本發(fā)明涉及光學顯微成像領(lǐng)域，特別是涉及一種光學超分辨顯微成像系統(tǒng)及方法。

背景技術(shù)：

隨著科學技術(shù)的發(fā)展，生命科學技術(shù)也得到了相應的發(fā)展，生物細胞成像的精度及準確度要求越來越高，微納材料的研究也如火如荼。而傳統(tǒng)光學顯微成像的空間分辨率受限于物鏡的數(shù)值孔徑與光波長，分辨率只能達到300nm左右，遠遠滿足不了現(xiàn)代顯微成像對分辨率的要求。

熒光是自然界常見的一種發(fā)光現(xiàn)象。熒光是光子與分子的相互作用產(chǎn)生的，即熒光分子在吸收能量(光能、電能、化學能等等)后，從處于最低能量的基態(tài)躍遷到能量較高的激發(fā)態(tài)(第一或第二激發(fā)態(tài))，激發(fā)態(tài)的電子處于高能量狀態(tài)，不穩(wěn)定，會在納秒級的時間范圍內(nèi)自發(fā)的躍遷回到基態(tài)，并以光子輻射的形式釋放出能量，具有這種性質(zhì)的出射光稱為熒光。熒光成像的理論基礎(chǔ)是熒光物質(zhì)被激發(fā)后所發(fā)射的熒光信號的強度在一定的范圍內(nèi)與熒光素的量成線性關(guān)系。傳統(tǒng)的光學顯微成像即通過檢測這一自發(fā)輻射的熒光信號來成像的。

當處于激發(fā)態(tài)的熒光分子在外界輻射的影響下，產(chǎn)生與外界輻射同頻率、同相位和同偏振的輻射，即受激熒光輻射過程，如果這一過程競爭超過了自發(fā)熒光輻射，便不會測量到自發(fā)輻射的熒光，這種現(xiàn)象稱為STED(stimulated emission depletion，受激輻射耗盡)?；谠摤F(xiàn)象的光學顯微術(shù)屬于超分辨顯微成像技術(shù)，該方法從分子級別上改變成像原理，突破了傳統(tǒng)光學顯微成像因受衍射極限的限制而導致分辨率無法提高的瓶頸，得到了很大的發(fā)展。

STED超分辨成像原理及光路如圖1-1至1-3所示，待成像目標受到第一束激光激發(fā)產(chǎn)生熒光，形成具有衍射極限的圓斑(瑞利斑)，這個位置同時被第二束光束形狀為圓環(huán)的激光激發(fā)，第二束激光正好可以激發(fā)同一照射位置所形成光斑的非中心區(qū)域，兩束光疊加后使得只有中心區(qū)域的熒光分子能夠?qū)崿F(xiàn)激發(fā)態(tài)自發(fā)輻射熒光，周圍的分子(即被第二束光照射的區(qū)域)處于耗損態(tài)不發(fā)光，這就使得有效的熒光激發(fā)半徑大大的降低，即光斑中心熒光區(qū)域由于非中心的耗盡態(tài)區(qū)域的侵占，直徑可以變得無限小，這樣就突破了瑞利衍射極限，提高成像的分辨率。

現(xiàn)有技術(shù)中，STED超分辨成像方法雖然可以滿足分辨率的要求，但是讓分子從基態(tài)轉(zhuǎn)化為激發(fā)態(tài)的需要的能量比較大，強的泵浦激光會影響待成像目標的性質(zhì)甚至是造成損壞；而且，該方法通常需要使用脈沖激光，且對激光脈沖需做精準的時序同步，需要較復雜的光學與電子系統(tǒng)，增加了操作成本，無疑也增大了費用成本。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明實施例的目的是提供一種光學超分辨顯微成像系統(tǒng)，使用低功率連續(xù)光泵浦，實現(xiàn)對待成像目標的超分辨顯微成像，不影響待成像目標的性質(zhì)，而且光學系統(tǒng)與電子系統(tǒng)也相較STED簡單，節(jié)省了操作成本和費用成本。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明實施例提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明實施例提供了一種光學超分辨顯微成像系統(tǒng)，包括：

光學模塊以及成像模塊；

其中，所述光學模塊包括第一泵浦光單元、第二泵浦光單元以及第三泵浦光單元；

所述第一泵浦光單元用于利用第一波長光束照射待成像目標，以使所述待成像目標的分子初始化為第一電荷態(tài)；

所述第二泵浦光單元用于產(chǎn)生第二波長空心光束，并利用所述第二波長空心光束照射所述待成像目標，以使所述待成像目標第一預設(shè)位置范圍內(nèi)的分子轉(zhuǎn)化為第二電荷態(tài)；

