本發(fā)明涉及ctn三聚體蛋白及其制備方法和ctni檢測(cè)試劑盒，具體是涉及一種肌鈣蛋白三個(gè)亞基ctni、ctnc和ctnt融合三聚體蛋白及其基因工程表達(dá)及一種檢測(cè)這三種亞基蛋白的時(shí)間分辨熒光定量檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
：肌鈣蛋白是由t、c、i三個(gè)亞基構(gòu)成，和原肌球蛋白一起通過(guò)調(diào)節(jié)鈣離子對(duì)橫紋肌動(dòng)蛋白atp酶的活性來(lái)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白相互作用。當(dāng)心肌損傷后，心肌肌鈣蛋白復(fù)合物釋放到血液中，4～6小時(shí)后，開始在血液中升高，升高的肌鈣蛋白i能在血液中保持很長(zhǎng)時(shí)間6～10天。肌鈣蛋白在急性心肌梗死中的作用是巨大的，無(wú)論是溶栓、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(pci)、還是冠脈搭橋術(shù)(cabg)，都是風(fēng)險(xiǎn)極大的治療手段，所以“冠心病，急性心肌梗塞”診斷的正確性就顯得尤為重要。長(zhǎng)期以來(lái)臨床工作者一直致力于尋找一種高敏感性和高特異性血清診斷指標(biāo)，以期提高診斷正確性。在近幾十年中曾經(jīng)有很多血清診斷指標(biāo)在臨床中得到應(yīng)用，從天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ast)到乳酸脫氫酶(ldh)，再到肌紅蛋白、肌酸激酶(ck)、心肌肌酸激酶同工酶(ck-mb)和心肌肌酸激酶同工酶質(zhì)量(ck-mbmass)，最后到心肌肌鈣蛋白(cardiactroponin，ctn)。這一演變體現(xiàn)心肌損傷標(biāo)志物檢測(cè)的敏感度和特異度越來(lái)越高，目前高敏肌鈣蛋白(hs-ctn)可以檢出非常微小的心肌損傷。肌鈣蛋白在臨床實(shí)踐中成為目前公認(rèn)的高敏感性和高特異性指標(biāo)為所有指南所推薦?，F(xiàn)階段，臨床上ctni的檢測(cè)方法有雙抗夾心免疫化學(xué)發(fā)光法、放射性免疫法、酶聯(lián)免疫法(elisa)、免疫層析法等。雙抗夾心免疫化學(xué)發(fā)光法敏感度高、所需時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，但是不能檢測(cè)正常人血中的ctni。放射性免疫法是通過(guò)將放射活性分子共價(jià)交聯(lián)至ctni抗體免疫反應(yīng)后測(cè)定放射活性分子的放射信號(hào)來(lái)間接定量檢測(cè)ctni的一種超微量分析方法。具有特異性好、靈敏度高(可達(dá)ng和pg級(jí))、操作簡(jiǎn)便、樣品制備簡(jiǎn)單、精確定量等優(yōu)點(diǎn)，但是該方法中操作人員會(huì)接觸到放射性物質(zhì)，可能會(huì)損害操作人員的身體，而且檢測(cè)完成后怎樣處置放射性材料也是個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題。ctni的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法時(shí)雙抗夾心elisa方法，將一對(duì)ctni單抗分別進(jìn)行酶標(biāo)板固化和酶標(biāo)記，抗原抗體反應(yīng)后，通過(guò)酵素呈色反應(yīng)，即可顯示特定抗原是否存在，并可根據(jù)呈色之深淺進(jìn)行定量分析。具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、快速、樣品能量大、不但能進(jìn)行定性檢測(cè)也能定量檢測(cè)，但是耗時(shí)較長(zhǎng)。側(cè)向?qū)游龇ㄔ诩膊】焖僭\斷、小分子快速檢測(cè)等領(lǐng)域已得到了廣泛的應(yīng)用。其原理是將特異性的抗原或抗體包被到硝酸纖維素膜上，構(gòu)成檢測(cè)線，將二抗包被在距離檢測(cè)線在2～3毫米的區(qū)域構(gòu)成質(zhì)控線。當(dāng)樣本中的目標(biāo)分子與帶有特定標(biāo)記物的檢測(cè)抗體結(jié)合后，從硝酸纖維素酶的上樣端向吸水端層析。由于毛細(xì)管作用，復(fù)合物將沿著膜向前移動(dòng)，但移動(dòng)到檢測(cè)線時(shí)，樣品中的目標(biāo)分子將被檢測(cè)線中的捕獲抗體捕捉而停留在檢測(cè)線，多余的檢測(cè)抗體則通過(guò)檢測(cè)線后被質(zhì)控線的二抗所捕捉。常用的標(biāo)記物為膠體金顆粒、熒光微球等。ctni的膠體金免疫層析法通過(guò)靜電吸附將ctni抗體標(biāo)記到膠體金顆粒表面，通過(guò)觀察膠體金顆粒在檢測(cè)線上的聚集顯色判斷檢測(cè)結(jié)果。