本發(fā)明涉及一種非洲爪蟾胰高血糖素樣肽-1(glp-1)類似物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

糖尿病(diabetesmellitus)是一種與遺傳因素有關(guān)，又與多種環(huán)境因素相關(guān)的慢性全身性疾病，是由于體內(nèi)胰島素分泌的絕對(duì)或相對(duì)不足而引起的糖、脂肪、蛋白質(zhì)的代謝紊亂，可分為胰島素依賴型糖尿病(1型)和非胰島素依賴型糖尿病(2型)，其中2型患者占糖尿病病例的80％以上。糖尿病是一種全球性的高發(fā)病，據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)，到2025年全世界糖尿病患者將達(dá)到3億。中國(guó)近期一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告表明，中國(guó)糖尿病患病率高達(dá)9.7％，遠(yuǎn)高于全球平均患病率6.4％，按此患病率估算，我國(guó)糖尿病患病人數(shù)已超過9000萬，并且還有約1.5億潛在的糖尿病危險(xiǎn)人群。目前對(duì)于1型糖尿病的治療，研究方向是開發(fā)給藥方便、有效的胰島素制劑及代用品。而對(duì)于2型糖尿病的治療，臨床治療手段主要是使用口服降糖藥物，傳統(tǒng)的磺酰脲類和雙胍類口服降糖藥療效有限，口服糖尿病藥物在治療2型糖尿病癥中最大的不足是無法逆轉(zhuǎn)糖尿病的病因，即“治標(biāo)不知本”，對(duì)于胰島β細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、增殖無明顯作用。

胰高血糖素樣肽-1(glucagonlikepeptide-1,glp-1)是小腸l細(xì)胞分泌的一種多肽類腸促胰島素。自1987年mojsov發(fā)現(xiàn)glp-1具有強(qiáng)的促胰島素釋放作用以來，有關(guān)的生物學(xué)和化學(xué)研究不斷深入。glp-1可通過多種機(jī)制控制2型糖尿病患者的血糖，當(dāng)血糖濃度升高時(shí)，通過與glp-1受體高度特異性地結(jié)合，刺激胰島素分泌，抑制胰高血糖素的產(chǎn)生，使餐后血糖降低并維持在恒定水平。在生理?xiàng)l件下，glp-1刺激胰島素分泌的作用依賴于血糖濃度，不會(huì)因持續(xù)分泌而發(fā)生低血糖。除了調(diào)節(jié)血糖，glp-1最顯著的功能是促進(jìn)β細(xì)胞的再生和修復(fù)，增加胰島β細(xì)胞數(shù)量。此外glp-1還具有調(diào)節(jié)神經(jīng)功能、延遲胃排空和降低食欲等作用。然而內(nèi)源性或外源性的glp-1在體內(nèi)會(huì)迅速被二肽基肽酶iv(dpp-iv)和中性內(nèi)切酶(nep24.11)降解而失去生物活性，其體內(nèi)半衰期只有兩分鐘左右，故天然glp-1難以獲得臨床使用。

雖然glp-1在2型糖尿病治療中的顯著效果已被人們所公認(rèn)，但是其體內(nèi)過短的半衰期限制了其直接成藥的可能。dpp-iv是使天然glp-1失活的主要蛋白酶，其作用位點(diǎn)是ala⁸-glu⁹之間的肽鍵。天然glp-1的另一個(gè)主要代謝酶是nep24.11，約50％的glp-1在體內(nèi)會(huì)被nep24.11降解，glp-1肽鏈上有多個(gè)nep24.11的酶切位點(diǎn)，主要是thr¹¹-phe¹²、asp¹⁵-val¹⁶、ser¹⁸-tyr¹⁹、glu²⁷-phe²⁸和trp³¹-leu³²位點(diǎn)。因此，僅置換個(gè)別氨基酸無法抗nep24.11降解，而多個(gè)氨基酸置換可能會(huì)使化合物的降糖活性下降。目前大部分長(zhǎng)效glp-1受體激動(dòng)劑的研究都是針對(duì)glp-1的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，這限制了新型glp-1受體激動(dòng)劑的研發(fā)。同時(shí)，由于天然glp-1上存在較多nep24.11酶切位點(diǎn)，很難通過氨基酸修飾的手段抵抗nep24.11的降解。

