本發(fā)明涉及體外檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種血清透明質(zhì)酸化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒及其制備方法。

背景技術(shù)：

透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid，下文簡寫為HA)是一種大分子氨基多糖，由N-乙酰氨基葡萄糖及D-葡萄糖醛酸的重復(fù)結(jié)構(gòu)組成線形多糖結(jié)構(gòu)，由間質(zhì)細(xì)胞合成。HA主要在肝臟內(nèi)代謝，當(dāng)肝硬化肝損害，內(nèi)皮細(xì)胞同時(shí)受損，攝取與分解HA的能力下降，導(dǎo)致HA增多，因此，HA是肝硬化的一個(gè)良好血清學(xué)指標(biāo)。另外，HA還有助于肝病的診斷和鑒別診斷、病情判斷和預(yù)后評估，還是抗纖維化藥物治療的一個(gè)非常重要的動態(tài)觀察手段。

目前臨床檢測透明質(zhì)酸的常見方法有酶聯(lián)免疫吸附法、放射免疫分析法、酶促化學(xué)發(fā)光法，但這些方法都存在著一些不足之處。

一、酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)被廣泛應(yīng)用，但該方法也存在著下述的不足之處：

(1)使用12×8型、6×8型、8×12型或整板型96孔專用微孔板作為抗體包被用具和反應(yīng)容器，在使用時(shí)只能分成12批次、6批次、8批次或整板一次使用，無法進(jìn)行獨(dú)立的、單人份的檢測；

(2)定量測定所用的試劑種類較多，每一種檢測試劑都要用試劑瓶來盛裝，并且每使用一種試劑時(shí)都需要更換吸液嘴來分別加注到微孔板的微孔中，不但試劑瓶種類多，加注試劑的操作也極為繁瑣；

(3)缺少對檢測信息的相應(yīng)標(biāo)注，只能通過查看試劑盒外包裝盒的標(biāo)識才能了解或知悉檢測試劑的生產(chǎn)批號及有效期信息，而且所知悉的信息在檢測過程中不受控，具有很大的隨意性；

(4)檢測試劑在檢測過程中處于開放的空間，容易引起各種試劑之間的交叉污染而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性；

(5)檢測過程多采用手工操作，試劑或樣本的加量不很精確，操作過程極為繁瑣和復(fù)雜，容易發(fā)生操作差錯(cuò)，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度較差；

(6)在檢測項(xiàng)目成套試劑的數(shù)量配置及使用上均為項(xiàng)目數(shù)×48/96人份，如果需要檢測10個(gè)項(xiàng)目，則試劑的配置及使用數(shù)須為10×48/96人份，如果只有一份樣本需要檢測10個(gè)不同的項(xiàng)目，也需要配置10×48/96人份的試劑，存在著不夠經(jīng)濟(jì)合理的缺點(diǎn)。

二、放射免疫分析法

放射免疫分析方法放射性污染大、加樣步驟繁瑣、操作復(fù)雜、操作時(shí)間長、測定結(jié)果不穩(wěn)定、試劑保存時(shí)間短、試劑盒操作自動化程度低、配套儀器價(jià)格昂貴等不足之處。

二、化學(xué)發(fā)光法

化學(xué)發(fā)光法按發(fā)光原理可分為直接化學(xué)發(fā)光和酶促化學(xué)發(fā)光。

酶促化學(xué)發(fā)光主要有辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶兩種，但都有一定的局限性，辣根過氧化物酶主要缺點(diǎn)為：魯米諾在沒有辣根過氧化物酶存在情況下，也會被H2O2氧化自身發(fā)光，本底相對較高，影響信噪比，反應(yīng)動力學(xué)復(fù)雜，影響因素多，結(jié)果不夠穩(wěn)定，要得到靈敏度高且平臺期長的底物不容易。堿性磷酸酶主要缺點(diǎn)為：底物達(dá)到平臺期的時(shí)間長，底物成本高，導(dǎo)致檢測成本高，患者負(fù)擔(dān)重。

吖啶酯作為標(biāo)記物的直接化學(xué)發(fā)光相比酶促化學(xué)發(fā)光具有明顯優(yōu)勢，主要表現(xiàn)在：反應(yīng)不需要催化劑，只要堿性環(huán)境即可進(jìn)行，反應(yīng)迅速，背景發(fā)光低，信噪比高，干擾因素少，試劑穩(wěn)定性好，可以兩點(diǎn)定標(biāo)，體系簡單，激發(fā)液成本低，吖啶酯易與蛋白質(zhì)聯(lián)結(jié)，且聯(lián)結(jié)后光子產(chǎn)率不減少。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，有必要提供一種檢測靈敏度較高的血清透明質(zhì)酸化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒及其制備方法。

