一種花生種子中優(yōu)勢表達(dá)啟動子的克隆和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，特別是植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及了一個(gè)新的 可在花生種子中優(yōu)勢表達(dá)啟動子的克隆和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 種子在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和國民經(jīng)濟(jì)中占有舉足輕重的地位。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，人類糧食的 80%直接取自植物的種子，稻、麥等種子中富含淀粉，是人類賴以生存的主糧；大豆、花生、 油菜、芝麻等種子的含油量高，是食用油的主要來源。種子中儲存物質(zhì)的多少和組成成份， 直接影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，提高糧食作物和油料作物產(chǎn)量、改善作物品質(zhì)的根本在 于提高和改善其種子中儲藏物質(zhì)的積累量和組成。盡管常規(guī)育種技術(shù)所培育的優(yōu)良作物品 種，為解決世界糧食安全問題、改善人民生活做出了重大貢獻(xiàn)。然而，常規(guī)育種技術(shù)在繼續(xù) 提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)方面的潛力有限。因此，挖掘新的功能基因，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高花生 等作物產(chǎn)量及種子的含油量具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。
[0003] 花生作為重要的油料作物，不僅在國內(nèi)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中具有重要地位，而且在世界貿(mào) 易中也具有舉足輕重的作用。研宄表明，不同植物種子儲藏油脂的含量存在很大差異如主 要油料作物油菜為28% -48%、大豆15% -22%、花生44% -54%、芝麻45% -57%，并且 其主要脂肪酸組成也不同，油菜油中含有大量的芥酸（31-55% )，其他含量較高的不飽和 脂肪酸為油酸14-19%、亞油酸12-24%和亞麻酸1-10% ;大豆油中含量最高的為亞油酸 52-65%和油酸25-36%，并且棕櫚酸（6-8% )、硬脂酸（3-5% )和亞麻酸（2-3% )也占 有較大比例；花生種子脂肪酸組成主要是：棕櫚酸、油酸和亞油酸，分別占總脂肪酸含量的 10%、36-67%和15-43%，是除橄欖油外單不飽和脂肪酸油酸含量最高的。研宄花生種子發(fā) 育和儲藏物質(zhì)積累相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控，闡明相關(guān)基因的功能，對于通過基因工程改良其 他作物具有一定指導(dǎo)意義。
[0004] 啟動子是位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板 DNA準(zhǔn)確的結(jié)合并起始基因特異性地轉(zhuǎn)錄。啟動子決定著基因轉(zhuǎn)錄的方向、效率和時(shí)空特 性，是理解基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵。按作用方式和功能，可將啟動子分為組成型 啟動子、組織特異型啟動子和誘導(dǎo)型啟動子。目前在植物基因工程研宄中，組成型啟動子的 應(yīng)用最為廣泛，如花椰菜花葉病毒的CaMV35S啟動子、玉米的Ubiquitin啟動子和水稻的 Actinl啟動子等。這些啟動子能夠驅(qū)動外源基因在植物的所有組織和器官中高效表達(dá)。然 而，許多具有時(shí)空表達(dá)特異性基因的過量表達(dá)往往造成能量浪費(fèi)，有些外源基因的組成性 高表達(dá)還影響了植物的正常發(fā)育。為在確保植物正常生長的情況下，對目標(biāo)性狀進(jìn)行更為 有效的定點(diǎn)、定時(shí)遺傳改良，在植物基因功能鑒定研宄和基因工程遺傳改良實(shí)踐中更加傾 向于使用組織特異性或誘導(dǎo)型啟動子。