因此，仍需要尋找具有新型結(jié)構(gòu)的glp-1類似物，特別是本身就具有一定nep24.11抗性和降糖活性的glp-1類似物，從而發(fā)現(xiàn)能高效、長(zhǎng)效降糖的新型glp-1類似物。這里，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種基于非洲爪蟾glp-1結(jié)構(gòu)的新型glp-1類似物，通過對(duì)肽鏈進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，從而延長(zhǎng)類似物的體內(nèi)生物活性作用時(shí)間和增加降糖活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及一類非洲爪蟾胰高血糖素樣肽-1(glp-1)類似物，其序列為：

his-xaa1-glu-gly-thr-tyr-thr-asn-xaa2-xaa3-thr-glu-tyr-leu-glu-glu-lys-ala-ala-lys-xaa4-xaa5-ile-glu-xaa6-xaa7-ile-lys-gly-lys-xaa8(seq.idno：1)

其中：

xaa1：ala，arg，asn，asp，cys，gln，glu，gly，his，ile，leu，lys，met，phe，pro，val，tyr，thr，trp或ser；

xaa2：ala，arg，asn，asp，cys，gln，glu，gly，his，ile，leu，lys，met，phe，pro，val，tyr，thr，trp或ser；

xaa3：ala，arg，asn，asp，cys，gln，glu，gly，his，ile，leu，lys，met，phe，pro，val，tyr，thr，trp或ser；

xaa4：ala，arg，asn，asp，cys，gln，glu，gly，his，ile，leu，lys，met，phe，pro，val，tyr，thr，trp或ser；

xaa5：ala，arg，asn，asp，cys，gln，glu，gly，his，ile，leu，lys，met，phe，pro，val，tyr，thr，trp或ser；

xaa6：ala，arg，asn，asp，cys，gln，glu，gly，his，ile，leu，lys，met，phe，pro，val，tyr，thr，trp或ser；

xaa7：ala，arg，asn，asp，cys，gln，glu，gly，his，ile，leu，lys，met，phe，pro，val，tyr，thr，trp或ser；

xaa8：pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-nh2，pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-ser-lys-lys-lys-lys-lys-lys-nh2或-nh2；

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有如下序列的非洲爪蟾glp-1類似物：

his-ala-glu-gly-thr-tyr-thr-asn-asp-val-thr-glu-tyr-leu-glu-glu-lys-ala-ala-lys-glu-phe-ile-glu-trp-leu-ile-lys-gly-lys-nh2(seq.idno：2)

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有如下序列的非洲爪蟾glp-1類似物：

his-gly-glu-gly-thr-tyr-thr-asn-asp-val-thr-glu-tyr-leu-glu-glu-lys-ala-ala-lys-glu-phe-ile-glu-trp-leu-ile-lys-gly-lys-nh2(seq.idno：3)

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有如下序列的非洲爪蟾glp-1類似物：

his-ala-glu-gly-thr-tyr-thr-asn-asp-val-thr-glu-tyr-leu-glu-glu-lys-ala-ala-lys-glu-phe-ile-glu-trp-leu-ile-lys-gly-lys-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-nh2(seq.idno：4)

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有如下序列的非洲爪蟾glp-1類似物：

his-gly-glu-gly-thr-tyr-thr-asn-asp-val-thr-glu-tyr-leu-glu-glu-lys-ala-ala-lys-glu-phe-ile-glu-trp-leu-ile-lys-gly-lys-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-nh2(seq.idno：5)

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有如下序列的非洲爪蟾glp-1類似物：

his-ala-glu-gly-thr-tyr-thr-asn-asp-val-thr-glu-tyr-leu-glu-glu-lys-ala-ala-lys-glu-phe-ile-glu-trp-leu-ile-lys-gly-lys-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-ser-lys-lys-lys-lys-lys-lys-nh2(seq.idno：6)

