一種藍圓鯵抗氧化鈣離子螯合肽的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于巧離子馨合膚技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種W藍圓錢為原料制備具有抗氧 化活性的巧離子馨合膚的方法及由該方法制成的藍圓慘抗氧化巧離子馨合膚。
【背景技術(shù)】
[0002] 膚-礦物離子馨合物是一種金屬有機化合物，它是由礦物離子與膚通過馨合反應(yīng) 制備而得的，其能夠借助膚類在機體內(nèi)的吸收機制提高金屬離子的生物利用率，具備無機 態(tài)金屬離子所沒有的生理生化特性。目前，W人體必需的微量元素與膚馨合后制得的馨合 物已成為一種新型礦物離子補充劑，越來越受到人們的重視。
[0003] 同時由于特定分子量及氨基酸序列的膚類物質(zhì)還具有較好的抗氧化活性，因此 膚-礦物離子馨合物不僅具有促進礦物離子吸收的活性，還可能具備較高的抗氧化等生物 活性，具有很大的研發(fā)價值。
[0004] 近年來，W食源性蛋白為原料采用酶解法制備抗氧化膚已取得了很大的進展，獲 得了較多具有高抗氧化活性的膚段。但目前關(guān)于W藍圓錢為原料制備具有抗氧化活性的巧 離子馨合膚的方法尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽〇化]本發(fā)明的目的是為了提供一種藍圓慘抗氧化巧離子馨合膚的制備方法。
[0006] 本發(fā)明的目的還在于提供上述藍圓慘抗氧化巧離子馨合膚的制備方法制成的藍 圓慘抗氧化巧離子馨合膚。
[0007] 本發(fā)明的第一個目的是通過W下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：一種藍圓慘抗氧化巧離子馨 合膚的制備方法，包括W下步驟：
[0008] (1)限制性酶解：取藍圓慘，粉碎后加水，調(diào)節(jié)溫度為50~60°C，加入復(fù)合酶酶解， 酶解至水解度為12~20%，滅酶后離屯、，取上清液，得酶解液；
[0009] (2)超濾分離：將酶解液過截留分子量為1~IOkDa的超濾膜，取濾過液；
[0010] (3)凝膠層析柱分離：將濾過液通過葡聚糖凝膠層析柱，采用洗脫液洗脫，分段收 集洗脫液各組分，抗氧化性最好的組分即為抗氧化膚；
[0011] (4)膚與巧離子的馨合：在抗氧化膚中加入巧鹽，調(diào)節(jié)抑值為5. 0~10. 0、溫度為 35~90°C進行馨合反應(yīng)5~120min后濃縮和干燥，即得藍圓慘抗氧化巧離子馨合膚。
[0012] 在上述藍圓慘抗氧化巧離子馨合膚的制備方法中：
[0013] 步驟（1)中藍圓慘和水的質(zhì)量份配比優(yōu)選為1:1~4。
[0014] 步驟（1)中所述的復(fù)合酶優(yōu)選為木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和膜蛋白酶中的兩種或 全部，其用量優(yōu)選為藍圓慘總質(zhì)量的0.2~0.8%。
[0015] 步驟（1)中滅酶時溫度優(yōu)選為85~95°C，時間優(yōu)選為10~30min。
[0016] 步驟（1)中離屯、時離屯、機的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為4000~8000r/min，離屯、時間優(yōu)選為15~ 40min〇
[0017] 步驟（3)中所述的洗脫液為超純水，抗氧化性最好的組分即為抗氧化膚的確定方 式為：分段收集洗脫液各組分，同時檢測收集的各組分的DPPH自由基清除率和OH自由基清 除率，根據(jù)DPPH自由基清除率和OH自由基清除率檢測結(jié)果，收集DPPH自由基清除率和OH 自由基清除率最高的組分即為抗氧化性最好的組分也即是抗氧化膚。
[0018] 本發(fā)明優(yōu)選采用分光光度計比色法檢測DPPH自由基清除率和OH自由基清除率。
[0019] 步驟（4)中所述的巧鹽優(yōu)選為氯化巧或硫酸巧，其與抗氧化膚的質(zhì)量比優(yōu)選為 1:1 ~30。
[0020] 步驟（4)中所述的濃縮優(yōu)選為真空濃縮，所述的干燥優(yōu)選為冷凍干燥或噴霧干 燥。