一種血清透明質(zhì)酸化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒，包括：血清透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白包被的羧基化的磁微粒和透明質(zhì)酸標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。

所述血清透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白包被的羧基化的磁微粒中，所述血清透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白與所述羧基化的磁微粒的比例為1：25～35。

所述透明質(zhì)酸標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物中，所述透明質(zhì)酸與所述化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的比例為50：1～10。

所述羧基化的磁微粒的粒徑為0.05μm～1μm。

所述化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物為魯米諾、異魯米諾、三聯(lián)吡啶釕或吖啶酯。

所述的血清透明質(zhì)酸化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒，還包括化學(xué)發(fā)光底物液，所述化學(xué)發(fā)光底物液包括A液和B液。

所述A液為H₂O₂溶液，所述B液為NaOH溶液。

所述的血清透明質(zhì)酸化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒，還包括血清透明質(zhì)酸定標(biāo)品。

在一個(gè)實(shí)施例中，所述血清透明質(zhì)酸定標(biāo)品為濃度分別為

0ng/mL,100ng/mL,500ng/mL,1000ng/mL,1500ng/mL,2000ng/mL的血清透明質(zhì)酸的溶液。

一種上述的血清透明質(zhì)酸化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒的制備方法，包括如下步驟：

取羧基化的磁微粒的懸浮液，磁分離去上清后用MES緩沖液重懸，接著加入EDC水溶液，活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接著加入透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白，室溫下混懸2h～10h，磁分離去除上清后用Tris緩沖液重懸，得到透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白包被的羧基化的磁微粒；以及

取透明質(zhì)酸，加入碳酸鹽緩沖液后混勻，然后加入化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物后混勻，室溫下避光反應(yīng)1h～2h后除雜，得到透明質(zhì)酸標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。

這種血清透明質(zhì)酸化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒能夠以全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀為檢測工具，完成血清透明質(zhì)酸的檢測。這種血清透明質(zhì)酸化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，其檢測靈敏度達(dá)到2.0ng/mL，相對于傳統(tǒng)的血清透明質(zhì)酸的檢測方法靈敏度至少提高了10倍，這種血清透明質(zhì)酸化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒的檢測精度較高。

附圖說明

圖1為一實(shí)施方式的血清透明質(zhì)酸化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒的制備方法的流程圖；

圖2為實(shí)施例3得到的血清透明質(zhì)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明的具體實(shí)施方式做詳細(xì)的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進(jìn)，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實(shí)施的限制。

一實(shí)施方式的血清透明質(zhì)酸化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒，包括：透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白包被的羧基化的磁微粒和透明質(zhì)酸標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。

優(yōu)選的，透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白包被的羧基化的磁微粒中，透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白與羧基化的磁微粒的比例為1：25～35。

優(yōu)選的，血清透明質(zhì)酸標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物中，透明質(zhì)酸與化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的比例為50：1～10。

優(yōu)選的，羧基化的磁微粒的粒徑為0.05μm～1μm。

化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物可以為魯米諾、異魯米諾、三聯(lián)吡啶釕或吖啶酯。其中，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物優(yōu)選為吖啶酯。

在其他的實(shí)施例中，上述血清透明質(zhì)酸化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒還包括化學(xué)發(fā)光底物液。

化學(xué)發(fā)光底物液包括A液和B液。A液可以為H₂O₂溶液，B液可以為NaOH溶液。

本實(shí)施例中，A液為濃度為0.1mol/L的H₂O₂溶液，B液為濃度為0.25mol/L的NaOH溶液。

在其他的實(shí)施例中，上述血清透明質(zhì)酸化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒還包括血清透明質(zhì)酸定標(biāo)品。

血清透明質(zhì)酸定標(biāo)品為濃度分別為0ng/mL,100ng/mL,500ng/mL,1000ng/mL,1500ng/mL,2000ng/mL的透明質(zhì)酸的溶液。

具體的，透明質(zhì)酸定標(biāo)品可以采用標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液將透明質(zhì)酸配制成濃度分別為0ng/mL,100ng/mL,500ng/mL,1000ng/mL,1500ng/mL,2000ng/mL的透明質(zhì)酸的溶液。

這種血清透明質(zhì)酸化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒用于血清透明質(zhì)酸檢測時(shí)，利用全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀對透明質(zhì)酸定標(biāo)品進(jìn)行檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，內(nèi)置于電腦軟件；接著測試實(shí)際樣本，根據(jù)樣本發(fā)光值計(jì)算樣本濃度；最后對血清透明質(zhì)酸全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)進(jìn)行性能(靈敏度、線性、精密度、干擾性)的評價(jià)。