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有如下序列的非洲爪蟾glp-1類似物：

his-gly-glu-gly-thr-tyr-thr-asn-asp-val-thr-glu-tyr-leu-glu-glu-lys-ala-ala-lys-glu-phe-ile-glu-trp-leu-ile-lys-gly-lys-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-ser-lys-lys-lys-lys-lys-lys-nh2(seq.idno：7)

本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，包括治療有效量的至少一種上述化合物和其藥學(xué)上可接受的鹽，或藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述化合物和其藥學(xué)上可接受的鹽，或藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑在制備用于糖尿病或減肥藥物中的運(yùn)用。

本發(fā)明提供的上述化合物化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不易被體內(nèi)的二肽基肽酶iv(dpp-iv)和中性內(nèi)切酶降解，所有的化合物的體內(nèi)降糖作用時(shí)間顯著延長(zhǎng)，克服了天然glp-1必須持續(xù)靜脈滴注或持續(xù)皮下注射才能產(chǎn)生療效的缺陷。另外，本發(fā)明提供的上述化合物或化合物作為有效成分制備的藥物組合物用于降低血糖和減肥治療時(shí)，既有顯著的長(zhǎng)效降糖效果，還有明顯的減肥作用。

本發(fā)明還提供了上述化合物的制備方法，本發(fā)明采用fmoc/tbu正交保護(hù)固相合成策略高效、高收率的合成得到上述目標(biāo)化合物。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

1、提出的一種非洲爪蟾胰高血糖素樣肽-1(glp-1)類似物，是一類具有全新結(jié)構(gòu)的新型glp-1類似物，有助于促進(jìn)新型glp-1類藥物的研發(fā)。

2、非洲爪蟾glp-1類似物的肽鏈本身就具有很好的nep24.11抗性，不需要像天然glp-1一樣必須對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾才能實(shí)現(xiàn)耐nep24.11酶降解，從而避免了化學(xué)修飾所帶來的降糖活性和水溶性下降等問題。

3、本發(fā)明所涉及的非洲爪蟾glp-1類似物，其生物半衰期較天然glp-1顯著延長(zhǎng)，其降糖活性也明顯優(yōu)于天然glp-1，此外，其還具有很好的減肥效果，可用于糖尿病和肥胖的治療。

4、本發(fā)明所涉及的非洲爪蟾glp-1類似物合成過程簡(jiǎn)單，成本低，粗品純度大于80％，較常規(guī)固相合成方法大大提高，并且易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、大規(guī)?；@使其更適合工業(yè)化生產(chǎn)。

因此本發(fā)明提供的非洲爪蟾glp-1類似物，合成周期短、收率高、粗品純化容易，生產(chǎn)成本低、易于工業(yè)自動(dòng)化生產(chǎn)。制備得到的非洲爪蟾glp-1類似物，比天然glp-1更加穩(wěn)定，降血糖作用時(shí)間和降糖活性都優(yōu)于天然glp-1，并且還具有很好的減肥效果，適合作為治療糖尿病和減肥藥物的活性成分。

附圖說明

上文對(duì)本發(fā)明做了一般性描述，下面附圖用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案。其中：

