一種葵花籽降壓活性肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種葵花籽降壓活性肽及其制備方法和應(yīng)用，該制備方法主要包括如下步驟：向葵花籽蛋白溶液中加入堿性蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值至8-9，在50-60℃下水解1-6h后，滅酶，獲得葵花籽蛋白堿性蛋白酶水解液；將葵花籽蛋白堿性蛋白酶水解液的pH值調(diào)節(jié)至5-7，加入風味蛋白酶，在50-60℃下水解1-6h，滅酶，離心取上清液，得到葵花籽活性肽粗提液。將葵花籽活性肽粗提液通過精制后獲得分子量為1-3KDa的葵花籽活性肽。本發(fā)明所制備的葵花籽降壓活性肽的ACE抑制率高，可應(yīng)用于制備降血壓的軟膠囊產(chǎn)品。
【專利說明】一種葵花籽降壓活性肽及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種葵花籽降壓活性肽及其制備方法和應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)了大量具有生理功能的食品，其中 源于食品蛋白質(zhì)中的生物活性肽備受注目，這些肽在原蛋白序列中并沒有活性，當用體 外酶或體內(nèi)腸道酶使它們從原有序列中釋放出來，就表現(xiàn)出某種活性。其中較引人關(guān) 注的是降血壓活性肽，它在動物體內(nèi)有降血壓作用，在體外實驗中對血管緊張素轉(zhuǎn)換酶 (Angiotensin converting enzyme, ACE)有抑制作用，又被稱為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽。 國內(nèi)外已從玉米、大豆、牛乳等許多蛋白質(zhì)中制備了降血壓肽。
[0003] 葵花籽柏中蛋白質(zhì)含量為21% -39%，以此為原料生產(chǎn)降壓活性肽可以為葵花籽 柏高附加值利用提供新途徑。
[0004] 目前，雖然有相關(guān)研究人員用蛋白酶水解葵花籽蛋白，得到葵花籽蛋白酶解液，并 驗證葵花籽蛋白酶解液具有一定的降血壓作用。但是還未有葵花籽降壓活性肽制備及精制 方法、以及制備一種ACE抑制率較高的葵花籽降壓活性肽的方法的相關(guān)研究。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種葵花籽降壓活性肽及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明 提供的制備方法所制備的葵花籽降壓活性肽的ACE抑制率高，并且制備的葵花籽降壓活性 肽可應(yīng)用于制備降血壓的軟膠囊產(chǎn)品。
[0006] 本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。依據(jù)本發(fā)明提出 的一種葵花籽降壓活性肽的制備方法，包括如下步驟：
[0007] 步驟一，向葵花籽蛋白溶液中加入堿性蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值至8-9，在50_60°C下水 解l_6h后，滅酶，獲得葵花籽蛋白堿性蛋白酶水解液；
[0008] 步驟二，將所述葵花籽蛋白堿性蛋白酶水解液的pH值調(diào)節(jié)至5-7,加入風味蛋白 酶，在50-60°C下水解l_6h，滅酶，離心取上清液，得到葵花籽活性肽粗提液；
[0009] 步驟三，將所述葵花籽活性肽粗提液通過精制后獲得分子量為l_3KDa的葵花籽 活性肽。
[0010] 優(yōu)選地，所述步驟三中的精制方法包括：將所述葵花籽活性肽粗提液配制成待濾 液，所述待濾液依次經(jīng)過3Kda和lKda的超濾膜進行超濾，收集分子量為l-3Kda的濾液，將 所述濾液透析脫鹽、冷凍干燥后，獲得葵花籽活性肽。
