金槍魚暗色肉蛋白抗氧化鐵螯合肽制備方法
【專利說明】金槍魚暗色肉蛋白抗氧化鐵螯合肽制備方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及一種功能性肽的制備方法，尤其涉及金槍魚暗色肉蛋白抗氧化鐵螯合肽制備方法。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]金槍魚為大洋性魚類，廣泛分布于太平洋、印度洋和大西洋的中低瑋度的近海、夕卜海和大洋中，屬高度洄游魚類種群，是世界遠(yuǎn)洋漁業(yè)發(fā)展的重點(diǎn)目標(biāo)魚種。金槍魚肉味鮮美，營養(yǎng)豐富，具有紅肌型肉質(zhì)，加之常年生活于無污染的深海區(qū)，被視為綠色、安全、無污染食品，因而被國際營養(yǎng)學(xué)會推薦為世界三大營養(yǎng)魚類之一。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)，目前世界大洋性漁業(yè)總產(chǎn)量為850萬噸，其中金槍魚產(chǎn)量超過600萬噸，占公海漁業(yè)總產(chǎn)量70%以上。在金槍魚加工過程中產(chǎn)生約占總重量50%?70%的下腳料，其中暗色肉約占原料的11%，是制備活性多肽的優(yōu)質(zhì)原料，但并未得到有效利用。
[0005]申請人研究發(fā)現(xiàn)，以金槍魚暗色肉為原料，利用酶解技術(shù)制備抗氧化鐵螯合肽的工藝研究處于空白階段，而以酶解產(chǎn)物為材料制備高活性抗氧化鐵螯合肽更是未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種金槍魚暗色肉蛋白抗氧化鐵螯合肽的制備方法，該工藝科學(xué)合理、易操作，所得到的肽具有很好的抗氧化和鐵螯合活性。
[0007]本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為:一種金槍魚暗色肉蛋白抗氧化鐵螯合肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟:
O金槍魚暗色肉的預(yù)處理:取金槍魚暗色肉用高速組織搗碎機(jī)處理成勻漿，加熱至95?100°C后保溫10?15min，然后降至室溫，按照料液比Ig: 3?5mL加入異丙醇，室溫下脫脂20?24 h，然后于4°C、9 000 rpm離心25?30min除去異丙醇，收集脫脂金槍魚暗色肉固形物，即為脫脂金槍魚暗色肉蛋白；
2)脫脂金槍魚暗色肉蛋白的酶解:以脫脂金槍魚暗色肉蛋白作為原料，按固液比Ig: 20?25mL加入磷酸鹽緩沖液(pH 6.5?7.5)，得混合液；將混合液溫度升至55?65 °C預(yù)熱5?10 min,按照脫脂金槍魚暗色肉質(zhì)量的1.5?2.0%加入蛋白酶，酶解溫度為55?65 °C，酶解3?5 h后，將溶液升溫至90?95°C，并于此溫度保持10?15min后，10 OOOg離心20?25 min，取上清液，即為酶解產(chǎn)物；
3)金槍魚暗色肉蛋白抗氧化鐵螯合肽的制備:將制備的酶解產(chǎn)物采用3kDa超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，得超濾酶解液，再將酶解液依次經(jīng)凝膠過濾層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，得到抗氧化鐵螯合肽。
[0008]作為優(yōu)選，所述步驟I)中的金槍魚為鰹魚pelainis、。
[0009]作為優(yōu)選，所述步驟2)中的蛋白酶為中性蛋白酶，酶活力多1.0XlO5 U/go
[0010]作為改進(jìn)，所述步驟3)中的凝膠過濾層析和RP-HPLC純化的具體過程為:
凝膠過濾層析:將上述超濾酶解液用pH 6.5?7.5磷酸鹽緩沖液配成15?25 mg/mL
的溶液，經(jīng)過葡聚糖凝膠G-25柱層析(2.6 X 80 cm)分離，用pH 6.5?7.5磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，根據(jù)220 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，自由基(DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基)清除活性最高組分為凝膠層析酶解物。
[0011]純化:將上述凝膠層析酶解物用超純水配成80?100 yg/mL的溶液，利用RP-HPLC進(jìn)行純化，根據(jù)抗氧化活性得I個(gè)高活性抗氧化鐵螯合肽Tyr-1le-Val-Tyr-Trp(YIVYff), ES1-MS 檢測分子量為 742.84 Da。
[0012]優(yōu)選，所述RP-HPLC條件為:進(jìn)樣量15?20 μ L ;色譜柱Zorbax SB-C18 (250 X