[0005] 近年來，國內(nèi)外多個(gè)實(shí)驗(yàn)室開展了花生種子發(fā)育和籽粒儲藏物質(zhì)積累相關(guān)基因啟 動子的克隆與研宄，旨在充分了解基因的表達(dá)調(diào)控特征，為作物遺傳改良提供依據(jù)?；ㄉ?籽粒中多個(gè)主要儲藏蛋白一過敏原Arahl、2、3和6基因的啟動子已被克隆和鑒定（Viquez 等，2003 ;2004 ;Zhong 等，2006 ;Bhattacharya 等，2012)，花生 Arah2 啟動子驅(qū)動 GUS 在種 胚中特異表達(dá)，且強(qiáng)度高于35S啟動子，而在種皮中基本無表達(dá)；花生Arah 6啟動子驅(qū)動 ⑶S在子葉中表達(dá)，而在真葉中表達(dá)較弱?；ㄉ腕w蛋白基因 Ah01eol7.8、Ah01eol8. 5啟動 子（Li et al.，2009)和脂肪酸合成與油脂積累相關(guān)的基因如AhDGAT3(唐桂英等，2013)、 AhACP (單雷等，2014)啟動子，也相繼獲得克隆與分析。調(diào)控種子發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基 因 AhLEClA的啟動子分析發(fā)現(xiàn)，其驅(qū)動的GUS基因在早期發(fā)育的種胚中特異表達(dá)，并且其特 異性表達(dá)受多個(gè)種子特異性調(diào)控元件和抑制其在營養(yǎng)組織中表達(dá)的負(fù)調(diào)控元件共同調(diào)節(jié) (唐桂英等，2013)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 基于上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過深入研宄，從花生中克隆獲得了一個(gè)新 的1289bp花生AhLEClB基因的啟動子，該啟動子包括Y端非翻譯區(qū)^ UTR)54bp和其 上游1235bp啟動子區(qū)，其核苷酸序列如Seq ID N〇:l所示；同時(shí)本發(fā)明為了進(jìn)一步驗(yàn)證其 功能，還構(gòu)建了 1281bp啟動子（包括52bp 5' UTR和1229bp啟動子區(qū)，其基因序列如Seq IDNo:2所示）以及：y端缺失351bp(缺失部分包括52bp5 ,UTR和 299bp啟動子區(qū)）的 930bp(其基因序列如Seq ID No:3所示）的啟動子驅(qū)動的⑶S報(bào)告基因植物表達(dá)載體，并 轉(zhuǎn)化擬南芥。實(shí)驗(yàn)表明，該1281bp啟動子驅(qū)動的GUS基因主要在轉(zhuǎn)基因植株的種子中高效 表達(dá)，在根、莖、葉、花中有極低水平的表達(dá)；而：V端缺失351bp的930bp啟動子僅驅(qū)動⑶S 基因在幼嫩的莖中表達(dá)，因此利用1281bp和1289bp的啟動子在種胚中高效表達(dá)的特性，可 以應(yīng)用在提高種子儲藏物質(zhì)含量中；構(gòu)建該啟動子和相關(guān)基因的表達(dá)載體，調(diào)控淀粉、油脂 或蛋白合成相關(guān)基因的表達(dá)，可能會影響花生及其它作物的產(chǎn)量。因此，該啟動子的克隆對 植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域啟動子的研宄也具有重要意義。
[0007] 該啟動子是在已得到的花生AhLEClB基因的基因組序列（該基因其核苷酸序列如 Seq ID No:4所示）的基礎(chǔ)上，通過染色體步移技術(shù)得到的1289bp AhLEClB基因 Y端上 游序列，其核苷酸序列如Seq ID No: 1所示。