[0011] 優(yōu)選地，所述步驟三中，所述待濾液進行超濾的壓力為0.6-1. OMPa，超濾的時間 為2-4h，所述待濾液的pH值為6-8,待濾液的濃度為0. 5-2. 5mg/mL。優(yōu)選地，所述步驟一 中的所述葵花籽蛋白溶液的濃度為5-25mg/mL ;所述步驟一中的堿性蛋白酶的添加量為 3500-4500U/g ;所述步驟二中的風味蛋白酶的添加量為3500-4500U/g。
[0012] 優(yōu)選地，所述堿性蛋白酶與所述風味蛋白酶的添加量比為1:3-3:1。
[0013] 優(yōu)選地，所述葵花籽蛋白溶液的濃度為13_15mg/mL，所述堿性蛋白酶與所述風味 蛋白酶的添加量的比例為1:2-2:1。
[0014] 優(yōu)選地，在所述步驟一之前，以粉碎的脫脂葵花籽柏為原料，將所述葵花籽柏脫除 綠原酸后，采用堿溶酸沉法提取葵花籽蛋白。
[0015] 優(yōu)選地，所述脫除綠原酸的步驟包括：將粉碎的葵花籽柏采用乙醇和正己烷混合 溶劑回流浸出工藝浸提l_3h，得到脫除綠原酸的葵花籽柏；
[0016] 其中，所述乙醇和正己烷的體積比為3:5-1:1，所述葵花籽柏的質(zhì)量與乙醇和正己 烷的總體積的比例為〇. 8:10-1. 2:10g/mL。
[0017] 優(yōu)選地，所述葵花籽降壓活性肽由上述任一項所述的制備方法制得。
[0018] 優(yōu)選地，所述葵花籽降壓活性肽應(yīng)用于制備降血壓的軟膠囊產(chǎn)品。
[0019] 借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點：本發(fā)明提供的葵花籽降壓活性肽 的制備方法，采用堿性蛋白酶-風味蛋白酶分步水解法將葵花籽蛋白水解為葵花籽活性肽 粗提液，隨后將葵花籽活性肽粗提液通過超濾獲得分子量為lKDa_3KDa的葵花籽活性肽， 所制備的葵花籽活性肽的ACE抑制率高，使其可應(yīng)用于制備降血壓的軟膠囊產(chǎn)品。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1為酶解溫度對葵花籽活性肽粗提液的ACE抑制率和水解度的影響曲線圖；
[0021] 圖2為底物濃度對葵花籽活性肽粗提液的ACE抑制率和水解度的影響曲線圖；
[0022] 圖3為堿性蛋白酶與風味蛋白酶的配比對葵花籽活性肽粗提液的ACE抑制率和水 解度的影響曲線圖；
[0023] 圖4A為底物濃度和酶添加量比例交互作用響應(yīng)曲面示意圖；
[0024] 圖4B為底物濃度和酶添加量比例交互作用等高線示意圖；
[0025] 圖5A為底物濃度和酶解溫度交互作用響應(yīng)曲面示意圖；
[0026] 圖5B為底物濃度和酶解溫度交互作用等高線示意圖；
[0027] 圖6A為酶添加量比例和酶解溫度交互作用響應(yīng)曲面示意圖；
[0028] 圖6B為酶添加量比例和酶解溫度交互作用等高線示意圖；
[0029] 圖7為超濾壓力對膜通量的影響示意圖；
[0030] 圖8為超濾時間對膜通量的影響示意圖；
[0031] 圖9為待濾液的pH值對膜通量的影響示意圖；
[0032] 圖10為待濾液濃度對膜通量的影響示意圖。

【具體實施方式】
[0033] 為更進一步闡述本發(fā)明為達成預(yù)定發(fā)明目的所采取的技術(shù)手段及功效，結(jié)合較佳 實施例詳細說明如下。
[0034] 制備方法
[0035] 本制備方法主要包括以下步驟：
[0036] 步驟一，原料預(yù)處理；
[0037] 該步驟中，將低溫脫脂葵花籽柏粉碎，過80目篩，之后采用乙醇和正己烷混合溶 劑回流浸出工藝脫除葵花籽柏中的綠原酸。
[0038] 其中，乙醇和正己烷混合溶劑浸出的工藝參數(shù)為：溫度為50°C，提取時間2h，溶 劑比（乙醇：正己烷）為4:5,料液比（葵花籽柏（g):(乙醇與正己烷的總體積mL))為 1:8-1:28/1111^優(yōu)選為1:48/1]1]^。
[0039] 利用該混合溶劑回流浸出工藝使得葵花籽柏的綠原酸脫除率為92. 6%。
[0040] 步驟二，制備葵花籽蛋白
