用于擴(kuò)增多個(gè)靶標(biāo)的擴(kuò)增子拯救多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的制作方法
【專利說明】用于擴(kuò)增多個(gè)靶標(biāo)的擴(kuò)增子拯救多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
[0001] 本申請是國際申請?zhí)朠CT/US2009/039552,國際申請日2009年4月3日，中國申 請?zhí)?00980118968. 1，發(fā)明名稱為"用于擴(kuò)增多個(gè)靶標(biāo)的擴(kuò)增子拯救多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)" 的分案申請。
[0002] 相關(guān)申請的奪叉引用
[0003] 本申請要求于2008年4月3日申請的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?1/042, 259的優(yōu)先權(quán) 權(quán)益。 發(fā)明領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明總體上涉及用于擴(kuò)增核酸的方法。更具體地，本發(fā)明涉及用于使用聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來擴(kuò)增多種核酸序列的方法。
[0005] 發(fā)明背景
[0006] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)的開發(fā)使得能夠使用DNA擴(kuò)增用于多種應(yīng)用，包括分子診 斷測試。然而存在許多與PCR用于分子鑒別診斷（MDD)測定的應(yīng)用相關(guān)的挑戰(zhàn)。PCR利用 特異性的引物或引物組、溫度條件和酶。PCR反應(yīng)可能容易被污染，引物結(jié)合對于不同的引 物可能需要不同的條件，引物應(yīng)該對于靶序列特異以便僅擴(kuò)增該靶序列，等等。這使得其更 難以從單個(gè)樣品中擴(kuò)增多種序列。
[0007] 過去，診斷測試臨床樣品以發(fā)現(xiàn)一種或多種疾病病原體需要分離和培養(yǎng)微生物。 然而，這可能需要幾天，并且在許多情況下，如果要挽救患者的生命，診斷必須在幾小時(shí)內(nèi) 作出。分析單個(gè)臨床樣品以鑒定多種生物體從而確定哪一種或哪幾種可能是疾病的（多 種）病原體是期望用于MMD的方法，并且已經(jīng)開發(fā)了許多方法來較好地實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)。例如， 已經(jīng)開發(fā)了多重PCR法以擴(kuò)增樣品內(nèi)的多種核酸以便產(chǎn)生足夠的DNA/RNA從而能夠檢測和 鑒定多種生物體。然而，多重PCR具有一些缺點(diǎn)。例如，多重PCR反應(yīng)中的每種靶標(biāo)需要其 自己的最佳反應(yīng)條件，因此增加靶標(biāo)的數(shù)目需要每種單個(gè)靶標(biāo)的反應(yīng)條件不是最佳條件。 此外，體系中的多組高濃度引物經(jīng)常產(chǎn)生引物二聚體或獲得非特異性的本底擴(kuò)增。這種特 異性的缺乏也需要PCR后提純和多次雜交后洗滌的額外步驟。密集的引物由于需要利用酶 和消耗底物而降低擴(kuò)增效率。擴(kuò)增效率的差異可能導(dǎo)致擴(kuò)增子產(chǎn)量的顯著差異。例如，一 些基因座可能非常有效地?cái)U(kuò)增，而另一些則擴(kuò)增的效率很低或根本不能擴(kuò)增。這種不均一 擴(kuò)增的可能性也使得難以至不可能準(zhǔn)確地進(jìn)行終點(diǎn)定量分析。
[0008] -種方法利用以非常低的濃度使用的嵌套式基因特異性引物以在初始PCR循環(huán) 期間富集靶標(biāo)。之后，使用共用引物來擴(kuò)增所有靶標(biāo)。整個(gè)反應(yīng)在一個(gè)試管中進(jìn)行，不需要 額外輪次的PCR，并且不需要專門的儀器，但代替地，可以使用常規(guī)的熱循環(huán)儀來進(jìn)行。然 而，此方法有缺點(diǎn)。例如，因?yàn)槭褂玫蜐舛鹊囊镌诔跏佳h(huán)期間富集靶標(biāo)，因此測定的靈 敏度最終降低，初始的富集循環(huán)的每次循環(huán)需要較長的退火時(shí)間，并且在經(jīng)過擴(kuò)增靶標(biāo)所 需的循環(huán)次數(shù)后酶很有可能變得不太有效。
[0009] 對于更靈敏的、更快速的和更有效的用于擴(kuò)增來自多種靶標(biāo)的DNA和/或RNA以 促進(jìn)那些靶標(biāo)的快速鑒定的方法仍然存在著需求。
[0010] 發(fā)明概沐
