針對(duì)融合基因進(jìn)行擴(kuò)增子測序的引物設(shè)計(jì)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體來說涉及一種針對(duì)融合基因進(jìn)行擴(kuò)增子測序的引 物設(shè)計(jì)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 擴(kuò)增子測序是指通過設(shè)計(jì)感興趣的基因組區(qū)域的引物，經(jīng)過多重PCR擴(kuò)增，將目 標(biāo)區(qū)域DNA富集后進(jìn)行高通量測序的研宄策略。該技術(shù)使用多組PCR引物對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行 擴(kuò)增，用于樣本量較大而擴(kuò)增區(qū)段較?。?lt;l〇〇k)的情況，通常情況下可以通過擴(kuò)增子測序的 技術(shù)對(duì)基因的熱點(diǎn)突變區(qū)或者長度<l〇〇k的全外顯子去進(jìn)行擴(kuò)增和分析，關(guān)注的是SNP、插 入/缺失等突變類型。
[0003] 擴(kuò)增子測序的引物設(shè)計(jì)目前最有效和商業(yè)化程度最好的方法是通過Ion Ampliseq? Designer (www. ampliseq. com)來進(jìn)行。Ion Ampliseq? Designer 是隸屬于賽 默飛公司（Thermo Fisher Scientific Inc.)的引物設(shè)計(jì)工具，采用該流程設(shè)計(jì)引物的具 體流程如下： 1、打開 Ion Ampliseq? Designer 網(wǎng)站（www. ampliseq. com)，注冊(cè)并登陸。
[0004] 2、登陸之后點(diǎn)擊Add design按鈕。
[0005] 3、點(diǎn)擊 start a new design按鈕，進(jìn)入相應(yīng)界面，填寫Assay design name，選擇 DNA Gene designs (multi-pool)和 Human (hgl9)，點(diǎn)擊 Next :Add Targets。
[0006] 4、確定待檢測的序列信息及對(duì)應(yīng)的染色體位置： 在采用該工具的擴(kuò)增子測序引物設(shè)計(jì)中，代表待檢測區(qū)域的指標(biāo)是該區(qū)域序列對(duì)應(yīng)的 染色體位置，查找方法是找到待檢測區(qū)域(或者待測位點(diǎn)前后各推IOObp的區(qū)域）的基因 組序列，將該序列粘貼到 http://genome. ucsc. edu/cgi_bin/hgBlat?org=human 的空白界 面，即可得到其對(duì)應(yīng)的染色體起始位置，和正反鏈的信息。
[0007] 5、進(jìn)入設(shè)計(jì)界面之后，根據(jù)需要選擇Exon padding和DNA Type，在Add gene/ Region處選擇Region，再在input specifications處填寫基因名字以及對(duì)應(yīng)的染色體起 始位置。當(dāng)需要設(shè)計(jì)的目標(biāo)區(qū)域較多時(shí)，此處可以選用upload File功能，將待檢測的一組 目標(biāo)區(qū)域的名稱、對(duì)應(yīng)的染色體起始位點(diǎn)的信息總結(jié)在一個(gè).CSV文件中，直接上傳，點(diǎn)擊 upload。
[0008] 6、序列成功上傳后，點(diǎn)擊submit targets，系統(tǒng)通常會(huì)在12h之內(nèi)完成引物設(shè)計(jì)。
[0009] 結(jié)果是針對(duì)靶點(diǎn)附近序列擴(kuò)增的一系列引物，相應(yīng)引物對(duì)的擴(kuò)增片段長度一般為 125-175bp、125-275bp或125-375bp，根據(jù)待檢測樣品的不同而不同，例如125-175bp用于 FFPE及cDNA檢測，而125-375bp用于gDNA檢測。
[0010] 融合基因，是指將兩個(gè)或多個(gè)基因的編碼區(qū)首尾相連，置于同一套調(diào)控序列（包括 啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、核糖體結(jié)合序列、終止子等）控制之下，構(gòu)成的嵌合基因。融合基因是重要 的腫瘤標(biāo)志物，以白血病的分型為例，bcr/abl融合基因存在于95%以上的慢性粒細(xì)胞白血 病患者，是CML最重要的分標(biāo)志，PML-RARa融合基因是急性早幼粒細(xì)胞白血病APL患者 特異的分子生物學(xué)標(biāo)志。融合基因的檢測對(duì)于疾病的分型、靶向治療、個(gè)性化用藥等起著 非常關(guān)鍵的作用，目前在基因水平上對(duì)融合基因進(jìn)行檢測的方法有：Southern blotting、 RT-PCR和實(shí)時(shí)定量PCR。然而這些方法都是只針對(duì)單個(gè)融合基因的檢測，是否可以利用上 述擴(kuò)增子測序的技術(shù)，采用多重PCR擴(kuò)增的方法，同時(shí)對(duì)多種融合基因進(jìn)行檢測？這就涉 及到最關(guān)鍵的技術(shù)問題：引物設(shè)計(jì)。