[0041] 在該步驟中，將步驟一中脫除綠原酸后所得的葵花籽柏干燥，采用酸堿沉法制備 葵花籽蛋白。具體為：將脫除綠原酸的葵花籽柏按照料液比為1:10(g/mL)加入水，升溫至 40-60°C，加入0. lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)葵花籽柏溶液的pH值至8. 5-9. 5,水浴攪拌 3h后，離心過濾（8000r/min)后取上清液，用0. lmol/L的HC1溶液調(diào)節(jié)上清液的pH值至 4-4. 2,靜置，離心（8000r/min)，將沉淀物經(jīng)水洗、冷凍干燥得到葵花籽蛋白。
[0042] 步驟三，酶解葵花籽蛋白
[0043] 將葵花籽蛋白配制成濃度為5_25mg/mL的葵花籽蛋白溶液，向葵花籽蛋白溶液中 加入堿性蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值至8-9,在50-60°C下水解l_6h (優(yōu)選3h)，滅酶，獲得葵花籽蛋 白堿性蛋白水解液；將所述葵花籽蛋白堿性蛋白水解液的pH值調(diào)節(jié)至5-7,加入風味蛋白 酶，在50-60°C下水解l_6h (優(yōu)選3h)，滅酶，離心取上清液，得到葵花籽柏活性肽粗提液。
[0044] 在該步驟中，向葵花籽蛋白溶液中堿性蛋白酶的添加量為3500_4500U/g，優(yōu)選 4000U/g (即，每克葵花籽蛋白中加入的堿性蛋白酶活3500-4500U，優(yōu)選為4000U)，風味蛋 白酶的添加量為3500-4500U/g(即，每克葵花籽蛋白中加入的風味蛋白酶活3500-4500U， 優(yōu)選為4000U);并且所述堿性蛋白酶和所述風味蛋白酶的總添加量為7000-9000U/g，優(yōu)選 為8000U/g ;其中，堿性蛋白酶與所述風味蛋白酶的添加量比為1:3-3:1，優(yōu)選為1. 2:1。
[0045] 步驟四，將上述所得的葵花籽活性肽粗提液通過精制后獲得分子量為l_3Kda的 葵花籽活性肽。
[0046] 具體地，將葵花籽活性肽粗提液配制成葵花籽活性肽粗提液濃度為0. 5-2. 5mg/ mL (優(yōu)選為1. Omg/mL)的待濾液，待濾液依次經(jīng)過3Kda和lKda的超濾膜進行超濾，收集分 子量為l-3KDa的濾液，將所述濾液透析脫鹽、冷凍干燥得葵花籽活性肽。
[0047] 在該步驟中的超濾壓力為0· 6-1. 2MPa，優(yōu)選為0· 8MPa，超濾時間為l_3h，葵花籽 活性肽提取液的pH值為6-8。
[0048] 下面用實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0049] 以下實施例主要采用以下實驗材料及儀器：
[0050] 堿性蛋白酶、風味蛋白酶，購于Sigma公司；
[0051] 堿性蛋白酶、風味蛋白酶，購于Sigma公司；
[0052] FAPGG (FA-Phe-Gly-Gly)，購于 Sigma 公司；
[0053] 血管緊張素抑制酶（ACE)，購于Sigma公司；
[0054] 水均為去離子水。
[0055] 酶標儀，Thermo公司生產(chǎn)
[0056] MA110型電子分析天平，上海第二天平儀器廠
[0057] 全自動新型鼓風干燥箱，上海智城分析儀器制造有限公司
[0058] 臺式高速冷凍離心機，力康發(fā)展有限公司
[0059] EQ-200VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司
[0060] 超濾裝置（中空纖維超濾器）天津膜天膜工程技術(shù)有限公司，
[0061] 超濾膜lKDa，無錫星達膜技術(shù)發(fā)展公司；
[0062] 超濾膜3KDa，無錫星達膜技術(shù)發(fā)展公司。
[0063] 實施例1
[0064] 將低溫脫脂葵花籽柏粉碎，過80目篩后，精確稱取一定量的葵花籽柏，在50°C下 采用乙醇和正己烷混合溶劑回流浸出工藝浸提2h (乙醇與正己烷的體積比為4:5,料液比 為1:4)，得到脫除綠原酸的葵花籽柏和綠原酸粗品。
[0065] 精確稱取適量的綠原酸粗品，用50%甲醇溶液溶解，過濾后定容至25mL，在波長 為326nm處，測其吸光度A，按照式（1)計算出綠原酸粗品中的綠原酸含量，通過式（2)可計 算出葵花籽中綠原酸的脫除率。