[0011] 本發(fā)明涉及用于擴(kuò)增核酸從而能夠檢測那些核酸的方法，該方法包括以下步驟： 在第一次擴(kuò)增反應(yīng)中使用高濃度、靶標(biāo)特異性引物擴(kuò)增一種或多種靶核酸，從而產(chǎn)生至少 一種含有至少一個(gè)共用引物結(jié)合位點(diǎn)的核酸擴(kuò)增子；拯救所述至少一種核酸擴(kuò)增子；以及 在第二次擴(kuò)增反應(yīng)中使用與所述至少一個(gè)共用引物結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的共用引物擴(kuò)增所述至 少一種核酸擴(kuò)增子。本發(fā)明的一個(gè)方面利用嵌套式靶標(biāo)特異性引物。靶核酸可以包括DNA 和/或RNA，并且可以包括病毒、細(xì)菌和/或真菌來源的DNA和/或RNA，以及人或其他動物 來源的基因組DNA和/或RNA。擴(kuò)增可以通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)和/或RT-PCR進(jìn)行。 靶核酸的來源可以是來自一份或多份臨床、環(huán)境、或食品樣品，并且該方法可以以廣泛多樣 的方式使用，包括，例如，臨床診斷、環(huán)境采樣、植物檢測、食品安全性分析、檢測遺傳病癥、 和/或檢測疾病狀況。該方法可以用于人和/或獸的醫(yī)學(xué)診斷。
[0012] 附圖簡要說明
[0013] 圖1是本發(fā)明的方法的圖示，其中F。代表正向-外側(cè)引物；Fi代表帶有正向共用 引物標(biāo)簽（結(jié)合序列）的正向-內(nèi)側(cè)引物；Cf代表正向共用引物；R i代表帶有反向共用引 物標(biāo)簽（結(jié)合序列）的反向-內(nèi)側(cè)引物；R。代表反向-外側(cè)引物；Q代表反向共用引物；Fa代表附加正向引物；和Ra代表附加反向引物，這些引物通常如所指示的那樣定位。
[0014] 連述
[0015] 本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了一種用于擴(kuò)增核酸的新方法，該方法可以用來檢測來自病 毒、細(xì)菌、真菌、植物和/或動物細(xì)胞的核酸的存在，和存在的相對量，從而用于醫(yī)學(xué)、環(huán)境、 食品、和其他樣品的評價(jià)以鑒定那些樣品內(nèi)的微生物和其他因子（agent)。該方法在本文中 稱為擴(kuò)增子拯救多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（"arm-PCR")。在此方法中，靶核酸的PCR擴(kuò)增相 繼地在兩個(gè)不同的反應(yīng)體系中進(jìn)行。這些體系可以包括獨(dú)立的柱、反應(yīng)容器或芯片的部分， 例如，含有一種或多種靶核酸、引物、酶、核苷酸（例如，dNTP)和緩沖液，它們是擴(kuò)增所述一 種或多種靶核酸以產(chǎn)生擴(kuò)增子所必需的。通過在第一次擴(kuò)增反應(yīng)中使用高濃度的引物并且 拯救在該反應(yīng)期間形成的擴(kuò)增子以用于在不同的反應(yīng)體系中的第二次擴(kuò)增反應(yīng)中，本發(fā)明 人已經(jīng)開發(fā)了一種增加靈敏度和特異性，減少產(chǎn)生可檢測結(jié)果所必需的時(shí)間，并且容易使 其適于自動化操作的方法。
[0016] 要理解的是，如本文所使用的術(shù)語"包括"可以用術(shù)語"基本上由......組成"和 "由......組成"代替。當(dāng)使用術(shù)語"反應(yīng)體系"時(shí)，其意在描述向其中置入了必需的引物、 酶、核苷酸、緩沖液和/或其他試劑以便進(jìn)行至少一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的一個(gè)或多個(gè)循環(huán) 的Eppendorf管、反應(yīng)室或其他容納裝置。因此不同的"反應(yīng)體系"可以指相同的反應(yīng)容納 容器，但不同的用于進(jìn)行所需的擴(kuò)增步驟的試劑組分（尤其是引物）。"反應(yīng)容納容器"意 在指具有充足的內(nèi)部容積以容納提供反應(yīng)體系所必需的引物、酶、核苷酸、緩沖液和/或其 他試劑的試管、板孔或其他容器。術(shù)語"拯救"意在指將擴(kuò)增子與第一次擴(kuò)增的至少一部分 引物分離。"PCR"意在指聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，并且可以包括PCR和/或RT-PCR步驟。
