本發(fā)明涉及一種基于氧化石墨烯/四氧化三鐵/膠體金復合納米粒子增強拉曼效應的副溶血性弧菌檢測方法，屬于食品安全檢測領域。

背景技術：

副溶血性弧菌是一種嗜鹽、革蘭氏陰性桿狀細菌，廣泛分布在海洋環(huán)境和多種海洋產(chǎn)品中。食用了生的或是未煮熟的感染了副溶血性弧菌的海產(chǎn)品會引發(fā)突發(fā)性食物中毒，出現(xiàn)腹痛、腹瀉、頭痛、惡心、嘔吐等癥狀，重癥患者還可能出現(xiàn)脫水、休克、甚至死亡。該病原菌是在中國、日本等許多亞洲國家引發(fā)食源性疾病的主要原因之一。我國食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，副溶血性弧菌食物中毒高居沿海沿江省份微生物食源性疾病首位。因此建立一種快速、準確、便捷的檢測方法，對于從源頭預防副溶血性弧菌的污染，預防中毒事故的發(fā)生具有重要意義。

檢測副溶血性弧菌的方法主要包括傳統(tǒng)的平板計數(shù)法、分子生物學法、免疫學方法等。平板計數(shù)法檢驗程序較繁瑣，在檢測時間、靈敏度與特異性等方面存在缺陷。新發(fā)展起來的實時熒光定量PCR技術，雖然能縮短檢驗時間，但前期需要提取細菌總DNA，且靈敏度仍然不高；免疫學方法如酶聯(lián)免疫吸附分析法、電化學免疫分析法、酶聯(lián)熒光分析法等，具有特異性強、靈敏度高、易于觀察等優(yōu)點，但制備抗體的成本高，周期長，且穩(wěn)定性不佳。近些年來，寡核苷酸適配體(aptamer)因其為體外制備獲得，周期短成本低，且穩(wěn)定性好，易于修飾，因此被作為抗體分子的前景性替代分子，受到很多領域的關注，廣泛應用于生命科學等各個領域的研究工作中。

表面增強拉曼散射(SERS)是一種可以高效檢測低濃度分子的方法，具有選擇性好和靈敏度高的優(yōu)點，被廣泛應用于物理、材料、表面科學、環(huán)境化學、生物化學、有機化學甚至生物學的分析和研究。表面增強拉曼散射的高靈敏性依賴于其增強基底的高活性和高普適性，目前應用最為廣泛的增強基底多為貴金屬類和碳基材料類，通過表面等離子體共振，形成“熱點”效應以達到增強信號的效果。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于克服上述不足之處，提供一種基于適配體識別和氧化石墨烯/四氧化三鐵/膠體金(GO/Fe₃O₄@Au)復合納米粒子增強拉曼效應的副溶血性弧菌檢測方法。本發(fā)明采用GO/Fe₃O₄@Au復合納米粒子作為基底，將巰基化修飾的副溶血性弧菌適配體加入到上述制備所得的GO/Fe₃O₄@Au復合納米粒子中孵育，從而將副溶血性弧菌適配體固定在基底上。將被測物與修飾有副溶血性弧菌適配體的GO/Fe₃O₄@Au復合納米粒子混合，再加入另一條具有拉曼信號TAMRA修飾的副溶血性弧菌適配體進行孵育，然后進行拉曼光譜掃描。基于適配體與副溶血性弧菌的特異性結合，實現(xiàn)對食品中副溶血性弧菌的檢測。具體檢測原理如圖1所示。本方法靈敏度高、特異性強、操作方便，在食品安全檢測領域?qū)⒕哂袕V闊的應用前景。

實現(xiàn)本發(fā)明的具體方法：

基于氧化石墨烯/四氧化三鐵/膠體金復合納米粒子增強拉曼效應的副溶血性弧菌檢測方法，包括以下步驟：

1)拉曼增強基底的合成：采用水熱法首先制備得到Fe₃O₄納米顆粒并進行表面氨基化修飾，同時利用檸檬酸鈉還原氯金酸的方法制備得到納米金粒子，然后將一定量上述制備得到的Fe₃O₄納米顆粒與金納米顆粒進行反應，合成Fe₃O₄@Au納米材料，接著將一定量上述制備得到的Fe₃O₄@Au納米材料與一定量氧化石墨烯混合反應，最終制得GO/Fe₃O₄@Au復合納米粒子。

2)適配體的固定化：將一定量巰基化修飾的適配體加入到上述制備所得的GO/Fe₃O₄@Au復合納米粒子中孵育，從而將適配體固定在基底上。

3)副溶血性弧菌的檢測：將待測液與修飾有適配體的GO/Fe₃O₄@Au復合納米粒子混合，再加入一定量的另一條具有拉曼信號TAMRA修飾的適配體，然后進行拉曼光譜檢測。

