本申請是申請日為2012年10月11日、發(fā)明名稱為“雙特異性抗體的改進的組裝”的中國專利申請201280060881.5的分案申請。

本發(fā)明涉及2011年10月11日提交的美國臨時申請系列號61/545863、2011年10月12日提交的美國臨時申請系列號61/546503、2011年11月16日提交的美國臨時申請系列號61/560704和2012年7月27日提交的美國臨時申請系列號61/676837，并要求其優(yōu)先權(quán)。上文引用的臨時申請中每一個的公開內(nèi)容在此以其整體引入作為參考。

本發(fā)明公開涉及組裝異源多聚體蛋白質(zhì)諸如雙特異性抗體的組合物及改進的方法。

背景技術(shù)：

igg類型的單克隆抗體包含兩條相同的抗原結(jié)合臂和恒定結(jié)構(gòu)域(fc)。在其結(jié)合臂中具有不同特異性的抗體通常不存在于自然界中，因此，必須借助化學工程(例如化學交聯(lián)等)、重組dna和/或細胞融合技術(shù)來制備。

雙特異性抗體可以同時結(jié)合兩種不同的抗原。此特性使得能夠發(fā)展對常規(guī)單克隆抗體而言不可能的治療策略。已發(fā)展的一系列富于想象的雙特異性抗體形式反映了對這些分子的濃厚興趣。見bergj,lotschere,steimerks等,“bispecificantibodiesthatmediatekillingofcellsinfectedwithhumanimmunodeficiencyvirusofanystrain,”procnatlacadsciusa(1991)88(11):4723-4727及fischern和legero.,“biospecificantibodies:moleculesthatenablenoveltherapeuticstrategies,”pathobiology(2007)74:3-14。

另一類多特異性分子是重組融合蛋白。由免疫調(diào)節(jié)蛋白的胞外域和免疫球蛋白(ig)的恒定(fc)結(jié)構(gòu)域組成的重組融合蛋白是一類正在不斷壯大的人治療劑。免疫黏附素將具有希望的特異性的蛋白質(zhì)序列的結(jié)合區(qū)與抗體的效應子結(jié)構(gòu)域組合。免疫黏附素具有對其作為治療劑的潛能而言有意義的兩種重要特性：靶標特異性和藥代動力學穩(wěn)定性(與抗體的體內(nèi)半衰期相當?shù)捏w內(nèi)半衰期)。免疫黏附素可以用作拮抗劑來抑制或阻斷有害的相互作用，或用作激動劑來模擬或增強生理反應。見chamowsm,zhangdz,tanxy等,“ahumanized,bispecificimmunoadhesin-antibodythatretargetscd3+effectorstokillhiv-1-infectedcells,”jhematother1995；4(5):439-446。

其他多特異性分子已在其他文獻中討論過。實例包括但不限于：fisher等,pathobiology(2007)74:3-14(多種雙特異性形式的綜述)；feige等的2003年12月9日授權(quán)的美國專利號6,660,843(肽體(peptibody))；2002年1月10日公開的美國專利公開號2002-004587(多特異性抗體)；wu等的2009年11月3日授權(quán)的美國專利號7612181(雙可變結(jié)構(gòu)域形式)；美國專利號6,534,628、nordk等,proteng(1995)8:601-608、nordk等,natbiotech(1997)15:772-777及等,biotechnolapplbiochem.(2008)jun；50(pt2):97-112(親和體(affibody))；martens等,clincancerres(2006),12:6144-6152及jin等,cancerres(2008)68(11):4360-4368(單臂抗體)；bostrom等,science(2009)323:1610-1614(雙作用fab、aka混合價抗體(akamixedvalencyantibodies))。其他形式為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。

對于抗體，通常且尤其是對于上述多特異性分子，臨床級物質(zhì)的制備仍富有挑戰(zhàn)。如上文所指出，存在許多產(chǎn)生具有混合結(jié)合臂(即相互不同的結(jié)合臂)的分子的途徑。但這些方法中的每一種都有它的缺點。

化學交聯(lián)為勞動密集型，因為可能還需從同二聚體及其他不想要的副產(chǎn)物中純化相關(guān)物質(zhì)。此外，化學修飾步驟可以改變蛋白質(zhì)的完整性，從而導致穩(wěn)定性差。因此，此方法常效率低，且可能導致抗體活性喪失。

細胞融合技術(shù)(例如雜交瘤)表達兩條重鏈和兩條輕鏈，其隨機組裝而導致產(chǎn)生10種抗體組合。期望的異源多聚體抗體只是這樣產(chǎn)生的抗體中的一小部分。對期望的異源多聚體蛋白質(zhì)的純化會顯著降低產(chǎn)率，并增加生產(chǎn)成本。

重組dna技術(shù)已用于產(chǎn)生不包含fc結(jié)構(gòu)域的多種異源多聚體形式，例如單鏈fv、雙抗體(diabody)等。這類抗體分子的主要缺點是缺乏fc結(jié)構(gòu)域，因此缺乏抗體觸發(fā)效應子功能(例如補體激活、fc受體結(jié)合等)的能力。因此，希望得到包含功能性fc結(jié)構(gòu)域的雙特異性抗體。

重組dna技術(shù)還已用于產(chǎn)生“杵入臼”(‘knobintohole’)雙特異性抗體。見美國專利申請20030078385(arathoon等-genentech)。此策略的一個限制是，兩種親本抗體的輕鏈必須相同，以防止在同一細胞中表達時錯配及形成不想要和/或無活性的分子。

此外，在退火和純化過程中的限制事件之一是氧化還原效率。氧化的異二聚體在此步驟后通常僅占蛋白質(zhì)的70-80％(bioanalyzer和ms-tof)。其余20-30％的抗體是同二聚體，且缺乏共價連接(sec-lls)。這可以去除，但顯著影響總體產(chǎn)率。因此，仍然存在改進抗體生產(chǎn)(尤其是異二聚體)的總體產(chǎn)率的需要。本發(fā)明所描述的是可以改進雙特異性抗體、異二聚體等的總體產(chǎn)率的方法。本發(fā)明的這些和其他方面及優(yōu)勢將從本文提供的發(fā)明詳述顯而易見。