所述第三泵浦光單元用于利用第三波長光束照射所述待成像目標第二預設(shè)位置范圍內(nèi)的分子，以輻射熒光信號；

所述成像模塊用于根據(jù)所述待成像目標輻射的熒光信號的光強信息對所述待成像目標進行成像。

優(yōu)選的，所述第一泵浦光單元包括：

光源，用于發(fā)射所述第一波長光束；

透鏡組，用于將所述第一波長光束聚焦到調(diào)制器，并將經(jīng)所述調(diào)制器出來的光準直為平行光束，再將其入射到所述待成像目標上；

所述調(diào)制器，用于將所述第一波長光束在預設(shè)時間范圍內(nèi)轉(zhuǎn)化為第一高階衍射光束。

優(yōu)選的，所述第二泵浦光單元包括：

光源，用于發(fā)射第二波長光束；

透鏡組，用于將所述第二波長光束聚焦到調(diào)制器，并將經(jīng)所述調(diào)制器出來的光準直為平行光束，再將其入射到所述待成像目標上；

所述調(diào)制器，用于將所述第一波長光束在預設(shè)時間范圍內(nèi)轉(zhuǎn)化為第二高階衍射光束；

螺旋相位片，用于將所述第二波長光束轉(zhuǎn)化為所述第二波長空心光束。

優(yōu)選的，所述第三泵浦光單元包括：

光源，用于發(fā)射所述第三波長光束；

透鏡組，用于將所述第三波長光束聚焦到調(diào)制器，并將經(jīng)所述調(diào)制器出來的光準直為平行光束，再將其入射到所述待成像目標上；

所述調(diào)制器，用于將所述第三波長光束在預設(shè)時間范圍內(nèi)轉(zhuǎn)化為第三高階衍射光束。

優(yōu)選的，所述光學模塊還包括：

合束單元，用于將三束泵浦光通過雙色片組和反射鏡合為一束，并通過物鏡聚焦到所述待成像目標上。

優(yōu)選的，所述成像模塊包括：

雙色片，用于將所述待成像目標輻射的熒光信號與泵浦光信號進行分離；

濾波片，用于將分離的熒光信號中摻入的泵浦光信號濾出；

探測器，用于收集過濾的熒光信號，并將所述熒光信號發(fā)送到控制單元；

透鏡，用于將所述過濾的熒光信號聚焦到所述探測器上；

位置掃描單元，用于將所述待成像目標的待測像素點移動到預設(shè)位置，以對所述待測像素點進行成像；

所述控制單元用于計算所述熒光信號的光強，并根據(jù)所述待成像目標輻射的熒光信號的光強與對應的位置對所述待成像目標進行成像。

優(yōu)選的，所述調(diào)制器為聲光調(diào)制器。

優(yōu)選的，所述控制單元包括數(shù)據(jù)采集卡和脈沖信號卡。

優(yōu)選的，所述探測器為單光子探測器。

本發(fā)明實施例另一方面提供了一種光學超分辨顯微成像方法，包括：

利用第一波長光束照射待成像目標，以使所述待成像目標的分子初始化為第一電荷態(tài)；

利用第二波長空心光束照射所述待成像目標，以使所述待成像目標第一預設(shè)位置范圍內(nèi)分子轉(zhuǎn)化為第二電荷態(tài)；

利用第三波長光束照射所述待成像目標第二預設(shè)位置范圍內(nèi)的分子，以輻射熒光信號；

根據(jù)所述待成像目標輻射的熒光信號的光強信息對所述待成像目標進行成像。

本發(fā)明實施例提供了一種光學超分辨顯微成像系統(tǒng)，包括光學模塊以及成像模塊；光學模塊用于通過第一波長光束以及第二波長光束照射待成像目標，以使待成像目標的分子初始化為第一電荷態(tài)以及在第一預設(shè)位置范圍內(nèi)分子轉(zhuǎn)化為第二電荷態(tài)；利用第三波長光束照射待成像目標第二預設(shè)位置范圍內(nèi)的分子，以輻射熒光信號；根據(jù)所述待成像目標輻射的熒光信號的光強信息對所述待成像目標進行成像。