具體的：步驟1)所述拉曼增強基底的合成具體操作為，稱取0.9g氯化鐵溶解到28mL乙二醇中，加入2.4g乙酸鈉，0.696g十二烷基磺酸鈉，攪拌30min后，置于反應釜中200℃反應8h得到Fe₃O₄納米顆粒；取30mg上述Fe₃O₄納米顆粒加入1mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，20mL乙醇，室溫攪拌反應6h，制備得到氨基化Fe₃O₄納米顆粒。同時取49mL超純水和0.5mL氯金酸溶液(1％)煮沸10min，然后加入0.5mL檸檬酸鈉(5％)繼續(xù)煮沸攪拌10min，制備得到納米金顆粒。取1mL氨基化Fe₃O₄納米顆粒，10mL納米金溶液，混合室溫攪拌反應3h，得到Fe₃O₄@Au納米粒子。取1mL上述制備得到的Fe₃O₄@Au納米粒子加入1mL GO(1mg/mL)和10mL超純水，室溫攪拌6h，最后制備得到GO/Fe₃O₄@Au納米粒子。

步驟2)所述的適配體固定化操作為，取GO/Fe₃O₄@Au納米粒子1mL，加入25μL適配體(10μmol/L)，室溫孵育16小時。

步驟3)所述的檢測，不同濃度的副溶血性弧菌樣品與適配體修飾的GO/Fe₃O₄@Au納米粒子于37℃孵育45min，然后加入另一條TAMRA修飾的適配體繼續(xù)孵育45min。之后于3000r/min離心5min，并清洗兩次。樣品重懸于緩沖液中上拉曼光譜儀檢測。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：

1.本發(fā)明方法以適配體作為識別元件，相比于免疫分析法中使用抗體作為識別元件，適配體穩(wěn)定性好，制備成本低，易于標記且標記后不影響其活性，同時對目標菌體具有高度親和力和高度選擇性，在很大程度上提高了檢測的準確性。

2.本發(fā)明以GO/Fe₃O₄@Au納米粒子作為拉曼增強基底，具有高表面增強拉曼活性，且試樣制備快速，成本低等優(yōu)點。

3.本發(fā)明中提供的檢測方法與現(xiàn)有副溶血性弧菌的檢測方法相比，具有靈敏度高的特點，其檢測限可達到14cfu/mL。

附圖說明

圖1基于適配體識別和GO/Fe₃O₄@Au復合納米粒子增強拉曼效應檢測副溶血性弧菌的示意圖

圖2 GO/Fe₃O₄@Au復合納米材料的透射電子顯微鏡圖

圖3不同濃度的副溶血性弧菌引起的表面增強拉曼光譜圖(A)，相對拉曼強度與副溶血性弧菌濃度的線性關系圖(B)

具體實施方式

為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結合具體實施方式對本發(fā)明所述的技術方案做進一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。

實施例1

1)拉曼增強基底的合成

首先制備氨基化Fe₃O₄納米顆粒：稱取0.9g氯化鐵溶解到28mL乙二醇中，加入2.4g乙酸鈉，0.696g十二烷基磺酸鈉，室溫攪拌30min，然后轉(zhuǎn)移至反應釜中置于200℃反應8h，自然冷卻后取出，用乙醇清洗3次，置于50℃烘箱干燥10h。取30mg研磨好的Fe₃O₄顆粒溶解于20mL乙醇中，接著逐滴加入1mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，室溫攪拌6h，磁分離棄去上清，加入適量無水乙醇，超聲分散洗滌。即制備得到氨基化Fe₃O₄納米顆粒。

然后制備納米金顆粒：首先取49mL超純水加入0.5mL 1％的氯金酸溶液并攪拌煮沸10min，接著加入0.5mL 5％的檸檬酸鈉溶液，于煮沸狀態(tài)下繼續(xù)攪拌10min，溶液由無色變?yōu)榫萍t色。移去熱源繼續(xù)攪拌15min，得到直徑為～15nm的納米金顆粒，將其置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

接著制備Fe₃O₄@Au納米粒子：取1mL氨基化Fe₃O₄納米顆粒，加入10mL納米金溶液和1mL超純水，混合均勻后于室溫攪拌反應3h，磁分離去除未連接的納米金顆粒，用乙醇清洗3次，得到Fe₃O₄@Au納米粒子。

最后制備GO/Fe₃O₄@Au復合納米顆粒：取1mL Fe₃O₄@Au納米粒子，1mL GO(1mg/mL)，加入到10mL超純水中，室溫劇烈攪拌反應6h，磁分離去除未反應的GO，最終制得GO/Fe₃O₄@Au復合納米粒子，即拉曼增強基底-GO/Fe₃O₄@Au復合納米粒子。圖2為GO/Fe₃O₄@Au復合納米粒子的透射電子顯微鏡圖。