發(fā)明概述

用目前的技術(shù)生產(chǎn)由兩種或更多種含鉸鏈多肽組裝的異源多聚體蛋白質(zhì)(例如從兩種或更多種半抗體組裝的多特異性抗體)具有缺點，包括產(chǎn)生混合產(chǎn)物、降低的產(chǎn)率和減少/消除的效應子功能等。此外，在制備每種含鉸鏈多肽的過程中及在組裝或退火異源多聚體的過程中常發(fā)生聚集和沉淀。聚集和沉淀可以大幅降低希望的異源多聚體的產(chǎn)率。因此，希望更有效和以更高的水平產(chǎn)生異源多聚體蛋白質(zhì)。

本文公開，通過使用或調(diào)節(jié)一個或多個方面來經(jīng)濟地生產(chǎn)異源多聚體蛋白質(zhì)(例如多特異性抗體)的有效生產(chǎn)方法/工藝，所述方面包括但不限于如下：穩(wěn)定劑、加溶劑、還原條件、所選擇的ph和所選擇的溫度等。本文描述的本發(fā)明方法減少了沉淀和/或聚集引起的蛋白質(zhì)丟失，并提高了異源多聚體蛋白質(zhì)生產(chǎn)(如雙特異性抗體生產(chǎn))的總體產(chǎn)率。

在一方面，本發(fā)明提供形成或產(chǎn)生異源多聚體蛋白質(zhì)的方法，該方法包括：

a.在第一加溶劑的存在下，在ph4-9，優(yōu)選5-9，提供第一含鉸鏈多肽，其中該第一含鉸鏈多肽包含異源多聚化結(jié)構(gòu)域；

b.在第二加溶劑的存在下，在ph4-9，優(yōu)選5-9，提供第二含鉸鏈多肽，其中該第二含鉸鏈多肽包含異源多聚化結(jié)構(gòu)域；

c.在還原條件下混合該第一和第二含鉸鏈多肽，以形成組裝混合物；和

d.孵育該組裝混合物，以形成或產(chǎn)生包含該第一和第二含鉸鏈多肽的異源多聚體蛋白質(zhì)，其中該第一含鉸鏈多肽與該第二含鉸鏈多肽在所述異源多聚化結(jié)構(gòu)域處相互作用。

在這方面的某些實施方案中，步驟a和/或步驟b之前是純化該第一和/或第二含鉸鏈多肽的步驟。在某些具體實施方案中，通過蛋白a來純化該第一和/或第二含鉸鏈多肽。

在另一方面，本發(fā)明提供形成或產(chǎn)生雙特異性抗體的方法，該方法包括：

a.在第一加溶劑的存在下，在ph4-9，優(yōu)選5-9，提供第一半抗體，其中該第一半抗體包含異源多聚化結(jié)構(gòu)域；

b.在第二加溶劑的存在下，在ph4-9，優(yōu)選5-9，提供第二半抗體，其中該第二半抗體包含異源多聚化結(jié)構(gòu)域；

c.在還原條件下混合該第一和第二半抗體，以形成組裝混合物；和

d.孵育該組裝混合物，以形成或產(chǎn)生包含該第一和第二半抗體的雙特異性抗體，其中該第一半抗體與該第二半抗體在所述異源多聚化結(jié)構(gòu)域處相互作用。

在這方面的某些實施方案中，步驟a和/或步驟b之前是純化該第一和/或第二半抗體的步驟。在某些具體實施方案中，通過蛋白a來純化該第一和/或第二半抗體。

在另一方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生異源多聚體的方法，該方法包括提供包含精氨酸的含鉸鏈多肽的混合物，該混合物具有4至9之間、優(yōu)選5至9之間的ph，加入弱還原劑，并在便于產(chǎn)生異源多聚體的條件下孵育。

還在另一方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生異源多聚體蛋白質(zhì)的方法，該方法包括：

a.獲得蛋白a純化的第一含鉸鏈多肽；

b.獲得蛋白a純化的第二含鉸鏈多肽；

c.調(diào)節(jié)每種半抗體的ph至4和9之間；

d.混合該第一和第二含鉸鏈多肽，以獲得組裝混合物；

e.向該組裝混合物中加入摩爾過量的弱還原劑；和

f.孵育該組裝混合物，以形成包含該第一和第二含鉸鏈多肽的異源多聚體蛋白質(zhì)。

在另一方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生異源多聚體蛋白質(zhì)的方法，該方法包括：

a.獲得蛋白a純化的第一含鉸鏈多肽；

b.獲得蛋白a純化的第二含鉸鏈多肽；

c.在l-精氨酸的存在下調(diào)節(jié)每種含鉸鏈多肽的ph至4和9之間；

d.混合該第一和第二含鉸鏈多肽，以獲得混合的含鉸鏈多肽池(pool)；

e.孵育，以形成包含該第一和第二含鉸鏈多肽的異源多聚體蛋白質(zhì)。

在這方面的某些實施方案中，在還原條件下孵育該混合的含鉸鏈多肽池。在某些實施方案中，含鉸鏈多肽包括半抗體、免疫黏附素或其功能片段。在某些其他實施方案中，精氨酸以20mm-1m、20mm-200mm或50mm-200mm的濃度存在。在某些其他實施方案中，向步驟d或步驟e中加入pvp。在某些實施方案中，在混合后調(diào)節(jié)ph。