經(jīng)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，AhLEClB基因轉(zhuǎn)錄 起始位點(diǎn)位于翻譯起始密碼ATG上游-83nt處，通過PlantCARE和PLACE軟件對該啟動子 進(jìn)行順式調(diào)控元件分析，該序列除包含啟動子中心元件TATA BOX，還包含光響應(yīng)調(diào)控元件 GATA BOX(GATA)、GT1C0NSENSUS(GRWAAW)、S0RLIP1AT(GCCAC)以及蓮座葉和根中高表達(dá)調(diào) 控元件RAVlA AT(CAACA)等；包含許多種子儲藏蛋白和胚胎發(fā)育相關(guān)基因啟動子中均含有 的 E BOX (CANNTG)、CARGCW8GAT (CffffffffffffffffG)以及胚表達(dá)調(diào)控元件 DPBF CORE (ACACNNG)、 SEF4M0TIF(RTTTTTR)等；包含細(xì)胞分裂素、赤霉素、乙烯等植物激素響應(yīng)調(diào)控元件CPB Sequence (TATTAG)、CARE element (CAACTC)、ERE Motif(AWTTCAAA)等；另外，還含有一些 負(fù)調(diào)控基因表達(dá)的元件 WRKY710S (TGAC)、SREATMSD (TTATCC)、HDZIP2ATATHB2 (TAATMATTA) 等。
[0008] 與已知的AhLEClA相比，本發(fā)明所針對的AhLEClB有著顯著的不同之處，它們核 苷酸序列存在28個(gè)堿基的差異，編碼蛋白有11個(gè)不同的氨基酸，氨基酸相似性達(dá)95%。 AhLEClA 和 AhLEClB 基因組 DNA 長度分別為 2279bp 和 2166bp。AhLEClA 和 AhLEClB 在根、 莖、葉、花和未成熟種子及種子發(fā)育過程中的表達(dá)特征均不同。而根據(jù)其獲得的相應(yīng)啟動子 也有著明顯的不同之處。
[0009] 為了完成該啟動子的初步功能分析，本發(fā)明以pCAMBIA3301為出發(fā)載體，分別以 Fl為正向引物、Rl和R2為反向引物，擴(kuò)增相應(yīng)的啟動子片段，構(gòu)建了含有AhLEClB基因 1281bp啟動子片段和Y端缺失351bp (包括Y UTR和300bp啟動子區(qū)）的930bp啟動子 片段的⑶S基因植物表達(dá)載體，即用不同啟動子片段取代pCAMBIA3301中驅(qū)動⑶S基因表 達(dá)的35S啟動子，獲得的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后，用花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，即待擬南 芥繁殖開花時(shí)，配制浸染液，用農(nóng)桿菌浸染將要開放的花序。
[0010] 本發(fā)明分別取轉(zhuǎn)基因擬南芥的根、莖、葉、花和種胚，通過現(xiàn)有的方法檢測GUS基 因的表達(dá)情況。本發(fā)明所提供的1281bp啟動子區(qū)域中，包括5'端非翻譯區(qū)52bp和其上 游啟動子1229bp區(qū)段，其基因序列如Seq ID N〇:2所示，即可驅(qū)動⑶S基因在種胚中高 效表達(dá)，而在植物根、莖、葉、花器官中表達(dá)量極低；而缺失了:V端351bp的930bp啟動子 區(qū)段由于缺失了核心區(qū)域的TATA BOX及其他重要的誘導(dǎo)型調(diào)控元件，故驅(qū)動功能基本喪 失。由此可見本發(fā)明克隆的花生AhLEClB基因的包括Y端非翻譯區(qū)52bp和其上游啟動子 1229bp區(qū)段具有在種子中高效表達(dá)的特性。
[0011] 通過上述實(shí)驗(yàn)，發(fā)明人證實(shí)了，在本發(fā)明提供的1281bp 5'端上游調(diào)控區(qū)包括非 翻譯區(qū)52bp和其上游啟動子1229bp區(qū)段，其基因序列Seq ID No: 2所示；以及包括Y端 非翻譯區(qū)C UTR)54bp和其上游1235bp啟動子區(qū)，其核苷酸序列如Seq ID No:l所示的 1289bp花生AhLEClB基因的啟動子，兩者具有在種胚中高效表達(dá)的特性。同時(shí)這種在種胚 中尚效表達(dá)的特性，可以應(yīng)用在提尚種子儲減物質(zhì)含量中；構(gòu)建該啟動子和相關(guān)基因的表 達(dá)載體，調(diào)控淀粉、油脂或蛋白合成相關(guān)基因的表達(dá)，可能會影響花生及其它作物的產(chǎn)量。 因此，該啟動子的克隆對植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域啟動子的研宄也具有重要意義。
【附圖說明】
[0012] 圖1為擴(kuò)增獲得的花生AhLEClB基因1289bp