4.6mm，5 μπι);柱溫為25?30 °C;流動相:A含0.1%三氟乙酸的水，B乙腈；梯度洗脫:0_6min為水，6 min以后乙腈濃度每分鐘升高0.5% ;洗脫速度0.8?1.0 mL/min ;紫外檢測波長 220 nm。
[0013]本發(fā)明所制備的金槍魚暗色肉蛋白抗氧化鐵螯合肽Tyr-1le-Val-Tyr-Trp(YIVYW)對DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；同時(shí)，Tyr-1le-Val-Tyr-Trp(YIVYW)亦顯示出顯著的鐵螯合作用。Tyr-1le-Val-Tyr_Trp(YIVYW)具有安全無毒副作用、抗氧化鐵螯合活性強(qiáng)、易于消化吸收等優(yōu)點(diǎn)，可以應(yīng)用于抗氧化和補(bǔ)鐵相關(guān)的藥品和功能廣品。
[0014]
【附圖說明】
[0015]圖1是本發(fā)明的超濾酶解液的葡聚糖凝膠G-25柱層析色譜圖；
圖2是本發(fā)明的葡聚糖凝膠G-25制備酶解物(Fr.B2)的RP-HPLC色譜圖。
[0016]
【具體實(shí)施方式】
[0017]以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0018]一種金槍魚暗色肉蛋白抗氧化鐵螯合肽的制備方法，制備工藝流程如下:金槍魚暗色肉〃脫脂〃酶解〃超濾〃凝膠過濾層析〃高效液相色譜純化〃抗氧化鐵螯合肽。
[0019]實(shí)施例:
1)金槍魚暗色肉的預(yù)處理:取鰹魚暗色肉用高速組織搗碎機(jī)處理成勻漿，加熱至95°C后保溫15min，然后降至室溫，按照料液比lg: 5 mL加入異丙醇，室溫下脫脂24 h，然后于4°C、9 000 rpm離心30 min除去異丙醇，收集脫脂金槍魚暗色肉固形物，即為脫脂金槍魚暗色肉蛋白；
2)脫脂金槍魚暗色肉蛋白的酶解:以脫脂金槍魚暗色肉蛋白作為原料，按固液比Ig:25mL加入磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)，得混合液；將混合液溫度升至60 °(:攪拌預(yù)熱10 min，按照脫脂金槍魚暗色肉質(zhì)量的2.0%加入中性蛋白酶(1.0XlO5 U/g)，酶解溫度為60 °C，酶解4 h后，將溶液升溫至90°C，并于此溫度保持10 min, 10 OOOg離心20 min，取上清液，即為酶解產(chǎn)物； 3)金槍魚暗色肉蛋白抗氧化鐵螯合肽的制備:將制備的酶解產(chǎn)物采用3 kDa超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，得超濾酶解液，再將酶解液依次經(jīng)凝膠過濾層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，得到抗氧化鐵螯合肽。
[0020]①凝膠過濾層析:將上述超濾酶解液用pH 7.0磷酸鹽緩沖液配成20 mg/mL的溶液，經(jīng)過葡聚糖凝膠G-25柱層析(2.6 X 80 cm)分離，用pH 7.0磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，根據(jù)220 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，自由基(DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基)清除活性最高組分為凝膠層析酶解物Fr.B2 (見圖1)。
[0021 ] ②RP-HPLC純化:將上述凝膠層析酶解物用超純水配成100 μ g/mL的溶液，利用RP-HPLC 進(jìn)行純化(條件為:進(jìn)樣量 20 yL;色譜柱 Zorbax SB-C18C250 X 4.6mm，5 ym)；柱溫30 °C ;流動相:A含0.1%三氟乙酸的水，B乙腈；梯度洗脫0-6 min為水，6 min以后乙腈濃度每分鐘升高0.5% ;洗脫速度1.0 mL/min ;紫外檢測波長220 nm)，根據(jù)抗氧化活性得I個(gè)高活性抗氧化鐵螯合肽(見圖2)。
[0022]③結(jié)構(gòu)檢測:收集抗氧化鐵螯合活性最高的多肽經(jīng)檢測為單一峰，利用蛋白/多肽序列分析儀測定氨基酸序列為Tyr-1le-Val-Tyr-Trp (YIVYff), ES1-MS檢測分子量為742.84 Da0
[0023]將上述制得的金槍魚暗色肉蛋白抗氧化鐵螯合肽Tyr-1le-Val-Tyr-Trp (YIVYff)進(jìn)行DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)、羥基自由基清除實(shí)驗(yàn)和超氧陰離子自由基清除實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:Tyr-1le-Val-Tyr-Trp (YIVYW)對 DPPH 自由基(EC5q 1.03 mg/mL)、羥基自由基(EC50 0.24 mg/mL)和超氧陰離子自由基(EC5q 0.25 mg/mL)具有良好的清除作用。