本發(fā)明的優(yōu)點在于使用低功率連續(xù)光泵浦，實現(xiàn)了對待成像目標的超分辨顯微成像。與現(xiàn)有技術(shù)相比，由于電荷態(tài)較激發(fā)態(tài)(幾個納秒)的壽命較長，可達到秒量級，故功率較低的泵浦光便可控制待成像目標的電荷態(tài)，采用較低功率的泵浦光不影響待測樣品的性質(zhì)；此外，本申請技術(shù)方案不需要對激光脈沖做精準的時序同步，故光學系統(tǒng)與電子系統(tǒng)結(jié)構(gòu)也相較簡單，使用和組裝更加方便，節(jié)省了操作成本和費用成本，提高了用戶的使用體驗。此外，本發(fā)明實施例還提供了相應的使用方法，所述方法具有相應的優(yōu)點。

附圖說明

為了更清楚的說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單的介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1-1為本發(fā)明實施例提供的STED超分辨成像原理圖；

圖1-2為本發(fā)明實施例提供的STED超分辨成像與普通成像的光路圖；

圖1-3為本發(fā)明實施例提供的STED超分辨成像的實際光路圖；

圖2為本發(fā)明實施例提供的光學超分辨顯微成像系統(tǒng)的一種具體實施方式的結(jié)構(gòu)圖；

圖3為本發(fā)明實施例提供的光學超分辨顯微成像系統(tǒng)的另一種具體實施方式的結(jié)構(gòu)圖；

圖4為本發(fā)明實施例提供的控制信號與讀取信號序列圖；

圖5為本發(fā)明實施例提供的一個示例性應用場景的示意圖；

圖6為本發(fā)明實施例提供圖5中示例性例子的光學超分辨顯微成像系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖7為本發(fā)明實施例提供的圖5中示例性例子的成像示意圖；

圖8為本發(fā)明實施例提供的圖5中示例性例子的成像示意圖；

圖9為本發(fā)明實施例提供的一種光學超分辨顯微成像方法的流程示意圖。

具體實施方式

為了使本技術(shù)領(lǐng)域的人員更好地理解本發(fā)明方案，下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明作進一步的詳細說明。顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

本申請的說明書和權(quán)利要求書及上述附圖中的術(shù)語“第一”、“第二”、“第三”“第四”等是用于區(qū)別不同的對象，而不是用于描述特定的順序。此外術(shù)語“包括”和“具有”以及他們?nèi)魏巫冃?，意圖在于覆蓋不排他的包含。例如包含了一系列步驟或單元的過程、方法、系統(tǒng)、產(chǎn)品或設(shè)備沒有限定于已列出的步驟或單元，而是可包括沒有列出的步驟或單元。

首先參見圖2，圖2為本發(fā)明實施例提供的光學超分辨顯微成像系統(tǒng)在一種具體實施方式中的結(jié)構(gòu)圖，本發(fā)明實施例可包括以下內(nèi)容：

一種光學超分辨顯微成像系統(tǒng)可包括光學模塊21以及成像模塊22。

其中，所述光學模塊21包括第一泵浦光單元211、第二泵浦光單元212以及第三泵浦光單元213。

所述第一泵浦光單元211用于利用第一波長光束照射待成像目標，以使所述待成像目標的分子初始化為第一電荷態(tài)。

所述第二泵浦光單元212用于產(chǎn)生第二波長空心光束，并利用第二波長空心光束照射所述待成像目標，以使所述待成像目標第一預設(shè)位置范圍內(nèi)分子轉(zhuǎn)化為第二電荷態(tài)。

所述第三泵浦光單元213用于利用第三波長光束照射所述待成像目標第二預設(shè)位置范圍內(nèi)的分子，以輻射熒光信號。

待成像目標一般為熒光材料，或者是使用熒光材料進行修飾的材料，例如熒光蛋白標記的細胞。熒光材料通常存在著帶有不同電荷量的狀態(tài)，不同的電荷態(tài)的熒光光譜和強度不同，而且，電荷態(tài)的壽命較長，通?？蛇_到秒量級，而分子的激發(fā)態(tài)壽命僅僅為幾個納秒。

