本發(fā)明涉及試劑技術領域，尤其是涉及一種血清銅離子定量檢測試劑。
背景技術：
自1928年人們發(fā)現(xiàn)銅是日糧組成的必需成分以后，一直到1950年銅在動物營養(yǎng)中的作用才被逐漸地認識。銅是畜禽所必需的微量元素之一，它是酪氨酸酶、單胺氧化酶、超氧化物歧化酶、細胞色素氧化酶等多種含銅酶的組成成分，同時還參與細胞色素C、抗壞血酸氧化酶、半乳糖酶的合成，因而具有較廣泛的生物學效應。血清銅是反映畜禽體內銅元素含量的一個重要參數(shù)，也是進行臨床生化檢驗的一個重要指標。
銅在人體內含量約100—150mg，是人體中含量位居第二的必需微量元素，是一組重要酶的組成部分，包括銅藍蛋白(亞鐵氧化酶)，超氧化物歧化酶、細胞色素氧化酶、賴氨酸氧化酶、多巴胺β-羥化酶以及酪氨酸酶。
血清銅增高見于：口服避孕藥、雌激素治療、霍奇金病、白血病及其他許多惡性病變、巨幼紅細胞貧血、再生障礙性貧血、色素沉著病、風濕熱、重型及輕型地中海貧血、創(chuàng)傷及膠原性疾病。
血清銅降低見于：威爾遜病(肝豆狀核變性)、Menkes或絲卷綜合癥、燒傷患者、某些缺鐵性貧血、蛋白質營養(yǎng)不良以及慢性局部缺血性心臟病等。
目前臨床測定血清銅方法主要有原子吸收分光光度法和比色法。原子吸收法靈敏、特異，但需要昂貴的原子吸收分光光度計，并且操作繁瑣、費時，臨床應用較少。化學法操作簡便，試劑易得，較易在臨床推廣使用。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種血清銅離子定量檢測試劑，它具有較為穩(wěn)定，且與原子吸收法相關性較佳的特點。
本發(fā)明所采用的技術方案是：
血清銅離子定量檢測試劑，包括試劑R1、試劑R2和校準品，其特征在于：
所述試劑R1包括：緩沖液50-200mmol、界面活性劑2.0-20.0g/L、反應促進劑2.0-12.0g/L、穩(wěn)定劑0.1-20.0g/L、抑菌劑0.1-10.0g/L，其中，緩沖液的pH值為2.0-5.0；
所述試劑R2包括：緩沖液50-500mmol、3,5-DiBr-PAESA 0.01-0.1g/L、電解質100-400mmol、穩(wěn)定劑0.1-20.0g/L、抑菌劑0.1-10.0g/L，其中，緩沖液的pH值為6.0-9.0；
所述校準品包括：緩沖液20-300mmol、銅離子20-60μmol/L、抑菌劑0.1-10.0g/L，其中，緩沖液的pH值為6.0-8.0。
所述緩沖液為枸緣酸緩沖液、乙酸緩沖液、HEPES緩沖液、PIPES緩沖液中的一種。
所述界面活性劑為Tween 20、Tween40、Span20、Span40、Span80、TritonX-100、20AB中的一種。
所述反應促進劑為SDS、Brij 35、KAO 24B、甲醇中的一種或多種。
所述電解質為鈉離子、鉀離子、鎂離子、鈣離子中一種或多種。
所述穩(wěn)定劑為尿酸、硫辛酸、抗壞血酸、抗壞血酸鈉、鹽酸羥胺中的一種或多種。
所述抑菌劑為甲醇、山梨酸鉀、Proclin200、Proclin300、慶大霉素中的一種。
本發(fā)明所具有的優(yōu)點是：
1、檢測快速。利用本發(fā)明的血清銅離子定量檢測試劑可以采用自動生化分析儀操作，可與其他檢測項目同時進行，每個樣本檢測時間縮短到10min內，檢測快速簡便。
2、檢測靈敏率高。本發(fā)明的血清銅離子定量檢測試劑通過合理調整試劑緩沖液、界面活性劑等成分的配比，提高了反應的靈敏度。
3、線性范圍寬。本發(fā)明的血清銅離子定量檢測試劑的線性范圍是3-78.5μmol/L，正常人群參考范圍為男性：11.0-22.0μmol/L，女性：12.6-24.4μmol/L，兒童：12.6-29.9μmol/L，能夠滿足臨床需要。
4、較為穩(wěn)定。本發(fā)明的血清銅離子定量檢測試劑各成分配比較優(yōu)，試劑在2-8℃密閉條件下可穩(wěn)定12個月，開蓋后貯2-8℃，R1穩(wěn)定20天，R2穩(wěn)定20天。
5、相關性較佳。經過實際驗證，本發(fā)明的血清銅離子定量檢測試劑與原子吸收法的相關系數(shù)約為0.9658，說明該試劑與原子吸收法具有較佳的相關性。
附圖說明
下面結合附圖和實施例對本發(fā)明進一步說明：