本申請人意外地發(fā)現(xiàn)，含鉸鏈多肽(如半抗體)的中間ph保持可以促進構(gòu)象轉(zhuǎn)換，增強該含鉸鏈多肽隨后的組裝。在某些實施方案中，該中間ph為ph4和9之間、優(yōu)選5和9之間、或至少ph5、至少ph5.5、至少ph5.7、大于ph5、大于ph5.5、大于ph5.7、在5和9之間、5和8之間、5.5和8之間、5.5和9之間、5.7和8之間、5.7和9之間、6和8之間、6和9之間、7和8之間、7.5和8.5之間、或7和8.5之間。可以加入加溶劑來防止或最小化ph誘導的含鉸鏈多肽的沉淀。在某些具體實施方案中，在中間ph保持之前加入加溶劑。在某些實施方案中，該第一加溶劑和第二加溶劑各自選自精氨酸、組氨酸和蔗糖，優(yōu)選精氨酸和/或組氨酸。在某些其他實施方案中，精氨酸是精氨酸鹽和/或組氨酸是組氨酸鹽。在某些其他實施方案中，精氨酸是精氨酸衍生物和/或組氨酸是組氨酸衍生物。在某些其他實施方案中，精氨酸或組氨酸是l-精氨酸或l-組氨酸。在某些其他實施方案中，精氨酸或組氨酸是鹽酸精氨酸或鹽酸組氨酸。在某些其他實施方案中，精氨酸或組氨酸是磷酸精氨酸或磷酸組氨酸。在某些實施方案中，該第一和第二加溶劑是不同的，而在其他實施方案中，該第一和第二加溶劑是相同的。在某些優(yōu)選實施方案中，該第一加溶劑和該第二加溶劑都包含精氨酸。在再其他實施方案中，精氨酸以20mm至1m、20mm至小于1m、20mm至100mm、20mm至200mm、20mm至300mm、20mm至400mm、50mm至100mm、50mm至150mm、50mm至200mm、50mm至250mm、或50mm至300mm、優(yōu)選20mm至200mm之間的濃度存在。還在其他實施方案中，加溶劑包含精氨酸衍生物，包括但不限于乙酰精氨酸。在其他實施方案中，該第一加溶劑和第二加溶劑都包含以20mm至1m、20mm至小于1m、20mm至小于500mm、20mm至100mm、20mm至200mm、20mm至300mm、20mm至400mm、50mm至100mm、50mm至150mm、50mm至200mm、50mm至250mm、50mm至300mm、50mm至400mm、50mm至500mm、或50mm至600mm之間的濃度存在的組氨酸。在某些優(yōu)選實施方案中，按50mm的濃度加入加溶劑。在某些其他實施方案中，按200mm的濃度加入加溶劑。在某些具體實施方案中，按20mm、50mm、100mm或200mm的濃度加入精氨酸或組氨酸。在某些其他具體實施方案中，在精氨酸和組氨酸二者的存在下提供該第一和/或第二含鉸鏈多肽。在其他實施方案中，精氨酸和組氨酸各以20mm至1m、20mm至小于1m、20mm至100mm、20mm至200mm、20mm至300mm、20mm至400mm、50mm至100mm、50mm至150mm、50mm至200mm、50mm至250mm、或50mm至300mm、優(yōu)選50mm至200mm的濃度存在。

在某些實施方案中，在中間ph保持(即ph調(diào)節(jié))之前混合該第一和第二含鉸鏈多肽。在某些其他實施方案中，于分別在第一含鉸鏈多肽中和第二含鉸鏈多肽中調(diào)節(jié)ph后，混合該第一和第二含鉸鏈多肽。在某些實施方案中，在ph調(diào)節(jié)之前加入加溶劑。

在某些實施方案中，在混合之前分別純化該第一含鉸鏈多肽和該第二含鉸鏈多肽；而在其他實施方案中，在混合后共純化該第一含鉸鏈多肽和該第二含鉸鏈多肽。在某些具體實施方案中，含鉸鏈多肽包含半抗體。在某些實施方案中，組裝的異源多聚體蛋白質(zhì)可以進行進一步純化。

可以用任意適宜的方法進行純化，其非限制性地包括通過蛋白a層析、蛋白g層析、疏水相互作用層析(hic)、免疫親和柱上的分級分離、乙醇沉淀、硅石上或離子交換樹脂(如deae)上的反向?qū)游?、層析聚焦、sds-page、硫酸銨沉淀、和使用例如sephadexg-75的凝膠過濾及其他類似的純化方法、及其組合來純化。

在某些實施方案中，通過蛋白a或蛋白g層析來純化含鉸鏈多肽，如半抗體。在另一實施方案中，在蛋白a純化之前混合第一和第二含鉸鏈多肽，并在蛋白a上共純化。在某些實施方案中，在混合蛋白a純化的多肽后調(diào)節(jié)ph。在其他實施方案中，在混合蛋白a純化的多肽之前調(diào)節(jié)ph。在某些實施方案中，在ph調(diào)節(jié)之前加入加溶劑。

在某些其他實施方案中，通過hic或離子交換柱，純化含鉸鏈多肽。選擇適宜的純化方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。例如，可以通過蛋白a柱后接著離子交換柱來純化含鉸鏈多肽；還可以通過蛋白a柱后接著凝膠過濾柱和/或hic來純化含鉸鏈多肽。在其他實例中，可以在通過蛋白a柱純化之前通過一個或多個離子交換柱來純化含鉸鏈多肽。在某些實施方案中，在含鉸鏈多肽的任何純化步驟中所用的洗滌和/或洗脫緩沖液都不含精氨酸和/或組氨酸。

在其他實施方案中，將在酸性ph從蛋白a基質(zhì)或其他柱基質(zhì)洗脫的半抗體調(diào)節(jié)至中間ph。此后續(xù)ph調(diào)節(jié)(也稱為中間ph保持)可以引起含鉸鏈多肽(如半抗體)的沉淀，從而導致組裝的異源多聚體蛋白質(zhì)的產(chǎn)率降低。因此，在某些實施方案中，在ph調(diào)節(jié)之前在加溶劑的存在下提供在酸性ph下從蛋白a或蛋白g柱洗脫的半抗體。在ph調(diào)節(jié)步驟并非必要的情況下，在某些實施方案中，優(yōu)選向純化的含鉸鏈多肽中加入加溶劑來防止或減少沉淀和/或聚集。

除中間ph保持外，本申請人意外地發(fā)現(xiàn)，加熱可以增強含鉸鏈多肽(如半抗體)的構(gòu)象轉(zhuǎn)換和/或組裝。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明方法的步驟a-d中的一個、多個或全部在15℃至39℃、15℃至42℃、18℃至37℃、20℃至42℃、20℃至25℃、25℃至42℃、25℃至35℃、25℃至39℃、30℃至35℃、32℃至35℃或32℃至37℃、優(yōu)選35℃至37℃之間的溫度加熱至少30分鐘。在某些實施方案中，孵育時間至多為72小時，尤其是在室溫。在一些實施方案中，孵育時間為35℃3小時。在某些其他實施方案中，溫度為或約為30℃、35℃或37℃。

