專利名稱：：具有溶血栓活性的多肽、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及多肽，尤其涉及具有溶血栓活性的多肽、其制備方法及它們作為溶血栓劑的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：目前臨床使用的治療急性血栓栓塞性疾病的鏈激酶、尿激酶和重組組織型纖溶酶原激活劑等藥物普遍存在全身出血傾向和免疫原性反應(yīng)，尋找安全有效的溶血栓藥物是新藥研究的熱點(diǎn)之一。大量研究表明，纖維蛋白P鏈的降解產(chǎn)物一血管活性肽P6A作為小分子內(nèi)源性寡肽不僅有良好的溶栓活性，而且不存在上述副作用，是理想的溶栓先導(dǎo)結(jié)構(gòu)。P6A的氨基酸序列為ARPAK。我們發(fā)現(xiàn)，ARPAK在小鼠體內(nèi)代謝成為RPAK，PAK，ARPA和ARP四種代謝產(chǎn)物。在大鼠頸動(dòng)靜脈旁路插管溶血栓模型上，PAK顯示出比母體ARPAK優(yōu)秀的溶栓作用。在藥物化學(xué)研究中，將肽鏈中的氨基酸殘基調(diào)換位置產(chǎn)生變換序列，以及將相同的序列拼合產(chǎn)生重復(fù)序列，往往可以產(chǎn)生一些意外的結(jié)果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一是提供一類具有良好的溶血栓活性的多肽。本發(fā)明的目的之一是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的；一類具有溶血栓活性的多肽，選自以下任意一種的氨基酸序列-(一)PAK(Pro-Ala國Lys)，PAKPAK(Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys)，PAKPAKPAK(Pro-Ala-Lys隱Pro-Ala-Lys-Pro陽Ala-Lys),PAKPAKPAKPAK(Pro隱Ala-Lys-Pro隱Ala-Lys-Pro-Ala隱Lys-Pro-Ala國Lys),PAKPAKPAKPAKPAK(Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys陽Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys)，PAKPAKPAKPAKPAKPAK(Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala誦Lys);(二)AKP(Ala-Lys-Pro)，AKPAKP(Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro)，AKPAKPAKP(Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro),AKPAKPAKPAKP(Ala-Lys陽Pro-Ala-Lys-Pro-Ala隱Lys-Pro-Ala-Lys-Pro)，AKPAKPAKPAKPAKP(Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro),AKPAKPAKPAKPAKPAKP(Ala-Lys-Pro-Ala匿Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro);(三)KPA(Lys-Pro-Ala),KPAKPA(Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala),KPAKPAKPA(Lys-Pro-Ala-Lys隱Pro-Ala-Lys陽Pro-Ala),KPAKPAKPAKPA(Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala),KPAKPAKPAKPAKPA(Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala)，KPAKPAKPAKPAKPAKP(Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala)。鏈激酶、尿激酶和重組組織型纖溶酶原激活劑等普遍存在全身出血傾向和免疫原性反應(yīng)。纖維蛋白e鏈的降解產(chǎn)物一血管活性肽P6A(ARPAK)作為小分子內(nèi)源性寡肽不僅有良好的溶栓活性，而且不引起全身出血傾向和免疫原性反應(yīng)；本發(fā)明通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)P6A經(jīng)小鼠體內(nèi)的代謝，其中的代謝產(chǎn)物之一PAK顯示出比母體ARPAK更為優(yōu)秀的溶血栓活性；在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明將PAK中的氨基酸殘基調(diào)換位置產(chǎn)生變換序列AKP和KPA，并進(jìn)一步以PAK為結(jié)構(gòu)單元合成重復(fù)序列肽(PAK)2(PAK)3、(PAK)4、(PAK)5和(PAK)6;以AKP為結(jié)構(gòu)單元分別合成重復(fù)序列肽(AKP)2、(AKP)3、(AKP)4、(AKP)5和(AKP)6，以KPA為結(jié)構(gòu)單元合成重復(fù)序列肽(KPA)2、(KPA)3、(KPA)4、(KPA)5和(KPA)6。本發(fā)明以上所有多肽均可按照常規(guī)的液相接肽法制備而成。動(dòng)物溶血栓模型試驗(yàn)表明，本發(fā)明多肽均具有良好的溶血栓活性。為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例。這些實(shí)施例完全是例證性的，它們僅用來對本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明的限制。本發(fā)明中所出現(xiàn)的術(shù)語或縮略語的說明THF四氫呋喃DCC二環(huán)己基酰亞胺DCU二環(huán)己基脲OBzl芐氧基Boc叔丁氧羰基HOBtN-羥基苯并三唑T1X薄層層析DMF二甲基甲酰胺NMMN-甲基嗎啉具體實(shí)施方式實(shí)施例1PAK的制備1)制備Boc-Pro-ONP將1.0g(4.65mmol)Boc-Pro-OH置于50ml茄形瓶中，加入20ml無水四氫呋喃溶解，冰浴攪拌，形成溶液A。將711mg(5.12mmol)對硝基苯酚(HONP)置于25ml三角瓶中，加入8ml無水四氫呋喃溶解，形成溶液B。將溶液B滴加至冰浴攪拌下的溶液A中，得到溶液C。將1.05g(5.12mmol)二環(huán)己基羰二亞胺(DCC)加入溶液C中，冰浴攪拌3h，期間任冰浴自行融化，不再加冰。反應(yīng)混合物過濾，濾除生成的二環(huán)己基脲(DCU)。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，殘留物用40ml乙酸乙酯溶解。溶液置于50ml分液漏斗中，以飽和碳酸氫鈉水溶液萃洗三遍(10mlX3)，TLC確認(rèn)酯層無Boc-Pro-OH后，乙酸乙酯層用飽和氯化鈉水溶液洗至中性(10mlX3)，分出乙酸乙酯層并置于50ml茄形瓶中用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，得到油狀產(chǎn)物即為Boc-Pro隱ONP。2)制備Boc-Pro-Ala-OH油狀Boc-Pro-ONP置于50ml茄形瓶中，加入15ml二氧六環(huán)溶解，得到溶液A。將496mg(5.58mmol)L-Ala-OH及468mg(5.581mmol)碳酸氫鈉固體置于25ml茄形瓶中，加入8ml水溶解，用單通抽出C02，得到溶液B。將溶液B滴加至攪拌下的溶液A中，并隨時(shí)用N-甲基嗎啉(NMM)調(diào)節(jié)pH至8-9，持續(xù)攪拌12h，分別在第1、3及6小時(shí)抽除C02。TLC檢測確認(rèn)Boc-Pro-ONP消失后，反應(yīng)混合物用飽和硫酸氫鉀水溶液調(diào)節(jié)至pH7后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，得到的油狀物加lml水稀釋后，繼續(xù)滴加飽和硫酸氫鉀水溶液酸化至pH2。得到的水溶液置于50ml分液漏斗中，用氯仿萃取三次(15mlX3)。合并氯仿層，并用飽和氯化鈉水溶液洗滌至中性(5mlX3)。分出氯仿層，加入無水硫酸鈉干燥過夜。過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物用乙酸乙酯-石油醚結(jié)晶，得950mg無色晶體(72y。)即為Boc-Pro-Ala-()H。(Mpl53-155。C，[a]D25=109.8(C=l,MeOH)。ESI-MS(m/e)287[M+H]+.元素分析(C13H22N205):計(jì)算值C54.53、H7.74、N9.78;實(shí)測值C54.67、H7.82、N9.61。3)制備Boc-Pro-Ala-Lys(Z)隱OBzl將500mg(1.75mmol)Boc-Pro-Ala-OH置于50ml茄形瓶中，加入15ml無水四氫呋喃溶解，冰浴攪拌下加入260mg(1.92mmol)N-羥基苯并三唑(HOBt)及396mg(1.92mmol)DCC，得到溶液A。將948mg(1.75mmol)H-Lys(Z)-OBzl對甲苯磺酸鹽置于50ml茄形瓶中，加入15ml無水四氫呋喃溶解，用NMM調(diào)pH7，得到溶液B。將溶液B滴加至冰浴攪拌下的溶液A中，用NMM調(diào)節(jié)pH8-9，持續(xù)攪拌3h直到Boc-Pro-Ala-OH消失。反應(yīng)混合物過濾，濾除DCU。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物用40ml乙酸乙酯重新溶解并置于50ml分液漏斗中，然后依次用飽和碳酸氫鈉水溶液(10mlX3)、5y。硫酸氫鉀水溶液(10mlX3)、飽和氯化鈉水溶液(10mlX3)萃洗三遍，分出的乙酸乙酯層，并用無水硫酸鈉干燥2h。過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，200-300目硅膠柱層析，得到無色油狀產(chǎn)物1.01g(90M)即為Boc隱Pro-Ala國Lys(Z)-OBzl。([a]D25=-32.7(C=l，MeOH)。ESI-MS(m/e)639[M+H]+.一MR(CDClrd)5/ppm=7.371(m，10H),5.223(s,2H),5.156(s，2H),4.601(q,1H),4.454(t，1H),4.271(t，1H),3.494(t，1H)，3,430(t，1H),3.130(t，2H),2.193(s,3H)，2.034(t，1H)，1.909(m，2H),1.817(t,1H)，1.712(m,2H)，1.703(m,1H)，1.506(m，1H)，1.417(s,9H),1.359(d,3H)，1.278(m，2H)。元素分析(C34H46N408):計(jì)算值C63.93、H7.26、N8.77;實(shí)測值C63.80、H7.33、N8.95。4)制備H-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl將lg(1.567mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl置于50ml茄形瓶中，用3ml乙酸乙酯溶解，滴入4NHCl/EtOAc6ml，反應(yīng)3小時(shí)直到原料點(diǎn)消失。用水泵將反應(yīng)液抽干，加入無水乙醚，再次用水泵將反應(yīng)液抽干，重復(fù)5次。殘留物用無水乙醚泡洗，塑料鏟磨洗，將無水乙醚傾出，反復(fù)多次直到得900mg類白色固體(100%)即為H-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl鹽酸鹽。Mp57-59°C，[a]D25=-47.9(C=19,MeOH)。ESI-MS(m/e)539[M+H]+。元素分析(C29H38N406):計(jì)算值C64.67、H7.ll、N10.40;實(shí)測值C64.81、H7.04、N10.58。5)制備H-Pro-Ala-Lys-OH將900mg(1.673mmol)H-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，用8ml乙醇及2ml水溶解，加入1.5gPd/C，滴加3滴甲酸，用三通抽出空氣，通入裝在氣袋內(nèi)的H2，反復(fù)五次，三通的最終狀態(tài)停留在通H2，持續(xù)通H2直至H-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。H-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失后，反應(yīng)混合物過濾，濾除Pd/C。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用無水乙醚磨洗，得520mg類白色固體(95°/。)即為H-Pro-Ala-Lys-OH。Mpl17-119°C，[a]D32=-48.5(C=15，MeOH)。ESI-MS(m/e)315[M+H]+'HNMR(DMSO-d)S/ppm=8.783(s,IH)，7.901(s,IH)4.308(q,IH),4.029(t，IH)，3.896(t，IH),3.099(t，2H),2.724(t，2H),2.228(t,IH),2.090s,4H),1.888(t，IH),1.788(m，2H),L692(m,IH)，1.599(m，IH)，1.569(m,2H)L321(d,3H),1.263(m,2H)."CNMR(DMSO-d)5/ppm=175.64,171.72,170.16,65.36,59.45,53.12,48.91，46.27,31.43,30.37，27.20,24.70,22.63,18.61。元素分析(C14H26N404):計(jì)算值C53.49、H8.34、N17.82;實(shí)測值C53.66、H8.41、N17.98。實(shí)施例2(PAK)2的制備1)制備Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OH將1.20g(3.8mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl置于50ml茄形瓶中，用3ml甲醇溶解，冰浴攪拌5分鐘，逐滴加入2N氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至11，檢測反應(yīng)一直保持pHll，反應(yīng)2小時(shí)直到Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。逐滴滴加飽和硫酸氫鉀水溶液至反應(yīng)溶液中調(diào)節(jié)pH至7，濾除析出的鹽，鹽餅滴加甲醇濾洗，轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮除去甲醇。繼續(xù)逐滴滴加飽和硫酸氫鉀水溶液調(diào)節(jié)pH至2，將此水溶液轉(zhuǎn)移至50ml分液漏斗中，加入20ml乙酸乙酯萃取一次，將有機(jī)層分出置于50ml三角瓶中，水層再以10ml乙酸乙酯萃取兩次(10mlX2)，合并有機(jī)層，有機(jī)層以飽和氯化鈉水溶液萃洗三遍(10mlX3)，分出乙酸乙酯，并用無水硫酸鈉固體干燥過夜，過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，得到920mg白色固體(90%)即為Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OH。Mpll3-115。C,[a]D25=-98.2(C=l,MeOH)。ESI-MS(m/e)549[M+H]+。1HNMR(CDClrd)5/ppm=7.361(m，5H),5.157(s,2H),4.523(q，1H)，4-499(t，1H),4.284(t,1H),3.499(t，IH)，3.33l(t，IH)，3.191(t,2H)，2-193(s,4H)，2.067(t,IH)，1.912(m，2H)，L814(t,1H)，L755(m，2H),L727(m,1H),1.526(m,1H)，1.499(s，9H)，1.380(d，3H),1.281(m，2H)。元素分析(C27H4()N408):計(jì)算值C59.11、H7.35、N10.21;實(shí)測值C59.00、H7.48、N10.06。2)制備Boc-Pro國Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl將819mg(1.495mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OH置于100ml茄形瓶中，加入30ml無水四氫呋喃溶解，冰浴攪拌下加入222mg(1.645mmol)HOBt及339mg(1.645mmol)DCC，得到溶液A。將860mg(1.495mmol)H-Pro-Ala-Lys(Z)隱OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，加入30ml無水四氫呋喃溶解，用NMM調(diào)pH7，得到溶液B。將溶液B滴加至冰浴攪拌下的溶液A中，用NMM調(diào)節(jié)pH8-9，持續(xù)攪拌3h直到原料點(diǎn)消失。反應(yīng)混合物過濾，濾除DCU。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物用80ml乙酸乙酯重新溶解并置于100ml分液漏斗中，然后依次用飽和碳酸氫鈉水溶液(20mlX3)、5y。硫酸氫鉀水溶液(20mlX3)、飽和氯化鈉水溶液(20mlX3)萃洗三遍，分出的乙酸乙酯層，并用無水硫酸鈉干燥2h。