一種紅曲霉液態(tài)發(fā)酵制備ace抑制肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種紅曲霉液態(tài)發(fā)酵制備ACE抑制肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著社會發(fā)展和人們生產(chǎn)、生活水平的提高，人口平均年齡增長，飲食結(jié)構(gòu)改變，鹽攝入量增高，以致高血壓、高血壓性心臟損害患病率增加。高血壓不僅是一個獨立的疾病，也是腦中風(fēng)、冠心病、腎功能衰竭和眼底病變的重要危險因素，高血壓患者還常常伴有糖尿病等慢性疾患。有效地預(yù)防并控制高血壓對人體健康具有重要意義。
[0003]降血壓肽，又稱為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Ang1ensin I Converting Enzyme，簡稱ACE)抑制肽，是從食物蛋白中分離出的一類具有顯著降低血壓功效的多肽短鏈物質(zhì)。這些來源于食品的降血壓肽通常由蛋白酶在溫和條件下水解蛋白質(zhì)而獲得，食用安全性高，其共同突出優(yōu)點是只對高血壓患者起到降壓作用，對血壓正常者無降壓作用，因而不會有降壓過度現(xiàn)象發(fā)生。
[0004]紅曲霉菌絲體的重量占發(fā)酵液重量的20%左右，紅曲霉菌絲體中富含對人體有保健作用的有益物質(zhì)，如具有降血壓功能的Monacolin K，豐富的必需氨基酸、不飽合脂肪酸，35%-40%的蛋白質(zhì)等物質(zhì)。紅曲菌絲中的這些有益物質(zhì)多為不飽和脂肪酸和菌體組織蛋白質(zhì)，其中的菌體組織蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)松軟，容易消化吸收，尤其適合兒童，老人和病人食用，具有較高的營養(yǎng)保健價值。
[0005]現(xiàn)階段我國的紅曲生產(chǎn)主要以大米為原料，以固態(tài)發(fā)酵的方式進行，目前已有酶法處理固態(tài)發(fā)酵紅曲霉菌渣從中回收蛋白多糖等物質(zhì)的報道。然而，通過液態(tài)發(fā)酵制備純凈的紅曲霉菌絲體，并使用酶解法從菌體蛋白中得到具有ACE抑制活性的多肽粉劑的方法尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的一個目的在于克服現(xiàn)有紅曲霉菌絲體再利用的技術(shù)不足，提供一種采用紅曲霉菌絲體制備可溶性ACE抑制肽的方法。
[0007]使用人工培養(yǎng)基進行液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲霉菌體，再應(yīng)用混合蛋白酶復(fù)合酶解法對紅曲霉菌絲體中的蛋白質(zhì)進行提取，生產(chǎn)出安全純凈的具有ACE抑制活性的紅曲多肽產(chǎn)品。通過對紅曲多肽理化性質(zhì)的測定及采用高效液相色譜法對其ACE抑制活性的研究，發(fā)現(xiàn)了紅曲多肽具有較好的降血壓功效，具有開發(fā)降血壓保健食品的潛力。
[0008]本發(fā)明采用的紅曲霉已于2013年3月13日保藏，保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏編號:CCTCC N0:M2013082，分類命名:紅色紅曲霉 SEI703 Monascus rubber SEI703。
[0009]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案予以實現(xiàn):
提供一種紅曲霉液態(tài)發(fā)酵制備ACE抑制肽的方法，包括以下步驟: (1)紅曲霉液態(tài)發(fā)酵:使用斜面活化培養(yǎng)基培養(yǎng)紅曲菌種，進行活化；取培養(yǎng)后的斜面種子一支，將菌體及孢子洗脫至生理鹽水中制成混合液，按10%的接種量接種到裝有二級液體種子培養(yǎng)基，于200rpm，30°C培養(yǎng)48h~72h ;將二級液體種子按10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中于30°C，200rpm培養(yǎng)5d，得到紅曲霉菌絲體；
(2)獲得菌體干粉:用去離子水清洗紅曲霉菌絲體，冷凍干燥得到菌體干粉；
(3)酶解處理:稱取一定量紅曲菌體干粉，加入適量的水和堿性蛋白酶，調(diào)節(jié)pH至堿性，保溫酶解一段時間；酶解一段時間后，對酶解液中的蛋白酶進行滅活；降溫后向滅活后的紅曲酶解液中加入木瓜蛋白酶，調(diào)節(jié)pH，保溫酶解一段時間；酶解完成后加熱一段時間，滅活木瓜蛋白酶，紅曲酶解液中加入胃蛋白酶，調(diào)節(jié)PH，保溫酶解一段時間；對酶解液進行抽濾，收集酶解液；
(4)后處理:對酶解液進行減壓蒸發(fā)濃縮，得到紅曲多肽濃縮液，對濃縮后的酶解液進行真空冷凍干燥，即得到對ACE有抑制活性的紅曲多肽產(chǎn)品；
步驟(I)中所述的二級液體種子培養(yǎng)基配方為:大米粉3%，硝酸鈉0.5%，磷酸二氫鉀
0.25%，硫酸鎂0.1%，使用乳酸調(diào)節(jié)pH 5.5-6 ；
步驟(I)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:葡萄糖4%，蛋白胨2%，可溶性淀粉3%，硝酸鈉
0.2%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.2%，使用乳酸調(diào)節(jié)pH 5.5-6ο