但是，加熱也可以增加聚集和/或沉淀。因此，在某些具體實施方案中，在加熱之前向從蛋白a或蛋白g柱洗脫的半抗體中加入加溶劑。

在某些實施方案中，含鉸鏈多肽包括半抗體、免疫黏附素或其功能片段。在某些具體實施方案中，含鉸鏈多肽包含fc成分。

在某些具體實施方案中，第一和/或第二含鉸鏈多肽包含半抗體。在某些實施方案中，半抗體是igg半抗體。在某些具體實施方案中，igg半抗體為igg1、igg4或igg2同種型。在某些有利的實施方案中，保留免疫球蛋白分子的信號肽，以便于該半抗體(尤其是在哺乳動物細胞中產(chǎn)生時)的分泌。在某些實施方案中，本發(fā)明的方法包括在濃度約為50mm的精氨酸的存在下，及備選地或此外在濃度約為200mm的組氨酸的存在下，在ph5-9提供第一和第二半抗體。在某些實施方案中，該第一和/或第二半抗體各包含對不同抗原或同一抗原上的不同表位特異的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，組裝的全抗體是雙特異性抗體。在某些其他實施方案中，第一和第二半抗體屬于同一同種型；而在其他實施方案中，第一和第二半抗體屬于不同同種型。

半抗體可以包含vl結(jié)構(gòu)域、vh結(jié)構(gòu)域、鉸鏈結(jié)構(gòu)域、ch2結(jié)構(gòu)域和/或ch3結(jié)構(gòu)域。半抗體還可以是進一步包含系鏈(tether)的單鏈多肽，其中該單鏈多肽按n端至c端方向包含彼此相對位置如下的結(jié)構(gòu)域：vl-系鏈-vh-鉸鏈-ch2-ch3。在某些其他實施方案中，半抗體進一步包含cl結(jié)構(gòu)域和ch1結(jié)構(gòu)域；在其他實施方案中，半抗體可以是進一步包含系鏈的單鏈多肽，其中該單鏈多肽按n端至c端方向包含彼此相對位置如下的結(jié)構(gòu)域：vl-cl-系鏈-vh-ch1-鉸鏈-ch2-ch3。

系鏈可以包含一個或多個甘氨酸(g)和絲氨酸(s)殘基。在其他實施方案中，系鏈包含ggs重復。系鏈的長度在例如15和50個氨基酸之間。在具體實施方案中，系鏈長度在20和32個氨基酸之間，例如長度為20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32個氨基酸。在某些實施方案中，系鏈是可切割的。在其他實施方案中，系鏈可以或不可以從蛋白質(zhì)切下。在某些優(yōu)選實施方案中，系鏈可以被同一個酶在位于或靠近系鏈的n端和c端的兩個位點切割。在一個實施方案中，系鏈包含蛋白酶(如弗林蛋白酶(furin))的切割位點。在另一實施方案中，弗林蛋白酶在切割位點rxrxrr(seqidno:1)處切割系鏈，其中x是任意氨基酸。在一些實施方案中，第一含鉸鏈多肽是半抗體，且第二含鉸鏈多肽是單鏈半抗體。

在另一實施方案中，本發(fā)明提供包含系鏈和fc成分復合物的蛋白質(zhì)，其中該系鏈可以或不可以從蛋白質(zhì)切割。

在其他實施方案中，第一和第二含鉸鏈多肽包含異源多聚化結(jié)構(gòu)域。該異源多聚化結(jié)構(gòu)域可以是杵入臼突變、亮氨酸拉鏈、靜電等。該第一含鉸鏈多肽可以包含杵，而該第二含鉸鏈多肽可以包含臼。在某些實施方案中，含鉸鏈多肽包含半抗體，第一半抗體包含杵，而第二半抗體包含臼。

在一些實施方案中，本發(fā)明方法包括在調(diào)節(jié)ph之前加入精氨酸至20mm至1m之間的終濃度。在一些實施方案中，加入精氨酸至50mm-600mm之間的終濃度。在一些實施方案中，加入精氨酸至50mm-100mm之間的終濃度。

在某些實施方案中，本發(fā)明方法包括在混合第一和第二半抗體之前在5至8之間的ph孵育各含鉸鏈多肽蛋白a池(pool)。在其他實施方案中，混合該蛋白a池，然后調(diào)節(jié)ph到5至8之間。

在一些實施方案中，本文所述的方法包括在15℃-39℃之間、優(yōu)選18℃-37℃之間、更優(yōu)選20℃-25℃之間、更優(yōu)選32℃-37℃之間的溫度，孵育該混合的半抗體或混合的含鉸鏈多肽池至少30分鐘。

含鉸鏈多肽可以通過例如細菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞中的桿狀病毒或哺乳動物細胞來產(chǎn)生。在某些實施方案中，通過細菌細胞，尤其是大腸桿菌(e.coli)來產(chǎn)生該含鉸鏈多肽。在某些其他具體實施方案中，通過哺乳動物細胞，尤其是cho細胞來產(chǎn)生該含鉸鏈多肽。在某些具體實施方案中，該含鉸鏈多肽包含半抗體。

含鉸鏈多肽可以通過異源二聚化結(jié)構(gòu)域相互作用來形成二聚體或多聚體。在某些實施方案中，第一和第二含鉸鏈多肽在異源二聚化結(jié)構(gòu)域界面上的相互作用是凸起進入凹陷的相互作用、疏水相互作用和/或靜電相互作用。在某些其他實施方案中，異源多聚化結(jié)構(gòu)域包含杵(例如凸起)、臼(例如凹陷)、亮氨酸拉鏈、卷曲螺旋、或能夠形成靜電相互作用的極性氨基酸殘基，或其組合。在某些實施方案中，第一含鉸鏈多肽包含杵，第二含鉸鏈多肽包含臼。在某些其他實施方案中，該相互作用涉及疏水相互作用和靜電相互作用二者。在某些示例性實施方案中，第一和第二含鉸鏈多肽各自的異源多聚化結(jié)構(gòu)域都包含杵或臼和能夠形成靜電相互作用的氨基酸殘基。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，異源二聚化結(jié)構(gòu)域可以包含一種以上相互作用方式，例如杵和臼(k&h)及疏水相互作用、k&h和亮氨酸拉鏈等。在某些實施方案中，含鉸鏈多肽進一步包含系鏈。在某些具體實施方案中，含鉸鏈多肽包含半抗體。