[0024]采用鄰菲羅啉比色法，測定該多肽對鐵離子的螯合作用。測定結(jié)果表明:純化得到的多肽 Tyr-1le-Val-Tyr-Trp (YIVYW)對鐵離子的螯合能力為 1.83 土 0.14 nmol/ymol。
[0025]最后，尚需注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種權(quán)利要求1所述的金槍魚暗色肉蛋白抗氧化鐵螯合肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)金槍魚暗色肉的預(yù)處理:取金槍魚暗色肉用高速組織搗碎機(jī)處理成勻漿，加熱至95?100°C后保溫10?15min，然后降至室溫，按照料液比Ig: 3?5mL加入異丙醇，室溫下脫脂20?24 h，然后于4°C、9 000 rpm離心25?30min除去異丙醇，收集脫脂金槍魚暗色肉固形物，即為脫脂金槍魚暗色肉蛋白； 2)脫脂金槍魚暗色肉蛋白的酶解:以脫脂金槍魚暗色肉蛋白作為原料，按固液比Ig: 20?25mL加入磷酸鹽緩沖液(pH 6.5?7.5)，得混合液；將混合液溫度升至55?65 °C攪拌預(yù)熱5?10 min，按照脫脂金槍魚暗色肉質(zhì)量的1.5?2.0%加入蛋白酶，酶解溫度為55?65 °C,酶解時(shí)間3?5 h后，將溶液升溫至90?95°C，并于此溫度保持10?15min，10 OOOg離心20?25 min，取上清液，即為酶解產(chǎn)物； 3)金槍魚暗色肉蛋白抗氧化鐵螯合肽的制備:將制備的酶解產(chǎn)物采用3kDa超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，得超濾酶解液，再將酶解液依次經(jīng)凝膠過濾層析和反相高效液相色譜純化，得到抗氧化鐵螯合肽。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟I)中的金槍魚為鰹魚{Katsuvonus pelamis)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟2)中的蛋白酶為中性蛋白酶，酶活力彡1.0XlO5 U/go4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)的凝膠過濾層析和反相高效液相色譜純化的具體過程為: 凝膠過濾層析:將上述超濾酶解液用pH 6.5?7.5磷酸鹽緩沖液配成15?25 mg/mL的溶液，經(jīng)過規(guī)格為2.6 X 80 cm的葡聚糖凝膠G-25柱層析分離，用pH 6.5?7.5磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，根據(jù)220 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，自由基清除活性最高組分為凝膠層析酶解物；所述的自由基包括DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基； RP-HPLC純化:將上述凝膠層析酶解物用超純水配成80?100 μ g/mL的溶液，利用RP-HPLC進(jìn)行純化，得I個(gè)高活性抗氧化鐵螯合肽Tyr-1le-Val-Tyr-Trp，ES1-MS檢測分子量為 742.84 Da05.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述反相高效液相色譜條件為:進(jìn)樣量15?20 μ L ;色譜柱為Zorbax SB-C18，規(guī)格為250 X 4.6mm，5 μ m ;柱溫為25?30°C;流動相:A含0.1%三氟乙酸的水，B乙腈；梯度洗脫:0-6 min為水，6 min以后乙腈濃度每分鐘升高0.5% ;洗脫速度0.8?1.0 mL/min ;紫外檢測波長220 nm。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種金槍魚暗色肉蛋白抗氧化鐵螯合肽及其制備方法，該抗氧化鐵螯合肽的氨基酸序列為Tyr-Ile-Val-Tyr-Trp，ESI-MS檢測分子量為742.84Da，制備時(shí)以金槍魚暗色肉作為原料，經(jīng)過脫脂、中性蛋白酶酶解、超濾、凝膠過濾層析和反相高效液相純化，得抗氧化鐵螯合肽Tyr-Ile-Val-Tyr-Trp。
【IPC分類】C12P21/06, C07K1/20, C07K1/16, C07K1/34
【公開號】CN105002245
【申請?zhí)枴緾N201510162433
【發(fā)明人】遲長鳳, 王斌, 陳蔭, 羅紅宇
【申請人】浙江海洋學(xué)院
【公開日】2015年10月28日
【申請日】2015年4月8日