過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，200-300目硅膠柱層析，得到類白色固體1.400g(88。/。)即為Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl。Mp54-56°C,[a]D"--28.7(C=l,MeOH)。ESI-MS(m/e)1069[M+H]+。'HNMR(CDCl3-d)5/ppm=7.389(m，15H),5.157(s，2H)，4.998(s，4H)，4.409(q，2H)，4.364(m，2H)，4.132(m，2H)，3.590(m，2H),3.498(m,2H)，3.350(t,4H),2.148(br，6H)，2.082(m,2H),L968(m，4H)，1.798(br，2H)，L720(b2，4H),1.652(br，2H),1.499(br，2H),1.398(s,9H),1.328(m，6H)，1.203(m,4H)。元素分析(C56H76N8013):計(jì)算值C62.90、H7.16、N10.48;實(shí)測值C62.74、H7.07、N10.61。2)制備H-Pro-Ala國Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl將lg(0.936mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala隱Lys(Z)-OBzl置于50ml茄形瓶中，用5ml乙酸乙酯溶解，滴入4NHCl/EtOAc8ml，反應(yīng)3小時(shí)直到原料點(diǎn)消失。用水泵將反應(yīng)液抽干，加入無水乙醚，再次用水泵將反應(yīng)液抽干，重復(fù)5次。殘留物用無水乙醚泡洗，塑料鏟磨洗，將無水乙醚傾出，反復(fù)多次直到得940mg類白色固體(100%)即為H-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro陽Ala-Lys(Z)國OBzl。Mp73-75°C，[a]D25=-34.7(Ol,MeOH)。ESI-MS(m/e)969[M+H〗+。元素分析(C51H68N80):計(jì)算值C63.21、H7.07、N11.56;實(shí)測值C63.04、H7.19、N11.79。3)制備(PAK^將320mg(0.319mmol)H-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，用8ml乙醇及2ml水溶解，加入300mgPd/C，滴加3滴甲酸，用三通抽出空氣，通入裝在氣袋內(nèi)的H2，反復(fù)五次，三通的最終狀態(tài)停留在通H2,持續(xù)通H2至H-Pro曙Ala-Lys(Z)-Pro-Ala陽Lys(Z)-OBzl消失。H-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失后，反應(yīng)混合物過濾，濾除Pd/C。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用無水乙醚磨洗，得180mg類白色固體(87。/。)艮卩為(PAK)2。Mp128-130°C,[a]D32=-70.7(C=l,MeOH)。ESI-MS(m/e)611[M+H]+.'HNMR(DMSO-d)5/ppm=8.568(br，1H)，8.167(br，IH)，7.915(br，1H),7.706(br，1H)，4.441(br,1H)，4.318(br,1H),4,220(br，1H),3.967(br,1H),3.619(br，2H),3.055(br,4H),2.724(br,4H)，2.227(br，2H)，2.082(s，6H),L868(br,2H),1.768(br,4H)，1.644(br,2H)，1.627(br，2H),1.552(br,4H)，1.373(br,6H),1.205(br，4H).13CNMR(DMSO-d)S/ppm=173.98，172.09，170.37，67.06,59.50，53.68,49.37，46.74，31.15，30.46,27.05,24.79,22.24，18.71。元素分析(C28H50N8O7):計(jì)算值C55.06、H8.25、N18.35;實(shí)測值C55.20、H8.32、N18.51。實(shí)施例3(PAK)3的制備1)制備Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl將381mg(0.697mmol)Boc隱Pro-Ala-Lys(Z)-OH置于100ml茄形瓶中，加入30ml無水四氫呋喃溶解，冰浴攪拌下加入104mg(0.767mmol)HOBt及159mg(0.767mmol)DCC，得至lj溶液A。將700mg(0.697mmo1)H-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，加入30ml無水四氫呋喃溶解，用NMM調(diào)pH7，得到溶液B。將溶液B滴加至冰浴攪拌下的溶液A中，用NMM調(diào)節(jié)pH8-9，持續(xù)攪拌3h直到H-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反應(yīng)混合物過濾，濾除DCU。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物用80ml乙酸乙酯重新溶解并置于100ml分液漏斗中，然后依次用飽和碳酸氫鈉水溶液(20mlX3)、5。/。硫酸氫鉀水溶液(20mlX3)、飽和氯化鈉水溶液(20mlX3)萃洗三遍，分出的乙酸乙酯層，并用無水硫酸鈉干燥2h。過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，200-300目硅膠柱層析，得類白色固體835mg(80%)即為Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro曙Ala-Lys(Z)-Pro-Ala國Lys(Z)-OBzl。Mp70-72°C，[a]D25=-69.6(C=1，MeOH)。ESI-MS(m/e)1499[M+H]+。元素分析(C78H106NI2Ol8):計(jì)算值C62.47、H7.12、N11.21;實(shí)測值C62.52、H7.21、N11.37。2)制備H-Pro-Ala扁Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl將800mg(0.534mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl置于50ml茄形瓶中，用5ml乙酸乙酯溶解，滴入4NHCl/EtOAc8ml，反應(yīng)3小時(shí)直到原料點(diǎn)消失。用水泵將反應(yīng)液抽干，加入無水乙醚，再次用水泵將反應(yīng)液抽干，重復(fù)5次。殘留物用無水乙醚泡洗，塑料鏟磨洗，將無水乙醚傾出，反復(fù)多次直到得760mg類白色固體(99%)艮卩為H-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala隱Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl。Mp93-95°C,[a]D25=-76.2(C=l,MeOH)。ESI-MS(m/e)1399[M+H]+。元素分析(C73H卯N。Ch6):計(jì)算值C62.64、H7.06、N12.01;實(shí)測值C62.81、H7.12、N12.18。3)制備(PAK)3將310mg(0.216mmol)H-Pro隱Ala-Lys(Z)-Pro-Ala匿Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，用8ml乙醇及2ml水溶解，加入250mgPd/C，滴加3滴甲酸，用三通抽出空氣，通入裝在氣袋內(nèi)的H2，反復(fù)五次，三通的最終狀態(tài)停留在通H2，持續(xù)通H2直至H-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。H-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失后，反應(yīng)混合物過濾，濾除Pd/C。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用無水乙醚磨洗，得180mg類白色固體(89。/。)艮卩為(PAK)3。Mp141-143°C,[a]D32=-100.1(C=l，MeOH)。ESI-MS(m/e)907[M+H]+。'HNMR(DMSO匿d)S/ppm=8.203(br,1H),8.176(br，2H),7.938(br，2H)，7.765(br,1H),4.447(br，2H),4.432(br，2H)，4.427(br,2H),3.629(br，1H),3.573(br，2H)，3.116(br，6H),2.722(br,6H),2.298(br,3H),2.096(s，8H),1.855(br，9H),1.639(br，6H),1.552(br,6H),L373(br，9H),1.202(br,6H).13CNMR(畫S()-d)S/ppm=173.56,172.34，170.78，67.08，59.73,53.61,49.05,47.32，31.16,30.46,27.11,24.95,22.29,18.73。元素分析(C42H74N1201()):計(jì)算值C55.61、H8.22、N18.53;實(shí)測值C55.77、H8.13、N18.69。實(shí)施例4(PAK)4的制備1)制備Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)陽OH將320mg(0.300mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala隱Lys(Z)-OBzl用3ml甲醇溶解，冰浴攪拌5分鐘，逐滴加入2N氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至ll，檢測反應(yīng)一直保持pHl1，反應(yīng)2小時(shí)直到Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。逐滴滴加飽和硫酸氫鉀水溶液至反應(yīng)溶液中調(diào)節(jié)pH至7，濾除析出的鹽，鹽餅滴加甲醇濾洗，轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮除去甲醇。繼續(xù)逐滴滴加飽和硫酸氫鉀水溶液調(diào)節(jié)pH至2，將此水溶液轉(zhuǎn)移至50ml分液漏斗中，加入20ml乙酸乙酯萃取一次，將有機(jī)層分出置于50ml三角瓶中，水層再以10ml乙酸乙酯萃取兩次(10mlX2)，合并有機(jī)層，有機(jī)層以飽和氯化鈉水溶液萃洗三遍(10mlX3)，分出乙酸乙酯，并用無水硫酸鈉固體干燥過夜，過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，得到290mg白色固體(99%)即為Boc曙Pro陽Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OH。Mp85-87°C，[a]D25=-90.3(C=l，MeOH)。ESI-MS(m/e)979[M+H]+。1HNMR(CDCl3-d)S/ppm=7.360(m，l()H)，5細(xì)(s，4H)，4.496(br,4H),4.254(br,2H)，3.672(br,1H)，3.586(br，1H)，3.429(br，1H),3.358(br，1H),3.157(br，4H)，2.127(br，7H),2.047(br，2H)，1.876(br，6H)，1.744(br，8H),1.499(br,9H),1.380(br,6H)，1.285(br,4H)。元素分析(C49H7QN8013):計(jì)算值C60.11、H7.21、N11,44;實(shí)測值C60.28、H7.30、N11.62。2)制備Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl將194mg(0.199mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OH置于50ml莉形瓶中，加入20ml無水四氫呋喃溶解，冰浴攪拌下加入30mg(0.219mmol)HOBt及45mg(0.219mmol)DCC，得到溶液A。將200mg(0.199mmol)H-Pro國Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，加入20ml無水四氫呋喃溶解，用NMM調(diào)pH7，得到溶液B。將溶液B滴加至冰浴攪拌下的溶液A中，用NMM調(diào)節(jié)pH8-9，持續(xù)攪拌3h直到Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OH消失。反應(yīng)混合物過濾，濾除DCU。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物用80ml氯仿重新溶解并置于100ml分液漏斗中，然后依次用飽和碳酸氫鈉水溶液(10mlX3)、5%硫酸氫鉀水溶液(10mlX3)、飽和氯化鈉水溶液(10mlX3)萃洗三遍，分出的氯仿層，并用無水硫酸鈉干燥2h。過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，200-300目硅膠柱層析，得300mg類白色固體(78%)艮卩為Boc-Pro陽Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro隱Ala-Lys(Z)-Pro陽Ala-Lys(Z)-OBzl。Mp78-80°C,[a]D25=-34.5(C=1.5，MeOH)。ESI-MS(m/e)1931[M+H]+。元素分析(<:100111361^6023):計(jì)算值C62.22、H7.10、N11.61;實(shí)測值C62.06、H7.02、N11.78。3)制備H隱Pro-Ala-Lys(Z)國Pro-Ala陽Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl將260mg(0.135mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl置于50ml茄形瓶中，用5ml乙酸乙酯溶解，滴入4NHCl/EtOAc8ml，反應(yīng)3小時(shí)直至UBoc-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala隱Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。用水泵將反應(yīng)液抽干，加入無水乙醚，再次用水泵將反應(yīng)液抽千，重復(fù)5次。殘留物用無水乙醚泡洗，塑料鏟磨洗，將無水乙醚傾出，反復(fù)多次得230mg類白色固體(91%)即為H-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala國Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl。Mp100-102。C,[a]D25=-42.5(C=l,MeOH)。ESI-MS(m/e)1831[M+H]+。元素分析(C95H128N16021):計(jì)算值C62.35、H7.05、N12.25;實(shí)測值C62.20、H7.97、N12.42。4)制備(PAK)4將230mg(0.123mmol)H-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala國Lys(Z)-Pro-Ala陽Lys(Z)-OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，用8ml乙醇及2ml水溶解，加入150mgPd/C，滴加3滴甲酸，用三通抽出空氣，通入裝在氣袋內(nèi)的H2，反復(fù)五次，三通的最終狀態(tài)停留在通H2，持續(xù)通H2直至H-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。H-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro陽Ala-Lys(Z)-OBzl消失后，反應(yīng)混合物過濾，濾除Pd/C。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用無水乙醚磨洗，得135mg類白色固體(90。/。)即為(PAK)4。Mp188-189°C,[a]D32=-98.9(C=l，MeOH)。ESI-MS(m/e)1203[M+H]+。'HNMR(DMSO-d)5/ppm=8.461(br,4H)，7.925(br,2H)，7.579(br,2H)，4.624(br,4H)，4.258(br,4H)，3.778(br，4H),2.702(br，16H)，2.473(br，4H)，2.096(br，IOH),1.790(br，12H)，1.558(br，16H)，1.212(br，20H)."CNMR(DMSO-d)5/ppm=173.45,172.32,170.56，65.51,60.52,50.56，49.13,47.35，30.97,29.85，27.06,24.92,21.72，18.87。元素分析(C56H98N16013)d"f^^C55.89、H8.21、N18.62;實(shí)測值C55.77、H8.14、N18.89。