具有快速、簡(jiǎn)便、直觀等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)存在著以存在依靠肉眼識(shí)別、靈敏度低、無(wú)法精確定量、標(biāo)記通過(guò)靜電吸附，標(biāo)記產(chǎn)物不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。ctni的免疫熒光層析技術(shù)是將ctni抗體共價(jià)結(jié)合于熒光微球表面的活性基團(tuán)(-cooh、-nh2)上，通過(guò)激發(fā)后檢測(cè)線是否產(chǎn)生熒光來(lái)判斷檢測(cè)結(jié)果，延續(xù)了膠體金免疫層析方法的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)具有高敏感度、完全定量、標(biāo)記物穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。在醫(yī)學(xué)、動(dòng)植物檢疫、食品安全監(jiān)督各領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。在生物流體和血清中的許多復(fù)合物和蛋白本身就可以發(fā)熒光，因此使用傳統(tǒng)的發(fā)色團(tuán)進(jìn)而進(jìn)行熒光檢測(cè)的靈敏度就會(huì)嚴(yán)重下降。大部分背景熒光信號(hào)是短時(shí)存在的，因此將長(zhǎng)衰減壽命的標(biāo)記物與時(shí)間分辨熒光技術(shù)相結(jié)合，就可以使瞬時(shí)熒光干擾減到最小化。時(shí)間分辨熒光免疫分析(timed-resolvedfluoroimmunoassay,trfia)是一種靈敏的高端定量免疫檢測(cè)技術(shù),是以鑭系稀土離子作為標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記抗原或抗體,因鑭系稀土離子stokes位移大，避免了激發(fā)光和發(fā)射光的重疊而影響結(jié)果，而且鑭系稀土離子熒光壽命長(zhǎng)，可以通過(guò)延長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)間來(lái)消除檢測(cè)物質(zhì)本底熒光的干擾，提高了靈敏度，另外稀土元素的熒光強(qiáng)度高，同樣能夠提高檢測(cè)的靈敏度。常用的稀土熒光微球?yàn)殇B(eu)熒光微球。由于不同檢測(cè)方法使用的質(zhì)控品(陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品)質(zhì)量存在差異，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)幾十倍或者更高的差異，給診斷準(zhǔn)確性造成較大影響。hytest公司從心肌組織中提純獲得一種ctni-ctnc-ctnt三元復(fù)合體在2002年獲得了nist認(rèn)證，但近年來(lái)的研究指出使用該三元復(fù)合物并沒(méi)有使不同ctni檢測(cè)方法結(jié)果之間的可比性有所提高。新近的研究表明可以使用原核表達(dá)的方法直接表達(dá)出患者血清中ctni的主要存在形式，在擴(kuò)增出的ctni和ctnc基因之間加上57個(gè)堿基的linker序列(19個(gè)中性氨基酸殘基ts-(g4s)3-ac)，轉(zhuǎn)化pet28a表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3)中，iptg誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)nta樹脂親和層析純化，得到ctni-ctnc融合蛋白。我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ctni和ctnc二聚體的偶聯(lián)原核表達(dá)只能得到包涵體，蛋白不可溶，在實(shí)際使用中仍然存在困難。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種ctni-ctnc-ctnt三聚體蛋白，具有抗原穩(wěn)定性好的特性。而且該三聚體蛋白能夠通過(guò)基因工程方式進(jìn)行原核表達(dá)，獲得具有活性的可溶性蛋白。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述ctni-ctnc-ctnt三聚體的制備方法。