熒光材料的大多數(shù)分子在常態(tài)下，是處于具有最低能量的基態(tài)能級，當受到能量(光能、電能、化學能等等)激發(fā)后，該熒光材料會吸收能量進行躍遷。分子不同狀態(tài)的吸收的能量是不同的，可根據(jù)熒光材料分子的性質(zhì)確定使其躍遷到需求的分子狀態(tài)需要吸收的能量。也就是說不同的波長的光可將同一熒光材料的分子泵浦到不同的電荷態(tài)，舉例來說，對于金剛石中的氮-空位(nitrogen vacancy，NV)色心熒光材料來說，NV的電荷態(tài)主要為帶負電的NV^-以及電中性的NV⁰，使NV分子的電荷態(tài)變?yōu)镹V^-需要使用637nm激光進行泵浦，而使NV分子的電荷態(tài)變?yōu)镹V⁰則使用532nm激光進行泵浦。

第一波長光束、第二波長空心光束以及第三波長光束可以是激光光束，當然也可以為其他任何一種光，例如紅外光，紫外光，極光，X射線等等；當然也可為其他能量如電能、化學能，本發(fā)明實施例并不對此做任何的限定。

需要說明的是，由上可知第一波長光束(初始光)與待成像目標的分子處于第一電荷態(tài)相對應；第二波長光束(轉(zhuǎn)換光)與待成像目標的分子處于第二電荷態(tài)相對應。

第二波長空心光束需要在第二波長光束的基礎(chǔ)上進行轉(zhuǎn)換，例如激光光束為高斯形狀的光束，為了獲得空心形狀的光束，高斯光束可通過一片螺旋相位片進行轉(zhuǎn)化。相位片對光束相位按照入射面上的角分布進行不同的調(diào)制，從而獲得空心光束。

待成像目標的第一預設(shè)位置范圍為光束照射在待成像目標不包括空心光束空心對應照射位置的其他位置，也就是說當?shù)谝徊ㄩL光束與第二波長光束為同樣形狀的光時，第一預設(shè)位置范圍為第一波長光束照射在待成像目標的表面區(qū)域減去第二波長空心光束空心位置映射在待成像目標的區(qū)域。舉例來說，假設(shè)第一波長光束與第二波長光束皆為高斯光束，當其照射在待成像目標時，光束的直徑為1cm，第二波長空心光束的空心位置映射在待成像目標的直徑為0.1cm，則第一預設(shè)位置范圍為外直徑為1cm，內(nèi)直徑為0.1cm的圓環(huán)的區(qū)域。

第三波長光束作為探測光，照射第二預設(shè)位置范圍內(nèi)的熒光材料分子，使其吸收光能從當前的電荷態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，再從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，以光子輻射的形式釋放出能量，即發(fā)射熒光。

第二預設(shè)位置范圍可為第一預設(shè)位置范圍；也可為第一波長光束照射待成像目標的表面區(qū)域不包含第一預設(shè)位置范圍的其他任何區(qū)域，也可以是第二波長空心光束空心位置映射在待成像目標的區(qū)域；當然也可為任意指定的光束照射在待成像目標的表面區(qū)域上的任何一塊區(qū)域。可根據(jù)實驗者或用戶的需求來確定第二預設(shè)位置范圍的區(qū)域。

所述成像模塊22用于根據(jù)所述待成像目標輻射的熒光信號的光強信息對所述待成像目標進行成像。

成像模塊22通過獲取熒光并收集熒光，將收集到的熒光發(fā)送到控制單元，控制單元通過對收集到的熒光的光強進行計算，然后根據(jù)熒光光強信息通過軟件(例如MATLAB、LabVIEW)進行對待成像目標進行成像。

可選的，在本實施例的一些實施方式中，所述第一泵浦光單元211可包括：

光源2111，用于發(fā)射所述第一波長光束；

透鏡組2112，用于將所述第一波長光束聚焦到調(diào)制器，并將經(jīng)所述調(diào)制器出來的光準直為平行光束，再將其入射到所述待成像目標上；

所述調(diào)制器2113，用于將所述第一波長光束在預設(shè)時間范圍內(nèi)轉(zhuǎn)化為第一高階衍射光束。

所述第二泵浦光單元212包括：

光源2121，用于發(fā)射第二波長光束；

透鏡組2122，用于將所述第二波長光束聚焦到調(diào)制器，并將經(jīng)所述調(diào)制器出來的光準直為平行光束，再將其入射到所述待成像目標上；

所述調(diào)制器2123，用于將所述第一波長光束在預設(shè)時間范圍內(nèi)轉(zhuǎn)化為第二高階衍射光束；

螺旋相位片2124，用于將所述第二波長光束轉(zhuǎn)化為所述第二波長空心光束。

所述第三泵浦光單元213包括：

光源2131，用于發(fā)射所述第三波長光束；

透鏡組2132，用于將所述第三波長光束聚焦到調(diào)制器，并將經(jīng)所述調(diào)制器出來的光準直為平行光束，再將其入射到所述待成像目標上；

所述調(diào)制器2133，用于將所述第三波長光束在預設(shè)時間范圍內(nèi)轉(zhuǎn)化為第三高階衍射光束。

光源2111、光源2121、光源2131可為激光光源，也可為其他光源。激光光源可為半導體激光器，當然也可采用其他類型的激光器。因為激光光源的準直性高、亮度高、單色性好、能量密度大等優(yōu)勢，優(yōu)選的，可采用激光光源。