實(shí)施例5(PAK》的制備制備Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)陽Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)陽Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl將307mg(0.314mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OH置于50ml茄形瓶中，加入20ml無水四氫呋喃溶解，冰浴攪拌下加入47mg(0.345mmol)HOBt及71mg(0.345mmol)DCC，得到溶液A。將450mg(0.199mmol)H-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro陽Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，加入20ml無水四氫呋喃溶解，用NMM調(diào)pH7，得到溶液B。將溶液B滴加至冰浴攪拌下的溶液A中，用NMM調(diào)節(jié)pH8-9，持續(xù)攪拌3h直到H-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala隱Lys(Z)-OBzl消失。反應(yīng)混合物過濾，濾除DCU。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物用80ml氯仿重新溶解并置于100ml分液漏斗中，然后依次用飽和碳酸氫鈉水溶液(10mlX3)、5n/。硫酸氫鉀水溶液(10mlX3)、飽和氯化鈉水溶液(10mlX3)萃洗三遍，分出的氯仿層，并用無水硫酸鈉干燥2h。過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，200-300目硅膠柱層析，得到白色固體470mg(64%)即為Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl。Mp85-87。C，[a]D25=-30.6(C=l,MeOH)。ESI-MS(m/e)1180[M+H]2+。元素分析(C122H166N20O28):計(jì)算值C62.07、H7.09、N11.87;實(shí)測值C62.23、H7.20、N11.70。2)鬼U備H-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala隱Lys(Z)隱Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl將410mg(0.mmmoUBoc-Pro-Ala-LysO-Pro-Ala-LysO-Pro-Ala-LysO-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl置于50ml茄形瓶中，用5ml乙酸乙酯溶解，滴入4NHCl/EtOAc8ml，反應(yīng)3小時(shí)直到Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)陽Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。用水泵將反應(yīng)液抽干，加入無水乙醚，再次用水泵將反應(yīng)液抽干，重復(fù)5次。殘留物用無水乙醚泡洗，塑料鏟磨洗，將無水乙醚傾出，反復(fù)多次直到得380mg類白色固體(95%)即為H-Pro-Ala-Lys(Z)陽Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala隱Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl。Mp112-114°C,D25=-47.5(C=l,MeOH)。ESI-MS(m/e)1130[M+H]2+。元素分析(C117H158N20O26):計(jì)算值C62.16、H7.04、N,12.39;實(shí)測值C62.01、H7.12、N12.21。3)制備(PAK)s將200mg(0.087mmol)H-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，用8ml乙醇及2ml水溶解，加入100mgPd/C，滴加3滴甲酸，用三通抽出空氣，通入裝在氣袋內(nèi)的H2，反復(fù)五次，三通的最終狀態(tài)停留在通H2，持續(xù)通H2直至H-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala陽Lys(Z)-OBzl消失。H-Pro隱Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失后，反應(yīng)混合物過濾，濾除Pd/C。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用無水乙醚磨洗，得120mg類白色固體(卯％)即為(PAK)s。Mp193-195°C,[a]D32=-75.9969(C=10mg/ml,MeOH)。ESI國MS(m/e)1500[M+H]+'，1HNMR(DMSO-d)5/ppm=8.098(br，10H),4.445(br，3H),4.312(br，4H)，4.226(br，3H),3.628(br，5H),2.732(br，20H)，2.673(m,3H),2.322(m,2H),2.096(br，12H),L825(br,15H),l,558(br,20H),1.312(br,25H).13CNMR(DMSO-d)3/ppm=172.35，171.72,170.37,65.38，60.09,50.59，49.38,47.32，30.43，29.56，27.07,24.94，23.89,18.85。元素分析(C70H122N20O16):計(jì)算值C56.06、H8.20、N18.68;實(shí)測值C56.21、H8.12、N18.51。實(shí)施例6(PAK)6的制備1)制備Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OH將690mg(0.461mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl用3ml甲醇溶解，冰浴攪拌5分鐘，逐滴加入2N氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至11，檢測反應(yīng)一直保持pHll，反應(yīng)2小時(shí)直到Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。逐滴滴加飽和硫酸氫鉀水溶液至反應(yīng)溶液中調(diào)節(jié)pH至7，濾除析出的鹽，鹽餅滴加甲醇濾洗，轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮除去甲醇。繼續(xù)逐滴滴加飽和硫酸氫鉀水溶液調(diào)節(jié)pH至2，將此水溶液轉(zhuǎn)移至50ml分液漏斗中，加入20m乙酸乙酯萃取一次，將有機(jī)層分出置于50ml三角瓶中，水層再以10ml乙酸乙酯萃取兩次(10mlX2)，合并有機(jī)層，有機(jī)層以飽和氯化鈉水溶液萃洗三遍(10mlX3)，分出乙酸乙酯，并用無水硫酸鈉固體干燥過夜，過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，得到570mg類白色固體(88%)即為Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OH。Mp86-88°C，[a]D25=-74.8(C=l，MeOH)。ESI-MS(m/e)1409[M+H〗+。元素分析(C71H100N12O18):計(jì)算值C60.50、H7.15、N11.92;實(shí)測值C60.66、H7.29、N11.78。2)制備Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl將314mg(0.223mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala國Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OH置于50ml茄形瓶中，加入20ml無水四氫呋喃溶解，冰浴攪拌下加入33mg(0.245mmol)HOBt及50mg(0.245mmol)DCC,得至U溶液A。將320mg(0.223mmol)H-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，加入20ml無水四氫呋喃溶解，用NMM調(diào)pH7，得到溶液B。將溶液B滴加至冰浴攪拌下的溶液A中，用畫M調(diào)pH8-9，持續(xù)攪拌3h直到Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OH消失。反應(yīng)混合物過濾，濾除DCU。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物用80ml氯仿重新溶解并置于100ml分液漏斗中，然后依次用飽和碳酸氫鈉水溶液(10mlX3)、5y。硫酸氫鉀水溶液(10mlX3)、飽和氯化鈉水溶液(10mlX3)萃洗三遍，分出的氯仿層，用無水硫酸鈉干燥2h。過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，200-300目硅膠柱層析，得到類白色固體370mg(59Q/。)即為Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro國Ala-Lys(Z)-Pro-Ala曙L(fēng)ys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl。Mp93-95°C，[a]D25=-23.6(Ol，MeOH)。ESI-MS(m/e)1395[M+H]2+。元素分析(C144H196N24033):計(jì)算值C61.96、H7肌N12.04;實(shí)測值C61.82、H7.00、N12.21。3)制備H-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala國Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala陽Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl將320mg(0,115mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl置于50ml茄形瓶中，用5ml乙酸乙酯溶解，滴入4NHCl/EtOAc8ml，反應(yīng)3小時(shí)直到Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro陽Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)畫Pro-Ala陽Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。用水泵將反應(yīng)液抽干，加入無水乙醚，再次用水泵將反應(yīng)液抽干，重復(fù)5次。殘留物用無水乙醚泡洗，塑料鏟磨洗，將無水乙醚傾出，反復(fù)多次直到得280mg類白色固體(90%)即為H-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl。Mp117-119°C,[a]D25=-81.4(C=1.MeOH)。ESI-MS(m/e)1345[M+H]2+。元素分析(C139H188N24031):計(jì)算值C62.04、H7.04、N12.49;實(shí)測值C62.21、H7.ll、N12.65。4)制備(PAK)6將280mg(0.103mmol)H-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，用8ml乙醇及2ml水溶解，加入100mgPd/C，滴加3滴甲酸，用三通抽出空氣，通入裝在氣袋內(nèi)的H2，反復(fù)五次，三通的最終狀態(tài)停留在通H2，持續(xù)通H2直至H-Pro-Ala-Lys(Z)國Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。H-Pro隱Ala-Lys(Z)-Pro-Ala曙L(fēng)ys(Z)-Pro-Ala曙L(fēng)ys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失后，反應(yīng)混合物過濾，濾除Pd/C。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用無水乙醚磨洗，得168mg類白色固體(89%)即為(PAK)6。Mp202-204°C，[a]D32=-64.9(C=l，MeOH)。ESI-MS(m/e)1797[M+H]+。1HNMR(DMSO-d)5/ppm=8.029(br,12H)，4.451(br,6H),4.256(br,6H),3.550(br，6H),2.729(br,24H)，2.489(br,6H),2.098(br,14H),L795(br，18H),1.536(br,24H)，1.227(br,30H).13CNMR(DMSO-d)S/ppm=172.49,171.71,170.23，65.58，60.22，51.01，49.28,47.32,31.14,29.51，27.14，24.90，22.62，18.42。元素分析(C84H146N24019):計(jì)算值C56.17、H8.19、N18.72;實(shí)測值C56.01、H8.13、N18.91。實(shí)施例7KPA的制備1)制備Boc-Pro-Ala-OBzl將3.0g(13.95mmol)Boc-Pro-OH置于100ml茄形瓶中，加入40ml無水四氫呋喃溶解，冰浴攪拌下加入2.072g(15.35mmol)HOBt及3.162mg(15.35mmol)DCC，得到溶液A。將5.14g(14.65mmol)H-Ala-OBzl對甲苯磺酸鹽置于50ml茄形瓶中，加入30ml無水四氫呋喃溶解，用NMM調(diào)pH7，得到溶液B。將溶液B滴加至冰浴攪拌下的溶液A中，用NMM調(diào)節(jié)pH8-9，持續(xù)攪拌3h直到原料點(diǎn)消失。反應(yīng)混合物過濾，濾除DCU。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物用80ml乙酸乙酯重新溶解并置于100ml分液漏斗中，然后依次用飽和碳酸氫鈉水溶液(20mlX3)、5%硫酸氫鉀水溶液(20mlX3)、飽和氯化鈉水溶液(20mlX3)萃洗三遍，分出的乙酸乙酯層，并用無水硫酸鈉干燥2h。過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，乙酸乙酯-石油醚重結(jié)晶，得到無色晶體4.62g(88。/o)即為Boc-Pro陽Ala-OBzl。Mp111-113°C,[a〗D25=-64.6(01,MeOH)。ESI-MS(m/e)377[M+H]+。元素分析(C20H28N2O5):計(jì)算值C63.81、H7.50、N7.44;實(shí)測值C63.98、H7.60、N7.31。2)制備H-Pro-Ala陽OBzl將3.76g(10mmol)Boc-Pro-Ala-OBzl置于100ml茄形瓶中，用7ml乙酸乙酯溶解，滴入4NHCl/EtOAc10ml，反應(yīng)10小時(shí)直到Boc-Pro-Ala-OBzl消失。用水泵將反應(yīng)液抽干，加入無水乙醚，再次用水泵將反應(yīng)液抽干，重復(fù)5次。殘留物用無水乙醚泡洗，塑料鏟磨洗，將無水乙醚傾出，反復(fù)多次得無色油狀產(chǎn)物即為H-Pro-Ala-OBzl。[a]D25=-78.5(C=l,MeOH)。ESI-MS(m/e)277[M+H]+。元素分析(C15H20N2O3):計(jì)算值C65.20、H7.30、N10.14;實(shí)測值C65.03、H7.21、N10.00。3)制備Boc-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl將3.776g(9.10mmol)Boc-Lys(Z-2-Cl)-OH置于100ml茄形瓶中，加入30ml無水四氫呋喃溶解，冰浴攪拌下加入1.289g(9.55mmol)HOBt及2.060g(10.00mmol)DCC，得到溶液A。將3.125g(10.00mmol)H-Pro-Ala-OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，加入30ml無水四氫呋喃溶解，用NMM調(diào)pH7，得到溶液B。將溶液B滴加至冰浴攪拌下的溶液A中，用NMM調(diào)節(jié)pH8-9，持續(xù)攪拌3h直到H-Pro-Ala-OBzl消失。反應(yīng)混合物過濾，濾除DCU。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物用80ml乙酸乙酯重新溶解并置于50ml分液漏斗中，然后依次用飽和碳酸氫鈉水溶液(20mlX3)、5。/。硫酸氫鉀水溶液(20mlX3)、飽和氯化鈉水溶液(20mlX3)萃洗三遍，分出的乙酸乙酯層，并用無水硫酸鈉干燥2h。過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，200-300目硅膠柱層析，得到無色油狀產(chǎn)物5.85g(95%)即為Boc-Lys(Z-2陽Cl)-Pro-Ala-OBzl。[a]D25=-50.7405(C=10mg/ml，MeOH)。ESI-MS(m/e)673[M+H〗+.'HNMR(CDCl3-d)5/ppm=7.316(m，9H)，5.342(s,2H)，5.207(s,2H)，4.656(q,1H),4.583(t,IH)，4.469(t，IH)，3.693(t,IH)，3.538(t，1H),3,186(t2H)，2.323(s,3H)，2細(xì)(t,1H)，L987(m,2H)，L893(t，1H),L737(m,2H)，1.652(m，IH),1.499(m,IH),l扁(s,9H),l，(d,3H),L263(m,2H)。