在某些具體實施方案中，組裝混合物存在于還原條件中，優(yōu)選弱還原條件中，具有-50至-600mv、-100至-600mv、-200至-600mv、-100至-500mv、-150至-300mv之間、更優(yōu)選-300至-500mv之間、最優(yōu)選約-400mv的氧化電位，以及在促進異源多聚體蛋白質(zhì)組裝的條件下，如ph在7和9之間，溫度在15℃和39℃之間。在某些實施方案中，在組裝期間向步驟c或步驟d中加入還原劑來制備希望的還原條件。在某些其他實施方案中，還原劑選自二硫蘇糖醇(dtt)、三(2-羧乙基)膦(tcep)、巰基乙酸、抗壞血酸、硫羥乙酸、谷胱甘肽(gsh)、β-巰基乙胺、半胱氨酸/胱氨酸、谷胱甘肽(gsh)、半胱胺/胱胺、甘氨酰半胱氨酸、和β-巰基乙醇，優(yōu)選gsh。在某些優(yōu)選實施方案中，還原劑，優(yōu)選弱還原劑，選自谷胱甘肽(gsh)、β-巰基乙胺、半胱氨酸/胱氨酸、谷胱甘肽(gsh)/谷胱甘肽二硫化物(gssg)、半胱胺/胱胺、甘氨酰半胱氨酸、和β-巰基乙醇，且優(yōu)選gsh。在某些實施方案中，還原劑不是dtt。

在某些其他實施方案中，相對于含鉸鏈多肽的總量，向組裝混合物中加入2-600x、2-200x、2-300x、2-400x、2-500x、2-20x、2-8x、20-50x、50-600x、50-200x或100-300x摩爾過量、優(yōu)選50-400x、更優(yōu)選100-300x和最優(yōu)選200x摩爾過量的還原劑。在某些實施方案中，組裝混合物具有7和9之間的ph，優(yōu)選ph8.5。在某些實施方案中，含鉸鏈多肽是半抗體。

在一些實施方案中，在混合前向第一和第二含鉸鏈多肽中加入還原劑。優(yōu)選地，該加入在混合前不到1小時、更優(yōu)選不到15分鐘、最優(yōu)選不到5分鐘進行。

在某些實施方案中，該方法進一步包括在一個或多個步驟中向反應中加入穩(wěn)定劑，所述步驟非限制性地包括：中間ph保持步驟和組裝步驟(在加熱或不加熱情況下)。例如，可以向含鉸鏈多肽中加入穩(wěn)定劑來防止或減少聚集。在其他實例中，可以向組裝混合物中加入穩(wěn)定劑來防止或減少在組裝異源多聚體蛋白質(zhì)期間的聚集。在某些具體實施方案中，含鉸鏈多肽包含半抗體。

在某些具體實施方案中，穩(wěn)定劑選自精氨酸、組氨酸和聚乙烯吡咯烷酮(pvp)。在某些實施方案中，精氨酸或組氨酸是精氨酸鹽或組氨酸鹽。在某些其他實施方案中，精氨酸或組氨酸是精氨酸衍生物或組氨酸衍生物。在某些其他實施方案中，精氨酸或組氨酸是鹽酸精氨酸或鹽酸組氨酸。在某些實施方案中，精氨酸不是磷酸精氨酸。

在某些其他實施方案中，本發(fā)明方法進一步包括在pvp的存在下孵育組裝混合物的步驟。在相關(guān)實施方案中，加入pvp至不超過40％(w/v)。在某些其他實施方案中，pvp以2％-6％(w/v)、10％-20％、2％-10％、1％、1.3％、1.7％、2％、2.3％、2.7％、3％、3.3％、3.7％或4％、優(yōu)選0.1％-10％、更優(yōu)選2％-6％和最優(yōu)選4％的濃度存在于組裝混合物中。在某些實施方案中，pvp不超過100kd、不超過30kd，且優(yōu)選10kd。在某些其他實施方案中，pvp以不到10％(w/w)或不到5％(w/w)存在。

在一些實施方案中，穩(wěn)定劑是以20mm至1m、20mm至小于1m、20mm至100mm、20mm至200mm、20mm至300mm、20mm至400mm、20mm至50mm、50mm至100mm、50nm至150mm、50mm至200mm、50mm至250mm、或50mm至300mm之間的濃度存在的精氨酸。在其他實施方案中，穩(wěn)定劑是以20mm至1m、20mm至小于1m、20mm至100mm、20mm至200mm、20mm至300mm、20mm至400mm、20mm至50mm、50mm至100mm、50nm至150mm、50mm至200mm、50mm至250mm、或50mm至300mm之間的濃度存在的組氨酸。在某些優(yōu)選實施方案中，以50mm或200mm的濃度加入精氨酸或組氨酸。在某些其他實施方案中，以20mm至200mm、20mm至100mm、50mm至200mm、或50mm至100mm的濃度加入精氨酸和/或組氨酸。在某些其他實施方案中，含鉸鏈多肽包含半抗體。

在再一方面，本發(fā)明提供表達含鉸鏈多肽的宿主細胞。在某些實施方案中，含鉸鏈多肽包含半抗體。

在另一方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生雙特異性抗體的方法，其包括步驟：(a)培養(yǎng)經(jīng)改造以表達對第一抗原或抗原的第一表位特異的第一半抗體的第一宿主細胞；(b)培養(yǎng)經(jīng)改造以表達對第二抗原或同一抗原的第二表位特異的第二半抗體的第二宿主細胞；(c)在第一加溶劑的存在下，在4-9、優(yōu)選5-9之間的ph，從步驟a的培養(yǎng)物獲得第一半抗體；(d)在第二加溶劑的存在下，在4-9、優(yōu)選5-9之間的ph，從步驟b的培養(yǎng)物獲得第二半抗體；(e)在還原條件中混合第一和第二半抗體，以形成組裝混合物；和(f)孵育組裝混合物，以形成包含第一和第二半抗體的雙特異性抗體。

在一些實施方案中，在分開的培養(yǎng)物中培養(yǎng)第一宿主細胞和第二宿主細胞，并在混合前分別從第一和第二宿主細胞的培養(yǎng)物純化第一半抗體和第二半抗體。在某些實施方案中，在分開的培養(yǎng)物中培養(yǎng)第一和第二宿主細胞，組合培養(yǎng)物，沉淀細胞，可選地勻漿和/或裂解，以及通過任何適宜的方法共純化第一和第二半抗體。在某些實施方案中，通過蛋白a純化來共純化第一和第二半抗體。在其他實施方案中，在混合培養(yǎng)物中共培養(yǎng)第一和第二宿主細胞，并共純化第一和第二半抗體。

宿主細胞可以是例如細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。在某些具體實施方案中，通過諸如cho細胞的哺乳動物細胞來產(chǎn)生含鉸鏈多肽或半抗體。在某些其他實施方案中，宿主細胞是細菌細胞，尤其是大腸桿菌。