需要說明的是，光源2111、光源2121、光源2131可為同一臺機器發(fā)射的不同波長的光，也可為三臺不同的機器發(fā)射三束泵浦光。

調(diào)制器用于將當前的光束在預設(shè)時間范圍內(nèi)轉(zhuǎn)化為高階衍射光束，即用來控制各光源的開關(guān)和持續(xù)時間。調(diào)制器的個數(shù)與光源的個數(shù)相對應，舉例來說，如果三束泵浦光由一臺半導體激光器產(chǎn)出。則只需要一臺調(diào)制器。

調(diào)制器可置于光束焦點處，調(diào)整調(diào)制器的三維位置與角度，使光束通過調(diào)制器后發(fā)生衍射，產(chǎn)生高階衍射光束。調(diào)制器可通過控制單元發(fā)射預設(shè)信號來控制，當對調(diào)制器加信號后，可以得到高階衍射光。舉例來說，當調(diào)制器接收控制單元發(fā)射的高電壓TTL信號時，調(diào)制器將泵浦光轉(zhuǎn)化為高階衍射光束輸出；當接收低電壓TTL信號時，則調(diào)制器不輸出光束。

優(yōu)選的，調(diào)制器可采用聲光調(diào)制器，高階衍射光可為聲光調(diào)制器的1階衍射光，其衍射效率可達百分之八十左右，消光比約為2000：1。TTL控制信號可由插置于控制單元的PCI卡產(chǎn)生，并通過LabView程序進行控制。通過采用調(diào)制器對光源照射時間的控制和光源的開啟和關(guān)閉，避免用戶自己操作，節(jié)約操作成本，提升用戶的使用體驗；此外，經(jīng)過調(diào)整后的光束可以獲得更好的成像效果。

透鏡組主要用于對光源出射的光進行整形，使其達到最好的成像效果。例如可采用焦距為15cm的凸透鏡將三束不同波長的光束由平行光聚焦到凸透鏡焦點，使其全部或大多數(shù)的光可通過下一個器件。經(jīng)過調(diào)制器后，光束可通過另外一個15cm焦距的凸透鏡將光束重新準直為平行光束。

優(yōu)選的，可采用美國RPC Photonics公司的VPP-1a螺旋相位片，獲得的空心光束中心光功率密度與最高光密度之比約為2：100。

需要說明的是，三束泵浦光可以同時照射帶成像目標，也可依次進行照射，當然也可根據(jù)預設(shè)的時間進行照射，預設(shè)的時間一般為多次實驗總結(jié)出效果最好的的照射時間。舉例來說，初始光照射時間為10微秒，轉(zhuǎn)換光照射時間為10微秒，探測光照射時間為1毫秒。

作為一種具體實施方式，請參閱圖3，上述實施例中的光學模塊還可還包括：

合束單元，用于將三束泵浦光通過雙色片組和反射鏡合為一束，并通過物鏡聚焦到所述待成像目標上。

第一波長光束(初始化光)通過凸透鏡準直的平行光經(jīng)過反射鏡投射到第一雙色片，第二波長空心光束(轉(zhuǎn)換光)通過凸透鏡準直的平行光入射到第一雙色片，第三波長光束(探測光)通過凸透鏡準直的平行光入射到第二雙色片，初始化光與轉(zhuǎn)換光通過第一雙色片入射到第二雙色片后再入射到第三雙色片，從第三雙色片出射的三束光通過第三雙色片入射到物鏡上，通過物鏡將三束光聚焦到待成像目標。優(yōu)選的，物鏡的數(shù)值孔徑可為NA＝0.9。調(diào)節(jié)雙色片的位置與角度，使三束激光光束通過物鏡后的聚焦點能夠完美重合。