元素分析(C34H45C1N408):計(jì)算值C60.66、H6.74、N8.32;實(shí)測值C60.50、H6.67、N8.51。4)制備H-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl將3.916g(5.810mmol)Boc-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl置于100ml茄形瓶中，用7ml乙酸乙酯溶解，滴入4NHCl/EtOAc10ml，反應(yīng)10小時(shí)直到Boc-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl消失。用水泵將反應(yīng)液抽干，加入無水乙醚，再次用水泵將反應(yīng)液抽干，重復(fù)5次。殘留物用無水乙醚泡洗，塑料,產(chǎn)磨洗，將無水乙醚傾出，反復(fù)多次直到得白色固體3.406g(96。/。)艮卩為H-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl。Mp49-51°C,[a]D25=-70.5(C=l,MeOH)。ESI-MS(m/e)573[M+H]+。元素分析(C29H37C1N406):計(jì)算值C60.78、H6.51、N9.78;實(shí)測值C60.94、H6.61、N9.62。5)制備KPA將350mg(0.611mmol)H-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，用8ml乙醇及2ml水溶解，加入600mgPd/C，滴加3滴甲酸，用三通抽出空氣，通入裝在氣袋內(nèi)的H2，反復(fù)五次，三通的最終狀態(tài)停留在通H2，持續(xù)通&直至H-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl消失。H-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl消失后，反應(yīng)混合物過濾，濾除Pd/C。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用無水乙醚磨洗，得200mg類白色固體(100%)即為KPA。Mp120-122°C,[a]D32=-19.3(C=l,MeOH)。ESI-MS(m/e)315[M+H]+。toMR(DMSO-d)5/ppm=8.273(s,1H),8.165(s，1H)4.238(q，IH)，4.097(t,IH)，3.629(t，1H),3.317(t，2H),2.705(t，2H),2.429(t,IH)，2.063(s，4H)，L893(t,IH)，L735(m,2H),1.532(m，2H)，1.378(m,2H)，1.224(d,3H)，lJ98(m，2H).13CNMR(DMSO-d)S/ppm=173.21，171.41,167.68,60.68，59.31,52.37，50.98,47.52，31,68,29.50，26.73，24.98，20.96,18.02。元素分析(C14H26N404):計(jì)算值C53.49、H8.34、N17.82;實(shí)測值C53.64、H8.42、N17.99。實(shí)施例8(KPA)2的制備1)制備Boc-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OH將5.020g(7.459mmol)Boc-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl用10ml甲醇溶解，冰浴攪拌5分鐘，逐滴加入2N氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至11，檢測反應(yīng)一直保持pHll，反應(yīng)2小時(shí)直到Boc-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl消失。逐滴滴加飽和硫酸氫鉀水溶液至反應(yīng)溶液中調(diào)節(jié)pH至7，濾除析出的鹽，鹽餅滴加甲醇濾洗，轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮除去甲醇。繼續(xù)逐滴滴加飽和硫酸氫鉀水溶液調(diào)節(jié)pH至2，將此水溶液轉(zhuǎn)移至100ml分液漏斗中，加入60ml乙酸乙酯萃取一次，將有機(jī)層分出置于100ml三角瓶中，水層再以10ml乙酸乙酯萃取兩次(10mlX2)，合并有機(jī)層，有機(jī)層以飽和氯化鈉水溶液萃洗三遍(10mlX3)，分出乙酸乙酯，并用無水硫酸鈉固體干燥過夜，過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，得到4.000g無色油狀產(chǎn)物(92%)即為Boc-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OH。[a]D25=-55.3494(C=10mg/ml，MeOH)。ESI-MS(m/e)583[M+H]+。'HNMR(CDCl3-d)S/ppm=7.369(m,2H),7.273(m,2H),5-210(s,2H)，4.694(q,1H),4.508(t,1H),4.493(t,1H),3.729(t,1H),3.612(t，1H)，3.196(t,2H),2.244(s,4H),2.098(t,1H)，1.909(m，2H),1.807(m，2H)，1.655(m,2H)，1.504(m，1H),1.499(s,9H),1.387(d,3H),1.261(m,2H)。元素分析(C27H39C1N408):計(jì)算值C55.62、H6.74;N9.61;實(shí)測值C55.76、H6.82、N9.80。2)制備Boc-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala陽OBzl將1.549g(2.657mmol)Boc-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OH置于100ml茄形瓶中，加入20ml無水四氫呋喃溶解，冰浴攪拌下加入0.395g(2.923mmol)HOBt及0.602g(2.923mmol)DCC，得到溶液A。將1.700g(2.790mmol)H-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，加入20ml無水四氫呋喃溶解，用NMM調(diào)pH7，得到溶液B。將溶液B滴加至冰浴攪拌下的溶液A中，用NMM調(diào)節(jié)pH8-9，持續(xù)攪拌3h直到H-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl消失。反應(yīng)混合物過濾，濾除DCU。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物用80ml乙酸乙酯重新溶解并置于50ml分液漏斗中，然后依次用飽和碳酸氫鈉水溶液(20mlX3)、5。/。硫酸氫鉀水溶液(20mlX3)、飽和氯化鈉水溶液(20mlX3)萃洗三遍，分出的乙酸乙酯層,并用無水硫酸鈉干燥2h。過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，200-300目硅膠柱層析，得到類白色固體2.655g(88。/o)艮卩為Boc-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl。Mp59-61°C,[a]D25=-61.2(C=l，MeOH)。ESI-MS(m/e)1137[M+H]+。元素分析(C56H74C12N8013):計(jì)算值C59.10、H6.55、N9.85;實(shí)測值C59.25、H6.72、N9.99。2)制備H-Lys(Z-2-Cl)陽Pro-Ala-Lys(Z陽2陽Cl)國Pro-Ala-OBzl將816mg(0.718mmol)Boc-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl置于100ml茄形瓶中，用3ml乙酸乙酯溶解，滴入4NHCl/EtOAc7ml，反應(yīng)3小時(shí)直到原料點(diǎn)消失。用水泵將反應(yīng)液抽干，加入無水乙醚，再次用水泵將反應(yīng)液抽干，重復(fù)5次。殘留物用無水乙醚泡洗，塑料鏟磨洗，將無水乙醚傾出，反復(fù)多次直到得類白色粉末692mg(90。/o)即為H-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl。Mp79-81。C，[a]D25=-63.6(C=l，MeOH)。ESI-MS(m/e)1037[M+H]+。元素分析(C^H^Cy^Ou):計(jì)算值C59.01、H6.41、N10.79;實(shí)測值C59.18、H6.49、N10.61。2)制備(KPA)2將365mg(0.340mmol)H-Lys(Z-2-Cl)-Pro陽Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro墨Ala國OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，用8ml乙醇及2ml水溶解，加入300mgPd/C，滴加3滴甲酸，用三通抽出空氣，通入裝在氣袋內(nèi)的H2，反復(fù)五次，三通的最終狀態(tài)停留在通H2，持續(xù)通H2直至H-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl消失。H-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl消失后，反應(yīng)混合物過濾，濾除Pd/C。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用無水乙醚磨洗，得220mg類白色固體(92。/。)即為(KPA)2。Mp132-134°C，[a]D32=-78.2(C=l,MeOH)。ESI-MS(m/e)611[M+H]+.'HNMR(DMSO-d)S/ppm=8.314(br，1H),8.283(br，1H),7.958(br,1H)，7.796(br，1H),4.445(br，1H)，4.293(br，2H)，4.015(br，1H),3.670(br,2H),3.507(br，4H),2.732(br,4H)，2.137(s,6H),2.028(br,2H)，1.854(br，4H),1.722(br,2H)，l細(xì)(br,4H),1.552(br，4H)，1.205(br，6H),1.121(br，4H).13CNMR(DMSO-d)S/ppm=172.99，171.32，167.93,65.37,60.34，51,04,49.03，47.53,31.25，29.59,26.81，24.93,21.86,18.52。元素分析(C28H5QN807):計(jì)算值C55.06、H8.25、N18.35;實(shí)測值C55.21、H8.33、N18.20。實(shí)施例9(KPA)3的制備1)制備Boc-Lys(Z國2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)國Pro-Ala-OH將3.000g(2.638mmol)Boc隱Lys(Z-2-Cl)陽Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl用6ml甲醇溶解，冰浴攪拌5分鐘，逐滴加入2N氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至11，檢測反應(yīng)一直保持pHl1，反應(yīng)2小時(shí)直到Boc-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl消失。逐滴滴加飽和硫酸氫鉀水溶液至反應(yīng)溶液中調(diào)節(jié)pH至7，濾除析出的鹽，鹽餅滴加甲醇濾洗，轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮除去甲醇。繼續(xù)逐滴滴加飽和硫酸氫鉀水溶液調(diào)節(jié)pH至2，將此水溶液轉(zhuǎn)移至100ml分液漏斗中，加入60ml乙酸乙酯萃取一次，將有機(jī)層分出置于100ml三角瓶中，水層再以10ml乙酸乙酯萃取兩次(10mlX2)，合并有機(jī)層，有機(jī)層以飽和氯化鈉水溶液萃洗三遍(10mlX3)，分出乙酸乙酯，并用無水硫酸鈉固體干燥過夜，過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，得到2.700g類白色固體(98%)即為Boc-Lys(Z-2曙Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)隱Pro-Ala-OH。Mp86-88°C,[a]D25=-32.4(C=l，MeOH)。ESI-MS(m/e)1047[M+H]+。元素分析(C49H68C12N8013):計(jì)算值C56.16、H6.54、N10.69;實(shí)測值C56.00、H6.48、N10.83。2)制備Boc-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala墨Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl將1.047g(lmmol)Boc-Lys(Z隱2陽Cl)-Pro扁Ala-Lys(Z-2墨Cl)-Pro-Ala-OH置于100ml茄形瓶中，加入30ml無水四氫呋喃溶解，冰浴攪拌下加入149mg(Ummol)HOBt及227mg(l.lmmol)DCC，得到溶液A。將609mg(lmmol)H-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，加入30ml無水四氫呋喃溶解，用NMM調(diào)pH7，得到溶液B。將溶液B滴加至冰浴攪拌下的溶液A中，用NMM調(diào)節(jié)pH8-9，持續(xù)攪拌3h直到Boc-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OH消失。反應(yīng)混合物過濾，濾除DCU。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物用80ml乙酸乙酯重新溶解并置于100ml分液漏斗中，然后依次用飽和碳酸氫鈉水溶液(20mlX3)、5%硫酸氫鉀水溶液(20mlX3)、飽和氯化鈉水溶液(20mlX3)萃洗三遍，分出的乙酸乙酯層，并用無水硫酸鈉干燥2h。過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，200-300目硅膠柱層析，得到類白色固體1.440g(90%)即為Boc-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala隱OBzl。Mp73-75°C，[a]D25=-60.1(C=l,MeOH)。ESI-MS(m/e)1601[M+H]+。元素分析(C78H103Cl3N12O18):計(jì)算值C58.44、H6.48、N10.48;實(shí)測值C58.62、H6.50、N10.31。3)制備H-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl將1000mg(0.625mmol)Boc-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl置于50ml茄形瓶中，用5ml乙酸乙酯溶解，滴入4NHCl/EtOAc8ml，反應(yīng)3小時(shí)直到原料點(diǎn)消失。用水泵將反應(yīng)液抽干，加入無水乙醚，再次用水泵將反應(yīng)液抽干，重復(fù)5次。殘留物用無水乙醚泡洗，塑料鏟磨洗，將無水乙醚傾出，反復(fù)多次直到得900mg類白色固體(94%)即為H-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl。Mp91-93°C,[a]D25=-71.9(C=l,MeOH)。ESI-MS(m/e)1501[M+H]+。元素分析(C73H95C13N12016):計(jì)算值C58.34、H6.37、N11.18;實(shí)測值C58.20、H6.31、N11.36。4)制備(KPA)3將300mg(0.195mmol)H-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，用8ml乙醇及2ml水溶解，加入200mgPd/C，滴加3滴甲酸，用三通抽出空氣，通入裝在氣袋內(nèi)的H2，反復(fù)五次，三通的最終狀態(tài)停留在通H2，持續(xù)通H2直至H-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl消失。H-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl消失后，反應(yīng)混合物過濾，濾除Pd/C。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用無水乙醚磨洗，得200mg類白色固體(99。/。)即為(KPA)3。Mp147-149°C，[a]D32=-98.1(C=l，MeOH)。ESI-MS(m/e)907[M+H]+。'