玉米胚乳特異表達啟動子14kD zein啟動子及其克隆方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及玉米胚乳特異表達啟動子14kD?zein啟動子及其克隆方法。該啟動子序列為下列之一：i）SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；ii）SEQIDNO.1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個或幾個核苷酸且具有同等功能的由i）衍生的核苷酸序列。本發(fā)明從克隆玉米胚乳特異表達啟動子14kD?zein啟動子入手，通過對14kD?zein啟動子的功能分析，從實驗水平驗證了該啟動子適用于啟動目標基因在玉米胚乳中特異性表達，而在其他組織中低表達或不表達。為植物基因工程表達載體構(gòu)建提供了合適的調(diào)控元件，為實驗室其他課題的研究進行提供了新的材料。
【專利說明】玉米胚乳特異表達啟動子14kD zein啟動子及其克隆方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種玉米胚乳特異表達啟動子14kD zein啟動子及其克隆方法。
技術(shù)背景
[0002]玉米(Zea mays L.)，又名玉蜀黍，是重要的糧食作物、優(yōu)良的飼料和工業(yè)原料。因此，大量研究致力于將外源基因轉(zhuǎn)入玉米以培育出滿足人們需求的新品種?，F(xiàn)今的轉(zhuǎn)基因技術(shù)通常采用組成型強啟動子使驅(qū)動外源基因高效表達。其缺點在于組成型啟動子使外源基因在植株中全方位表達，造成不必要的能源浪費。其次，組成型啟動子常引起基因多效性，以及引起食品安全性問題。
[0003]將外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中定位表達不僅可以降低植株負擔、減輕對作物農(nóng)藝性狀的影響，還可以提高外源基因在特定部位的表達量，同時盡可能地避免食品安全性問題。組織特異性啟動子在植物發(fā)育過程中能夠在時間和空間上有效地調(diào)控目的基因的特異性表達，使目的基因表達產(chǎn)物在特定的空間區(qū)域積累，進而按照人們的意愿改進代謝途徑、提高組織中營養(yǎng)物質(zhì)含量、調(diào)控轉(zhuǎn)基因植物繼代繁殖、利用種子便利地獲得工業(yè)新產(chǎn)品和醫(yī)藥新化合物等。因此，良好的組織特異性啟動子已成為轉(zhuǎn)基因研究中最具有發(fā)展前景的外源基因啟動元件。
[0004]當前的植物基因工程中還常使用一些來自于病毒、細菌等的調(diào)控元件，也有引起生物安全性問題的隱患。因此，克隆來源于植物自身的具有組織特異性的啟動子不僅為研究植物生長發(fā)育的調(diào)控機理提供了材料，為植物基因工程研究提供了更多調(diào)控元件的選擇，同時還在某種程度上 避免了生物安全性問題。本試驗中研究的啟動子都是來自植物自身的具有組織特異性的啟動子。
[0005]玉米胚乳中的蛋白質(zhì)成分根據(jù)能否溶解于70%乙醇溶液可分為兩種類型，醇溶蛋白和非醇溶蛋白。19kD、22kD zein是由zei/72基因家族編碼的,而14kD zein是由
基因家族中的及i基因編碼的。1990年Manuel Reina等人從玉米W64A基因組中克隆到β -zein中的14kD zein基因，序列比對發(fā)現(xiàn)與NCBI中的序列有98%的相似度。14kD zein基因編碼醇溶蛋白，在胚乳中特異表達。
[0006]目前對于組織特異性啟動子的應用主要有以下方面:①改良農(nóng)作物品質(zhì)，提高作物的抗凍、抗旱、抗鹽能力，防止水果腐爛改良花卉品質(zhì)、控制觀賞花卉的顏色提高植物的抗病性、抗蟲性和抗除草劑能力；④開發(fā)生物反應器用于生物制藥創(chuàng)建雄性不育系和恢復系；⑥用于植物的分化發(fā)育研究等。
[0007]谷類、油類作物的種子是植物基因工程改良的重要材料。因此，種子特異性啟動子的研究對植物基因工程的發(fā)展和人們生產(chǎn)生活水平的提高具有十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的之一在于提供玉米胚乳中特異表達啟動子14kD zein的啟動子序列。[0009]本發(fā)明的目的之二在于提供該啟動子序列的克隆方法。
[0010]為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的采用如下技術(shù)方案:
一種玉米胚乳特異表達啟動子14kD zein的啟動子序列,其特征在于該啟動子序列為下列之一:
i)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；
ii)SEQID N0.1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個或幾個核苷酸且具有同等功能的由i)衍生的核苷酸序列。
[0011]—種載體,其特征在于該載體含有上述的啟玉米胚乳特異表達啟動子14kD zein的啟動子序列。
[0012]一種轉(zhuǎn)基因細胞系，其特征在于該轉(zhuǎn)基因細胞系含有上述的啟動子序列。[0013]—種克隆上述的玉米胚乳特異表達啟動子14kD zein的啟動子序列的方法,其特征在于該方法的具體步驟為:在NCBI數(shù)據(jù)庫中找到玉米胚乳特異表達基因14kD zein的ATG上游序列，截取2031bp的堿基序列，設(shè)計引物，以B73基因組為模板，通過PCR擴增技術(shù)獲得2031bp目的片段后通過TA克隆連接載體；所述的引物序列為:
正向引物從Y端至3'端為:CCCTCAGAACCATACCTT ;
反向引物從5'端至3'端為:GGTGTCGAGTTCTCCAATC。
[0014]本發(fā)明首次提出一個新的能夠在玉米胚乳中特異表達的14kD zein啟動子,該啟動子適用于啟動目標基因(如GUS基因或GFP基因)在玉米胚乳中的特異性表達。該啟動子的特異性很強，因此為植物基因工程表達載體的構(gòu)建提供了合適的調(diào)控元件，也為實驗室其他課題的研究進行提供了新的材料。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1 PCR獲得玉米胚乳特異表達基因14kD zein的ATG上游2031bp片段電泳圖 圖 2 PCR 獲得 1043bp、588bp、443bp、302bp、202bp、104bp 的序列片段
圖3 pBI121載體圖譜 圖4 pUC18載體圖譜
圖5 B73玉米授粉后14天的籽?；驑屴Z擊GUS染色結(jié)果
A:35S (正對照)B:B73 負對照 C:14kDzein_2031bp 片段 D:14kDzein-1043bp 片段 E:14kDzein_588bp 片段 F:14kDzein_443bp 片段 G: 14kDzein_302bp 片段 圖中的標尺長度代表1_
圖6 PBPA玉米幼胚轉(zhuǎn)化流程圖
A:取胚侵染B:共培養(yǎng)C:恢復培養(yǎng)D: 一輪篩選E:三輪篩選F:抗性愈傷 G:暗再生 H:光再生 1:陽性苗入土 圖7 PCR檢測結(jié)果電泳圖
A: (bar) 14—1—1，2，3, 4, 5; 14—2—2，3; 14—4—1，2; 14-5-2; 14—6—5，6, 7, 8; 14—8—1，2，3，4，5;14-A-12;14-B-27, 28;14-C-1, 2
B: (GUS) 14-1-1，2，3, 4, 5; 14—2—2，3; 14—4—1，2; 14-5-2; 14—6—5，6, 7, 8; 14—8—1，2，3，4，5;14-A-12;14-B-27, 28;14-C-1, 2
圖8部分事件bar探針Southern雜交檢測圖1-5:14kD 5個轉(zhuǎn)基因事件6 =PBPA負對照 圖9植株的葉、根、種皮、胚、胚乳組織的GUS染色結(jié)果圖 35S-GUS 的
A:葉B:根C:種皮D:胚E:胚乳 HkD-GUS 的
Al:葉 B1-M Cl:種皮 Dl -M El:胚乳 圖中的標尺長度代表1_。
【具體實施方式】
[0016]下面結(jié)合具體實施事例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如分子克隆(Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd ed.)或植物分子生物學一實驗手冊(Plant Molecular Biology — A Laboratory Manual, Melody S.Clark編’ Springer-verlag Berlin Heidelberg, 1997)中所述條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0017]實施例一:獲得啟動子片段
在NCBI數(shù)據(jù)庫中找到玉米胚乳特異表達基因14kD zein的ATG上游序列，截取2031bp的堿基序列，具體序列詳見SEQ ID N0.1，設(shè)計引物，以B73基因組為模板，通過PCR擴增技術(shù)獲得片段，參見圖1。擴增片段的引物序列:
正向引物從Y端至3 '端為:CCCTCAGAACCATACCTT ;
反向引物從5'端至3'端為:GGTGTCGAGTTCTCCAATC ;
結(jié)果:獲得2031bp目的片段后通過TA克隆連接載體，測序比對，與數(shù)據(jù)庫中提供的序
列一致。
[0018]實施例二:啟動子截短片段的獲得
根據(jù)預測啟動子元件的網(wǎng)站(http://www.softberry.com)的預測結(jié)果，分別截取1043bp、588bp、443bp、302bp、202bp、104bp大小的堿基序列，PCR獲得片段，見圖2。擴增片段的引物序列:
1043bp:
正向引物從5'端至3'端為:TCGAGAAATGACGTGGCA ;
反向引物從5'端至3'端為:GGTGTCGAGTTCTCCAATC ;
588bp:
正向引物從5'端至3'端為:ATTCACGGGTAATCTCAG ;
反向引物從5'端至3'端為:GGTGTCGAGTTCTCCAATC ;
443bp:
正向引物從Y端至3'端為:TTAATTGGGTGAGAAACA ;
反向引物從5'端至3'端為:GGTGTCGAGTTCTCCAATC ;
302bp:
正向引物從Y端至3'端為:TAGTTTCGTGAAAAGCAA ;
反向引物從5'端至3'端為:GGTGTCGAGTTCTCCAATC ;202bp:
正向引物從5'端至3'端為:CCAAAAGTGAATGAGATG ;
反向引物從5'端至3'端為:GGTGTCGAGTTCTCCAATC ;
104bp:
正向引物從5'端至3'端為:AAAGCTATAAATAACCGTC ;
反向引物從5'端至3'端為:GGTGTCGAGTTCTCCAATC ;