需要說明的是，當三束光分別在各自的預設(shè)時間內(nèi)依次照射待成像目標時，則不需要合束單元。

通過將三束泵浦光進行合束，使其全部或絕大多數(shù)的光照射到待成像目標上，從而獲取更多的熒光信號，有利于對待成像目標進行成像。

在本實施例的另一些實施方式中，請參閱圖3，成像模塊22可包括：

熒光收集單元221，用于對待成像目標輻射的熒光光子進行收集，具體包括：

雙色片2211，用于所述待成像目標輻射的熒光信號與泵浦光信號進行分離。

濾波片2212，用于將分離的熒光信號中摻入的泵浦光信號濾出。

探測器2213，用于收集過濾的熒光信號，并將所述熒光信號發(fā)送到控制單元。

透鏡2214，用于將所述過濾的熒光信號聚焦到所述探測器上。

位置掃描單元222，用于將所述待成像目標的待測像素點移動到預設(shè)位置，以對所述待測像素點進行成像。

所述控制單元223用于計算所述熒光信號的光強，并根據(jù)所述待成像目標輻射的熒光信號的光強與對應的位置對所述待成像目標進行成像。

因為泵浦光照射到待成像目標上，然后待成像目標會自發(fā)輻射熒光光子，這樣不可避免的泵浦光與熒光會有重合，而熒光的光強較弱，與泵浦光混合后難以識別，故需要雙色片進行分離；此外，由于兩者光強懸殊太大，導致熒光中只要混較少的泵浦光，對收集等后續(xù)操作都是不利的，故還需要經(jīng)過濾波片進行進一步的過濾，將熒光信號中摻入的泵浦光濾出，以得到純度較高的熒光光子，獲得更佳的成像效果。

需要說明的是，雙色片2211與實施例中的第三雙色片可以為同一片雙色片，即雙色片2211即為第三雙色片，這樣即可以節(jié)省材料和成本，又可簡化系統(tǒng)結(jié)構(gòu)。

優(yōu)選的，可采用單光子探測器進行收集熒光光子，熒光光束可由一個7.5cm焦距的凸透鏡聚焦到單光子探測器。每當一個熒光光子被測量到，單光子探測器將發(fā)出一個TTL脈沖信號。TTL信號被控制單元的數(shù)據(jù)采集卡記錄，從而得到熒光強度數(shù)值。

對待成像目標進行成像時，可以直接對整個目標進行成像，也可按照每一個像素點進行成像，優(yōu)選的，可采用第二種方式。通過位置掃描單元將待成像目標的待測像素點移動到探測位置，對每一個像素點輻射的熒光進行收集，然后根據(jù)該像素點的位置與光強的關(guān)系利用控制單元進行成像。位置掃描系統(tǒng)可為壓電陶瓷位移臺，壓電陶瓷位移臺可采購德國PI公司P733.3系列，位置掃描系統(tǒng)可通過控制單元進行控制，即通過控制單元控制壓電平移臺將樣品移動到下一個位置，依次完成對每一個像素點的熒光強度的測量。

舉例來說，以二維成像為例，在對面積為2微米*2微米的待成像目標進行成像時，可將成像區(qū)域分為40*40個像素點，每個像素點大小則為50納米＊50納米。利用壓電平移臺將樣品依次移動到40*40個坐標，分別測量每個坐標點的熒光強度，對該待成像目標進行光學超分辨成像。

控制單元，可由電腦以及整合到電腦主板的數(shù)據(jù)采集卡和脈沖信號發(fā)生卡構(gòu)成，數(shù)據(jù)采集卡可采購美國NI公司的USB6343系列，脈沖信號發(fā)生卡可采購美國Spincore公司生產(chǎn)的PCI脈沖卡?？刂葡到y(tǒng)可基于LabVIEW軟件編寫，可用于對光源開關(guān)和位置移動的控制，獲取的熒光強度和位置信息也可通過LabVIEW程序?qū)崿F(xiàn)最終的成像。

需要說明的是，對待成像目標或每一個像素點進行成像時，通常需要對每一塊區(qū)域或每一個像素點循環(huán)多次以獲得足夠的熒光光子計數(shù)。也就是說初始光、轉(zhuǎn)化光、探測光需要循環(huán)多次。這樣，通過獲得足夠多的熒光光子，得到較高的光強值，有利于對待成像目標進行超分辨成像。

在一種具體的實施方式，舉例來說，可參見圖5，圖5為控制信號與讀取信號序列圖。對一個像素點進行收集熒光光子時，可采用初始光照射10微秒，轉(zhuǎn)換光照射20微秒，探測光照射10微秒，然后初始光、轉(zhuǎn)化光、探測光在50毫秒內(nèi)循環(huán)多次進行。