HNMR(DMSO-d)S/ppm=8.315(br,IH)，8.128(br,3H)，7.982(br,2H),4.429(br,2H),4.257(br,2H),4.199(br,2H),3.702(br,1H),3.613(br，2H)，3.386(br,6H),2.732(br，6H),2.108(br，11H),1.785(br，9H),1.539(br,6H)，1.320(br,6H)，1.210(br,9H)，1.087(br,6H)."CNMR(DMSO-d)S/ppm=172.50，171.80,170.41,167.58,65,37,59.85,52.33,49.02，47.56，31.16，30.87，27.01，24.82，22.28,18.65。元素分析(C42H74N12O10):計(jì)算值C55.61、H8.22、N17.64;實(shí)測值C55.79、H8.30、N17.49。實(shí)施例10(KPA)4的制備1)制備Boc-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2隱Cl)-Pro-Ala-OBzl將488mg(0.466mmol)Boc-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OH置于50ml茄形瓶中，加入20ml無水四氫呋喃溶解，冰浴攪拌下加入69mg(0.513mmol)HOBt及106mg(0,513mmol)DCC，得到溶液A。將500mg(0.466mmol)H-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，加入20ml無水四氫呋喃溶解，用NMM調(diào)pH7，得到溶液B。將溶液B滴加至冰浴攪拌下的溶液A中，用NMM調(diào)節(jié)pH8-9，持續(xù)攪拌3h直到H-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl消失。反應(yīng)混合物過濾，濾除DCU。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物用80ml氯仿重新溶解并置于100ml分液漏斗中，然后依次用飽和碳酸氫鈉水溶液(10mlX3)、5。/。硫酸氫鉀水溶液(10mlX3)、飽和氯化鈉水溶液(10mlX3)萃洗三遍，分出的氯仿層，用無水硫酸鈉干燥2h。過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，200-300目硅膠柱層析，得到白色固體540mg(56%)即為Boc-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)陽Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl。Mp81-83。C，[a]D25=-68.6(01，MeOH)。ESI-MS(m/e)1034[M+H]2+。元素分析(C1()0H132Cl4N16O23):計(jì)算值C58.08、H6.43、N10.84;實(shí)測值C58.22、H6.52、N10.70。2)制備H-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro陽Ala-OBzl將50011^(0.24211111101)8001^(2陽2隱(:1)-1"0-八13-1^(2-2-(:1)-1"0-八13-1^(2-2-(:1)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl置于50ml茄形瓶中，用5ml乙酸乙酯溶解，滴入4NHCl/EtOAc8ml，反應(yīng)3小時(shí)直到Boc-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl消失。用水泵將反應(yīng)液抽干，加入無水乙醚，再次用水泵將反應(yīng)液抽干，重復(fù)5次。殘留物用無水乙醚泡洗，塑料鏟磨洗，將無水乙醚傾出，反復(fù)多次直到得42511^類白色固體(88%)即為11-1^3(2-2-<:1)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)陽Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala陽Lys(Z-2-Cl)-Pro陽Ala-OBzl。Mp108-110。C，[a]D25=-114.0(Ol，MeOH)。ESI-MS(m/e)1967[M+H]+。元素分析((:9511021):計(jì)算值C57.98、H6.35、N11.39;實(shí)測值C58.16、H6.43、N11.22。3)制備(KPA)4將325mg(0.162mmo1)H-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，用8ml乙醇及2ml水溶解，加入150mgPd/C，滴加3滴甲酸，用三通抽出空氣，通入裝在氣袋內(nèi)的H2，反復(fù)五次，三通的最終狀態(tài)停留在通H2，持續(xù)通H2直至H-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl消失。H-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)國Pro陽Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl消失后，反應(yīng)混合物過濾，濾除Pd/C。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用無水乙醚磨洗，得140mg類白色固體(70。/。)即為(KPA)4。Mp185-187°C,[a]D32=-105.7(C=l,MeOH)。ESI-MS(m/e)1203[M+H]+一MR(DMSO-d)S/ppm=8.361(br，2H),8.133(br，4H),7.902(br,2H)，4.434(br，4H),4.327(br，4H),3.667(br，4H)，2.706(br，固)，2.097(br，10H),L850(br，16H)，1.633(br，16H)，1.396(br,12H),1.287(br,4H),1.193(br，4H).13CNMR(DMSO-d)S/ppm=173.52，172.46，171.68,170.41，167.59，59.86，59.38，50.97，48.53，47.98,30.97,29.59，27.03，24.94，22.22,18.90。元素分析(C56H98Nl6013):計(jì)算值C55.89、H8.21、N18.62;實(shí)測值C55.72、H8.12、N18.77。實(shí)施例ll(KPA)s的制備1)制備8001^5(2-2-<:1)-1"0-八13-1^3(2-2-(:1)隱？1"0-八1&-1^5(2-2-(:1)-1"0-八13-1^5(2-2-C1)-Pro陽Ala國Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl將200mg(0.191mmol)Boc-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OH置于50ml茄形瓶中，加入15ml無水四氫呋喃溶解，冰浴攪拌下加入29mg(0.210mmol)HOBt及44mg(0.210mmol)DCC，得到溶液A。將294mg(0.191mmol)H-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，加入15ml無水四氫呋喃溶解，用NMM調(diào)pH7，得到溶液B。將溶液B滴加至冰浴攪拌下的溶液A中，用NMM調(diào)節(jié)pH8-9，持續(xù)攪拌3h直到H-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl消失。反應(yīng)混合物過濾，濾除DCU。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物用80ml氯仿重新溶解并置于100ml分液漏斗中，然后依次用飽和碳酸氫鈉水溶液(10mlX3)、5。/。硫酸氫鉀水溶液(10mlX3)、飽和氯化鈉水溶液(10mlX3)萃洗三遍，分出的氯仿層，并用無水硫酸鈉干燥2h。過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，200-300目硅膠柱層析，得到類白色固體380mg(79%)即為Boc-Lys(Z陽2-Cl)扁Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z隱2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl。Mp87-89°C,[a]D25=-102.4(C=1，MeOH)。ESI-MS(m/e)1266[M+H]2+。元素分析(C122H161Cl5N20O28):計(jì)算值C57.85、H6.41、N11.06;實(shí)測值C58.01、H6.49、N11.22。2)制備H-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-a)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl將380mg(0.150mmol)Boc-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro國Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl置于50ml茄形瓶中，用2ml乙酸乙酯溶解，滴入4NHCl/EtOAc3ml，反應(yīng)3小時(shí)直到Boc-Lys(Z-2-Cl)國Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala國Lys(Z-2-Cl)隱Pro-Ala曙L(fēng)ys(Z國2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl消失。用水泵將反應(yīng)液抽干，加入無水乙醚，再次用水泵將反應(yīng)液抽干，重復(fù)5次。殘留物用無水乙醚泡洗，塑料鏟磨洗，將無水乙醚傾出，反復(fù)多次直到得346mg類白色固體(95%)即為H-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl。Mp117隱119。C,[a]D25=-90.6(C=l,MeOH)。ESI-MS(m/e)1239[M/2+Na]+。元素分析(C117H153Cl5N20O26):計(jì)算值C57.76、H6.34、N11,51;實(shí)測值C57.60、H6.28、N11.67。3)制備(KPA)s將32011^(0.13011111101)11-1^^7-2-(:1)-1"0-八1&國1^(2-2曙(:1)-1"0-八1&-1^5(2-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，用8ml乙醇及2ml水溶解，加入100mgPd/C，滴加3滴甲酸，用三通抽出空氣，通入裝在氣袋內(nèi)的H2，反復(fù)五次，三通的最終狀態(tài)停留在通H2，持續(xù)通H2直至原料點(diǎn)消失。H-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2陽Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2國Cl)-Pro墨Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl消失后，反應(yīng)混合物過濾，濾除Pd/C。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用無水乙醚磨洗，得180mg類白色固體(90%)即為(KPA)s。Mp196-198°C,[a]D32=-101.0(01，MeOH)。ESI-MS(m/e)1500[M+H廣'HNMR(DMSO-d)S/ppm=8.112(br,10H),4.454(br,3H),4.309(br，4H),4.213(br，3H)，3.568(br,20H),2.821(br,10H),2.076(br,12H)，1.815(br,15H),1.574(br，20H),1.342(br，10H),1.213(br,IOH)，1.096(br,5H).I3CNMR(DMSO-d)5/ppm=174.36,171.98，170.19,65.27,59.31，52.46,50.67,48.29,47.23,31.12，29.61,26.91,24.93,22.21,18.25。元素分析(C7oH122N2Q016):計(jì)算值C56.06、H8.20、N18.68;實(shí)測值C56.24、H8.28、N18.84。實(shí)施例12(KPA)6的制備1)制備Boc-Lys(Z-2陽Cl)-Pro隱Ala-Lys(Z隱2國Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala陽OH將300mg(0.187腿ol)Boc-Lys(Z-2-Cl)隱Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2陽Cl)-Pro-Ala-OBzl用3ml甲醇溶解，冰浴攪拌5分鐘，逐滴加入2N氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至11，檢測反應(yīng)一直保持pHl1，反應(yīng)2小時(shí)直到Boc-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl消失。逐滴滴加飽和硫酸氫鉀水溶液至反應(yīng)溶液中調(diào)節(jié)pH至7，濾除析出的鹽，鹽餅滴加甲醇濾洗，轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮除去甲醇。繼續(xù)逐滴滴加飽和硫酸氫鉀水溶液調(diào)節(jié)pH至2，將此水溶液轉(zhuǎn)移至50ml分液漏斗中，加入20ml乙酸乙酯萃取一次，將有機(jī)層分出置于50ml三角瓶中，水層再以10ml乙酸乙酯萃取兩次(10mlX2)，合并有機(jī)層，有機(jī)層以飽和氯化鈉水溶液萃洗三遍(10mlX3)，分出乙酸乙酯，并用無水硫酸鈉固體干燥過夜，過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，得到280mg白色固體(98%)即為Boc-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro隱Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OH。Mp85-87。C,[a]D25=-67.3(C=l，MeOH)。ESI-MS(m/e)1511[M+H]+。元素分析(C71H97C13N12018):計(jì)算值C56.36、H6.46、N11.11;實(shí)測值C56.20、H6.38、N11.29。2)制備8001^5(2-2隱(:1)-1"0-八1&-1^5(2陽2-0)-1"0-八1&-1^5(2-2-(:1)-1"0-八1&-1^5(2-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro誦Ala-OBzl將200mg(0.132mmol)Boc-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OH置于50ml茄形瓶中，加入20ml無水四氫呋喃溶解，冰浴攪拌下加入20mg(0.146mmol)HOBt及30mg(0.146mmol)DCC，得到溶液A。將203mg(0.132mmo1)H隱Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala國OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，加入20ml無水四氫呋喃溶解，用NMM調(diào)pH7，得到溶液B。將溶液B滴加至冰浴攪拌下的溶液A中，用NMM調(diào)節(jié)pH8-9，持續(xù)攪拌3h直到Boc-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OH消失。反應(yīng)混合物過濾，濾除DCU。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物用80ml氯仿重新溶解并置于100ml分液漏斗中，然后依次用飽和碳酸氫鈉水溶液(10mlX3)、5/。硫酸氫鉀水溶液(10mlX3)、飽和氯化鈉水溶液(10mlX3)萃洗三遍，分出的氯仿層，并用無水硫酸鈉干燥2h。過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，200-300目硅膠柱層析，得到類白色固體270mg(68。/。)即為Boc-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)國Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala隱OBzl。Mp94-96°C，[a〗D25=-75.9(C=l,MeOH)。ESI-MS(m/e)1521[M/2+Na]+。元素分析(C144H190Cl6N24O33):計(jì)算值C57.69、H6.39、N11.21;實(shí)測值C57.52、H6.31、N11.38。3)制備H-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)國Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z隱2-Cl)-Pro-Ala-OBzl將2701^(0.09011111101)8001^(2-2-(:1)-1"0-八13-1^(2-2-(:1)-1"0國八13-1^(2-2-(:1)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro陽Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl置于50ml茄形瓶中，用2ml乙酸乙酯溶解，滴入4NHCl/EtOAc3ml，反應(yīng)3小時(shí)直到Boc-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)墨Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala隱Lys(Z國2扁Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl消失。