本發(fā)明的再一目的是提供上述ctni-ctnc-ctnt三聚體在作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品制備檢測(cè)ctni的試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的：本發(fā)明提供的一種ctni-ctnc-ctnt三聚體蛋白，由ctni蛋白、ctnc蛋白和ctnt蛋白依次連接形成。我們研究發(fā)現(xiàn)，該三聯(lián)體并不需要用到其他的loop序列，只需利用這三個(gè)蛋白本身的n末端的loop結(jié)構(gòu)即可。優(yōu)選地，上述ctni-ctnc-ctnt三聚體蛋白，氨基酸序列如seqidno.1所示。本發(fā)明還保護(hù)上述ctni-ctnc-ctnt三聚體蛋白的編碼基因。本發(fā)明提供的一種上述ctni-ctnc-ctnt三聚體蛋白的制備方法，其包括以下步驟：人工合成ctni-ctnc-ctnt三聚體蛋白的編碼基因，克隆到表達(dá)載體pet28a的多克隆位點(diǎn)bamhi/xhoi中，得到表達(dá)質(zhì)粒pet28a-ctni；將表達(dá)質(zhì)粒pet28a-ctni轉(zhuǎn)化到大腸桿菌bl21(de3)中，iptg誘導(dǎo)表達(dá)；培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)液用tris-鹽酸緩沖液攪拌振蕩使細(xì)菌沉淀重懸，超聲波破壁，離心取上清，依次過(guò)鎳柱、強(qiáng)陰離子交換柱q柱和sephedexg200分子篩層析柱，得到純化的ctni-ctnc-ctnt三聚體蛋白。鎳柱也稱為鎳離子親和層析柱，是以瓊脂糖凝膠微球?yàn)榛A(chǔ)，在其表面共價(jià)交聯(lián)帶有多個(gè)游離羧基的配體有機(jī)小分子化合物，由于多個(gè)羧基與ni2+發(fā)生螯合，螯合后的ni2+能與目標(biāo)蛋白中his上的咪唑環(huán)發(fā)生特殊的相互作用，從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離。優(yōu)選使用美國(guó)ge公司histraphpniffnta型號(hào)的5ml規(guī)格的鎳離子親和層析柱。強(qiáng)陰離子交換柱q柱，優(yōu)選使用美國(guó)ge公司hitrapq型號(hào)的5ml規(guī)格的預(yù)裝柱。superdexg200凝膠過(guò)濾層析柱是美國(guó)ge公司superdex75/300gl型號(hào)的預(yù)裝柱。本發(fā)明還提供上述ctni-ctnc-ctnt三聚體蛋白作為抗原，制備的抗體。本發(fā)明還提供了一種ctni的檢測(cè)試劑盒，包括ctni陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，所述ctni陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品為以上任意所述的ctni-ctnc-ctnt三聚體蛋白。本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)ctni的免疫熒光試劑盒，其包括含凍干的熒光微球復(fù)合體的槍頭、免疫熒光試紙卡、含樣品緩沖液的凍存管，和以上所述ctni-ctnc-ctnt三聚體蛋白制備的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品；其中，熒光微球復(fù)合體：將稀土熒光微球通過(guò)碳二亞胺和羥基硫代琥珀酰亞胺將羧基活化，然后以羧基化的稀土熒光微球作為標(biāo)記載體，與ctni單抗中-nh2共價(jià)結(jié)合；免疫熒光試紙卡包括ctni檢測(cè)試紙，檢測(cè)試紙由吸水墊、硝酸纖維素膜、樣品墊依次搭接貼于pvc襯板上構(gòu)成，硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線位置包被有抗ctni單抗，質(zhì)控線位置包被有羊抗小鼠多抗；檢測(cè)試紙固定在塑料底卡上并且表面用面卡壓緊，面卡在對(duì)應(yīng)檢測(cè)試紙的樣品墊和硝酸纖維素膜的部位分別預(yù)留加樣孔和觀察窗。檢測(cè)原理：將稀釋好的樣品與熒光檢測(cè)抗體(熒光微球復(fù)合體，標(biāo)記有小鼠源的ctni單抗)混合后，加入到試紙卡一端的加樣口，通過(guò)毛細(xì)作用向前移動(dòng)，反應(yīng)一段時(shí)間后，利用熒光掃描儀，掃描試紙卡的觀察框，捕捉質(zhì)控線和檢測(cè)線被激發(fā)的熒光強(qiáng)度，如果樣品中含有相應(yīng)的ctni抗原，包被在檢測(cè)線上的抗體(抗ctni單抗)和熒光標(biāo)記物與樣品中的抗原結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，檢測(cè)線和質(zhì)控線均會(huì)產(chǎn)生熒光；如果待檢樣品中沒(méi)有相應(yīng)抗原，熒光標(biāo)記物將不會(huì)與包被在檢測(cè)線上的抗原或抗體結(jié)合，熒光標(biāo)記物不會(huì)富集，則檢測(cè)線上不會(huì)產(chǎn)生熒光，而質(zhì)控線會(huì)出現(xiàn)熒光。