[0011] 普通擴(kuò)增子引物設(shè)計(jì)是一項(xiàng)極為耗時(shí)費(fèi)力的工作，我們希望能夠采用以上所述 的Ion Ampliseq? Designer工具進(jìn)行融合基因擴(kuò)增子引物設(shè)計(jì)。然而如上所述，Ion Ampliseq? Designer工具所設(shè)計(jì)的擴(kuò)增子引物針對(duì)的是SNP、插入/缺失等突變類型，而沒 有考慮到融合基因。Ion Ampliseq? Designer工具是根據(jù)基因及其所在的染色體位置推斷 出序列，然后設(shè)計(jì)引物。但是在融合基因的情況下，所融合的兩個(gè)基因在染色體上的原始位 置可能相隔甚遠(yuǎn)，或者原本是在不同的染色體上，因此在Ion Ampliseq? Designer工具中 輸入基因位置，往往得到大量的廢引物，或者根本不能得到結(jié)果。再考慮融合的兩個(gè)基因是 位于不同的正負(fù)鏈上和倒位融合，情況更為復(fù)雜。因此有必要對(duì)現(xiàn)有的利用Ion Ampliseq? Designer工具進(jìn)行擴(kuò)增子引物設(shè)計(jì)的方法進(jìn)行改良，以便適用于設(shè)計(jì)用于融合基因擴(kuò)增子 測序的引物序列。
[0012] 本文將介紹通過Ion Ampliseq? Designer工具進(jìn)行融合基因擴(kuò)增子引物的設(shè)計(jì) 方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 為了高效地進(jìn)行融合基因擴(kuò)增子引物設(shè)計(jì)，我們對(duì)現(xiàn)有利用Ion Ampliseq? Designer工具進(jìn)行擴(kuò)增子引物設(shè)計(jì)的方法進(jìn)行改良，使其適用于融合基因擴(kuò)增子引物設(shè) 計(jì)。
[0014] 我們開發(fā)的利用Ion Ampliseq? Designer工具進(jìn)行融合基因擴(kuò)增子引物設(shè)計(jì)的 方法采用了以下技術(shù)方案： 一種針對(duì)融合基因進(jìn)行擴(kuò)增子測序的引物設(shè)計(jì)方法，所述方法是在Ion Ampliseq? Designer工具上進(jìn)行的擴(kuò)增子引物設(shè)計(jì)方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： 1) 確定融合基因序列信息，即確定發(fā)生融合的前基因 A序列和后基因 B序列以及融合 位點(diǎn)，找到前基因 A和后基因 B發(fā)生融合的外顯子區(qū)序列，以及各自的染色體定位信息，即 各自對(duì)應(yīng)的染色體起點(diǎn)和終點(diǎn)位置； 2) 在Ion Ampliseq? Designer中輸入前基因 A和后基因 B發(fā)生融合的外顯子區(qū)的各 自的染色體定位信息，分別設(shè)計(jì)出擴(kuò)增子引物； 3 )根據(jù)基因 A、基因 B在染色體中定位的正負(fù)鏈信息，確定基因 A、基因 B分別應(yīng)該選 擇正向引物還是反向引物，其中選擇情況如下所示：
， 4 )引物及擴(kuò)增子序列確認(rèn)，即當(dāng)引物設(shè)計(jì)完成之后，首先需要對(duì)并選擇好的融合基因 引物在融合基因的序列中進(jìn)行位置查找，查看其擴(kuò)增子長度，并判斷擴(kuò)增子長度范圍。
[0015] 進(jìn)一步，步驟4)中所獲得的擴(kuò)增子長度范圍為125_175bp。
[0016] 進(jìn)一步，若步驟4)中所獲得的擴(kuò)增子長度范圍不為125-175bp，則該方法還進(jìn)一 步包括步驟5)對(duì)在步驟2)中輸入的前基因 A和后基因 B的染色體定位信息進(jìn)行調(diào)整，重 復(fù)步驟2)至4)，直至在步驟4)中所獲得的擴(kuò)增子長度范圍在125-175bp內(nèi)。
[0017] 具體來說，步驟5)的染色體定位信息調(diào)整包括：若所得擴(kuò)增子長度大于175bp，則 將前基因 A的輸入定位信息右移或?qū)⒑蠡?B的輸入定位信息左移以縮短擴(kuò)增子長度，若 所得擴(kuò)增子長度小于125bp，則將前基因 A的輸入定位信息左移或?qū)⒑蠡?B的輸入定位信 息右移以增加擴(kuò)增子長度。進(jìn)一步，每次調(diào)整的量為50bp或50bp以上。
[0018] 通過采用本發(fā)明的方法，可以利用Ion Ampliseq? Designer工具進(jìn)行融合基因擴(kuò) 增子檢測引物的設(shè)計(jì)，從而為利用擴(kuò)增子測序方法檢測融合基因掃清了障礙。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 本發(fā)明的目的是提供一種利用Ion Ampliseq? Designer工具來設(shè)計(jì)可以用于融 合基因擴(kuò)增子檢測的引物的方法，從而使得我們可以利用擴(kuò)增子測序方法來對(duì)融合基因進(jìn) 行檢測，突破現(xiàn)有融合基因檢測的缺陷。
[0020] 下面將結(jié)合具體實(shí)例來詳細(xì)說明本發(fā)明的原理及步驟。
[0021] 根據(jù)發(fā)生融合的兩個(gè)基因在染色體上的定位情況可將融合基因分為四類：正 鏈-正鏈、負(fù)鏈-負(fù)鏈、正鏈-負(fù)鏈、負(fù)鏈-正鏈，融合基因的引物設(shè)計(jì)也是在Ion Ampliseq? Designer中進(jìn)行，原理及步驟如下： 確定融合基因序列信息 即確定發(fā)生融合的前基因 A序列和后基因 B序列以及融合位點(diǎn)，找到基因 A和基因 B 發(fā)生融合的外顯子區(qū)序列，及各自對(duì)應(yīng)的染色體起點(diǎn)和終點(diǎn)位置。
[0022] 擴(kuò)增子引物設(shè)計(jì) 在Ion Ampliseq? Designer中分別設(shè)計(jì)出前基因 A和后基因 B發(fā)生融合的外顯子區(qū) 的擴(kuò)增子引物(操作方法如上文現(xiàn)有技術(shù)部分所述)。
[0023] 選擇正反向引物 根據(jù)基因 A、基因 B在染色體中定位的正反鏈信息，確定基因 A、基因 B分別應(yīng)該選擇正 向引物還是反向