圖1顯示的是glp-1與非洲爪蟾glp-1類似物在nep24.11酶中的溫敷降解圖；

圖2顯示的是glp-1與非洲爪蟾glp-1類似物在大鼠血漿中的溫敷降解圖；

圖3顯示的是glp-1與非洲爪蟾glp-1類似物在db/db模型小鼠體內(nèi)的腹腔糖耐量實(shí)驗(yàn)血糖圖；

圖4顯示的是glp-1與非洲爪蟾glp-1類似物在db/db模型小鼠體內(nèi)的提前給藥腹腔糖耐量實(shí)驗(yàn)血糖圖；

圖5顯示的是exenatide與非洲爪蟾glp-1類似物在長(zhǎng)期治療實(shí)驗(yàn)中小鼠的體重增加量；

具體實(shí)施方式

在本說明書全文中采用以下縮寫：

dmf：二甲基甲酰胺；dcm：二氯甲烷；fmoc：n-9-芴甲氧羰基；dic：n,n’-二異丙基碳二亞胺；hobt：1-羥基-苯并三氮唑；tfa：三氟乙酸；edt：二巰基乙烷；hplc：高效液相色譜；esi-ms：電噴霧質(zhì)譜；lc-ms：液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜；gly：甘氨酸；ser：絲氨酸；ala：丙氨酸；thr：蘇氨酸；val：纈氨酸；ile：異亮氨酸；leu：亮氨酸；tyr：酪氨酸；phe：苯丙氨酸；his：組氨酸；pro：脯氨酸；asp：天門冬氨酸；met：蛋氨酸；glu：谷氨酸；trp：色氨酸；lys：賴氨酸；arg：精氨酸；asn：天冬酰胺；gln：谷氨酰胺；cys：半胱氨酸。

本發(fā)明是通過下列實(shí)施例來進(jìn)行說明的，但這些實(shí)施例不做任何限制本發(fā)明的解釋。

實(shí)施例1

his-ala-glu-gly-thr-tyr-thr-asn-asp-val-thr-glu-tyr-leu-glu-glu-lys-ala-ala-lys-glu-phe-ile-glu-trp-leu-ile-lys-gly-lys-nh2(seq.idno：2)

的固相合成(0.1mmol)

(1)樹脂的溶脹

稱取fmoc-rinkamide-mbharesin0.262g(取代量0.382mmol/g)，經(jīng)7mldcm溶脹2min，抽濾去dcm，再用10mldcm溶脹30min，最后分別用dcm，dmf7ml沖洗干凈。

(3)fmoc保護(hù)基的脫除

將溶脹好的樹脂放入反應(yīng)器中，加入7ml20％哌啶/dmf(v/v)溶液，在反應(yīng)器中180度往返振搖反應(yīng)5min，反應(yīng)溫度25℃，反應(yīng)結(jié)束后濾去溶液；再加入7ml20％哌啶/dmf(v/v)溶液在反應(yīng)器中180度往返振搖反應(yīng)15min，反應(yīng)溫度25℃。反應(yīng)結(jié)束后濾去溶液，用dmf洗滌干凈。得到脫去初始連接的fmoc保護(hù)基的樹脂。

(4)lys-rinkamide-mbharesin的合成

將lys(0.4mmol)，dic(0.4mmol)，hobt(0.4mmol)溶于5mldmf中，再將此溶液加入上面的樹脂中，在反應(yīng)器中180度往返振搖反應(yīng)90min，反應(yīng)溫度25℃。反應(yīng)結(jié)束后濾除反應(yīng)液，用7mldmf洗滌樹脂3次。

(5)偶合效率的檢測(cè)

用茚三酮法檢測(cè)樹脂的偶合效率，顯色反應(yīng)為陰性即可進(jìn)入下一個(gè)偶合循環(huán)。

茚三酮法：取少量樹脂顆粒用乙醇洗滌，放入透明小瓶中加入5％茚三酮乙醇、kcn吡啶溶液(2ml0.001mkcn稀釋于98ml吡啶中)、80％苯酚乙醇溶液各2滴，于100℃加熱5分鐘，如果樹脂顯藍(lán)色即為陽(yáng)性。

(6)肽鏈的延長(zhǎng)

按照肽鏈的序列，重復(fù)上述脫保護(hù)和偶合的步驟依次連接上相應(yīng)的氨基酸直至肽鏈合成完畢，得到連有化合物的樹脂。

(7)樹脂上多肽的裂解

將上述得到的連有化合物的樹脂放入反應(yīng)瓶中，各加入裂解劑reagentk(tfa/苯甲硫醚/水/苯酚/edt，82.5∶5∶5∶5∶2.5，v/v)5ml，再在常溫下攪拌反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后抽濾，加少量tfa洗滌三次，合并濾液，濾液減壓濃縮。將濃縮濾液加入大量的冰乙醚中析出白色絮狀沉淀，冷凍離心得到目標(biāo)多肽的粗品，最終收率為91.9％。