優(yōu)選地，上述用于檢測(cè)ctni的免疫熒光試劑盒，其還包括干燥劑；全部試劑均封裝在鋁箔袋中，真空封口，4℃保存。優(yōu)選地，上述用于檢測(cè)ctni的免疫熒光試劑盒，所述樣品緩沖液為含有質(zhì)量體積比0.25％酪蛋白和40mmedta的pb緩沖液。優(yōu)選地，上述用于檢測(cè)ctni的免疫熒光試劑盒，還包括陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，所述陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為含有質(zhì)量體積比6％bsa和濃度5mm葡萄糖的pb緩沖液。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明將ctni、ctnc、ctnt進(jìn)行融合表達(dá)，不需要增加額外的連接肽，得到的ctni-ctnc-ctnt三聚體蛋白，具有較好的抗原穩(wěn)定性，為可溶的蛋白，而且用elisa的方法檢測(cè)也是具有活性的，因此可以用于標(biāo)準(zhǔn)品。本發(fā)明提供的ctni-ctnc-ctnt三聚體蛋白的制備方法，能夠得到ctni活性蛋白含量40％以上的蛋白產(chǎn)物，為可溶性表達(dá)的蛋白，其他二聚體表達(dá)等都是包涵體。以本發(fā)明的ctni-ctnc-ctnt三聚體蛋白為基礎(chǔ)，稀釋后得到含有不同濃度ctni活性蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，經(jīng)elisa法檢測(cè)，誤差小于5％，穩(wěn)定性非常好。本發(fā)明提供的檢測(cè)試劑盒，通過(guò)采用稀土(鑭系元素)熒光微球作為標(biāo)記載體，標(biāo)記載體穩(wěn)定，標(biāo)記通過(guò)共價(jià)鍵將微球和抗體連接，標(biāo)記產(chǎn)物穩(wěn)定；可避免樣品本身的熒光影響，檢測(cè)快速簡(jiǎn)便、敏感性高，可實(shí)現(xiàn)全定量檢測(cè)；以本發(fā)明的ctni-ctnc-ctnt三聚體蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照，組裝檢測(cè)ctni免疫熒光定量檢測(cè)試劑盒，使試劑盒具有穩(wěn)定、敏感、定量、簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果可靠的特點(diǎn)。附圖說(shuō)明圖1是實(shí)施例1中sds-page凝膠電泳檢測(cè)表達(dá)純化后的ctni-ctnc-ctnt三聚體蛋白結(jié)果，圖中ctntci表示三聚體蛋白。圖2是實(shí)施例3中試紙條結(jié)構(gòu)組成圖。圖3是實(shí)施例4中ctni活性蛋白(ctni-ctnc-ctnt三聚體中的ctni活性蛋白)在不同濃度下在熒光試紙卡上的層析曲線。圖4是實(shí)施例4中ctni活性蛋白(ctni-ctnc-ctnt三聚體中的ctni活性蛋白)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖5是實(shí)施例5中fn熒光層析和elisa方法檢測(cè)血液樣本的準(zhǔn)確度的相關(guān)性結(jié)果圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好地理解本發(fā)明并能予以實(shí)施，但所舉實(shí)施例不作為對(duì)本發(fā)明的限定。以下實(shí)施例中，如無(wú)特殊說(shuō)明，所用生物材料及試劑均為市售商品，未詳細(xì)提及的實(shí)驗(yàn)步驟均為常規(guī)技術(shù)手段。實(shí)施例1：ctni融合蛋白的克隆、表達(dá)與純化①按氨基酸序列n端到c端的方向，人工化學(xué)合成“ctni-ctnc-ctnt”三聯(lián)體基因序列，如seqidno.2所示。②將“ctni-ctnc-ctnt”基因序列克隆到pet28a質(zhì)粒表達(dá)載體的bamhi和xholi的多克隆插入位點(diǎn)，得到表達(dá)質(zhì)粒pet28a-ctni。③將克隆得到的表達(dá)質(zhì)粒pet28a-ctni轉(zhuǎn)化到大腸桿菌bl21(de3)中，涂布平板，并過(guò)夜培養(yǎng)。④第二天早上挑取單菌落接種到lb培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)至菌液光吸收值(od)達(dá)到1.0，加入1μg/ml的iptg誘導(dǎo)表達(dá)。