這種血清透明質(zhì)酸化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒能夠以全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀為檢測工具，完成血清透明質(zhì)酸的檢測這種血清透明質(zhì)酸化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，其檢測靈敏度達(dá)到2.0ng/mL，相對于傳統(tǒng)的血清透明質(zhì)酸的檢測方法靈敏度至少提高了10倍，這種血清透明質(zhì)酸化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒的檢測精度較高。

此外，這種血清透明質(zhì)酸化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒還具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、選擇吖啶酯作為標(biāo)記材料，并應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)，該發(fā)光體系為直接化學(xué)發(fā)光，與傳統(tǒng)的酶促化學(xué)發(fā)光相比，該反應(yīng)不需要酶的參與，更加節(jié)約成本；

2、選用吖啶酯的化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)線性范圍寬，能達(dá)到

2.0ng/mL-2000ng/mL。，而傳統(tǒng)的血清透明質(zhì)酸的檢測方法的檢線性范圍為20ng/mL～1000ng/mL；

3、吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)重復(fù)性高，批內(nèi)及批間差均在5％以內(nèi)，這是其它化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)難以達(dá)到的；

4、化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)已實(shí)現(xiàn)樣本的定量，通過內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線到測試軟件，只需測試樣本就可直接得到樣本的濃度值；

5、化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)全自動化，試劑及樣本的添加全有儀器完成，操作更加簡便，減少了人為的誤差。

如圖1所示的上述血清透明質(zhì)酸化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒的制備方法，包括如下步驟：

取羧基化的磁微粒的懸浮液，磁分離去上清后用MES緩沖液重懸，接著加入EDC水溶液，活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接著加入透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白，室溫下混懸2h～10h，磁分離去除上清后用Tris緩沖液重懸，得到透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白包被的羧基化的磁微粒。

MES(2-(N-嗎啡啉)乙磺酸)緩沖液的濃度為0.02M，pH為5.5。

Tris緩沖液的濃度為0.1M并且含有2％BSA，pH為8.0。

EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺)水溶液的濃度為10mg/mL～20mg/mL，EDC與羧基化的磁微粒的比例為0.05：0.1～1。

優(yōu)選的，透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白包被的羧基化的磁微粒中，透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白與羧基化的磁微粒的比例為1：25～35。

優(yōu)選的，羧基化的磁微粒的粒徑為0.05μm～1μm。

取透明質(zhì)酸，加入碳酸鹽緩沖液后混勻，然后加入化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物后混勻，室溫下避光反應(yīng)1h～2h后除雜，得到血清透明質(zhì)酸標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。

碳酸鹽緩沖液濃度為0.1M，pH為9.0～9.5，

除雜的操作為離心脫鹽柱脫鹽，具體操作為：先分別用純凈水及TBS緩沖液(40mM Tris-HCl，0.5％BSA，1％NaCl，pH 8.0)處理離心脫鹽柱，最后加入得到的透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白包被的羧基化的磁微粒的溶液，最后收集離心管中的液體。

優(yōu)選的，透明質(zhì)酸標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物中，透明質(zhì)酸與化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的比例為50：1～10。

化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物可以為魯米諾、異魯米諾、三聯(lián)吡啶釕或吖啶酯。其中，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物優(yōu)選為吖啶酯。

得到的透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白包被的羧基化的磁微粒和透明質(zhì)酸標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物組合即可得到上述血清透明質(zhì)酸化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒。

這種血清透明質(zhì)酸化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒在使用時(shí)，還需要化學(xué)發(fā)光底物液和血清透明質(zhì)酸定標(biāo)品。

化學(xué)發(fā)光底物液和血清透明質(zhì)酸定標(biāo)品可以自行配制得到。

化學(xué)發(fā)光底物液包括A液和B液。A液可以為H₂O₂溶液，B液可以為NaOH溶液。

本實(shí)施例中，A液為濃度為0.1mol/L的H₂O₂溶液，B液為濃度為0.25mol/L的NaOH溶液。

具體的，血清透明質(zhì)酸定標(biāo)品可以采用標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液將透明質(zhì)酸配制成濃度分別為0ng/mL,100ng/mL,500ng/mL,1000ng/mL,1500ng/mL,2000ng/mL的透明質(zhì)酸的溶液。

這種血清透明質(zhì)酸化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒的制備方法簡單方便，制得的血清透明質(zhì)酸化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒的檢測靈敏度較高，具有良好的應(yīng)用前景。