在某些其他實施方案中，本發(fā)明的方法進一步包括步驟：回收步驟(d)中形成的異源多聚體蛋白質(zhì)或雙特異性抗體。組裝的異源多聚體蛋白質(zhì)可以通過本申請通篇描述的方法或本領(lǐng)域已知的適宜方法來進一步純化。

在另一方面，本發(fā)明提供包含含鉸鏈多肽和穩(wěn)定劑的組合物，其中組合物的ph在ph4-ph9之間，優(yōu)選ph5-9之間。在某些實施方案中，組合物的ph為至少ph5、至少ph5.5、至少ph5.7、大于ph5、大于ph5.5、大于ph5.7、5和9之間、5和8之間、5.5和8之間、5.5和9之間、5.7和8之間、5.7和9之間、6和8之間、6和9之間、7和8之間、7.5和8.5之間、或7和8.5之間。在某些實施方案中，穩(wěn)定劑選自精氨酸、組氨酸和蔗糖，優(yōu)選精氨酸和/或組氨酸。在某些其他實施方案中，精氨酸是精氨酸鹽和/或組氨酸是組氨酸鹽。在某些其他實施方案中，精氨酸是精氨酸衍生物和/或組氨酸是組氨酸衍生物。在某些其他實施方案中，精氨酸或組氨酸是l-精氨酸或l-組氨酸。在某些其他實施方案中，精氨酸或組氨酸是鹽酸精氨酸或鹽酸組氨酸。

在某些具體實施方案中，穩(wěn)定劑是精氨酸或組氨酸。在某些其他實施方案中，精氨酸或組氨酸以20mm、50mm、200mm、400mm、20mm至1m之間、20mm至小于1m之間、20mm至200mm之間、20mm至400mm之間、20mm至100mm之間、50mm至100mm之間、50mm至200mm之間、50mm至300mm之間或50mm至400mm之間的濃度存在。在某些具體實施方案中，組合物包含各以20mm、50mm、200mm、400mm、20mm至1m之間、20mm至小于1m之間、20mm至200mm之間、20mm至400mm之間、20mm至100mm之間、50mm至100mm之間、50mm至200mm之間、50mm至300mm之間、或50mm至400mm之間的濃度存在的精氨酸和組氨酸二者。在某些其他實施方案中，組合物不包含鹽酸胍或尿素。在某些實施方案中，組合物備選地或額外地包含穩(wěn)定劑。

在某些具體實施方案中，含鉸鏈多肽包含半抗體。在某些其他具體實施方案中，組合物僅包含一種類型的含鉸鏈多肽或半抗體。在某些實施方案中，組合物僅包含一種類型的半抗體，即，杵半抗體。在某些其他實施方案中，組合物僅包含一種類型的半抗體，即，臼半抗體。

在某些具體實施方案中，組合物進一步包含第二含鉸鏈多肽，其中第一含鉸鏈多肽包含杵，而第二含鉸鏈多肽包含臼。在某些實施方案中，含鉸鏈多肽包含半抗體。在某些具體實施方案中，含鉸鏈多肽是半抗體。在某些其他實施方案中，半抗體為igg1、igg2或igg4同種型。

除非文中清楚地另有說明，可以組合本文中公開的所有實施方案。此外，除非文中清楚地另有說明，上文所述的任一個和每一個實施方案都適用于本發(fā)明的任一個和每一個方面。

本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)勢將從以下發(fā)明詳述變得顯而易見。但是，應理解，雖然指出了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但發(fā)明詳述和具體實施例僅以舉例說明的方式給出，對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，落入本發(fā)明的范圍和精神之內(nèi)的各種改變和修改將從本發(fā)明詳述變得顯而易見。

附圖簡述

圖1a顯示完全氧化的半抗體。未顯示“杵”或“臼”或其他異源二聚化結(jié)構(gòu)域。此圖中所示的半抗體是igg1同種型。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可以設(shè)想其他免疫球蛋白同種型作為具有相應的鏈間和鏈內(nèi)鍵的半抗體。在完整抗體中，鉸鏈半胱氨酸將形成鏈間二硫鍵。

圖1b顯示具有異源多聚化結(jié)構(gòu)域的全長雙特異性抗體。未顯示鉸鏈區(qū)中的重鏈間二硫鍵。所顯示的異源多聚化結(jié)構(gòu)域是杵入臼形式。

圖1c是包含異源多聚化結(jié)構(gòu)域(杵入臼)、弗林蛋白酶可切割系鏈和可選的額外二硫鍵(s354)的雙特異性抗體的卡通示意圖。還顯示了鉸鏈區(qū)中的重鏈間二硫鍵。三角形指示弗林蛋白酶切割位點。雖然弗林蛋白酶可切割系鏈顯示在包含杵的半抗體上，但它也可以用在臼半抗體上或杵和臼半抗體二者上。

圖2a-b顯示復合大小排阻層析圖，說明ph對半抗體構(gòu)象轉(zhuǎn)變的作用。圖2a顯示提高的ph誘導臼半抗體構(gòu)象轉(zhuǎn)變，導致更大的流體動力學半徑。這種構(gòu)象轉(zhuǎn)變增強了組裝期間的異二聚化。圖2b顯示提高的ph促進非共價杵半抗體同二聚體的形成。這種構(gòu)象轉(zhuǎn)變有利于組裝期間的雙特異性形成。參考實施例2。

圖3a-3b顯示這樣的結(jié)果，其顯示諸如鹽酸精氨酸(圖3a和b)或組氨酸(圖3b)的穩(wěn)定劑減少中間ph誘導的杵半抗體的沉淀。

圖4a-b顯示組成層析圖，說明諸如谷胱甘肽的還原劑對聚集和雙特異性抗體組裝的作用。按2-200x摩爾過量加入谷胱甘肽。參考實施例3。

圖5a的圖顯示溫度對igg1雙特異性抗體形成(組裝)速率的影響。圖5b顯示，如通過反相層析分析的，在200x摩爾過量的谷胱甘肽存在下、在有或無ph保持下、提高的溫度促進杵入臼雙特異性igg1抗體的組裝。圖5b還顯示，在組裝前優(yōu)化半抗體池的ph保持以驅(qū)動構(gòu)象轉(zhuǎn)變，提高了組裝的速度和效率。參考實施例4。

