leuserproleuprogluvalproprotrpthrglygluvalserpro130135140alaglnarggluvalvalproproglnvalleusergluproasnglu145150155160glualaglyalaalaleuserproleuprogluvalproprotrpthr165170175glygluvalserproalaglnarggluvalvalproproglnvalleu180185190sergluproasngluglualaglyalaalaleuserproleuproglu195200205valproprotrpthrglygluvalserproalaglnarggluvalval210215220proproglnvalleusergluproasngluglualaglyalaalaleu225230235240serproleuprogluvalproprotrpthrglygluvalserproala245250255glnarggluvalvalproproglnvalleusergluproasngluglu260265270alaglyalaalaleuserproleuprogluvalproprotrpthrgly275280285gluvalserproalaglnarggluvalvalproproglnvalleuser290295300gluproasngluglualaglyalaalaleuserproleuprogluval305310315320proprotrpthrglygluvalserproalaglnarggluvalvalpro325330335proglnvalleusergluproasngluglualaglyalaalaleuser340345350proleuprogluvalproprotrpthrglygluvalserproalagln355360365arggluvalvalproproglnvalleusergluproasnglugluala370375380glyalaalaleuserproleuprogluvalproprotrpthrglyglu385390395400valserproalaglnarggluvalvalproproglnvalleuserglu405410415proasngluglualaglyalaalaleuserproleuprogluvalpro420425430protrpthrglygluvalserproalaglnarg435440<210>14<211>340<212>dna<213>人工序列<220><223>b72r-vsdl(340bp)<400>14catatgaaagaagtgaagtcattgctgctggatttacagttgcttttggagaaagttaaa60aatcctgagaacctcaagctctccaggatgcatacatttgacttttacgtgcccaaggtt120aacgctacagaattgaaacatcttaaggcgttactagaagaactcaaacttctagaggaa180gtactaaatttagctccaagcaaaaacctgaacgtcgaccgtgaagttgtaccgccgcag240gttctgtctgaaccgaacgaagaagcgggtgcggcgctgtctccgctgccggaagttccg300ccgtggaccggtgaagtgagcccagcgcagcgttaagctt340<210>15<211>562<212>dna<213>人工序列<220><223>b72r-(vsdl)3(562bp)<400>15catatgaaagaagtgaagtcattgctgctggatttacagttgcttttggagaaagttaaa60aatcctgagaacctcaagctctccaggatgcatacatttgacttttacgtgcccaaggtt120aacgctacagaattgaaacatcttaaggcgttactagaagaactcaaacttctagaggaa180gtactaaatttagctccaagcaaaaacctgaacgtcgaccgtgaagttgtaccgccgcag240gttctgtctgaaccgaacgaagaagcgggtgcggcgctgtctccgctgccggaagttccg300ccgtggaccggtgaggtgagcccagcgcagcgcgaagttgtaccgccgcaggttctgtct360gaaccgaacgaagaagcgggtgcggcgctgtctccgctgccggaagttccgccatggacc420ggcgaagtgagcccagcgcagcgcgaagttgtaccgccgcaggttctgtctgaaccgaac480gaagaagcgggtgcggcgctgtctccgctgccggaagttccgccatggaccggtgaagtg540agcccagcgcagcgttaagctt562<210>16<211>562<212>dna<213>人工序列<220><223>b72(q)r-(vsdl)3(562bp)<400>16catatgaaagaagtgaagtcattgctgctggatttacagttgcttttggagaaagttaaa60aatcctgagaacctcaagctctccaggatgcatacatttgacttttacgtgcccaaggtt120aacgctacagaattgaaacatcttaaggcgttactagaagaactcaaacttctagaggaa180gtactaaatttagctccaagcaaaaacctgaacgtccagcgtgaagttgtaccgccgcag240gttctgtctgaaccgaacgaagaagcgggtgcggcgctgtctccgctgccggaagttccg300ccgtggaccggtgaggtgagcccagcgcagcgcgaagttgtaccgccgcaggttctgtct360gaaccgaacgaagaagcgggtgcggcgctgtctccgctgccggaagttccgccatggacc420ggcgaagtgagcccagcgcagcgcgaagttgtaccgccgcaggttctgtctgaaccgaac480gaagaagcgggtgcggcgctgtctccgctgccggaagttccgccatggaccggtgaagtg540agcccagcgcagcgttaagctt562<210>17<211>895<212>dna<213>人工序列<220><223>b72(q)r-(vsdl)6(895bp)<400>17catatgaaagaagtgaagtcattgctgctggatttacagttgcttttggagaaagttaaa60aatcctgagaacctcaagctctccaggatgcatacatttgacttttacgtgcccaaggtt120aacgctacagaattgaaacatcttaaggcgttactagaagaactcaaacttctagaggaa180gtactaaatttagctccaagcaaaaacctgaacgtccagcgtgaagtggttccgccgcag240gttctgagcgaaccgaacgaagaagcaggtgcagcactgtctccgctgccggaagtcccg300ccgtggaccggtgaagttagtccggcgcaacgtgaagtggttccgccgcaggttctgagc360gaaccgaacgaagaagcaggtgcagcactgtctccgctgccggaagtcccgccgtggacc420ggtgaagttagtccggcgcaacgtgaagtggttccgccgcaggttctgagcgaaccgaac480gaagaagcaggtgcagcactgtctccgctgccggaagtcccgccgtggaccggtgaagtt540agtccggcgcaacgtgaagtggttccgccgcaggttctgagcgaaccgaacgaagaagca600ggtgcagcactgtctccgctgccggaagtcccgccgtggaccggtgaagttagtccggcg660caacgtgaagtggttccgccgcaggttctgagcgaaccgaacgaagaagcaggtgcagca720ctgtctccgctgccggaagtcccgccgtggaccggtgaagttagtccggcgcaacgtgaa780gtggttccgccgcaggttctgagcgaaccgaacgaagaagcaggtgcagcactgtctccg840ctgccggaagtcccgccgtggaccggtgaagttagtccggcgcaacgttaagctt895<210>18<211>1117<212>dna<213>人工序列<220><223>b72(q)r-(vsdl)8(1117bp)<400>18catatgaaagaagtgaagtcattgctgctggatttacagttgcttttggagaaagttaaa60aatcctgagaacctcaagctctccaggatgcatacatttgacttttacgtgcccaaggtt120aacgctacagaattgaaacatcttaaggcgttactagaagaactcaaacttctagaggaa180gtactaaatttagctccaagcaaaaacctgaacgtccagcgtgaagtggttccgccgcag240gttctgagcgaaccgaacgaagaagcaggtgcagcactgtctccgctgccggaagtcccg300ccgtggaccggtgaagttagtccggcgcaacgtgaagtggttccgccgcaggttctgagc360gaaccgaacgaagaagcaggtgcagcactgtctccgctgccggaagtcccgccgtggacc420ggtgaagttagtccggcgcaacgtgaagtggttccgccgcaggttctgagcgaaccgaac480gaagaagcaggtgcagcactgtctccgctgccggaagtcccgccgtggaccggtgaagtt540agtccggcgcaacgtgaagtggttccgccgcaggttctgagcgaaccgaacgaagaagca600ggtgcagcactgtctccgctgccggaagtcccgccgtggaccggtgaagttagtccggcg660caacgtgaagtggttccgccgcaggttctgagcgaaccgaacgaagaagcaggtgcagca720ctgtctccgctgccggaagtcccgccgtggaccggtgaagttagtccggcgcaacgtgaa780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