以下為具體實(shí)施例。

實(shí)施例1：血清透明質(zhì)酸化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒的制備

(1)血清透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白包被的羧基化的磁微粒的制備：

取含有50mg粒徑為0.05μm～1μm的羧基化的磁微粒(MagnaBindTM，貨號21353)懸浮液，磁分離去上清，用0.02M，pH為5.5MES緩沖液重懸，加入1mL新配置的10mg/mL的EDC水溶液，活化磁珠表面羧基，加入4mg透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白(biorbyt，貨號orb48780)，室溫下混懸6h，磁分離，去除上清，用含2％BSA的0.1M，pH為8.0的Tris緩沖液重懸到1mg/mL，得到透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白包被的羧基化的磁微粒，每瓶5mL分裝保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

(2)血清透明質(zhì)酸標(biāo)記的吖啶酯的制備：

取50μL濃度為25mg/mL的透明質(zhì)酸，加入150μL濃度為0.1M、pH為9.0～9.5的碳酸鹽緩沖液，混勻，然后加入1.5μL濃度為5mg/mL的吖啶酯溶液混勻，室溫下避光反應(yīng)，1.5h后取出，用2mL的zeba離心脫鹽柱脫鹽處理，脫鹽過程中首先分別用純凈水及TBS緩沖液進(jìn)行處理，最后加入得到的透明質(zhì)酸標(biāo)記的吖啶酯溶液，收集離心管中的液體至保存管得到血清透明質(zhì)酸標(biāo)記的吖啶酯，每瓶5mL分裝保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

(3)血清透明質(zhì)酸定標(biāo)品的制備：

用標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液(40mM Tris-HCl，0.5％BSA，1％NaCl，pH 8.0)將透明質(zhì)酸配置成濃度為0ng/mL,100ng/mL,500ng/mL,1000ng/mL,1500ng/mL,2000ng/mL，每瓶0.5mL分裝凍干，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例2：血清透明質(zhì)酸化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法

以全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(YHLO，貨號iFlash3000)為檢測工具，方法學(xué)模式為競爭法，即儀器依次加入50μL的樣品、50μL的血清透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白包被的羧基化的磁微粒及50μL的透明質(zhì)酸包被的吖啶酯，反應(yīng)20min后，進(jìn)行磁分離，儀器將反應(yīng)混合物送入暗室，依次加入發(fā)光底物A液(H₂O₂)及B液(NaOH)進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，最后記錄發(fā)光值。

實(shí)施例3：血清透明質(zhì)酸化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒性能評價(jià)

采用實(shí)施例2中的方法對血清透明質(zhì)酸定標(biāo)品進(jìn)行檢測，得到繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

接著對接著測試實(shí)際樣本，根據(jù)樣本發(fā)光值計(jì)算樣本濃度。

靈敏度的檢測：

參照CLSI EP17-A文件推薦實(shí)驗(yàn)方案，計(jì)算血清透明質(zhì)酸化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒的靈敏度，求得的靈敏度為0.68ng/mL。

線性的檢測：

對濃度為0ng/mL,100ng/mL,500ng/mL,1000ng/mL,1500ng/mL,2000ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品做線性分析，計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)，r＝0.9996，另外，該試劑盒對血清透明質(zhì)酸樣品檢測的線性范圍為20ng/mL～1000ng/mL。

精密度測定：

取濃度為500ng/mL及1000ng/mL兩個(gè)血清透明質(zhì)酸樣品，每個(gè)樣本每個(gè)濃度各做3個(gè)平行，用三批試劑盒進(jìn)行檢測，計(jì)算試劑盒批內(nèi)及批間差，結(jié)果表明該試劑盒批內(nèi)及批間差均小于5％。

干擾性實(shí)驗(yàn)：

取混合血清分別添加干擾物包括：結(jié)合膽紅素、游離膽紅素、血紅蛋白、抗壞血酸、甘油酯，添加比例按照1：20進(jìn)行，分別測定混合血清及添加了各種干擾物后混合血清的測值，計(jì)算二者之間的偏差，以±10％為可接受范圍。結(jié)果表明，干擾性均達(dá)到NCCLS的文件標(biāo)準(zhǔn)，可用于臨床實(shí)驗(yàn)室血清透明質(zhì)酸狀況的準(zhǔn)確評估。

實(shí)施例4、血清透明質(zhì)酸化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒的對比實(shí)驗(yàn)

分別用化學(xué)發(fā)光檢測方法和傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法對濃度約為0ng/mL的血清透明質(zhì)酸樣品做檢測，兩種方法檢測靈敏度相比，數(shù)據(jù)如下表所示：

由上表可以看出，化學(xué)發(fā)光檢測方法的靈敏度較酶聯(lián)免疫吸附法提高了約20倍。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。