馬面鲀魚(yú)皮鋅螯合肽的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種水產(chǎn)品多肽，尤其涉及馬面飩魚(yú)皮鋅螯合肽。
【背景技術(shù)】
[0002]馬面飩俗名橡皮魚(yú)、剝皮魚(yú)，隸屬于飩形目、革飩科，是我國(guó)的一種常見(jiàn)魚(yú)類(lèi)。馬面飩皮較厚且硬，無(wú)食用價(jià)值，多數(shù)扔掉，造成資源的浪費(fèi)和環(huán)境污染。鋅是人體必須的微量元素，兒童鋅缺乏可導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育不良、智力發(fā)育落后、免疫力降低等病癥；孕婦缺鋅，胎兒畸形率增高。傳統(tǒng)的鋅補(bǔ)充劑如硫酸鋅和葡萄糖酸鋅等吸收利用率低，腸胃刺激大，不利于長(zhǎng)期服用。而鋅螯合肽即可促進(jìn)鋅的吸收利用，同時(shí)又能滿(mǎn)足機(jī)體對(duì)活性肽、氨基酸等的需求，而且無(wú)副作用，得到了廣泛關(guān)注。
[0003]但是，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，以馬面飩魚(yú)皮為原料制備馬面飩魚(yú)皮鋅螯合肽及其工藝研宄處于空白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)上述的技術(shù)現(xiàn)狀提供一種馬面飩魚(yú)皮鋅螯合肽，該多肽具有較強(qiáng)的鋅螯合能力。
[0005]本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題所采取的技術(shù)方案為:一種馬面飩魚(yú)皮鋅螯合肽，其特征在于該多肽的氨基酸序列為Gly-Pro-Tyr-Gly-Pro-Phe-Gly-Pro-Trp-Gly(GPYGPFGPffG), ES1-MS 測(cè)定分子量為 1034.09 Da。
[0006]該馬面飩魚(yú)皮鋅螯合肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟:
I)馬面飩魚(yú)皮明膠的制備:將馬面飩魚(yú)皮絞碎，按照料液比I g: 15?20 mL加入到
0.3?0.5%的NaOH溶液中攪拌5?8 h，用雙蒸水洗至中性；然后按照I g: 10?15 mL加入到0.3?0.5%的仏504中，室溫浸泡2 d，每8 h換水一次；最后將處理過(guò)的魚(yú)皮勻漿，按照料液比I g:8?10 mL加入到雙蒸水中，于70°C動(dòng)態(tài)提取12?15 h，然后于6 OOOg離心25?30 min，取上清液，凍干得馬面飩魚(yú)皮明膠。
[0007])馬面飩魚(yú)皮明膠的酶解:將馬面飩魚(yú)皮明膠按照料液比Ig:8?12 mL加入到巴比妥鈉-鹽酸中，調(diào)pH值至7.0，于45?50°C保溫5?10 min，按照魚(yú)皮質(zhì)量的2?3%加入中性蛋白酶(1.0 X 15 U/g)，于45?50°C酶解3?5 h，將溶液升溫至90?95°C，并于此溫度保持5?10 min后，冷卻至35?40°C ;調(diào)溶液pH值至8.0，按照明膠質(zhì)量的
1.5?2.0%向溶液中加入胰蛋白酶(1.9X 14 U/g)，于溫度35?40°C下酶解3?4 h，將溶液升溫至90?95°C，并于此溫度保持10?15min后，10 OOOg離心15?20 min，取上清液，即為酶解產(chǎn)物；
3)馬面飩魚(yú)皮鋅螯合肽的制備:將制備的酶解產(chǎn)物采用3 kDa超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，得超濾酶解液，超濾酶解液依次經(jīng)固定化鋅離子親和層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，得到馬面飩魚(yú)皮鋅螯合肽。
[0008]作為優(yōu)選，所述步驟I)中的馬面飩為綠鰭?cǎi)R面飩(/ferat/oz? septentr1nalis)。
[0009]作為改進(jìn)，所述步驟3)的固定化鋅離子親和層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化的具體過(guò)程為:
固定化鋅離子親和層析:將上述超濾酶解液溶于雙蒸水配成濃度為8?10 mg/mL的溶液，經(jīng)過(guò)固定化鋅離子Sepharose 6B親和層析柱吸附后，用3?5倍柱體積雙蒸水洗脫除去未吸附的多肽，然后用5?8倍柱體積的pH 3.0的雙蒸水洗脫層析柱，收集洗脫液，凍干，得親和層析酶解物；
RP-HPLC純化:將上述親和層析酶解物用雙蒸水配成100?120 μ g/mL的溶液，利用RP-HPLC進(jìn)行純化，根據(jù)對(duì)鋅離子的螯合活性得I個(gè)高Zn螯合活性多肽Gly-P1-Tyr-Gly-Pro-Phe-Gly-Pro-Trp-Gly (GPYGPFGPffG)0
[0010]優(yōu)選，所述RP-HPLC條件為:進(jìn)樣量10?15 μ L ;色譜柱為Gemini C18 (250 X4.6mm, 5 μ m);柱溫為25?30 °C ;流動(dòng)相:30%乙腈(含0.1%三氟乙酸)；洗脫速度0.5?0.8 mL/min ;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。
[0011]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明選用中性蛋白酶和胰蛋白酶作為酶解用酶，通過(guò)生物酶解法同時(shí)融合超濾分級(jí)和色譜精制，制得的多肽具有較強(qiáng)的鋅螯合能力，且具有易于消化吸收和安全無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，可用作補(bǔ)鋅藥品或功能產(chǎn)品。
[0012]
【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1是本發(fā)明的固定化鋅離子親和層析酶解物的RP-HPLC色譜圖。
[0014]
【具體實(shí)施方式】
[0015]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0016]馬面飩魚(yú)皮鋅螯合肽的制備工藝流程如下:馬面飩魚(yú)皮〃脫非膠原蛋白、脫鈣、提取明膠〃酶解〃超濾〃固定化鋅離子親和層析〃高效液相色譜純化〃鋅螯合肽〃結(jié)構(gòu)鑒定、活性評(píng)價(jià)。
[0017]實(shí)施例:
I)馬面飩魚(yú)皮明膠的制備:將綠鰭?cǎi)R面飩(#arai/o/7 septentr1nalis)魚(yú)皮絞碎，按照料液比I g: 15 mL加入到0.3%的NaOH溶液中攪拌5 h，用雙蒸水洗至中性；然后按照Ig:10 mL加入到0.4%的H2SO4中，室溫浸泡2 d，每8 h換水一次；最后將處理過(guò)的魚(yú)皮勻漿，按照料液比1:10加入到雙蒸水中，于70°C動(dòng)態(tài)提取15 h，于6 OOOg離心30 min,取上清液，凍干得馬面飩魚(yú)皮明膠。
[0018])馬面飩魚(yú)皮明膠的酶解:將馬面飩魚(yú)皮明膠按照料液比Ig: 12 mL加入到巴比妥鈉-鹽酸緩沖液中，調(diào)pH值至7.0，于50°C保溫10 min,按照魚(yú)皮質(zhì)量的2%加入中性蛋白酶(1.0 X 15 U/g)，于50°C酶解3 h，將溶液升溫至90°C，并于此溫度保持15min后，冷卻至37°C ;調(diào)溶液pH值至8.0，按照明膠質(zhì)量的1.5%向溶液中加入胰蛋白酶(1.9X104 U/g)，于溫度37°C下酶解4 h，將溶液升溫至95°C，并于此溫度保持1min后，10 OOOg離心15min，取上清液，即為酶解產(chǎn)物；
3)馬面飩魚(yú)皮鋅螯合肽的制備:將制備的酶解產(chǎn)物采用3 kDa超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，得超濾酶解液，超濾酶解液依次經(jīng)固定化鋅離子親和層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，得到馬面飩魚(yú)皮鋅螯合肽。