[0017] 在該方法的第一個(gè)步驟中，使用高濃度的靶標(biāo)特異性的嵌套引物來進(jìn)行靶標(biāo)特異 性的第一次擴(kuò)增步驟。引物選自病毒、細(xì)菌、真菌和/或期望使用核酸檢測進(jìn)行鑒定的其他 靶標(biāo)的已知序列，并且對于那些靶核酸和/或密切相關(guān)的靶核酸是特異的。靶標(biāo)特異性引 物可以用來擴(kuò)增，例如，細(xì)菌、病毒、真菌和/或其他來源的一種或多種（和優(yōu)選多種）靶核 酸。嵌套引物濃度通?？梢詾?-50pmol。如圖1中所示，選擇的引物用附加的核苷酸進(jìn)行 "標(biāo)記"以提供對一種或多種靶核酸不特異的附加序列，使得用此引物對靶核酸的擴(kuò)增也會 在所生成的擴(kuò)增子中加入共用引物的結(jié)合位點(diǎn)，該共用引物與靶標(biāo)特異性引物不同，其可 以用來進(jìn)一步擴(kuò)增不相關(guān)的靶核酸擴(kuò)增子（見圖1中的A和B)。擴(kuò)增進(jìn)行大致10-15個(gè)循 環(huán)，反應(yīng)終止，并且從反應(yīng)混合物中拯救生成的擴(kuò)增子用于第二個(gè)不依賴靶標(biāo)的擴(kuò)增步驟 中，包括由共用引物引發(fā)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，該反應(yīng)將以相對無差別的方式提供不相關(guān)核 苷酸序列的擴(kuò)增，所述不相關(guān)核苷酸序列由從靶標(biāo)特異性反應(yīng)中拯救的多種擴(kuò)增子代表。
[0018] 然后進(jìn)行擴(kuò)增子拯救以盡量減少或清除第一次反應(yīng)的引物，同時(shí)提供用于使用共 用引物的第二次擴(kuò)增中的擴(kuò)增子。擴(kuò)增子拯救可以以多種方式進(jìn)行。例如，可以取來自完成 的第一次擴(kuò)增反應(yīng)的小樣品以提供用于第二次擴(kuò)增的擴(kuò)增子。當(dāng)取得小樣品時(shí)，其提供足 夠數(shù)目的用于第二次擴(kuò)增的擴(kuò)增子，同時(shí)顯著地減少（例如，稀釋）剩余數(shù)目的第一次擴(kuò)增 的引物。擴(kuò)增子拯救也可以通過如下步驟來進(jìn)行：去除第一次擴(kuò)增的反應(yīng)體系的大部分內(nèi) 容物并且向剩余的內(nèi)容物中加入一種或多種共用引物和必需的一種或多種酶、核苷酸、一 種或多種緩沖液和/或其他試劑以進(jìn)行第二次擴(kuò)增，所述第二次擴(kuò)增利用所述一種或多種 共用引物在第二反應(yīng)體系中擴(kuò)增拯救的擴(kuò)增子。分離技術(shù)也可以用來拯救擴(kuò)增子。這些技 術(shù)可以依靠引物和擴(kuò)增子之間的尺寸差異，依靠已經(jīng)連接在擴(kuò)增子、引物或兩者上的標(biāo)簽， 或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法。一旦被分離，所有拯救的擴(kuò)增子或一部分拯救的擴(kuò)增 子可以用于第二次擴(kuò)增中。
[0019] 第二次擴(kuò)增在不同的反應(yīng)體系中進(jìn)行，其可以利用或可以不利用相同的反應(yīng)容納 容器。第二次擴(kuò)增使用新鮮的緩沖液、核苷酸和一種或多種共用引物擴(kuò)增拯救的擴(kuò)增子。選 擇共用引物以提供對拯救的擴(kuò)增子的有效擴(kuò)增從而在第二次擴(kuò)增結(jié)束時(shí)提供大量拷貝數(shù) 的那些擴(kuò)增子。
[0020] 通過將反應(yīng)分成第一次靶標(biāo)特異性的引物驅(qū)動的擴(kuò)增和第二次不依賴靶標(biāo)的共 用引物驅(qū)動的擴(kuò)增，本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了一種方法，該方法通過使用靶標(biāo)特異性引物僅擴(kuò) 增存在于特定靶標(biāo)中的核酸種類和數(shù)目來提供特異性，和通過使用嵌套引物、高濃度靶標(biāo) 特異性引物實(shí)現(xiàn)靈敏度，并且使用一種或多種共用引物以提供較高拷貝數(shù)的非特異性（不 依賴靶標(biāo)的）擴(kuò)增。此外，在第一次擴(kuò)增中使用高濃度引物，緊接著進(jìn)行擴(kuò)增子拯救，尤其 是當(dāng)通過分離一部分第一次擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增拯救時(shí)，所述分離通過去除該部分并將其置 于新的反應(yīng)體系中或通過去除大部分的第一次擴(kuò)增產(chǎn)物并向其加入必需的試劑以形成用 于第二次不依賴靶標(biāo)的擴(kuò)增的第二反應(yīng)體系而進(jìn)行，這使其適于自動化操作。不僅這些步 驟可以在相對密閉的反應(yīng)體系（該體系限制了污染的可能性）內(nèi)進(jìn)行，而且由該方法提供 的第一次擴(kuò)增、擴(kuò)增子拯救和第二次擴(kuò)增的組合產(chǎn)生了在少于2小時(shí)的時(shí)間內(nèi)的特異性 的、靈敏的用于來自多個(gè)樣品的多種靶標(biāo)的檢測方法。
[0021] 靶核酸可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方式分離自其各自來源。由該方法產(chǎn) 生的擴(kuò)增子的檢測也可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種方式來進(jìn)行，諸如將來自第二擴(kuò) 增步驟的擴(kuò)增子應(yīng)用至用于雜交和檢測的印刷陣列。共用引物序列可以包括將有效地提供 擴(kuò)增反應(yīng)的有效啟動的任何序列。這些序列和