一種l-色氨酸的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及L-色氨酸的制備方法，尤其是快速制備L-色氨酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]L-色氨酸即β -吲哚基丙氨酸，為白色或微黃色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，是八種必須氨基酸之一，人和動物只能從食物中攝取。L-色氨酸作為一種必須氨基酸，除在營養(yǎng)代謝中起重要作用外，目前被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品及飼料等領(lǐng)域。
[0003]色氨酸的生產(chǎn)方法主要包括如下幾種:蛋白質(zhì)水解法，以毛發(fā)、血粉等為材料通過水解的方式獲得包括色氨酸在內(nèi)的多種氨基酸，但蛋白質(zhì)水解法對環(huán)境污染大?；瘜W(xué)合成法，即以化學(xué)合成的手段合成色氨酸，但合成步驟多，收率低且產(chǎn)物為混旋的色氨酸，需要進(jìn)一步的酶法拆分才能得到L-色氨酸。微生物前體轉(zhuǎn)化法是以葡萄糖等作為碳源培養(yǎng)微生物，同時(shí)在培養(yǎng)過程中向培養(yǎng)基中添加各種前體物質(zhì)，利用微生物體內(nèi)的色氨酸合成酶系轉(zhuǎn)化這些前體物合成L-色氨酸。由于色氨酸合成酶體系容易受到來自底物和產(chǎn)物的抑制作用，所以該方法需解除底物、產(chǎn)物對色氨酸合成途徑中相關(guān)酶的反饋抑制才能得到高濃度的色氨酸。發(fā)酵法生產(chǎn)L-色氨酸，以廉價(jià)的葡萄糖、蜜餞等物質(zhì)為原料，通過微生物菌種發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸。目前報(bào)道的發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸在發(fā)酵液中產(chǎn)物積累不高，一般色氨酸含量低于50g/L，后續(xù)的產(chǎn)物分離困難較大。酶促轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-色氨酸，即利用基因工程菌中L-色氨酸生物合成酶系的催化功能將吲哚、L-絲氨酸等酶促轉(zhuǎn)化為L-色氨酸。該方法最大優(yōu)點(diǎn)為酶促反應(yīng)體系中色氨酸積累濃度高，高達(dá)100-120g/L，因此為目前工業(yè)上生產(chǎn)色氨酸的主要方法。
[0004]酶促轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-色氨酸后的產(chǎn)物分離與純化一直是人們比較關(guān)注的問題。楊文革等在《酶法合成中色氨酸的分離》、武彩蓮等在《發(fā)酵液中L-色氨酸分離純化工藝研宄》、司晶星在《色氨酸工廠發(fā)酵與分離工藝過程控制》、韋平和等在《膜技術(shù)在酶法生產(chǎn)L-色氨酸中去除蛋白質(zhì)和色素的應(yīng)用研宄》等文獻(xiàn)資料中報(bào)道了色氨酸的分離與純化。綜合目前有關(guān)酶促轉(zhuǎn)化制備色氨酸報(bào)道，其工藝流程大致如下圖1所示，其產(chǎn)物分離與純化過程中有關(guān)菌體的分離發(fā)生在酶促轉(zhuǎn)化之后與離子柱分離之前的工藝段。雖然有關(guān)研宄利用膜分離酶促反應(yīng)液中菌體在實(shí)驗(yàn)室階段取得了較好的效果，但是在氨基酸工業(yè)化生產(chǎn)中還有一定的距離，而且由于酶促轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-色氨酸之后的混合液體積大、粘度高給后續(xù)的膜分離帶來了很大的困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的問題是提供一種L-色氨酸的制備方法。