37℃培養(yǎng)4小時(shí)后離心收集細(xì)菌。⑤在細(xì)菌中加入100ml的100mm的tris-鹽酸緩沖液(ph7.4)，攪拌振蕩使細(xì)菌沉淀重懸，用超聲波破壁后，16,000rpm轉(zhuǎn)速下離心取上清。⑥將上清依次通過(guò)鎳柱、強(qiáng)陰離子交換柱q柱和sephedexg200分子篩層析柱。得到純化的ctni-ctnc-ctnt三聚體蛋白，其中包含ctni活性蛋白。純化結(jié)果如圖1所示。實(shí)施例2：ctni活性蛋白的elisa法定量檢測(cè)①利用熱電公司生產(chǎn)的bca蛋白含量測(cè)定試劑盒測(cè)定純化到的ctni-ctnc-ctnt三聚體蛋白的總蛋白含量，對(duì)三批純化蛋白進(jìn)行檢測(cè)，并做誤差分析。結(jié)果如表一所示。②利用clonetech公司生產(chǎn)的ctni的elisa試劑盒檢測(cè)ctni的活性蛋白含量。對(duì)以上三批純化蛋白進(jìn)行檢測(cè)，并做誤差分析。結(jié)果如表一所示。表一、利用bca法測(cè)定總蛋白含量和利用elisa法測(cè)定ctni活性蛋白含量實(shí)施例3：免疫層析試劑盒的制備(1)熒光微球標(biāo)記抗體：①取0.5ml微球，離心取沉淀，加入ph6.0的mes緩沖液洗滌兩次。②活化：在洗滌后的微球中分別加入114μl的50mm的碳二亞胺(edac)和114μl的50mm的羥基硫代琥珀酰亞胺(sulfo-nhs)，室溫震蕩1h。③離心微球，用pb緩沖液洗滌兩次。④加入適當(dāng)量的小鼠源的ctni單克隆抗體，室溫震蕩2h。⑤離心微球，加入50mm的羥胺緩沖液淬滅反應(yīng)，室溫震蕩5min；然后離心微球，加入50mm的羥胺緩沖液徹底淬滅反應(yīng)，室溫震蕩30min⑥離心微球，加入封閉液(0.5％酪蛋白，10mmpb)，室溫震蕩2h。⑦加入400μl儲(chǔ)存液(0.5％bsa，0.5％tween-20，0.02％疊氮化鈉，10mmpb)保存于4℃。(2)槍頭的制備：將制備好的標(biāo)記有ctni單抗的熒光微球噴點(diǎn)于槍頭中，每個(gè)2.5μl，-80℃冰箱冷凍過(guò)夜后，冷凍真空干燥2h后可用于組裝試劑盒。(3)包被膜的制備：①包被揭開pvc底板中間寬度25mm的保護(hù)膜，將硝酸纖維素膜(即nc膜)粘貼于此，即可用于t線(檢測(cè)線)和c線(質(zhì)控線)抗體的包被。調(diào)整劃線的位置，是t線距nc膜下緣(樣品墊端)7mm，c線距nc膜下緣(吸水墊端)11mm，t線和c線間距為4mm。檢測(cè)線(t線)：用0.01m的pbs(ph7.4，包含3％甲醇)將抗ctni單抗稀釋到1mg/ml進(jìn)行包被，劃線濃度為1μl/cm，速度100mm/s。質(zhì)控線(c線)：用0.01m的pbs(ph7.4，包含3％甲醇)將羊抗小鼠多克隆抗體稀釋到1mg/ml進(jìn)行包被，劃線濃度為1μl/cm，速度100mm/s。②干燥放入37℃烘箱，干燥30～40min。(4)樣品墊的制備：將玻璃纖維膜裁剪至31mm×100mm，用槍頭將1.91ml封閉液(0.01mpb緩沖液，包含3％bsa)均勻涂布于玻璃纖維膜表面，置37℃烘箱過(guò)夜干燥。(5)檢測(cè)試紙的組裝與剪切在已粘貼硝酸纖維素膜(包被有抗ctni單抗檢測(cè)區(qū)和羊抗小鼠質(zhì)控區(qū))的pvc底板(寬77mm)上下兩端分別粘貼吸水墊和已處理好的樣品墊，吸水墊在較窄一端，寬度為25mm，與包被膜交聯(lián)2mm；樣品墊在較寬一端，寬度為31mm，與包被膜交聯(lián)2mm。組裝完成，切條機(jī)切成5mm寬度，即為免疫熒光試紙。具體組裝方式如圖2所示。(6)試紙卡的制備把一條免疫熒光試紙固定在塑料底卡上，試紙表面用面卡壓緊，面卡在對(duì)應(yīng)試紙條的樣品墊和nc膜的部位分別預(yù)留加樣孔和觀察窗。即為免疫熒光試紙卡。(7)試劑盒的制備將免疫熒光試紙卡、含凍干熒光微球抗體復(fù)合物的槍頭、含樣品稀釋液的凍存管、兩包1g干燥劑共同放入鋁箔袋，真空封口后4℃保存，即制備完成檢測(cè)ctni的免疫熒光試劑盒。實(shí)施例4：檢測(cè)ctni標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)稀釋ctni陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品(本發(fā)明的ctni-ctnc-ctnt三聚體蛋白)，用稀釋液(6％bsa，5mm葡萄糖，pb)將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍稀釋，制成50000ng/l、25000ng/l、15000ng/l、5000ng/l、2000ng/l、500ng/l、50ng/l、10ng/l等濃度的樣品。用含凍干熒光微球復(fù)合物的移液器取75μl樣品溶液，加入到300μl的樣品緩沖液(0.25％酪蛋白，40mmedta，pb)中，混勻后取75μl點(diǎn)加到試紙卡的加樣孔中。