用水泵將反應(yīng)液抽干，加入無水乙醚，再次用水泵將反應(yīng)液抽干，重復(fù)5次。殘留物用無水乙醚泡洗，塑料鏟磨洗，將無水乙醚傾出，反復(fù)多次直到得250mg類白色固體(96%)即為H-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro陽Ala曙OBzl。Mp118-120。C,[a]D25=-58.5(C=l,MeOH)。ESI-MS(m/e)1471[M/2+Na]+。元素分析(C136H182C16N24031):計(jì)算值C57.61、H6.33、N11.60;實(shí)測值C57.46、H6.24、N11.42。4)制備(KPA、將23011^(0.07811111101)11-1^(2-2-(:1)-1"0-八1&-1^(2-2陽(:1)-1"0-八1&-1^(2-2-(:1)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro墨Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，用8ml乙醇及2ml水溶解，加入100mgPd/C，滴加3滴甲酸，用三通抽出空氣，通入裝在氣袋內(nèi)的H2，反復(fù)五次，三通的最終狀態(tài)停留在通H2，持續(xù)通H2直至H-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z-2-Cl)-Pro-Ala-Lys(Z陽2隱Cl)-Pro-Ala-OBzl消失。原料點(diǎn)消失后，反應(yīng)混合物過濾，濾除Pd/C。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用無水乙醚磨洗，得140mg類白色固體(98。/。)即為(KPA)6。Mp197-199°C，[a]D32=-94.5(C=l,MeOH)。ESI-MS(m/e)1797[M+H廣'HNMR(DMS()-d)3/ppm=8.14(br,12H),4.44(br，6H)，4.32(br,6H)，3.62(br，3H)，3.39(br，3H),2.73(br,24H),2.08(br,20H)，1.82(br,18H)，1.58(br，24H),1.37(br,IOH)，L25(br,20H).'3CNMR(DMSO隱d)S/ppm=174.34，172.51,171.68，170.32，65.37,59.65，50.59,49.04,47.76，31.17，29.59，27.05,24.94，22.26,19.01,18.38。元素分析(C84H146N24019):計(jì)算值C56.17、H8.19、N18.72;實(shí)測值C56.34、H8.10、N18.89。實(shí)施例13AKP的制備1)制備Boc-Ala隱Lys(Z)-OBzl將2.0g(10.582mmol)Boc-Ala-OH置于100ml茄形瓶中，加入40ml無水四氫呋喃溶解，冰浴攪拌下加入1.571g(11.640mmol)HOBt及2.398mg(11.640mmol)DCC，得到溶液A。將5.740g(14.65mmol)H-Lys(Z)-OBzl對甲苯磺酸鹽置于50ml茄形瓶中，加入30ml無水四氫呋喃溶解，用NMM調(diào)pH7，得到溶液B。將溶液B滴加至冰浴攪拌下的溶液A中，用NMM調(diào)節(jié)pH8-9，持續(xù)攪拌3h直到H-Lys(Z)-OBzl消失。反應(yīng)混合物過濾，濾除DCU。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物用80ml乙酸乙酯重新溶解并置于100ml分液漏斗中，然后依次用飽和碳酸氫鈉水溶液(20mlX3)、5。/。硫酸氫鉀水溶液(20mlX3)、飽和氯化鈉水溶液(20mlX3)萃洗三遍，分出的乙酸乙酯層，并用無水硫酸鈉干燥2h。過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，乙酸乙酯-石油醚重結(jié)晶，得到無色晶體4.920g(86。/。)即為Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl。Mp115-117°C,[a]D25=-25.7(C=l，MeOH)。ESI-MS(m/e)542[M+H]+。元素分析(C29H39N307):計(jì)算值C64.31、H7.26、N7.76;實(shí)測值C64.47、H7.33、N7.92。2)制備Boc-Ala-Lys(Z)隱OH將4.5g(8.318mmol)Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl置于100ml茄形瓶中，用9ml甲醇溶解，冰浴攪拌5分鐘，逐滴加入2N氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至11，檢測反應(yīng)一直保持pHll，反應(yīng)2小時(shí)直到Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。逐滴滴加飽和硫酸氫鉀水溶液至反應(yīng)溶液中調(diào)節(jié)pH至7，濾除析出的鹽，鹽餅滴加甲醇濾洗，轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮除去甲醇。繼續(xù)逐滴滴加飽和硫酸氫鉀水溶液調(diào)節(jié)pH至2，將此水溶液轉(zhuǎn)移至100ml分液漏斗中，加入50ml乙酸乙酯萃取一次，將有機(jī)層分出置于50ml三角瓶中，水層再以10ml乙酸乙酯萃取兩次(10mlX2)，合并有機(jī)層，有機(jī)層以飽和氯化鈉水溶液萃洗三遍(10mlX3)，分出乙酸乙酯，并用無水硫酸鈉固體干燥過夜，過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，得無色油狀產(chǎn)物3.75g(100%)即為Boc-Ala-Lys(Z)-OH。[a]D25=-36.5(C=l,MeOH)。ESI-MS(m/e)452[M+H]+。元素分析(C22H33N307):計(jì)算值C58.52、H7.37、N9.31;實(shí)測值C58.40、H7.28、N9.48。3)制備Boc-Ala-Lys(Z)國Pro-OBzl將3.75g(8.315mmol)Boc-Ala-Lys(Z)-OH置于100ml茄形瓶中，加入30ml無水四氫呋喃溶解，冰浴攪拌下加入1.235g(9.146mmol)HOBt及1.884g(9.146mmol)DCC，得到溶液A。將3.76g(9.978mmol)H-Pro-OBzl對甲苯磺酸鹽置于50ml茄形瓶中，加入30ml無水四氫呋喃溶解，用NMM調(diào)pH7，得到溶液B。將溶液B滴加至冰浴攪拌下的溶液A中，用NMM調(diào)節(jié)pH8-9，持續(xù)攪拌3h直到Boc-Ala-Lys(Z)-OH消失。反應(yīng)混合物過濾，濾除DCU。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物用80ml乙酸乙酯重新溶解并置于100ml分液漏斗中，然后依次用飽和碳酸氫鈉水溶液(20mlX3)、5。/。硫酸氫鉀水溶液(20mlX3)、飽和氯化鈉水溶液(20mlX3)萃洗三遍，分出的乙酸乙酯層，并用無水硫酸鈉干燥2h。過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，200-300目硅膠柱層析，得到淡黃色油狀產(chǎn)物5.002g(94%)即為Boc-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl。[a]D25=-92.6(C=l,MeOH)。ESI-MS(m/e)639[M+H]+.一MR(CDClrd)3/ppm=7.390(m,10H),5.440(s,2H)，5.106(s，2H),4.618(q，1H),4.508(t,IH)，4.357(t，IH)，3.758(m,IH)，3.724(m,IH)，3.626(m,2H)，2.23l(m，3H)，2.07l(m,1H),L966(m，2H),L732(m,3H)，1.448(m，11H),L368(d，3H),1.238(m,2H)。元素分析(C34H46N408):計(jì)算值C63.93、H7.26、N8.77;實(shí)測值C63.76、H7.16、N8.59。4)制備H-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl將3.536g(5.534mmol)Boc-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl置于100ml茄形瓶中，用8ml乙酸乙酯溶解，滴入4NHCl/EtOAc10ml，反應(yīng)3小時(shí)直到Boc-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl消失。用水泵將反應(yīng)液抽干，加入無水乙醚，再次用水泵將反應(yīng)液抽干，重復(fù)5次。殘留物用無水乙醚泡洗，塑料鏟磨洗，將無水乙醚傾出，反復(fù)多次直到得2.985g淡黃色固體(94%)即為H-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl鹽酸鹽。Mp53-55°C,[a]D25=-73.1(C=l，MeOH)。ESI-MS(m/e)539[M+H]+。元素分析(C29H38N406):計(jì)算值C64.67、H7.ll、N10.40;實(shí)測值C64.79、H7.18、N10.24。4)制備AKP將340mg(0.592mmol)H-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，用8ml乙醇及2ml水溶解，加入600mgPd/C，滴加3滴甲酸，用三通抽出空氣，通入裝在氣袋內(nèi)的H2，反復(fù)五次，三通的最終狀態(tài)停留在通H2，持續(xù)通&直至原料點(diǎn)消失。原料點(diǎn)消失后，反應(yīng)混合物過濾，濾除Pd/C。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至千，殘留物反復(fù)用無水乙醚磨洗，得193mg類白色固體(93。/。)即為AKP。Mp157-159°C，[a]D32=-52.9(C=l，MeOH)。ESI-MS(m/e)315[M+H]+,'HNMR(DMSO-d)S/ppm=8.627(s，1H),8.397(s,1H)4.519(q,1H)，4.154(t,1H)，3.662(t，1H)，3.3173(t，2H),2.734(t，2H),2.030(m，4H),1.902(t，1H),1.860(t，1H),L727(m，2H)，1.589(m,2H),1.459(m，2H),1.280(d，3H)，U02(m，2H).13CNMR(DMSO-d)S/ppm=175.18,170.70,169.46,65.38，60.67,50.78，49.04,46.97,31,77，29.34，26.93，24.97，21.69，18.41。元素分析(C14H26N404):計(jì)算值C53.49、H8.34、N17.82;實(shí)測值C53.64、H8.42、N17.97。實(shí)施例14(AKP)2的制備1)制備Boc-Ala-Lys(Z)-Pro國OH將5.305g(8.302mmol)Boc-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl置于100ml琉形瓶中，用8ml四氫呋喃溶解，冰浴攪拌5分鐘，逐滴加入2N氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至11，檢測反應(yīng)一直保持pHll，反應(yīng)2小時(shí)直到Boc-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl消失。逐滴滴加飽和硫酸氫鉀水溶液至反應(yīng)溶液中調(diào)節(jié)pH至7，濾除析出的鹽，鹽餅滴加甲醇濾洗，轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮除去四氫呋喃及甲醇。繼續(xù)逐滴滴加飽和硫酸氫鉀水溶液調(diào)節(jié)pH至2，將此水溶液轉(zhuǎn)移至100ml分液漏斗中，加入50ml乙酸乙酯萃取一次，將有機(jī)層分出置于50ml三角瓶中，水層再以10ml乙酸乙酯萃取兩次(10mlX2)，合并有機(jī)層，有機(jī)層以飽和氯化鈉水溶液萃洗三遍(10mlX3)，分出乙酸乙酯，并用無水硫酸鈉固體干燥過夜，過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，得到4.226g淡黃色油狀產(chǎn)品(93%)即為Boc-Ala-Lys(Z)-Pro-OH。[a]D25=-25.0(C=l,MeOH)。ESI-MS(m/e)549[M+H]+。'HNMR(CDClrd)S/ppm=7,357(m,5H),5.156(s,2H),4.836(q,1H)，4.524(t，1H),4.262(t，1H),3.806(t,1H)，3.639(t，1H)，3.161(t，2H),2.252(s，4H),2.086(t，1H)，2扁(m，2H),1.787(t，1H),1.682(m,2H)，1.550(m，2H),1.441(s，9H),1.360(d，3H)，1.279(m，2H)。元素分析(<:27114()>4408):計(jì)算值C59.11、H7.35、N10.21;實(shí)測值C59.27、H7.43、N10.39。2)制備Boc-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl將U89g(2.171mmol)Boc-Ala-Lys(Z)-Pro-OH置于100ml茄形瓶中，加入20ml無水四氫呋喃溶解，冰浴攪拌下力[]入322mg(2.388mmol)HOBt及492mg(2.388mmol)DCC，得到溶液A。將1.310mg(2.280mmol)H-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，加入20ml無水四氫呋喃溶解，用NMM調(diào)pH7，得到溶液B。將溶液B滴加至冰浴攪拌下的溶液A中，用NMM調(diào)節(jié)pH8-9，持續(xù)攪拌3h直到H-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl消失。反應(yīng)混合物過濾，濾除DCU。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物用80ml乙酸乙酯重新溶解并置于100ml分液漏斗中，然后依次用飽和碳酸氫鈉水溶液(20mlX3)、5n/。硫酸氫鉀水溶液(20mlX3)、飽和氯化鈉水溶液(20mlX3)萃洗三遍，分出的乙酸乙酯層，并用無水硫酸鈉干燥2h。過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，200-300目硅膠柱層析，得到淡黃色油狀產(chǎn)品2.058g(89o/o)艮卩為Boc-Ala-Lys(Z)-Pro陽Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl。[a]D25=-61.9(C=l,MeOH)。ESI-MS(m/e)1069[M+H]+。元素分*/f(C56H76N8013):計(jì)算值C62.90、H7.16、N10.48;實(shí)測值C62.73、H7.05、N10.62。3)制備H-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro陽OBzl將1.900g(1.779mmol)Boc-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl置于50ml茄形瓶中，用5ml乙酸乙酯溶解，滴入4NHCl/EtOAc8ml，反應(yīng)3小時(shí)直到Boc-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl消失。用水泵將反應(yīng)液抽千，加入無水乙醚，再次用水泵將反應(yīng)液抽干，重復(fù)5次。殘留物用無水乙醚泡洗，塑料鏟磨洗，將無水乙醚傾出，反復(fù)多次直到得1.700mg淡黃色固體(95%)即為H-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl。Mp78-80°C，[a]D25=-103.3(C=l，MeOH)。ESI-MS(m/e)969[M+H]+。元素分析(C51H68N80):計(jì)算值C63.21、H7.07、N11.56;實(shí)測值C63.38、H7.16、N11.41。4)制備(AKP)2將380mg(0.378mmol)H-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，用8ml乙醇及2ml水溶解，加入300mgPd/C，滴加3滴甲酸，用三通抽出空氣，通入裝在氣袋內(nèi)的H2，反復(fù)五次，三通的最終狀態(tài)停留在通H2，持續(xù)通H2直至H國Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)隱Pro-OBzl消失。