[0021] 本發(fā)明的第二個目的是通過W下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：采用上述藍圓慘抗氧化巧離 子馨合膚的制備方法制成的藍圓慘抗氧化巧離子馨合膚。
[0022] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下優(yōu)點：
[0023] (1)本發(fā)明中的藍圓慘抗氧化巧離子馨合膚具有促進巧離子吸收的生物活性，同 時具有較好的抗氧化活性；
[0024] (2)本發(fā)明中的藍圓慘抗氧化巧離子馨合膚的制備工藝較為簡便，產(chǎn)品安全，可應(yīng) 用于實際生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0025] 圖1是本發(fā)明實施例1中根據(jù)DPPH自由基清除率和OH自由基清除率檢測結(jié)果， 收集DPPH自由基清除率和OH自由基清除率最高的組分B的過程。
【具體實施方式】
[00%] W下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。 陽〇27] 實施例1
[0028] 本實施例提供的藍圓慘抗氧化巧離子馨合膚的制備方法，包括W下步驟：
[0029] (1)W藍圓慘為原料，取肉絞碎，按照1:2的料水重量比加水，水溫調(diào)節(jié)至55。 同時加入木瓜蛋白酶與中性蛋白酶，酶的加入量為藍圓慘總質(zhì)量的0. 5%，酶解至水解度為 15%，85°C滅酶20min，再W轉(zhuǎn)速為5000r/min離屯、25min，取上清液，得酶解液；
[0030] (2)將酶解液過截留分子量為IOkDa的超濾膜，取濾過液；
[0031] (3)將濾過液通過葡聚糖凝膠層析柱，采用洗脫液洗脫，洗脫液為水，分段收集洗 脫液各組分，抗氧化性最好的組分即為抗氧化膚； 陽0巧 （4)在抗氧化膚中加入氯化觀抗氧化膚與氯化巧質(zhì)量比為30:1，抑值為6.0,溫 度為37°C，反應(yīng)時間為40min的條件下進行馨合反應(yīng)，得馨合物；
[0033] (5)真空濃縮馨合物，噴霧干燥得藍圓慘抗氧化巧離子馨合膚。 W34]其中步驟（3)中對超濾液進行凝膠層析分離，條件為：填料為葡聚糖凝膠S巧hadexG-25,流動相（洗脫液）為超純水，流速為1血/min,檢測波長為214皿或280皿， 具體過程是：分段收集洗脫液各組分，同時檢測收集的各組分的DPPH自由基清除率和OH自 由基清除率，根據(jù)DPPH自由基清除率和OH自由基清除率檢測結(jié)果，收集DPPH自由基清除 率和OH自由基清除率最高的組分即為抗氧化性最好的組分也即是抗氧化膚，如圖1、表1和 表2中所示，收集抗氧化活性最好的B組分峰（分子量在500化左右的組分）。
[0035]表1本實施例過葡聚糖凝膠Se地adexG-25后各組分的自由基清除率
[0037] 表2過葡聚糖凝膠Se地adexG-25后的各組分的分子量
[0039] 相關(guān)測定方法（下同）介紹如下：
[0040] 水解度的測定方法：水解度（％)=酶解液中游離氨基態(tài)氮含量/原料總氮含 量X100,式中：酶解液中游離氨基態(tài)氮含量采用甲醒電位滴定法測定；原料總氮含量采用 半微量凱氏定氮法測定。
[0041] 抗氧化性的測定方法： 陽0創(chuàng)DPPH自由基清除率的測定方法：取2血樣液（各洗脫組分如A、B、C和D)，加入 0. 15mMDPPH(95 %乙醇溶解），混勻后于室溫下避光反應(yīng)30min，在517皿處測得其吸光值 Ai，空白為2mL95 %乙醇溶液代替DPPH溶液，加入2mL樣液混勻，在517皿處測得其吸光值 Aj,對照組為2血DPPH溶液加入2血95%乙醇，在517皿處測得其吸光值A(chǔ)0。對樣品溶液 做梯度稀釋，測定不同濃度下的自由基清除率，經(jīng)線性回歸后計算出自由基清除率為50% 時的濃度，即ICw值。清除率按W下公式進行計算：清除率（％) = [I-(Aj-Ai)/A。]X100%， 式中：A。為對照組吸光值；Ai為樣品組吸光值;A為空白組吸光值。 陽0創(chuàng) OH自由基清除率的測定方法：取0.6血5mmol/L鄰二氮菲的無水乙醇溶液，先加 入0. 4mL0. 15mol/L的憐酸鹽緩沖液（pH7. 40)和0.6血0. 75mmol/L的