室溫靜置20min，將試紙卡放到熒光掃描儀中讀數(shù)。用檢測(cè)線熒光值除以質(zhì)控線熒光值為測(cè)量值。每個(gè)樣品濃度進(jìn)行測(cè)量三次，取平均值后，以測(cè)量值對(duì)樣品濃度作圖。檢測(cè)線和質(zhì)控線的峰形圖如圖3所示，峰形非常靈敏。標(biāo)準(zhǔn)品的線性結(jié)果如圖4所示，線性也非常好。實(shí)施例5：臨床血樣中ctni的檢測(cè)采集醫(yī)院ctni的陽(yáng)性和陰性樣本，用本試劑盒(方法同上)和eisa兩種方法進(jìn)行檢測(cè)，分別計(jì)算檢出率。結(jié)果如表二所示，本免疫熒光定量檢測(cè)試劑盒(表二中fn熒光層析)的檢出率明顯高于elisa的方法。表二、臨床血樣中ctni的檢測(cè)陰性陽(yáng)性陰性符合率陽(yáng)性符合率elisa18045096.2％96.8％fn熒光層析18045097.6％98.2％同時(shí)對(duì)血樣進(jìn)行準(zhǔn)確度相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)，以免疫熒光定量檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果對(duì)elisa的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行作圖，如圖5所示，點(diǎn)的分布主要分布在45度角直線附近，擬合得到相關(guān)曲線，得到兩種方法的相關(guān)系數(shù)為0.9946，可見(jiàn)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果非常一致。以上所述實(shí)施例僅是為充分說(shuō)明本發(fā)明而所舉的較佳實(shí)施例，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。sequencelisting<110>武漢普諾金生物科技有限責(zé)任公司<120>ctni-ctnc-ctnt三聚體蛋白及其制備方法和ctni檢測(cè)試劑盒<130><160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>476<212>prt<213>人工序列（ctni-ctnc-ctnt三聚體蛋白）<400>1metalaaspglyserseraspalaalaarggluproargproalapro151015alaproileargargargserserasntyrargalatyralathrglu202530prohisalalyslyslysserlysileseralaserarglysleugln354045leulysthrleuleuleuglnilealalysglngluleugluargglu505560alaglugluargargglyglulysglyargalaleuserthrargala65707580glnproleugluleualaglyleuglyphealagluleuglnaspleu859095alaargglnleuhisalaargvalasplysvalaspglugluargtyr100105110aspileglualalysvalthrlysasnilethrgluilealaaspleu115120125thrglnlysilepheaspleuargglylysphelysargprothrleu130135140argargvalargileseralaaspalametmetglnalaleuleugly145150155160alaargalalysgluserleuaspleuargalahisleulysglnval165170175lyslysgluaspthrglulysgluasnarggluvalglyasptrparg180185190lysasnileaspalaleuserglymetgluglyarglyslyslysphe195200205glusermetaspaspiletyrlysalaalavalgluglnleuthrglu210215220gluglnlysasngluphelysalaalapheaspilephevalleugly225230235240alagluaspglycysileserthrlysgluleuglylysvalmetarg245250255metleuglyglnasnprothrproglugluleuglnglumetileasp260265270gluvalaspgluaspglyserglythrvalasppheaspglupheleu275280285valmetmetvalargcysmetlysaspaspserlysglylysserglu290295300glugluleuseraspleupheargmetpheasplysasnalaaspgly305310315320tyrileaspleuaspgluleulysilemetleuglnalathrglyglu325330335thrilethrgluaspaspileglugluleumetlysaspglyasplys340345350asnasnaspglyargileasptyraspglupheleugluphemetlys355360365glyvalgluglyglytyrleuvallysalagluglnlysargglylys370375380argglnthrglyargglumetlysvalargileleusergluarglys385390395400lysproleuaspileasptyrmetglyglugluglnleuargglulys405410415alaglngluleuserasptrpilehisglnleugluserglulysphe420425430aspleumetalalysleulysglnglnlystyrgluileasnvalleu435440445tyrasnargileserhisalaglnlysphearglysglyalaglylys450455460glyargvalglyglyargseralaglysersergly465470475<210>2<211>1428<212>dna<213>人工序列（ctni-ctnc-ctnt三聚體蛋白編碼基因）<400>2atggcggatgggagcagcgatgcggctagggaacctcgccctgcaccagccccaatcaga60cgccgctcctccaactaccgcgcttatgccacggagccgcacgccaagaaaaaatctaag120atctccgcctcgagaaaattgcagctgaagactctgctgctgcagattgcaaagcaagag180ctggagcgagaggcggaggagcggcgcggagagaaggggcgcgctctgagcacccgcgct240cagccgctggagttggccgggctgggcttcgcggagctgcaggacttggctcgacagctc300cacgcccgtgtggacaaggtggatgaagagagatacgacatagaggcaaaagtcaccaag360aacatcacggagattgcagatctgactcagaagatctttgaccttcgaggcaagtttaag420cggcccaccctgcggagagtgaggatctctgcagatgccatgatgcaggcgctgctgggg480gcccgggctaaggagtccctggacctgcgggcccacctcaagcaggtgaagaaggaggac540accgagaaggaaaaccgggaggtgggagactggcgcaagaacatcgatgcactgagtgga600atggagggccgcaagaaaaagtttgagagcatggatgacatctacaaggctgcggtagag660cagctgacagaagagcagaaaaatgagttcaaggcagccttcgacatcttcgtgctgggc720gctgaggatggctgcatcagcaccaaggagctgggcaaggtgatgaggatgctgggccag780aaccccacccctgaggagctgcaggagatgatcgatgaggtggacgaggacggcagcggc840acggtggactttgatgagttcctggtcatgatggttcggtgcatgaaggacgacagcaaa900gggaaatctgaggaggagctgtctgacctcttccgcatgtttgacaaaaatgctgatggc960tacatcgacctggatgagctgaagataatgctgcaggctacaggcgagaccatcacggag1020gacgacatcgaggagctcatgaaggacggagacaagaacaacgacggccgcatcgactat1080gatgagttcctggagttcatgaagggtgtggagggcggctacctggtcaaggcagaacag1140aagcgtggtaagcggcagacggggcgggagatgaaggtgcgcatcctctccgagcgtaag1200aagcctctggacattgactacatgggggaggaacagctccgggagaaagcccaggagctg1260tcggactggatccaccagctggagtctgagaagttcgacctgatggcgaagctgaaacag1320cagaaatatgagatcaacgtgctgtacaaccgcatcagccacgcccagaagttccggaag1380ggggcagggaagggccgcgttggaggccgcagtgctggaagtagtgga1428當(dāng)前第1頁(yè)12