(8)多肽的純化

將粗品多肽溶于50％的甲醇/水中，使用制備液相色譜純化，色譜條件為：c18反相柱(320mm×28mm，5μm)；流動(dòng)相a：0.1％tfa/水(v/v)，流動(dòng)相b：甲醇(v/v)；流動(dòng)相梯度：流動(dòng)相b30％～90％，20min；流速為10ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm，收集的溶液減壓除去甲醇，冷凍干燥得到純品多肽。理論相對(duì)分子質(zhì)量為3513.9。esi-msm/z：calu[m+3h]³⁺1172.3，[m+4h]⁴⁺879.5；found[m+3h]³⁺1172.5，[m+4h]⁴⁺879.6。

實(shí)施例2～6

根據(jù)實(shí)施例1所述的方法，根據(jù)相應(yīng)的序列合成得到實(shí)施例2～6的非洲爪蟾胰高血糖素樣肽-1(glp-1)類似物，通過esi-ms確證各自的分子量。

實(shí)施例2

his-gly-glu-gly-thr-tyr-thr-asn-asp-val-thr-glu-tyr-leu-glu-glu-lys-ala-ala-lys-glu-phe-ile-glu-trp-leu-ile-lys-gly-lys-nh2(seq.idno：3)

理論相對(duì)分子質(zhì)量為3499.9。esi-msm/z：calu[m+3h]³⁺1167.6，[m+4h]⁴⁺875.9；found[m+3h]³⁺1167.7，[m+4h]⁴⁺876.2；。

實(shí)施例3

his-ala-glu-gly-thr-tyr-thr-asn-asp-val-thr-glu-tyr-leu-glu-glu-lys-ala-ala-lys-glu-phe-ile-glu-trp-leu-ile-lys-gly-lys-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-nh2(seq.idno：4)

理論相對(duì)分子質(zhì)量為4291.7。esi-msm/z：calu[m+3h]³⁺1431.6，[m+4h]⁴⁺1073.9；found[m+3h]³⁺1431.2，[m+4h]⁴⁺1073.5。

實(shí)施例4

his-gly-glu-gly-thr-tyr-thr-asn-asp-val-thr-glu-tyr-leu-glu-glu-lys-ala-ala-lys-glu-phe-ile-glu-trp-leu-ile-lys-gly-lys-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-nh2(seq.idno：5)

理論相對(duì)分子質(zhì)量為4277.7。esi-msm/z：calu[m+3h]³⁺1426.9，[m+4h]⁴⁺1070.4；found[m+3h]³⁺1427.4，[m+4h]⁴⁺1070.8。

實(shí)施例5

his-ala-glu-gly-thr-tyr-thr-asn-asp-val-thr-glu-tyr-leu-glu-glu-lys-ala-ala-lys-glu-phe-ile-glu-trp-leu-ile-lys-gly-lys-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-ser-lys-lys-lys-lys-lys-lys-nh2(seq.idno：6)

理論相對(duì)分子質(zhì)量為4963.7。esi-msm/z：calu[m+4h]⁴⁺1241.9，[m+5h]⁵⁺993.7；found[m+4h]⁴⁺1241.8，[m+5h]⁵⁺993.4。

實(shí)施例6

his-gly-glu-gly-thr-tyr-thr-asn-asp-val-thr-glu-tyr-leu-glu-glu-lys-ala-ala-lys-glu-phe-ile-glu-trp-leu-ile-lys-gly-lys-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-ser-lys-lys-lys-lys-lys-lys-nh2(seq.idno：7)

理論相對(duì)分子質(zhì)量為4949.7。esi-msm/z：calu[m+4h]⁴⁺1238.4，[m+5h]⁵⁺990.9；found[m+4h]⁴⁺1238.7，[m+5h]⁵⁺991.4。

實(shí)施例7

非洲爪蟾glp-1類似物對(duì)nep24.11的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

經(jīng)過純化后的非洲爪蟾glp-1類似物和天然glp-1(對(duì)照)5nmol和5mu的nep24.11在200μl濃度為50mm的tris-hcl緩沖溶液中，37℃溫孵12h，ph7.4。最后加入10μl20％的乙腈/水溶液終止反應(yīng)。分別取0，1，2，4，6，12h點(diǎn)的溫孵溶液，離心，取上清液，進(jìn)lc-ms分析，計(jì)算各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的峰面積，做出衰減曲線。分析采用c18反相柱(150mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相a：0.1％tfa/水(v/v)，流動(dòng)相b：0.1％tfa/乙腈(v/v)；流動(dòng)相梯度：流動(dòng)相b10％～45％，22min；流速為0.3ml/min；柱溫為30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm。