結(jié)果:分別回收不同大小的目的片段后通過TA克隆連接載體，測序比對，與提供的序
列一致。
[0019]實施例三:截短 片段與⑶S基因連接，打基因槍，驗證啟動子核心元件
用Sma I +EcoR I酶點將gusA_N0S片段從pBI121載體(圖譜見圖3)上酶切連接到PUC18載體(圖譜見圖4)中，構(gòu)建pUC18-Gus-n0s載體。將克隆到的不同長度的片段回收連接測序驗證正確后，用酶切,連入pUC18-Gus_nos,構(gòu)建pUC18_14kD zein-GUS載體。將構(gòu)好的載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌T0P10中，抽提質(zhì)粒后打基因槍。
[0020]選取B73玉米授粉后14天的籽粒為受體材料，用70%酒精消毒剝?nèi)シN皮，放到滲透培養(yǎng)基上培養(yǎng)6小時后進行基因槍的瞬時轉(zhuǎn)化。基因槍的轟擊參數(shù):壓力650，距離3cm，兩槍。轟擊之后25°C暗培養(yǎng)48小時，⑶S染色(圖5)。
[0021]結(jié)果:14kDzein-2031bp、1043bp片段、588bp 片段、443bp 片段、302bp 片段均有GUS表達，說明截短到302bp片段時啟動子仍有功能。
[0022]實施例四:根據(jù)截短片段的功能驗證結(jié)果，選取1043bp片段構(gòu)建表達載體，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米幼胚
選取PTF102載體作為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米幼胚的載體。先用Fsi I酶切PTF102載體去除35S-GUS片段，載體自連。將pUC18-14kD zein-GUS載體中的1043bp啟動子片段連接⑶S的區(qū)段用油I酶切后，連入自連后的pTF102載體，構(gòu)建pTF102-14kDzein-GUS載體，電擊轉(zhuǎn)化EHAlOl菌株。
[0023]選取PBPA玉米品系授粉8-12天的幼胚，大小約1.5mm左右作為受體材料，進行幼胚轉(zhuǎn)化，具體流程(圖6):農(nóng)桿菌侵染IOmin-共培養(yǎng)20°C 3天-恢復培養(yǎng)28°C 7天-篩選培養(yǎng)(雙丙氨磷1.5mg/l)28°C 14天-篩選培養(yǎng)(雙丙氨磷3mg/l)28°C 14天3-5輪-獲得抗性愈傷組織-暗再生培養(yǎng)280C 14-21天-光再生培養(yǎng)28 V 14_21天-獲得陽性苗-移入盆中-PCR檢測(圖7) -Southern檢測(圖8)-授粉獲得后代。
[0024]結(jié)果:選取約2000個幼胚作為受體材料，經(jīng)過轉(zhuǎn)化篩選后獲得10個抗性愈傷，經(jīng)過再生后獲得轉(zhuǎn)基因植株，并收獲后代。同時選取部分事件的葉子抽提基因組，通過PCR檢測及Southern雜交驗證轉(zhuǎn)基因結(jié)果。
[0025]實施例五:GUS染色
選取35S-GUS作為正對照，對轉(zhuǎn)基因植株的葉、根、種皮、胚、胚乳分別進行GUS染色，驗證啟動子的特異性(圖9)。
[0026]結(jié)果:35S_GUS在玉米植株的葉、根、胚、胚乳均有⑶S基因表達，而14kD_GUS在玉米植株的葉、根、種皮組織均沒有⑶S基因表達，胚組織有少量的表達，只有胚乳組織中⑶S基因高效表達，證明14kD啟動子的特異性很好。
【權(quán)利要求】
1.一種玉米胚乳特異表達啟動子14kD zein的啟動子序列,其特征在于該啟動子序列為下列之一: i)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列； ii)SEQID N0.1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個或幾個核苷酸且具有同等功能的由i)衍生的核苷酸序列。
2.一種載體，其特征在于該載體含有根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟玉米胚乳特異表達啟動子14kD zein的啟動子序列。
3.—種轉(zhuǎn)基因細胞系，其特征在于該轉(zhuǎn)基因細胞系含有根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動子序列。
4.一種克隆根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米胚乳特異表達啟動子14kD zein的啟動子序列的方法，其特征在于該方法的具體步驟為:在NCBI數(shù)據(jù)庫中找到玉米胚乳特異表達基因14kD zein的ATG上游序列，截取2031bp的堿基序列，設(shè)計引物，以B73基因組為模板，通過PCR擴增技術(shù)獲得2031bp目的片段后通過TA克隆連接載體；所述的引物序列為: 正向引物從Y端至3'端為:CCCTCAGAACCATACCTT ; 反向引物從5'端至3'端為:GGTGTCGAGTTCTCCAATC。
【文檔編號】C12N15/63GK103952408SQ201410147180
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月14日
【發(fā)明者】宋任濤, 邢瑩瑩, 王明民, 張舉善, 馬東東, 王珊珊, 祁巍巍, 梅冰, 唐遠平 申請人:上海大學