[0066]

【權(quán)利要求】
1. 一種葵花籽降壓活性肽的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： 步驟一，向葵花籽蛋白溶液中加入堿性蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值至8-9,在50-60°C下水解 l-6h后，滅酶，獲得葵花籽蛋白堿性蛋白酶水解液； 步驟二，將所述葵花籽蛋白堿性蛋白酶水解液的pH值調(diào)節(jié)至5-7,加入風味蛋白酶，在 50-60°C下水解l_6h，滅酶，離心取上清液，得到葵花籽活性肽粗提液； 步驟三，將所述葵花籽活性肽粗提液通過精制后獲得分子量為l_3KDa的葵花籽降壓 活性肽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的葵花籽降壓活性肽的制備方法，其特性在于，所述步驟三中 的精制方法包括： 將所述葵花籽活性肽粗提液配制成待濾液，所述待濾液依次經(jīng)過3Kda和lKda的超濾 膜進行超濾，收集分子量為l_3Kda的濾液，將所述濾液透析脫鹽、冷凍干燥后，獲得葵花籽 降壓活性肽。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的葵花籽降壓活性肽的制備方法，其特征在于，所述待濾液進 行超濾的壓力為〇. 6-1. OMPa，超濾的時間為2-4h，所述待濾液的pH值為6-8,待濾液的濃 度為 0· 5-2. 5mg/mL。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的葵花籽降壓活性肽的制備方法，其特征在于， 所述葵花籽蛋白溶液的濃度為5-25mg/mL ; 所述堿性蛋白酶的添加量為3500-4500U/g ; 所述風味蛋白酶的添加量為3500-4500U/g。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的葵花籽降壓活性肽的制備方法，其特征在于，所述堿性蛋白 酶與所述風味蛋白酶的添加量比為1:3-3:1。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的葵花籽降壓活性肽的制備方法，其特征在于，所述葵花籽 蛋白溶液的濃度為13_15mg/mL，所述堿性蛋白酶與所述風味蛋白酶的添加量的比例為 1:2-2:1。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的葵花籽降壓活性肽的制備方法，其特征在于，在所述步驟一 之前還包括：以粉碎的脫脂葵花籽柏為原料，將所述葵花籽柏脫除綠原酸后，采用堿溶酸沉 法提取葵花籽蛋白。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述葵花籽降壓活性肽的制備方法，其特征在于，所述脫除綠原酸 的步驟包括：將粉碎的脫脂葵花籽柏采用乙醇和正己烷混合溶劑回流浸出工藝浸提l_3h， 得到脫除綠原酸的葵花籽柏； 其中，所述乙醇和正己烷的體積比為3:5-1:1，所述葵花籽柏的質(zhì)量與乙醇和正己烷的 總體積的比例為l:8-l:2g/mL。
9. 一種葵花籽降壓活性肽，其特征在于，所述葵花籽降壓活性肽由權(quán)利要求1-8任一 項所述的制備方法制得。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的葵花籽降壓活性肽，其特征在于，所述葵花籽降壓活性肽應(yīng) 用于制備降血壓的軟膠囊產(chǎn)品。
【文檔編號】C07K1/34GK104059957SQ201410277444
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年6月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月20日
【發(fā)明者】羅鵬, 陳國剛, 楊越, 張建, 田洪磊, 劉憶冬, 劉婭 申請人:石河子大學(xué)