如圖1所示，未經(jīng)改造的天然glp-1在與nep24.11溫孵4h后，基本上皆被水解，完整的肽鏈小于10％。而非洲爪蟾glp-1類似物與dpp-iv溫孵12h后完整的肽鏈大于80％。結(jié)果表明我們?cè)O(shè)計(jì)的非洲爪蟾glp-1類似物具有抵抗nep24.11的酶解作用。

實(shí)施例8

非洲爪蟾glp-1類似物對(duì)大鼠血漿的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

大鼠眼球取血，血液裝入含有肝素的離心管中，3000rpm離心10分鐘，取上清血漿作為溫孵血漿，利用lc-ms來檢測(cè)化合物的響應(yīng)信號(hào)。100ul的glp-1(對(duì)照)和非洲爪蟾glp-1類似物與100ul的血漿，渦旋混合后置入37℃水浴中，溫孵24小時(shí)，在0，1，2，4，8，12，24h時(shí)間點(diǎn)取10ul，加入20ul乙腈沉淀，14000rpm離心，取上清液進(jìn)lc-ms，計(jì)算各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的峰面積，做出衰減曲線。

如圖2所示，沒有經(jīng)過改造的原型glp-1的血漿半衰期只有15min左右，而非洲爪蟾glp-1類似物的血漿半衰期都在10小時(shí)以上。

實(shí)施例9

非洲爪蟾glp-1類似物的腹腔糖耐量實(shí)驗(yàn)

6周齡db/db糖尿病模型小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，隨機(jī)分組，每組六只。小鼠在禁食18h，提前5min腹腔給予陽(yáng)性對(duì)照glp-1(25nmol/kg)，陰性對(duì)照生理鹽水和非洲爪蟾glp-1類似物(25nmol/l)，0min腹腔給予葡萄糖(1g/kg)，在0，15，30，60，120min用血糖儀監(jiān)測(cè)血糖水平。

如圖3所示，非洲爪蟾glp-1類似物的降糖活性優(yōu)于天然glp-1，說明非洲爪蟾glp-1類似物具有很強(qiáng)的血糖控制能力。

實(shí)施例10

非洲爪蟾glp-1類似物的提前給藥腹腔糖耐量實(shí)驗(yàn)

6周齡db/db糖尿病模型小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，隨機(jī)分組，每組六只。小鼠在禁食18h，提前120min腹腔給予陽(yáng)性對(duì)照glp-1(25nmol/kg)，陰性對(duì)照生理鹽水和非洲爪蟾glp-1類似物(25nmol/l)，0min腹腔給予葡萄糖(1g/kg)，在0，15，30，60，120min用血糖儀監(jiān)測(cè)血糖水平。第一次腹腔糖耐量周期結(jié)束后，在6和12h重復(fù)兩次腹腔注射葡萄糖，每次糖耐量周期血糖的檢測(cè)間隔與第一次相同。

如圖4所示，提前120min給藥后，天然glp-1在整個(gè)糖耐量實(shí)驗(yàn)中沒有顯示出降糖活性，說明glp-1已經(jīng)被完全代謝。而非洲爪蟾glp-1類似物的降糖活性并沒有改變，說明類似物的體內(nèi)穩(wěn)定性很高，具有長(zhǎng)效降糖活性。

實(shí)施例11

非洲爪蟾glp-1類似物的長(zhǎng)期治療實(shí)驗(yàn)

6周齡db/db糖尿病模型小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，隨機(jī)分組，每組6只。小鼠每天2次給予陽(yáng)性對(duì)照exenatide(25nmol/kg)，陰性對(duì)照生理鹽水，給藥組1天1次給予非洲爪蟾glp-1類似物(25nmol/l)，治療周期20天，每?jī)商鞕z測(cè)一次小鼠的體重。