圖1是本發(fā)明的血清銅離子定量檢測試劑與對照試劑進行40份樣本檢測結果相關性測試的關系圖。
具體實施方式
實施例1
血清銅離子定量檢測試劑，包括試劑R1、試劑R2和校準品。
具體的：
試劑R1包括：緩沖液150mmol、界面活性劑5.5g/L、反應促進劑8g/L、穩(wěn)定劑10g/L、抑菌劑0.8g/L。其中，緩沖液采用pH值為2.8的枸緣酸，界面活性劑采用Triton X-100，反應促進劑采用SDS，穩(wěn)定劑采用抗壞血酸鈉，抑菌劑采用甲醇。
試劑R2包括：緩沖液300mmol、3,5-DiBr-PAESA 0.08g/L、電解質150mmol、穩(wěn)定劑3g/L、抑菌劑0.9g/L。其中，緩沖液采用pH值為7.8的枸緣酸，電解質采用氫氧化鈉，穩(wěn)定劑采用抗壞血酸，抑菌劑采用甲醇。
校準品包括：緩沖液30mmol、銅離子50μmol/L、抑菌劑0.9g/L。其中，緩沖液采用pH值為7.8的枸緣酸，銅離子來自硫酸銅，抑菌劑采用甲醇。
使用方法：
儀器：日立7180自動生化分析儀；
測定方法：二點終點法；
檢測波長：570nm；
反應方向：上升反應；
V樣本:VR1:VR2＝15μl:240μl:60μl；
定標及校準方式：水與校準品定標后采用linear校準。
操作步驟：
樣本和試劑R1混勻后于37℃孵育3-5min，讀取第1讀數(shù)點吸光度A1，隨即加入試劑R2，混勻后37℃孵育5min，讀取第2讀數(shù)點吸光度A2。
結果計算：
采用校準品與水(零點)進行定標，將兩點的吸光度變化值(A校準-A空白)對其相應濃度做圖，繪制定標曲線。根據樣品的(A樣品-A空白)值在定標曲線上求得樣品中銅離子的含量。
從理論上講，由于試劑R1提供了血清中銅離子與底物反應的液體環(huán)境，具有能使銅離子成為游離狀態(tài)的特點。試劑R2具有使特定濃度的3,5-DiBr-PAESA在2-8℃保存條件下穩(wěn)定保存的特點。尤其是3,5-DiBr-PAESA僅與銅離子反應，與其他離子不反應。該校準品中人銅離子來源于硫酸銅或者氯化銅。
具體使用時，該血清銅離子定量檢測試劑采用比色法，反應原理為樣本中的銅離子與試劑R1在液體中相遇后，與原本結合的物質解離，與試劑中相應底物(3,5-DiBr-PAESA)在液相中相遇并發(fā)生反應，使吸光度發(fā)生變化。該吸光度變化在足量底物存在時與樣本中銅離子的濃度成比例，將吸光度變化與已知濃度的校準品比較，可以定量得出樣品中銅離子的含量。
實施例2
血清銅離子定量檢測試劑，包括試劑R1、試劑R2和校準品。
具體的：
試劑R1包括：緩沖液200mmol、界面活性劑7.0g/L、反應促進劑7g/L、穩(wěn)定劑12g/L、抑菌劑0.8g/L。其中，緩沖液采用pH值為3.6的乙酸，界面活性劑采用20AB，反應促進劑采用SDS，穩(wěn)定劑采用抗壞血酸，抑菌劑采用Proclin300。
試劑R2包括：緩沖液200mmol、3,5-DiBr-PAESA 0.09g/L、電解質150mmol、穩(wěn)定劑5g/L、抑菌劑0.9g/L。其中，緩沖液采用pH值為7.8的檸乙酸，電解質采用氫氧化鈉，穩(wěn)定劑采用尿酸，抑菌劑采用甲醇。
校準品包括：緩沖液30mmol、銅離子50μmol/L、抑菌劑0.9g/L。其中，緩沖液采用pH值為7.8的枸緣酸，銅離子來自硫酸銅，抑菌劑采用Proclin200。
使用方法、操作步驟、結果計算與實施例1相同。
實施例3
血清銅離子定量檢測試劑，包括試劑R1、試劑R2和校準品。
具體的：
試劑R1包括：緩沖液50mmol、界面活性劑2.0g/L、反應促進劑2g/L、穩(wěn)定劑0.1g/L、抑菌劑0.1g/L。其中，緩沖液采用pH值為2的枸緣酸，界面活性劑采用Tween 20，反應促進劑采用Brij 35、SDS，穩(wěn)定劑采用硫辛酸，抑菌劑采用山梨酸鉀。
試劑R2包括：緩沖液50mmol、3,5-DiBr-PAESA 0.01g/L、電解質100mmol、穩(wěn)定劑0.1g/L、抑菌劑0.1g/L。其中，緩沖液采用pH值為6.0的HEPES緩沖液，電解質采用氫氧化鉀，穩(wěn)定劑采用鹽酸羥胺，抑菌劑采用慶大霉素。
校準品包括：緩沖液20mmol、銅離子20μmol/L、抑菌劑0.1g/L。其中，緩沖液采用pH值為6.0的PIPES，銅離子來自硫酸銅，抑菌劑采用慶大霉素。