圖6a顯示諸如pvp的穩(wěn)定劑對穩(wěn)定所形成的雙特異性抗體和減少聚集體形成上的作用。

圖6b顯示，如通過反相層析分析，pvp和組氨酸在提高的溫度下促進杵入臼雙特異性igg4抗體的組裝。下部曲線：室溫組裝，其中300x谷胱甘肽:ab比、ph＝8.5、～400mm精氨酸；上部曲線：加熱組裝，其中200x谷胱甘肽:ab比、ph＝8.0、4％pvp、50mm精氨酸、100mm組氨酸，在35℃。

圖6c證明pvp減少igg4杵入臼雙特異性抗體在37℃和ph8下加熱組裝6小時期間的聚集。參考實施例5。

圖7顯示組氨酸減少igg4臼半抗體在37℃和ph8下3小時由熱誘導的聚集。

發(fā)明詳述

現(xiàn)對本發(fā)明進行詳細描述，使用以下定義和實施例。本文中提到的所有專利和出版物，包括這些專利和出版物中公開的所有序列，明確引入作為參考。

除非本文中另作定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。singleton等,dictionaryofmicrobiologyandmolecularbiology,第2版,johnwileyandsons,newyork(1994)，和hale&marham,theharpercollinsdictionaryofbiology,harperperennial,ny(1991)為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了許多本發(fā)明中使用的術(shù)語的一般字典。本文描述了優(yōu)選的方法和材料，但與本文中所述的那些方法和材料類似或等同的任意方法和材料都可以用于實施或測試本發(fā)明。數(shù)字范圍包含定義該范圍的數(shù)字。除非另有說明，按5’至3’的方向從左至右書寫核酸；按氨基至羧基的方向從左至右書寫氨基酸序列。對于本領(lǐng)域的定義和術(shù)語，從業(yè)者尤其可參考sambrook等,1989和ausubelfm等,1993。應理解，本發(fā)明不限于所述的具體方法、工藝和試劑，因為這些可以變動。

數(shù)字范圍包含定義該范圍的數(shù)字。

除非另有說明，按5’至3’的取向從左至右書寫核酸；按氨基至羧基的取向從左至右書寫氨基酸序列。

除非文中清楚地另有說明，本文中所用的單數(shù)形式“一”、“一個”和“該”包括復數(shù)指代物。例如，提到“一個宿主細胞”意指一個或多個宿主細胞。

本文中提供的標題不對本發(fā)明的各個方面或?qū)嵤┓桨笜?gòu)成限制，本發(fā)明的方法和實施方案可參考說明書整體而得。因此，下文即將定義的術(shù)語通過參考說明書整體而得到更充分的定義。

除非文中清楚地另有說明，本文中公開的所有實施方案可以組合。此外，除非文中清楚地另有說明，下文所述的任一個和每一個實施方案適用于本發(fā)明的任一個和每一個方面。

i.定義

本發(fā)明提供產(chǎn)生包含第一含鉸鏈多肽和第二含鉸鏈多肽的異源多聚體蛋白質(zhì)的方法。本文所用的術(shù)語“含鉸鏈多肽”指，包含至少一個鉸鏈區(qū)的多肽。在某些實施方案中，鉸鏈區(qū)連接多個結(jié)構(gòu)域，例如結(jié)合結(jié)構(gòu)域和效應子結(jié)構(gòu)域，并為多肽的二聚化或多聚化提供一定的結(jié)構(gòu)柔性。作為一個實例，結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以是抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，效應子結(jié)構(gòu)域可以是抗體的fc成分。在某些實施方案中，第一含鉸鏈多肽不同于第二含鉸鏈多肽，得到的二聚體或多聚體是異二聚體或異源多聚體。在某些具體實施方案中，第一含鉸鏈多肽和第二含鉸鏈多肽結(jié)合同一靶蛋白上的兩個不同表位。在某些其他實施方案中，第一含鉸鏈多肽具有不同于第二含鉸鏈多肽的靶標結(jié)合特異性，得到的異二聚體或異源多聚體結(jié)合兩種或多種不同的靶蛋白。在某些實施方案中，含鉸鏈多肽包含天然存在的或改造的異二聚化結(jié)構(gòu)域。在某些具體實施方案中，含鉸鏈多肽在鉸鏈區(qū)中包含一個或多個半胱氨酸殘基，其能夠與另一含鉸鏈多肽形成一個或多個二硫鍵。

含鉸鏈多肽非限制性地包括半抗體、免疫黏附素及其功能片段。本文所用的術(shù)語“功能片段”指含鉸鏈多肽的片段，即小于全長，其仍保留希望的功能，例如，保留靶標或抗原結(jié)合活性、fc效應子活性和/或二聚化/多聚化能力。在某些具體實施方案中，第一含鉸鏈多肽和第二含鉸鏈多肽各為具有不同抗原結(jié)合特異性的半抗體，得到的二聚體或多聚體是雙特異性或多特異性抗體。在某些實施方案中，得到的異源多聚體蛋白質(zhì)包含半抗體和免疫黏附素。

術(shù)語“多特異性抗體”以最廣泛的含義使用，特別涵蓋具有多表位特異性的抗體。這類多特異性抗體包括但不限于：包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl)的抗體，其中vhvl單元具有多表位特異性；具有兩個或多個vl和vh結(jié)構(gòu)域的抗體，每個vhvl單位結(jié)合不同的表位；具有兩個或多個單可變結(jié)構(gòu)域的抗體，每個單可變結(jié)構(gòu)域結(jié)合不同的表位；全長抗體；抗體片段，如fab、fv、dsfv、scfv；雙抗體；雙特異性雙抗體和三抗體；共價或非共價連接的抗體片段?！岸啾砦惶禺愋浴敝柑禺愋越Y(jié)合一個或多個相同或不同靶標上的兩個或多個不同表位的能力?！皢翁禺愋浴敝竷H結(jié)合一種表位的能力。根據(jù)一個實施方案，多特異性抗體是以5μm至0.001pm、3μm至0.001pm、1μm至0.001pm、0.5μm至0.001pm、或0.1μm至0.001pm的親和力結(jié)合各表位的igg抗體。