2)適配體的固定化

取GO/Fe₃O₄@Au復合納米粒子1mL，加25μL適配體(10μmol/L)，使適配體最終濃度為250nmol/L，于室溫孵育16h。然后加入0.1mol/L NaCl陳化24h，磁分離富集，棄上清，并用PBS緩沖液清洗2次，重懸于1mL PBS緩沖液中備用。

3)緩沖液中副溶血性弧菌的檢測

以平板計數(shù)法得到濃度為1.4×10⁷cfu/mL的副溶血性弧菌菌液，再將該菌液梯度稀釋至1.4×10⁶cfu/mL，1.4×10⁵cfu/mL，1.4×10⁴cfu/mL，1.4×10³cfu/mL，1.4×10²cfu/mL，1.4×10cfu/mL；以步驟2)合成的適配體修飾的GO/Fe₃O₄@Au納米粒子作為拉曼增強試劑與捕獲探針，取該復合物200μL，30μL的待測樣品和24μL(10μmol/L)修飾有TAMRA信號分子的適配體混合并用緩沖液補足體系至300μL，37℃孵育45min。之后磁分離去除未結合的細菌，并清洗兩次。樣品重懸于50μL緩沖液中上拉曼光譜儀檢測。圖3A所示為濃度范圍在1.4×10²～1.4×10⁶cfu/mL副溶血性弧菌引起的拉曼光譜圖。由圖可見，隨著副溶血性弧菌濃度的增加，拉曼強度也相應增高。以1330cm^-1為定量特征峰，圖3B所示為副溶血性弧菌線性曲線圖。副溶血性弧菌在1.4×10²～1.4×10⁶cfu/mL濃度范圍內(nèi)，與1330cm^-1處相對拉曼強度呈良好的線性關系，線性方程為y＝671.4x-884.8(R＝0.9964)，最低檢出限為1.4cfu/mL。

實施例2

1)拉曼增強基底的合成

首先制備氨基化Fe₃O₄納米顆粒：稱取0.9g氯化鐵溶解到28mL乙二醇中，加入2.4g乙酸鈉，0.696g十二烷基磺酸鈉，室溫攪拌30min，然后轉(zhuǎn)移至反應釜中置于200℃反應8h，自然冷卻后取出，用乙醇清洗3次，置于50℃烘箱干燥10h。取30mg研磨好的Fe₃O₄顆粒溶解于20mL乙醇中，接著逐滴加入1mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，室溫攪拌6h，磁分離棄去上清，加入適量無水乙醇，超聲分散洗滌。即制備得到氨基化Fe₃O₄納米顆粒。

然后制備納米金顆粒：首先取49mL超純水加入0.5mL 1％的氯金酸溶液并攪拌煮沸10min，接著加入0.5mL 5％的檸檬酸鈉溶液，于煮沸狀態(tài)下繼續(xù)攪拌10min，溶液由無色變?yōu)榫萍t色。移去熱源繼續(xù)攪拌15min，得到直徑為～15nm的納米金顆粒，將其置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

接著制備Fe₃O₄@Au納米粒子：取1mL氨基化Fe₃O₄納米顆粒，加入10mL納米金溶液和1mL超純水，混合均勻后于室溫攪拌反應3h，磁分離去除未連接的納米金顆粒，用乙醇清洗3次，得到Fe₃O₄@Au納米粒子。

最后制備GO/Fe₃O₄@Au復合納米顆粒：取1mL Fe₃O₄@Au納米粒子，1mL GO(1mg/mL)，加入到10mL超純水中，室溫劇烈攪拌反應6h，磁分離去除未反應的GO，最終制得GO/Fe₃O₄@Au復合納米粒子，即拉曼增強基底-GO/Fe₃O₄@Au復合納米粒子。

2)適配體的固定化

取GO/Fe₃O₄@Au復合納米粒子1mL，加25μL適配體(10μmol/L)，使適配體最終濃度為250nmol/L，于室溫孵育16h。然后加入0.1mol/L NaCl陳化24h，磁分離富集，棄上清，并用PBS緩沖液清洗2次，重懸于1mL PBS緩沖液中備用。

3)三文魚肉中副溶血性弧菌的檢測

25g冷凍的三文魚肉絞碎，與225mL含3％NaCl(w/v)的堿性蛋白胨混合均質(zhì)10min，然后過濾去除大顆粒和懸浮物，取上清作為實際樣品。配制不同濃度的副溶血性弧菌加入待測溶液中。用本發(fā)明方法進行檢測，并計算回收率，結果如表1所示。

表1本發(fā)明方法檢測三文魚中副溶血性弧菌的結果

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬于本發(fā)明的涵蓋范圍。

序列表

〈110〉 江南大學

〈120〉 基于氧化石墨烯/四氧化三鐵/膠體金復合納米粒子增強拉曼效應的副溶血性弧菌檢測方法

〈130〉

〈160〉 1

〈170〉 PatentIn version 3.5

〈210〉 1

〈211〉 40

〈212〉 DNA

〈213〉 人工序列

〈400〉 1

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