H-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala陽Lys(Z)-Pro-OBzl消失后，反應(yīng)混合物過濾，濾除Pd/C。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用無水乙醚磨洗，得230mg類白色固體(收率86。/。)即為(AKP)2。Mp160-162°C,[a]D32=-105.9(C=l，MeOH)。ESI-MS(m/e)611[M+H]+.!HNMR(DMSO-d)S/ppm=8.72(br,1H)，8.16(br,2H)，7.97(br，IH)，4.46(br，IH)，4.30(br,2H)，4.22(br,1H),3.61(br，2H)，3.38(br，4H),2.72(br，4H),2.08(m,6H),2.03(br,2H)，1.82(br，10H),1.58(br，6H)，1.37(br，4H),1.19(d,2H),1.03(m,2H)."CNMR(DMSO-d)S/ppm=173.65,172.72,171.70,169.74，65.37，59.71，52.28,50.44,47.34，31.02，29.52，27.08，24.90,22.45，18.37。元素分析(C28H50N8O7):計(jì)算值C55.06、H8.25、N18.35;實(shí)測值C55.19、H8.34、N18.53。實(shí)施例15(AKP)3的制備1)制備Boc-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro陽OH將900mg(0.843mmol)Boc-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl用3ml甲醇溶解，冰浴攪拌5分鐘，逐滴加入2N氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至11，檢測反應(yīng)一直保持pHll，反應(yīng)2小時(shí)直到Boc-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl消失。逐滴滴加飽和硫酸氫鉀水溶液至反應(yīng)溶液中調(diào)節(jié)pH至7，濾除析出的鹽，鹽餅滴加甲醇濾洗，轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮除去甲醇。繼續(xù)逐滴滴加飽和硫酸氫鉀水溶液調(diào)節(jié)pH至2，將此水溶液轉(zhuǎn)移至50ml分液漏斗中，加入20ml乙酸乙酯萃取一次，將有機(jī)層分出置于50ml三角瓶中，水層再以10ml乙酸乙酯萃取兩次(10mlX2)，合并有機(jī)層，有機(jī)層以飽和氯化鈉水溶液萃洗三遍(10mlX3)，分出乙酸乙酯，并用無水硫酸鈉固體干燥過夜，過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，得到800mg淡黃色油狀產(chǎn)物(97%)即為Boc-Ala-Lys(Z)墨Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OH。Mp85-87°C,[a]D25=-73.2(C=l，MeOH)。ESI-MS(m/e)979[M+H廣。元素分析(C49H70N8O13):計(jì)算值C60.11、H7.21、N11.44;實(shí)測值C60.28、H7.27、N11.62。2)制備Boc-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)陽Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl將1.530mg(1.564mmol)Boc-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OH置于100ml茄形瓶中，加入20ml無水四氫呋喃溶解，冰浴攪拌下加入233mg(1.721mmol)HOBt及355mg(1.721mmol)DCC，得到溶液A。將898mg(1.564mmol)H-Ala-Lys(Z)國Pro-OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，加入20ml無水四氫呋喃溶解，用NMM調(diào)pH7，得到溶液B。將溶液B滴加至冰浴攪拌下的溶液A中，用NMM調(diào)節(jié)pH8-9，持續(xù)攪拌3h直到Boc-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OH消失。反應(yīng)混合物過濾，濾除DCU。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物用80ml乙酸乙酯重新溶解并置于100ml分液漏斗中，然后依次用飽和碳酸氫鈉水溶液(20mlX3)、5n/。硫酸氫鉀水溶液(20mlX3)、飽和氯化鈉水溶液(20mlX3)萃洗三遍，分出的乙酸乙酯層，并用無水硫酸鈉干燥2h。過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，200-300目硅膠柱層析，得到類白色固體2.056mg(88%)l!P為Boc-Ala-Lys(Z)國Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl。Mp73-75°C，[a]D25=-99.2(C=l，MeOH)。ESI-MS(m/e)1499[M+H]+。元素分析((^7811106:^12018):計(jì)算值C62.47、H7'12、N11.21;實(shí)測值C62.30、H7.02、N11.38。3)制備H-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl將800mg(0.534mmol)Boc-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)誦Pro-OBzl置于50ml茄形瓶中，用5ml乙酸乙酯溶解，滴入4NHCl/EtOAc8ml，反應(yīng)3小時(shí)直到Boc-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl消失。用水泵將反應(yīng)液抽干，加入無水乙醚，再次用水泵將反應(yīng)液抽干，重復(fù)5次。殘留物用無水乙醚泡洗，塑料鏟磨洗，將無水乙醚傾出，反復(fù)多次直到得725mg類白色固體(95。/。)即為H-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro隱OBzl。Mp99-101°C，[a]D25=-96.0(C=l,MeOH)。ESI-MS(m/e)1399[M+H]+。元素分析(C73H98N12016):計(jì)算值C62.64、H7.06、N12.01;實(shí)測值C62.50、H7.00、N12.19。4)制備(AKP)3將380mg(0.265mmol)H-Ala-Lys(Z)陽Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，用8ml乙醇及2ml水溶解，加入250mgPd/C，滴加3滴甲酸，用三通抽出空氣，通入裝在氣袋內(nèi)的H2，反復(fù)五次，三通的最終狀態(tài)停留在通H2，持續(xù)通H2直至H-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl消失。H-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl消失后，反應(yīng)混合物過濾，濾除Pd/C。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用無水乙醚磨洗，得200mg類白色固體(80。/。)艮卩為(AKP)3。Mp175-178°C,[a]D32=-102.7(C=l，MeOH)。ESI-MS(m/e)907[M+H]+.'HN纖(DMSO-d)S/ppm=8.425(br,1H),8.235(br,3H)，7.988(br,2H)，4.471(br，2H)，4.230(br,2H)，4.218(br,2H),3.61l(br，6H),3.387(br，3H)，2.729(br,6H),2.030(br,IIH)，1.827(br，9H)，L560(br,6H),1.366(br，6H),1.194(br，9H),l據(jù)(br，6H).13CNMR(畫SO-d)S/ppm=173.56,172.28,170.49,166.55，65.37，63.19,59.61，50.59，49.30,47.35，31.06，29.53，27.29,24.93,22.30，18.20。元素分析(C42H74N120k)):計(jì)算值C55.61、H8.22、N18.53;實(shí)測值C55.77、H8.31、N18.69。實(shí)施例16(AKP)4的制備1)制備Boc-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)隱Pro-OBzl將824mg(0.842mmol)Boc-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OH置于50ml茄形瓶中，加入20ml無水四氫呋喃溶解，冰浴攪拌下加入126mg(0.927mmol)HOBt及191mg(0.927mmol)DCC，得到溶液A。將845mg(0.824mmol)H-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，加入20ml無水四氫呋喃溶解，用NMM調(diào)pH7,得到溶液B。將溶液B滴加至冰浴攪拌下的溶液A中，用NMM調(diào)節(jié)pH8-9，持續(xù)攪拌3h直到H-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl消失。反應(yīng)混合物過濾，濾除DCU。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物用80ml氯仿重新溶解并置于100ml分液漏斗中，然后依次用飽和碳酸氫鈉水溶液(10mlX3)、5%硫酸氫鉀水溶液(10mlX3)、飽和氯化鈉水溶液(10mlX3)萃洗三遍，分出的氯仿層，并用無水硫酸鈉干燥2h。過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，200-300目硅膠柱層析，得到1.256g類白色固體(77%)艮卩為Boc-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl。Mp79-81°C,[a]D25=-58.8(C=l,MeOH)。ESI-MS(m/e)1931[M+H]+。元素分析(Cn)oH,36Ni6023):計(jì)算值C62.22、H7.10、N11.61;實(shí)測值C62.04、H7.01、N11.78。2)制備H-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl將500mg(0.259mmo1)Boc-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala誦Lys(Z)-Pro-Ala陽Lys(Z)-Pro-Ala陽Lys(Z)-Pro-OBzl置于50ml茄形瓶中，用3ml乙酸乙酯溶解，滴入4NHCl/EtOAc4ml，反應(yīng)3小時(shí)直到原料點(diǎn)消失。用水泵將反應(yīng)液抽干，加入無水乙醚，再次用水泵將反應(yīng)液抽干，重復(fù)5次。殘留物用無水乙醚泡洗，塑料鏟磨洗，將無水乙醚傾出，反復(fù)多次直到得465mg類白色固體(96%)艮卩為H-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl。Mp110國112。C,[a]D25=-78.6(C=l，MeOH)。ESI-MS(m/e)1831[M+H]+。元素分析(C95H128N16021):計(jì)算值C62.35、H7.05、N12.25;實(shí)測值C62.20、H7.15、N12.39。3)制備(AKP)4將330mg(0.177mmol)H-Ala-Lys(Z)曙Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，用8ml乙醇及2ml水溶解，加入150mgPd/C，滴加3滴甲酸，用三通抽出空氣，通入裝在氣袋內(nèi)的H2，反復(fù)五次，三通的最終狀態(tài)停留在通H2，持續(xù)通H2直至H-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro匿Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl消失。H-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl消失后，反應(yīng)混合物過濾，濾除Pd/C。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用無水乙醚磨洗，得215mg類白色固體(98%)即為(AKP)4。Mp196-198°C,[a]D32=-124.0(C=l,MeOH)。ESI-MS(m/e)1203[M+H]+.'HNMR(DMSO-d)3/ppm=8.684(br,1H),8.楊(br，2H),8.165(br,2H)，8.085(br，2H)，7.796(br,1H),4.493(br，4H)，4.308(br，4H),3.859(br,4H),2,724(br，16H),2.044(br,10H),1.831(br，16H)，1.570(br，16H),1.357(br,12H),1.276(br，4H)，1.210(br,4H).13CNMR(DMSO-d)S/ppm=172.52,172.07,171.70，170.36,170.21,65.38,59.79,50.65，48.8847.35，31.02，29.55，27.15，24.97，22.28,18.34。元素分析(C56H98N160!3):計(jì)算值C55.89、H8.21、N18.62;實(shí)測值C55.73、H8.12、N18.44。實(shí)施例17(AKP)5的制備1)制備Boc-Ala國Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro隱Ala-Lys(Z)-Pro-OH將1.300mg(0.868mmol)Boc-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl用3ml甲醇溶解，冰浴攪拌5分鐘，逐滴加入2N氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至11，檢測反應(yīng)一直保持pHll，反應(yīng)2小時(shí)直到Boc-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl消失。逐滴滴加飽和硫酸氫鉀水溶液至反應(yīng)溶液中調(diào)節(jié)pH至7，濾除析出的鹽，鹽餅滴加甲醇濾洗，轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮除去甲醇。繼續(xù)逐滴滴加飽和硫酸氫鉀水溶液調(diào)節(jié)pH至2，將此水溶液轉(zhuǎn)移至50ml分液漏斗中，加入20ml乙酸乙酯萃取一次，將有機(jī)層分出置于50ml三角瓶中，水層再以10ml乙酸乙酯萃取兩次(10mlX2)，合并有機(jī)層，有機(jī)層以飽和氯化鈉水溶液萃洗三遍(10mlX3)，分出乙酸乙酯，并用無水硫酸鈉固體干燥過夜，過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，得至lj1.115mg類白色固體(91%)即為Boc-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro國Ala-Lys(Z)-Pro-OH。Mp86曙88。C,[a]D25=-91.0(C=l，MeOH)。ESI-MS(m/e)1409[M+H]+。元素分析(C71H10。N12O18):計(jì)算值C60.50、H7.15、N11.92;實(shí)測值C60.67、H7.24、N11.73。2)制備Boc-Ala-Lys(Z)國Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro國Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl將600mg(0.426mmol)Boc-Ala-Lys(Z)-Pro誦Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OH置于50ml茄形瓶中，加入20ml無水四氫呋喃溶解，冰浴攪拌下加入64mg(0.469mmol)HOBt及97mg(0.469mmol)DCC，得到溶液A。將428mg(0.426mmo1)H-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，加入20ml無水四氫呋喃溶解，用NMM調(diào)pH7，得到溶液B。將溶液B滴加至冰浴攪拌下的溶液A中，用NMM調(diào)節(jié)pH8-9，持續(xù)攪拌3h直到Boc-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OH消失。反應(yīng)混合物過濾，濾除DCU。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物用80ml氯仿重新溶解并置于100ml分液漏斗中，然后依次用飽和碳酸氫鈉水溶液(10mlX3)、5%硫酸氫鉀水溶液(10mlX3)、飽和氯化鈉水溶液(10mlX3)萃洗三遍，分出的氯仿層，并用無水硫酸鈉干燥2h。