如圖5所示，非洲爪蟾glp-1類似物能夠顯著抑制小鼠的體重增長(zhǎng)，并且其體重減輕作用優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照exenatide，表明了非洲爪蟾glp-1類似物具有良好的治療糖尿病和減肥的藥用前景。

<110>江蘇師范大學(xué)

<120>一種非洲爪蟾胰高血糖素樣肽-1（glp-1）類似物及其應(yīng)用

<160>6

<210>1

<211>31

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<221>合成構(gòu)建體

<222>(2)..(2)

<223>第2位的xaa是ala，arg，asn，asp，cys，gln，glu，gly，his，ile，leu，lys，met，phe，pro，val，tyr，thr，trp或ser

<220>

<221>合成構(gòu)建體

<222>(9)..(9)

<223>第9位的xaa是ala，arg，asn，asp，cys，gln，glu，gly，his，ile，leu，lys，met，phe，pro，val，tyr，thr，trp或ser

<220>

<221>合成構(gòu)建體

<222>(10)..(10)

<223>第10位的xaa是ala，arg，asn，asp，cys，gln，glu，gly，his，ile，leu，lys，met，phe，pro，val，tyr，thr，trp或ser

<220>

<221>合成構(gòu)建體

<222>(21)..(21)

<223>第21位的xaa是ala，arg，asn，asp，cys，gln，glu，gly，his，ile，leu，lys，met，phe，pro，val，tyr，thr，trp或ser

<220>

<221>合成構(gòu)建體

<222>(22)..(22)

<223>第22位的xaa是ala，arg，asn，asp，cys，gln，glu，gly，his，ile，leu，lys，met，phe，pro，val，tyr，thr，trp或ser

<220>

<221>合成構(gòu)建體

<222>(25)..(25)

<223>第25位的xaa是ala，arg，asn，asp，cys，gln，glu，gly，his，ile，leu，lys，met，phe，pro，val，tyr，thr，trp或ser

<220>

<221>合成構(gòu)建體

<222>(26)..(26)

<223>第26位的xaa是ala，arg，asn，asp，cys，gln，glu，gly，his，ile，leu，lys，met，phe，pro，val，tyr，thr，trp或ser

<220>

<221>合成構(gòu)建體

<222>(31)..(31)

<223>第31位的xaa是pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-nh2，pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-ser-lys-lys-lys-lys-lys-lys-nh2或-nh2

<400>1

hisxaagluglythrtyrthrasnxaaxaathrglutyrleugluglulysalaala

151015

lysxaaxaailegluxaaxaailelysglylysxaa

202530

<210>2

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<221>合成構(gòu)建體

hisalagluglythrtyrthrasnaspvalthrglutyrleugluglulysalaala

151015

lysglupheileglutrpleuilelysglylys

202530

<210>3

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<221>合成構(gòu)建體

hisglygluglythrtyrthrasnaspvalthrglutyrleugluglulysalaala

151015

lysglupheileglutrpleuilelysglylys

202530

<210>4

<211>39

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<221>合成構(gòu)建體

hisalagluglythrtyrthrasnaspvalthrglutyrleugluglulysalaala

151015

lysglupheileglutrpleuilelysglylysproserserglyalaproproproser

20253035

<210>5

<211>39

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<221>合成構(gòu)建體

hisglygluglythrtyrthrasnaspvalthrglutyrleugluglulysalaala

151015

lysglupheileglutrpleuilelysglylysproserserglyalaproproproser

20253035

<210>6

<211>44

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<221>合成構(gòu)建體

hisalagluglythrtyrthrasnaspvalthrglutyrleugluglulysalaala

151015

lysglupheileglutrpleuilelysglylysproserserglyalaproproserlyslyslyslyslyslys

2025303540

<210>7

<211>44

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<221>合成構(gòu)建體

hisglygluglythrtyrthrasnaspvalthrglutyrleugluglulysalaala

151015

lysglupheileglutrpleuilelysglylysproserserglyalaproproserlyslyslyslyslyslys

2025303540