為了更好的理解本發(fā)明實施例的原理和思想，請參閱圖5至圖8，以下以一種具體的應用場景介紹利用本發(fā)明實施例所述的光學超分辨顯微成像系統(tǒng)對金剛石中的NV(nitrogen vacancy，氮-空位)色心熒光材料進行光學超分辨顯微成像。

NV有兩種電荷態(tài)，帶負電的NV^-，以及電中性的NV⁰。如圖5所示，637納米激光可將NV以95％的概率泵浦到NV⁰電荷態(tài)；而532納米激光可將NV以75％的概率泵浦到NV^-電荷態(tài)。589納米激光可用于對電荷態(tài)進行探測。由于NV^-輻射的熒光波長比NV⁰輻射的熒光波長更長，可采用在光路中加入650納米長通濾波片濾出NV⁰輻射的光子，從而只探測NV^-輻射的光子。

如圖6所示，為對NV進行光學超分辨成像的光路及系統(tǒng)圖。圖中1為第一波長光束(初始光)，2為第三波長光束(探測光)，3為第二波長光束(轉(zhuǎn)換光)，三束光通過半導體激光器同時發(fā)射；4為凸透鏡，用于對光束進行準直；5為聲光調(diào)制器，用于對光束的開閉進行控制以及將光束調(diào)制為一階衍射光，聲光調(diào)制器通過控制單元的脈沖信號發(fā)生卡141進行控制；6為螺旋相位片用于將第二波長光束調(diào)制為空心光束；反射鏡10、雙色片7-1、7-2、7-3用于對三束泵浦光進行合束將其照射到待成像目標9上；8物鏡用于進一步將合束后的光聚焦到待成像目標9上；7-3雙色片與11濾波片為了對熒光中的泵浦光進行分離得到純度較高的熒光；熒光經(jīng)過凸透鏡12與4聚焦到單光子探測器13上進行熒光的收集；單光子探測器收集到一個熒光光子，便將發(fā)出一個TTL脈沖信號，TTL信號被控制單元14的數(shù)據(jù)采集卡142記錄，從而得到熒光強度數(shù)值。

電荷態(tài)的壽命較長，通?？蛇_到秒量級，因此可以使用功率較低的光束控制電荷態(tài)。而受激輻射耗盡技術(shù)中，需要控制的是熒光材料的激發(fā)態(tài)，其壽命僅為幾個納秒，自發(fā)輻射速率較大。為了實現(xiàn)對熒光強度的控制，其激光泵浦的受激輻射耗盡速率需要大于其自發(fā)輻射速率。受激輻射耗盡的激光功率較高，通常達到上百毫瓦；相反本發(fā)明的激光功率僅需幾毫瓦便可獲得較高的分辨率。因637和532納米激光均能用作成像的初始化光或轉(zhuǎn)化光，有兩種實現(xiàn)超分辨成像的方案。

請參閱圖7，以637納米激光為初始化光，532納米光為轉(zhuǎn)化光實現(xiàn)超分辨成像：

對于每一個像素點的熒光測量，首先用一束功率為2毫瓦的637納米高斯光束將NV初始化到NV⁰，光束的持續(xù)時間可為10微秒；然后用30毫瓦的532納米空心光束將除光束中心以外的NV的電荷態(tài)轉(zhuǎn)化為NV^-，光束的持續(xù)時間也可為10微秒；最后用40微瓦的589納米高斯光束泵浦，并用單光子計數(shù)器測量NV^-電荷態(tài)對應的光子數(shù)。“初始化-轉(zhuǎn)化-探測”序列循環(huán)50毫秒，然后通過壓電平移臺控制NV待成像目標進行移動，測量下一個像素點的熒光強度。由于光束中心的NV始終處于NV⁰態(tài)，而探測的是NV^-態(tài)的熒光，最后得到的圖像中每個暗點代表一個NV。在這樣的泵浦條件下，得到的單個NV的分辨率達約為25納米，遠低于350納米左右的衍射極限。