過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，200-300目硅膠柱層析，得到白-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl。Mp90-92。C，[a]D25=-23.6(C=l,MeOH)ESI-MS(m/e)1180[M十H廣。元素分析((:122111661^0028):計(jì)算值C62.07、H7.09、N11.87;實(shí)測值C62.24、H7.19、N11.70。3)制備H-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)陽Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)隱Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl將376mg(0.159mmo1)Boc-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl置于50ml茄形瓶中，用5ml乙酸乙酯溶解，滴入4NHCl/EtOAc8ml，反應(yīng)3小時(shí)直到Boc-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl消失。用水泵將反應(yīng)液抽干，加入無水乙醚，再次用水泵將反應(yīng)液抽干，重復(fù)5次。殘留物用無水乙醚泡洗，塑料鏟磨洗，將無水乙醚傾出，反復(fù)多次直到得330mg類白色固體(90%)即為H-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)曙Pro陽Ala-Lys(Z)國Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl。Mp116-118°C,[a]D25=-90.5(C=l，MeOH)。ESI陽MS(m/e)1131[M+H]2+。元素分析(C7H158N20O26):計(jì)算值C62.16、H7.04、N12.39;實(shí)測值C62.00、H6.95、N12.58。4)制備(AKP)5將33011^(0.1441110101)11-八1&-1^5(2)陽？1"0國八1&-1^(2)-1"0陽八1&勿3(2)-1"0-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，用8ml乙醇及2ml水溶解，加入100mgPd/C，滴加3滴甲酸，用三通抽出空氣，通入裝在氣袋內(nèi)的H2,反復(fù)五次，三通的最終狀態(tài)停留在通H2，持續(xù)通H2直至H-Ala-Lys(Z)陽Pro隱Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl消失。H-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl消失后，反應(yīng)混合物過濾，濾除Pd/C。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用無水乙醚磨洗，得200mg類白色固體(91。/。)即為(AKP)5。Mp203-205°C,[a]D32=-98.1(C=l,MeOH)。ESI-MS(m/e)1500[M+H]+.!HNMR(DMSO-d)S/ppm=8.12(br，10H)，4.45(br，3H),4.31(br，4H)，4.22(br,3H)，3.61(br，10H),3.39(br,10H)，2,73(br,IOH),2.08(br，12H)，1.85(br，15H),L58(br,20H),1.36(br，IOH)，1.20(br，10H),l.ll(br,5H).13CNMR(DMSO-d)S/ppm=172.49，171.71,170.37,170.04,65.37,59.67,50.59,49.03,48.50,47.32,30.97,29.11，27.03，24.94,22.24,18.36。元素分析(C70H122N20O16):計(jì)算值C56.06、H8.20、N18.68;實(shí)測值C56.22、H8.31、N18.51。實(shí)施例18(AKP)6的制備1)制備Boc-Ala-Lys(Z)墨Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-.Ala-Lys(Z)-Pro-Ala陽Lys(Z)-Pro隱OBzl將500mg(0.355mmol)Boc-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OH置于50ml茄形瓶中，加入20ml無水四氫呋喃溶解，冰浴攪拌下加入53mg(0.391mmol)HOBt及81mg(0.391mmol)DCC，得到溶液A。將510mg(O.355mmol)H-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，加入20ml無水四氫呋喃溶解，用NMM調(diào)pH7，得到溶液B。將溶液B滴加至冰浴攪拌下的溶液A中，用NMM調(diào)節(jié)pH8-9，持續(xù)攪拌3h直到H-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl消失。反應(yīng)混合物過濾，濾除DCU。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物用80ml氯仿重新溶解并置于100ml分液漏斗中，然后依次用飽和碳酸氫鈉水溶液(10mlX3)、5n/。硫酸氫鉀水溶液(10mlX3)、飽和氛化鈉水溶液(10mlX3)萃洗三遍，分出的氯仿層，并用無水硫酸鈉干燥2h。過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，200-300目硅膠柱層析，得到類白色固體350mg(35o/o)即為Boc國Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala隱Lys(Z)陽Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl。Mp99-107。C,[a]D25=-60.3(C=l,MeOH)。ESI-MS(m/e)1418[M/2+Na]+。元素分析(C144H196N24033):計(jì)算值C61.96、H7.08、N12.04;實(shí)測值C61.80、H6.98、N12.22。2)制備H-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl將350mg((U26mmo1)Boc-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)隱Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl置于50ml茄形瓶中，用5ml乙酸乙酯溶解，滴入4NHCl/EtOAc8ml，反應(yīng)3小時(shí)直到Boc-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro陽Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl消失。用水泵將反應(yīng)液抽干，加入無水乙醚，再次用水泵將反應(yīng)液抽干，重復(fù)5次。殘留物用無水乙醚泡洗，塑料鏟磨洗，將無水乙醚傾出，反復(fù)多次直到得300mg類白色固體(88%)即為H-Ala-Lys(Z)-Pro陽Ala-Lys(Z)-Pro-Ala隱Lys(Z)陽Pro-Ala陽Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)曙Pro隱Ala陽Lys(Z)-Pro陽OBzl。Mp121-123°C，[a]D25=-102.1(C=l,MeOH)。ESI-MS(m/e)1368[M/2+Na〗+。元素分析(C139H188N24031):計(jì)算值C62.04、H7.04、N12.49;實(shí)測值C62.39、H7.12、N12.31。3)制備(AKP)6將300mg(0.110mmo1)H-Ala-Lys(Z)-Pro國Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl鹽酸鹽置于50ml茄形瓶中，用8ml乙醇及2ml水溶解，加入100mgPd/C，滴加3滴甲酸，用三通抽出空氣，通入裝在氣袋內(nèi)的H2，反復(fù)五次，三通的最終狀態(tài)停留在通H2，持續(xù)通H2直至H-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)墨Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-Ala-Lys(Z)國Pro-Ala-Lys(Z)-Pro-OBzl消失。原料點(diǎn)消失后，反應(yīng)混合物過濾，濾除Pd/C。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用無水乙醚磨洗，得150mg類白色固體(75。/。)即為(AKP)6。Mp207-209°C，[a]D32=-98.2(C=l,MeOH)。ESI-MS(m/e)1797[M+H]+.一MR(DMSO誦d)S/ppm=8.115(br，12H),4.476(br，4H),4.328(br，4H)，4.230(br，4H),3.623(br,3H),3.394(br，3H),2.738(br，24H),2.049(br,20H),1.803(br,18H),1.574(br，24H)，1.328(br,10H),1.180(br,20H).13CNMR(DMSO-d)5/ppm=172.51,172,35，171.69，170.36,65.37,59.72,50.64,49.04，47.36，30.96,29.53，27.06,24.94，22.95,18.38,17.81。元素分析(C84H146N24019):計(jì)算值C56.17、H8.19、N18.72;實(shí)測值C56.00、H8.ll、N18.91。試驗(yàn)例1本發(fā)明多肽溶血栓活性試驗(yàn)1)大鼠手術(shù)與器械SD大鼠(雄性,220230g)按1200mgkg—^U量腹腔注射烏拉坦溶液進(jìn)行麻醉。麻醉大鼠仰臥位固定，分離右頸總動(dòng)脈，于近心端夾動(dòng)脈夾，近心端和遠(yuǎn)心端分別穿入手術(shù)線，將遠(yuǎn)心端的手術(shù)線于皮毛用止血鉗夾緊，在遠(yuǎn)心端插管，松開動(dòng)脈夾，放出約lml動(dòng)脈血，裝在lml子彈頭中。往垂直固定的玻璃管(長15mm,內(nèi)徑2.5mm，外徑5.0mm,管底用膠塞密封)中注入O.1ml大鼠動(dòng)脈血液，往管內(nèi)迅速插入一支不銹鋼質(zhì)料的血栓固定螺栓。該血栓固定螺旋用直徑為O.2mm的不銹鋼絲繞成，螺旋部分長12mm，含15個(gè)螺圈，螺圈的直徑為1.0mm,托柄與螺旋相連，長7.Omm,呈問號(hào)型。血液凝固15min后，打開玻璃管底部的膠塞，用鑷子固定血栓固定螺旋的托柄,從玻璃管中小心地取出被血栓包裹的血栓固定螺旋。精確稱重。2)大鼠頸動(dòng)靜脈旁路插管旁路插管由3段構(gòu)成,中段為聚乙烯膠管,長60.0mm，內(nèi)徑3.5mm;兩端為相同的聚乙烯管，管長100.0mm，內(nèi)徑l.0mm,外徑2.0mm該管的一端拉成尖管(用于插入大鼠頸動(dòng)脈或靜脈),外徑為l.0mm，另一端的外部套一段長7.0mm,外徑為3.5mm的聚乙烯管(加粗,用于插入中段的聚乙烯膠管內(nèi))3段管的內(nèi)壁均硅垸化。將血栓包裹的血栓固定螺旋放入中段聚乙烯膠管內(nèi),膠管的兩端分別與兩根聚乙烯的加粗端相套。用注射器通過尖管端將管中注滿肝素生理鹽水溶液(50IUkg^)，備用。繼續(xù)分離麻醉大鼠的氣管，并做氣管插管。分離大鼠的左頸外靜脈，近心端和遠(yuǎn)心端分別穿入手術(shù)線，在暴露的左頸外靜脈上小心地剪一斜口,將上面制備好的旁路管道的尖管由斜口插入左頸外靜脈開口的近心端，同時(shí)遠(yuǎn)離旁路管中段(含精確稱重的血栓固定螺旋)內(nèi)血栓固定螺旋的托柄。用注射器通過另一端的尖管推入準(zhǔn)確量的肝素生理鹽水(50IU'kg—"，此時(shí)注射器不要撤離聚乙烯管，用止血鉗夾住注射器與聚乙烯管之間的軟管。在右頸總動(dòng)脈的近心端用動(dòng)脈夾止血，在離動(dòng)脈夾不遠(yuǎn)處將右頸總動(dòng)脈小心地剪一斜口。從聚乙烯管的尖部拔出注射器，將聚乙烯管的尖部插入動(dòng)脈斜口的近心端。旁路管道的兩端都用4號(hào)手術(shù)縫線與動(dòng)靜脈固定。3)給藥用頭皮針將生理鹽水(3ml*kg")，尿激酶的生理鹽水溶液(20000IU'kg力或線性肽的生理鹽水溶液(101111101*1^-1)通過旁路管的中段(含精確稱重的血栓固定螺旋)，刺入遠(yuǎn)離血栓固定螺旋的近靜脈處，打開動(dòng)脈夾，使血流通過旁路管道從動(dòng)脈流向靜脈，此即大鼠動(dòng)靜脈旁路溶栓模型，緩慢將注射器中的液體注入到血液中，使生理鹽水(空白對照)，尿激酶(陽性對照)或線性肽(治療劑)通過血液循環(huán)，按靜脈一心臟--動(dòng)脈的順序作用到血栓上。從開始注射時(shí)計(jì)時(shí)，lh后從旁路管道中取出血栓固定螺旋，精確稱重。求每只大鼠旁路管道中血栓固定螺旋給藥前后的質(zhì)量差,統(tǒng)計(jì)各組的血栓質(zhì)量差值(X士SD),并做Z檢驗(yàn)。4)結(jié)果血栓質(zhì)量差值列入下表。表1經(jīng)藥物治療引起的血栓減重<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>權(quán)利要求1、具有溶血栓活性的多肽，選自以下任意一種的氨基酸序列Pro-Ala-Lys，Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys，Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys，Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys，Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys或Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Ly。2、具有溶血栓活性的多肽，選自以下任意一種的氨基酸序列Ala-Lys-Pro，Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro，Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro，Ala—Lys—Pro—Ala—Lys—Pro—Ala—Lys—Pro—Ala—Lys—Pro,Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro或Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro3、具有溶血栓活性的多肽，選自以下任意一種的氨基酸序列Lys-Pro-Ala，Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala，Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala，Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala，Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala或Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala4、一種制備權(quán)利要求1的多肽方法，其特征在于采用常規(guī)液相接肽法逐步接肽而成。5、一種制備權(quán)利要求2的多肽方法，其特征在于采用常規(guī)液相接肽法逐步接肽而成。6、一種制備權(quán)利要求3的多肽方法，其特征在于采用常規(guī)液相接肽法逐步接肽而成。.7、權(quán)利要求1的多肽在制備溶血栓藥物中的用途。8、權(quán)利要求2的多肽在制備溶血栓藥物中的用途。9、權(quán)利要求3的多肽在制備溶血栓藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明公開了一系列具有溶血栓活性的多肽、其制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)P6A經(jīng)小鼠體內(nèi)代謝，其中的代謝產(chǎn)物之一PAK顯示出比母體ARPAK更為優(yōu)秀的溶血栓活性；在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明將PAK中的氨基酸殘基調(diào)換位置產(chǎn)生變換序列AKP和KPA，并進(jìn)一步以PAK為結(jié)構(gòu)單元合成重復(fù)序列肽(PAK)₂(PAK)₃、(PAK)₄、(PAK)₅和(PAK)₆，以AKP為結(jié)構(gòu)單元合成重復(fù)序列肽(AKP)₂、(AKP)₃、(AKP)₄、(AKP)₅和(AKP)₆，以KPA為結(jié)構(gòu)單元合成重復(fù)序列肽(KPA)₂、(KPA)₃、(KPA)₄、(KPA)₅和(KPA)₆。動(dòng)物溶血栓模型試驗(yàn)表明，本發(fā)明多肽均具有良好的溶血栓活性。文檔編號(hào)C07K7/06GK101190941SQ20061014423公開日2008年6月4日申請日期2006年11月30日優(yōu)先權(quán)日2006年11月30日發(fā)明者雪任,彭師奇,超王,明趙申請人:首都醫(yī)科大學(xué)