使用方法、操作步驟、結果計算與實施例1相同。
實施例4
血清銅離子定量檢測試劑，包括試劑R1、試劑R2和校準品。
具體的：
試劑R1包括：緩沖液160mmol、界面活性劑20.0g/L、反應促進劑12g/L、穩(wěn)定劑20g/L、抑菌劑10g/L。其中，緩沖液采用pH值為5.0的乙酸，界面活性劑采用Tween 40，反應促進劑采用KAO 24B、SDS，穩(wěn)定劑采用任意比例組合的硫辛酸和尿酸，抑菌劑采用山梨酸鉀。
試劑R2包括：緩沖液500mmol、3,5-DiBr-PAESA 0.1g/L、電解質400mmol、穩(wěn)定劑20.0g/L、抑菌劑10g/L。其中，緩沖液采用pH值為9.0的HEPES緩沖液，電解質采用氫氧化鎂，穩(wěn)定劑采用任意比例組合的尿酸、硫辛酸、抗壞血酸、抗壞血酸鈉、鹽酸羥胺，抑菌劑采用Proclin300。
校準品包括：緩沖液300mmol、銅離子60μmol/L、抑菌劑10g/L。其中，緩沖液采用pH值為8.0的PIPES，銅離子來自硫酸銅，抑菌劑采用慶大霉素。
使用方法、操作步驟、結果計算與實施例1相同。
實施例5
與實施例1的區(qū)別僅在于：界面活性劑采用Span20，反應促進劑采用任意比例組合的SDS、Brij 35、KAO 24B，電解質采用氫氧化鈣。
實施例6
與實施例2的區(qū)別僅在于：界面活性劑采用Span40，反應促進劑采用任意比例組合的SDS、Brij 35、KAO 24B、甲醇，電解質采用任意比例組合的氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鎂。
實施例7
與實施例3的區(qū)別僅在于：界面活性劑采用Span80，反應促進劑采用任意比例組合的SDS、甲醇，電解質采用任意比例組合的氫氧化鉀、氫氧化鈣，穩(wěn)定劑采用任意比例組合的尿酸、硫辛酸、抗壞血酸、抗壞血酸鈉、鹽酸羥胺。
效果例
1、穩(wěn)定性考察：
將實施例1的試劑開蓋，定標后置于儀器試劑倉，每天測定同一質控品，測定24天。結果如表1，顯示本發(fā)明血清銅離子定量檢測試劑開蓋20天后，測定質控仍在范圍內，符合臨床使用需要。
表1：本發(fā)明試劑開蓋穩(wěn)定性評價
根據前述方法，對實施例2至7的試劑進行相同的實驗，結果類似于表1，說明實施例2至7的試劑同樣具有較佳的穩(wěn)定性。
2、相關性考察
本效果例中，相關分析是用相關系數(shù)(r)來表示兩個變量間相互的直線關系，并判斷其密切程度的統(tǒng)計方法。相關系數(shù)r沒有單位，在-1—+1范圍內變動，其絕對值愈接近1，兩個變量間的直線相關愈密切，愈接近0，相關愈不密切。相關系數(shù)若為正，說明一變量隨另一變量增減而增減，方向相同；若為負，表示一變量增加、另一變量減少，即方向相反，但它不能表達直線以外(如各種曲線)的關系。相關系數(shù)r＝0—0.3表示相關程度低于普通，相關系數(shù)r＝0.3—0.5表示相關程度普通，相關系數(shù)r＝0.5—0.7表示相關程度顯著，相關系數(shù)r＝0.7—0.9表示相關程度高，相關系數(shù)r＝0.9—1.0表示相關程度極高。
取實施例2的試劑，與原子吸收法進行比對試驗，對照試劑按照說明書設置參數(shù)，分別使用各自檢測系統(tǒng)，對相同40份血清樣本中銅離子定量檢測。結果如表2和圖1所示，涉及的40例樣本，相關系數(shù)為0.9658，顯示本發(fā)明血清銅離子定量檢測試劑與對照試劑相比，具有良好的相關性。
表2：本發(fā)明試劑與對照試劑(原子吸收法)40份樣本檢測結果
根據前述方法，對實施例1以及實施例3至7的試劑進行相同的實驗，結果類似于表2，說明實施例1以及實施例3至7的試劑同樣具有良好的相關性。
以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書內容及附圖所作的等效結構或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關的技術領域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護范圍內。