[0010]步驟(3)中所述的堿性蛋白酶的加入量占原料紅曲菌體干粉的0.3%，加水量是紅曲菌體干粉的100倍重量，即用電子天平稱取蛋白酶加入其中，加堿性蛋白酶前要根據(jù)酶的最適pH調(diào)節(jié)酸堿范圍，調(diào)節(jié)pH至7-8.5 ;調(diào)節(jié)水浴蛋白酶酶解的最適溫度50°C -60°C，保溫酶解2h，酶解結(jié)束后，將水浴鍋的溫度調(diào)至90°C，保溫維持15min，除去酶解液中堿性蛋白酶的活性；溫度降低至50°C以下時，向滅活了蛋白酶的紅曲菌體蛋白水解液中加入原料質(zhì)量0.2%的木瓜蛋白酶，保持酶解溫度在50°C -60°C，調(diào)節(jié)pH在6_7左右，維持Ih ;調(diào)節(jié)水浴鍋的溫度至90°C，維持15min，滅活木瓜蛋白酶的酶活性；加入原料質(zhì)量0.3%的胃蛋白酶，保持酶解溫度在30°C -40°C，調(diào)節(jié)pH在3-4左右，維持1.5h。
[0011]與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下的有益效果；
1.傳統(tǒng)的紅曲霉發(fā)酵主要以大米為主要原料進行固態(tài)發(fā)酵，使用葡萄糖和蛋白胨作為主要碳氮源，液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲菌體多肽可以有效避免培養(yǎng)基中的大米蛋白和色素浸提過程中的有機溶劑對紅曲多肽的污染，提高了紅曲多肽產(chǎn)品的安全性。
[0012]2.本發(fā)明利用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶對紅曲霉菌絲體中的蛋白質(zhì)進行酶解，提取并酶解了紅曲霉菌絲體中蛋白質(zhì)，提高了紅曲菌體蛋白的原料利用率，并且提高了蛋白質(zhì)多肽的提取收率。產(chǎn)品總蛋白含量大于65%，ACE抑制活性1(:5。為26.lmg/mL。
[0013]3.本發(fā)明中對紅曲霉菌絲體的前處理不同于傳統(tǒng)的高溫烘干粉碎處理，高溫烘干也會破壞紅曲菌體蛋白的結(jié)構(gòu)和活性。通過改善前處理的條件，采用新鮮紅曲霉菌絲體進行清洗，過濾去除大部分水分后，低溫真空冷凍干燥獲得菌體干粉進行后續(xù)酶解步驟，以獲得我們所需要的產(chǎn)品。同時，紅曲霉產(chǎn)生的一些活性物質(zhì)混合在多肽冷凍干燥的粉末中，活性得到最大限度的保留，對人體起著保健作用。
[0014]4.本發(fā)明制備的ACE抑制肽產(chǎn)品其ACE抑制活性IC5q值能夠達到26.lmg/mL。將其作為功能因子添加到各類食品中，對高血壓患者具有一定的降壓作用。
【附圖說明】
[0015]圖1為實施例1紅曲肽濃度與ACE抑制率對應(yīng)圖；
圖2為實施例2紅曲肽濃度與ACE抑制率對應(yīng)圖。
【具體實施方式】
[0016]通過以下詳細(xì)說明結(jié)合附圖可以進一步理解本發(fā)明的特點和優(yōu)點。所提供的實施例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。
[0017]【實施例1】
使用配方為葡萄糖6%，蛋白胨2%，可溶性淀粉3%，瓊脂3%的紅曲霉斜面活化培養(yǎng)基進行菌種活化。將實驗室保藏的紅曲菌種SE1703接種到斜面培養(yǎng)基上，30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)進行活化。
[0018]取培養(yǎng)后的斜面種子一支，將菌體及孢子洗脫至10mL生理鹽水中制成混合液，按10%的接種量接種到裝有二級液體種子培養(yǎng)基10mL的250mL的三角瓶，于200rpm，30°C培養(yǎng)48h-72h。二級種子培養(yǎng)基配方為:大米粉3%，硝酸鈉0.5%，磷酸二氫鉀0.25%，硫酸鎂0.1%，使用乳酸調(diào)節(jié)pH 5.5-6ο
[0019]將培養(yǎng)24h_48h后的二級液體種子按10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中于30°C,200rpm培養(yǎng)5d，得到紅曲霉菌絲體。發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:葡萄糖4%，蛋白胨2%，可溶性淀粉3%，硝酸鈉0.2%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.2%，使用乳酸調(diào)節(jié)pH 5.5-60
[0020]紅曲霉菌絲體使用適量去離子水清洗，冷凍干燥得到菌體干粉，電子天平稱取濕重的紅曲霉菌絲體100g，加入200mL體積的去離子水清洗，過濾去除濾液，菌體置于_80°C冰箱冷凍12h，調(diào)節(jié)冷凍干燥機條件為_85°C，真空度-0.0lmPa,將菌體進行真空冷凍干燥得到菌體干粉。
[0021]用電子天平稱取干重的紅曲菌體干粉5g，加入100倍重量即500mL的去離子水，加入質(zhì)量為菌體干粉原料0.3%的堿性蛋白酶，即0.015g的堿性蛋白酶，調(diào)節(jié)pH=8.5，放置于水浴鍋中，調(diào)節(jié)溫度為55°C，保溫酶解2h。
[0022]酶解結(jié)束后，將水浴鍋溫度調(diào)至90°C，保溫15min左右，目的是將酶解液中的蛋白酶進行滅活。
[0023]用電子天平稱取占原料質(zhì)量為0.2%的木瓜蛋白酶，即0.0lg的木瓜蛋白酶加入到紅曲菌體蛋白酶解液中，調(diào)節(jié)