[0019]①固定化鋅離子親和層析:將上述超濾酶解液溶于雙蒸水配成濃度為8?10 mg/mL的溶液，經(jīng)過(guò)固定化鋅離子Sepharose 6B親和層析柱吸附后，用3?5倍柱體積雙蒸水洗脫除去未吸附的多肽，然后用5?8倍柱體積的pH 3.0的雙蒸水洗脫層析柱，收集洗脫液，凍干，得親和層析酶解物；
②RP-HPLC純化:將上述親和層析酶解物用雙蒸水配成120 μ g/mL的溶液，利用RP-HPLC進(jìn)行純化(條件:進(jìn)樣量15 UL ;色譜柱為Gemini C18 (250 X 4.6mm, 5 μπι);柱溫為30 °C ;流動(dòng)相30%乙腈(含0.1%三氟乙酸);洗脫速度0.8 mL/min ;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)220nm)，根據(jù)對(duì)鋅離子的螯合活性得I個(gè)高Zn螯合活性多肽(圖1)。
[0020]③結(jié)構(gòu)檢測(cè):收集Zn螯合活性最高的多肽經(jīng)檢測(cè)為單一峰，利用蛋白/多肽序列分析儀測(cè)定氨基酸序列為 Gly-Pro-Tyr-Gly-Pro-Phe-Gly-Pro-Trp-Gly (GPYGPFGPffG),ES1-MS測(cè)定分子量為1034.09 Da。
[0021]Zn螯合肽對(duì)鋅離子的螯合作用采用EDTA滴定法測(cè)定。取待測(cè)樣品100 mg放入到100 mL燒杯中，加水50 mL和HCl (6 mol/L)數(shù)滴，在水浴上加熱使樣品完全溶解，冷卻后定容至100 mL，從中吸取10 mL于三角瓶，平行3份，加入10 mL的NH3-NH4Cl緩沖液(pH10)，鉻黑T作指示劑，然后用Na2EDTA溶液(0.01 mol/L)滴定至藍(lán)色，記錄消耗EDTA的毫升數(shù)，計(jì)算螯合物含鋅量。
[0022]測(cè)定結(jié)果表明:純化得到的Zn螯合膠原肽Gly-Pro-Tyr-Gly-Pro-Phe-Gly-Pro-Trp-Gly (GPYGPFGPffG)對(duì)鋅離子的螯合能力為56.74 μ g/mg，與馬面飩魚(yú)皮明膠酶解物(23.97 μ g/mg)相比其對(duì)Zn的螯合能力有了顯著提高。
[0023]最后，尚需注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種馬面飩魚(yú)皮鋅螯合肽，其特征在于該多肽的氨基酸序列為Gly-Pro-Tyr-Gly-Pro-Phe-Gly-Pro-Trp-Gly, ES1-MS 測(cè)定分子量為 1034.09 Da0
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種馬面鲀魚(yú)皮鋅螯合肽，具體講是以馬面鲀魚(yú)皮為原料，采用酸堿脫除魚(yú)皮非膠原蛋白和礦物質(zhì)后提取魚(yú)皮明膠，利用中性蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)魚(yú)皮明膠進(jìn)行酶解，采用超濾、固定化鋅離子親和層析和反相高效液相色譜分離純化得到鋅螯合肽Gly-Pro-Tyr-Gly-Pro-Phe-Gly-Pro-Trp-Gly（GPYGPFGPWG），ESI-MS測(cè)定分子量為1034.09Da。鋅螯合肽由于其獨(dú)特的螯合和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，可顯著提高鋅的吸收利用度，又可同時(shí)補(bǔ)充人體所需的多肽/氨基酸，是一種理想的補(bǔ)鋅物質(zhì)，可用于補(bǔ)鋅藥物或者功能產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。
【IPC分類(lèi)】C07K1/36, C07K1/20, C12P21/06, C07K1/22, C07K14/78, C07K1/34
【公開(kāi)號(hào)】CN104928337
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510177228
【發(fā)明人】遲長(zhǎng)鳳, 王斌, 陳蔭, 孫坤來(lái)
【申請(qǐng)人】浙江海洋學(xué)院
【公開(kāi)日】2015年9月23日
【申請(qǐng)日】2015年4月15日