[0006]本發(fā)明一種L-色氨酸的制備方法，其特征在于包含有以下步驟:a.細(xì)胞破碎工藝段:將發(fā)酵所得菌28-35kg重懸于去離子水中，總體積為400L，向其中加入CTAB破細(xì)胞，CTAB加入量為總體積濃度0.05-0.2% ；b.分離細(xì)胞碎片并對分離液濃縮工藝段:向破細(xì)胞后混合液體積中加入1000-1500L去離子水，并向其中加入分離輔助物后進(jìn)行分離，真空抽濾，得到分離液1200-1700L ;將分離液在35-40°C真空濃縮至體積為400L ；c.酶促轉(zhuǎn)化工藝段:將上述破細(xì)胞混合物泵入轉(zhuǎn)化罐中，加入去離子水至總體積為600L，轉(zhuǎn)化罐中含絲氨酸 0.5-lmol/L，吲哚 0.5-lmol/L，PLP 0.2-0.4mmol/L，pH 值為 6.0-9.0，攪拌100-150rpm，溫度35-40°C，時(shí)間為35_50h，達(dá)到酶促反應(yīng)平衡；d.柱分離工藝段:向酶促反應(yīng)平衡液中加入去離子水1000-1200L并上活化后的001X7型陽離子柱，上樣完畢后用2mol/L的氨水洗脫，得到含L-色氨酸分離液500-1200L ；e.結(jié)晶工藝段:將含L-色氨酸的洗脫液在50-60°C減壓濃縮結(jié)晶得到L-色氨酸。
[0007]本發(fā)明公開了 L-色氨酸的制備方法，其特征在于所述的步驟b.分離細(xì)胞碎片并對分離液濃縮工藝段中，所述的分離輔助物為:聚丙烯酰胺、聚合氯化鋁、廢舊717陰離子樹脂其中的一種物質(zhì)或任意兩種混合物或三種物質(zhì)混合物。
[0008]本發(fā)明公開了一種L-色氨酸的制備方法，其特征在于所述的步驟b.分離細(xì)胞碎片并對分離液濃縮工藝段中，所述的分離輔助物為:聚丙烯酰胺和廢舊717陰離子樹脂的混合物。
[0009]本發(fā)明公開了一種L-色氨酸的制備方法，其特征在于所述的步驟b.分離細(xì)胞碎片并對分離液濃縮工藝段中，所述的分離輔助物為聚丙烯酰胺和廢舊717陰離子樹脂的混合物的用量為:按反應(yīng)總體積加入0.01-2ppm的聚丙烯酰胺與2% -5%的廢舊717陰離子樹脂。
[0010]本發(fā)明公開了一種L-色氨酸的制備方法，其特征在于所述的步驟b.分離細(xì)胞碎片并對分離液濃縮工藝段中，所述的分離輔助物為:聚合氯化鋁和廢舊717陰離子樹脂的混合物。
[0011]本發(fā)明公開了一種L-色氨酸的制備方法，其特征在于所述的步驟b.分離細(xì)胞碎片并對分離液濃縮工藝段中，所述的分離輔助物為聚合氯化鋁和廢舊717陰離子樹脂的混合物的用量為:按反應(yīng)總體積加入0.01-2ppm的聚合氯化鋁與2% -5%的廢舊717陰離子樹脂。
[0012]本發(fā)明公開了一種L-色氨酸的制備方法，其特征在于所述的步驟b.分離細(xì)胞碎片并對分離液濃縮工藝段中，所述的分離輔助物為:廢舊717陰離子樹脂。
[0013]本發(fā)明公開了一種L-色氨酸的制備方法，其特征在于所述的步驟b.分離細(xì)胞碎片并對分離液濃縮工藝段中，所述的分離輔助物為廢舊717陰離子樹脂的用量為:按反應(yīng)總體積加入2% -5%的廢舊717陰離子樹脂。
[0014]本發(fā)明公開了一種L-色氨酸的制備方法，其特征在于所述的步驟b.分離細(xì)胞碎片并對分離液濃縮工藝段中，所述的分離輔助物為廢舊717陰離子樹脂的用量為:按反應(yīng)總體積加入5% -10%的廢舊717陰離子樹脂。