請參閱圖8，以532納米激光為初始化光，637納米激光為轉(zhuǎn)化光實現(xiàn)超分辨成像：

首先用一束功率為2毫瓦的532納米高斯光束將NV初始化NV^-，光束的持續(xù)時間可為10微秒；然后用30毫瓦的637納米空心光束將除光束中心以外的NV的電荷態(tài)轉(zhuǎn)化為NV⁰，光束的持續(xù)時間為10微秒；最后用40微瓦的589納米高斯光束泵浦，并測量NV^-電荷態(tài)輻射的光子數(shù)。每一個像素點的熒光測量時間同樣為50毫秒。由于光束中心的NV處于NV^-電荷態(tài)，最后得到的圖像中每個亮點代表一個NV。在這樣的泵浦條件下，得到的單個NV的分辨率達約為45納米，同樣遠低于衍射極限。

由上可知，本發(fā)明實施例使用低功率連續(xù)光泵浦，不僅實現(xiàn)了對待成像目標的超分辨顯微成像，而且不影響待成像目標的性質(zhì)，與現(xiàn)有技術(shù)相比，不需要對激光脈沖做精準的時序同步，故光學與電子系統(tǒng)結(jié)構(gòu)也相較簡單，使用和組裝更加方便，節(jié)省了操作成本和費用成本，提高了用戶的使用體驗。

本發(fā)明實施例還針對上述實施例所述的光學超分辨顯微成像系統(tǒng)提供了相應的使用方法。下文描述的光學超分辨顯微成像方法與上文描述的光學超分辨顯微成像系統(tǒng)可相互對應參照。

請參閱圖9，圖9為本發(fā)明實施例提供的一種光學超分辨顯微成像方法的流程示意圖，本發(fā)明實施例可包括以下內(nèi)容：

S901：利用第一波長光束照射待成像目標，以使所述待成像目標的分子初始化為第一電荷態(tài)；

S902：利用第二波長空心光束照射所述待成像目標，以使所述待成像目標第一預設(shè)位置范圍內(nèi)分子轉(zhuǎn)化為第二電荷態(tài)；

S903：利用第三波長光束照射所述待成像目標第二預設(shè)位置范圍內(nèi)的分子，以輻射熒光信號；

S904：根據(jù)所述待成像目標輻射的熒光信號的光強信息對所述待成像目標進行成像。

本發(fā)明實施例所述的光學超分辨顯微成像方法的具體實現(xiàn)過程可參照上述實施例中光學超分辨顯微成像系統(tǒng)的各功能模塊的具體實現(xiàn)，此處就不再贅述。

由上可知，本發(fā)明實施例使用低功率連續(xù)光泵浦，不僅實現(xiàn)了對待成像目標的超分辨顯微成像，而且不影響待成像目標的性質(zhì)，與現(xiàn)有技術(shù)相比，不需要對激光脈沖做精準的時序同步，故光學與電子系統(tǒng)結(jié)構(gòu)也相較簡單，使用和組裝更加方便，節(jié)省了操作成本和費用成本，提高了用戶的使用體驗。

本說明書中各個實施例采用遞進的方式描述，每個實施例重點說明的都是與其它實施例的不同之處，各個實施例之間相同或相似部分互相參見即可。對于實施例公開的裝置而言，由于其與實施例公開的方法相對應，所以描述的比較簡單，相關(guān)之處參見方法部分說明即可。

專業(yè)人員還可以進一步意識到，結(jié)合本文中所公開的實施例描述的各示例的單元及算法步驟，能夠以電子硬件、計算機軟件或者二者的結(jié)合來實現(xiàn)，為了清楚地說明硬件和軟件的可互換性，在上述說明中已經(jīng)按照功能一般性地描述了各示例的組成及步驟。這些功能究竟以硬件還是軟件方式來執(zhí)行，取決于技術(shù)方案的特定應用和設(shè)計約束條件。專業(yè)技術(shù)人員可以對每個特定的應用來使用不同方法來實現(xiàn)所描述的功能，但是這種實現(xiàn)不應認為超出本發(fā)明的范圍。

結(jié)合本文中所公開的實施例描述的方法或算法的步驟可以直接用硬件、處理器執(zhí)行的軟件模塊，或者二者的結(jié)合來實施。軟件模塊可以置于隨機存儲器(RAM)、內(nèi)存、只讀存儲器(ROM)、電可編程ROM、電可擦除可編程ROM、寄存器、硬盤、可移動磁盤、CD-ROM、或技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)所公知的任意其它形式的存儲介質(zhì)中。

以上對本發(fā)明所提供的光學超分辨顯微成像系統(tǒng)及方法進行了詳細介紹。本文中應用了具體個例對本發(fā)明的原理及實施方式進行了闡述，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。