[0015]目前L-色氨酸的制備方法工藝為:
[0016]細(xì)胞破碎工藝段:將發(fā)酵所得菌28_35kg重懸于去離子水中，總體積為400L，向其中加入CTAB至終濃度為0.05-0.2%破細(xì)胞。
[0017]酶促轉(zhuǎn)化工藝段:將上述破細(xì)胞混合物泵入轉(zhuǎn)化罐中，600L的體系中含絲氨酸0.5-lmol/L,吲哚 0.5-lmol/L, PLP 0.2-0.4mmol/L，pH:6.0-9.0，攪拌 100_150rpm，溫度35-40 °C，達(dá)到酶促反應(yīng)平衡。
[0018]離心分離酶促反應(yīng)混合液中細(xì)胞碎片工藝段:向酶促轉(zhuǎn)化平衡后的混合液加2000-2500L去離子水并用離心機(jī)分離，轉(zhuǎn)速8000rpm。
[0019]柱分離工藝段:離心液調(diào)上活化后的001 X 7陽離子柱，上樣完畢后用2mol/L的氨水洗脫，得到含L-色氨酸洗脫液2500-3000L。
[0020]結(jié)晶工藝段:將含L-色氨酸的洗脫液在50_60°C減壓濃縮結(jié)晶，得到色氨酸。
[0021]本發(fā)明一種L-色氨酸的制備方法為:
[0022]細(xì)胞破碎工藝段:與以前工藝一致。
[0023]分離細(xì)胞碎片并對分離液濃縮工藝段:此工藝段為新增工藝段。向破細(xì)胞后混合液中(體積為400L)加入1000-1500L去離子水，并向其中加入分離輔助物后進(jìn)行真空抽濾，得到分離液1200-1700L。將分離液在35-40°C真空濃縮至體積為400L。
[0024]酶促轉(zhuǎn)化工藝段:與前面一致。
[0025]離心分離酶促反應(yīng)混合液中細(xì)胞碎片工藝段:由于在酶促反應(yīng)前已經(jīng)對細(xì)胞碎片進(jìn)行了分離，在新工藝中該工藝段已經(jīng)刪除。
[0026]柱分離工藝段:向酶促反應(yīng)平衡液中加入去離子水1000-1200L并上活化后的001X7陽離子柱，上樣完畢后用2mol/L的氨水洗脫，得到含L-色氨酸分離液500-1200L。
[0027]結(jié)晶工藝段:將含色氨酸的洗脫液在50_60°C減壓濃縮結(jié)晶得到L-色氨酸。
[0028]本發(fā)明一種L-色氨酸的制備方法中，對酶促轉(zhuǎn)化制備L-色氨酸工藝做了適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)，具體包括兩方面:一方面將附圖1中酶促反應(yīng)平衡液中的細(xì)胞碎片分離的工藝提前至破細(xì)胞之后，即在酶促轉(zhuǎn)化前先進(jìn)行細(xì)胞碎片的分離，具體見附圖2 ;另一方面，利用廢舊的717陰離子樹脂作為助濾材料，改善分離體系，有利于破細(xì)胞后的細(xì)胞碎片與粗酶液的分離。示意附圖1與附圖2中虛線框所示為新舊工藝流程的主要區(qū)別之處，其他工藝流程一致。
[0029]改進(jìn)后工藝改降低了后續(xù)L-色氨酸分離的難度和分離周期。利用新工藝生產(chǎn)L-色氨酸與傳統(tǒng)通過調(diào)節(jié)酶促反應(yīng)平衡液pH達(dá)到細(xì)胞碎片與反應(yīng)混合液自然分離工藝整個(gè)反應(yīng)時(shí)間從原來的70多小時(shí)變?yōu)?5小時(shí)，可節(jié)約時(shí)間24h左右，而且減少了由于分離細(xì)胞碎片導(dǎo)致的氨基酸的損失，產(chǎn)量從每批次的50公斤變?yōu)?7公斤，大約增加7kg，同時(shí)利用廢舊的樹脂節(jié)約了膜分離的膜成本，每年膜使用成本從30多萬元降低至15萬左右。
【附圖說明】
[0030]附圖1是酶促轉(zhuǎn)化制備L-色氨酸傳統(tǒng)工藝流程示意圖；