天然存在的基本4鏈抗體單位是由兩條相同的輕(l)鏈和兩條相同的重(h)鏈組成的異源四聚體糖蛋白(igm抗體由5個基本的異源四聚體單位連同稱為j鏈的附加多肽組成，因此包含10個抗原結(jié)合部位，而分泌性iga抗體可以多聚化形成包含2-5個基本4鏈單位連同j鏈的多價集聚體)。在igg的情況下，4鏈單位通常為約150,000道爾頓。每個l鏈通過一個共價二硫鍵與h鏈連接，而取決于h鏈同種型，兩條h鏈通過一個或多個二硫鍵相互連接。每條h和l鏈還具有規(guī)則間隔開的鏈內(nèi)二硫鍵。每條h鏈在n端具有可變結(jié)構(gòu)域(vh)，對于α和γ鏈，后隨三個恒定結(jié)構(gòu)域(ch)，對于μ和ε同種型，后隨四個ch結(jié)構(gòu)域。每條l鏈在n端具有可變結(jié)構(gòu)域(vl)，后隨c端的恒定結(jié)構(gòu)域(cl)。vl與vh對齊，而cl與重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(ch1)對齊。認為特定的氨基酸殘基形成輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域之間的界面。vh和vl配對在一起形成單個抗原結(jié)合部位。對于不同種類抗體的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，見例如basicandclinicalimmunology,第8版,danielp.stites,abbai.ter和tristramg.parslow(編輯),appleton&lange,norwalk,ct,1994,第71頁和第6章。

可以將來自任意脊椎動物物種的l鏈，根據(jù)其恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，分至兩個明顯不同的類型之一，稱為κ和λ。取決于其重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(ch)的氨基酸序列，可以將免疫球蛋白分至不同的類或同種型。存在五類免疫球蛋白：iga、igd、ige、igg和igm，其分別具有稱為α、δ、ε、γ和μ的重鏈。根據(jù)ch序列和功能上相對小的差異，將γ和α類進一步劃分為亞類，例如，人表達以下亞類：igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。

術(shù)語“可變的”指可變結(jié)構(gòu)域的某些區(qū)段在抗體間在序列上十分不同的事實。v結(jié)構(gòu)域介導抗原結(jié)合，并限定特定抗體對其特定抗原的特異性。但是，可變性并非在可變區(qū)的110個氨基酸的跨度內(nèi)均勻分布。相反，v區(qū)由15-30個氨基酸的稱為構(gòu)架區(qū)(fr)的相對不變的區(qū)段組成，構(gòu)架區(qū)由長度各為9-12個氨基酸的稱為“高變區(qū)”的極端可變性的較短區(qū)域分開。天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域各包含四個fr，其大部分采用β-折疊構(gòu)象，通過三個高變區(qū)連接，高變區(qū)形成連接β-折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)，且在一些情況下形成β-折疊結(jié)構(gòu)的部分。每條鏈中的高變區(qū)通過fr緊靠在一起，并與來自另一條鏈的高變區(qū)一起促成抗體的抗原結(jié)合部位的形成(見kabat等,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991))。恒定結(jié)構(gòu)域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但顯示多種效應子功能，如在抗體依賴性細胞毒性(adcc)中抗體的參與。

在本文中使用時，術(shù)語“高變區(qū)”、“hvr”或“hv”指抗體可變結(jié)構(gòu)域中在序列上高變和/或形成結(jié)構(gòu)上限定的環(huán)的區(qū)域。通常，抗體包含六個hvr；三個在vh(h1、h2、h3)中，三個在vl(l1、l2、l3)中。在天然抗體中，h3和l3顯示六個hvr中最大的多樣性，尤其h3被認為在賦予抗體良好的特異性中發(fā)揮獨特作用。見例如xu等,immunity13:37-45(2000)；johnson和wu,inmethodsinmolecularbiology248:1-25(lo,ed.,humanpress,totowa,nj,2003)。事實上，僅由重鏈組成的天然駝類抗體在缺乏輕鏈的情況下具有功能且穩(wěn)定。見例如hamers-casterman等,nature363:446-448(1993)；sheriff等,naturestruct.biol.3:733-736(1996)。

許多hvr劃界法在使用，并為本文所涵蓋。kabat互補決定區(qū)(cdr)基于序列可變性，且最常用((kabat等,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991))。而chothia指結(jié)構(gòu)環(huán)的位置(chothia和leskj.mol.biol.196:901-917(1987))。abmhvr代表了在kabathvr和chothia結(jié)構(gòu)環(huán)之間的折中，且為oxfordmolecular'sabm抗體模擬軟件所使用?！敖佑|”hvr所基于的是對可用的復合物晶體結(jié)構(gòu)的分析。下文指出了來自這些hvr的每一個的殘基。

hvr可以包含以下“延長的hvr”：vl中24-36或24-34(l1)、46-56或50-56(l2)和89-97或89-96(l3)；vh中26-35(h1)、50-65或49-65(h2)和93-102、94-102或95-102(h3)。對于這些定義中的每一個，按照kabat等編號可變結(jié)構(gòu)域殘基。

“構(gòu)架區(qū)”(fr)是除cdr殘基外的那些可變結(jié)構(gòu)域殘基。每個可變結(jié)構(gòu)域通常具有標識為fr1、fr2、fr3和fr4的四個fr。如果按照kabat定義cdr，則輕鏈fr殘基位于大約殘基1-23(lcfr1)、35-49(lcfr2)、57-88(lcfr3)和98-107(lcfr4)，重鏈fr殘基位于大約重鏈殘基中的殘基1-30(hcfr1)、36-49(hcfr2)、66-94(hcfr3)和103-113(hcfr4)。如果cdr包含來自高變環(huán)的氨基酸殘基，則輕鏈fr殘基位于輕鏈中大約殘基1-25(lcfr1)、33-49(lcfr2)、53-90(lcfr3)和97-107(lcfr4)，重鏈fr殘基位于在重鏈殘基中大約殘基1-25(hcfri)、33-52(hcfr2)、56-95(hcfr3)和102-113(hcfr4)。在一些情況下，在cdr包含來自kabat定義的cdr和高變環(huán)的氨基酸時，將相應地調(diào)整fr殘基。例如，在cdrh1包括氨基酸h26-h35時，重鏈fr1殘基位于1-25位，fr2殘基位于36-49位。

“人共有構(gòu)架”是指這樣的構(gòu)架，其代表了一組選擇的人免疫球蛋白vl或vh構(gòu)架序列中最常見的氨基酸殘基。通常，選擇的該組人免疫球蛋白vl或vh序列來自一個可變結(jié)構(gòu)域序列亞組。通常，該序列亞組是kabat中的亞組。在一個實施方案中，對于vl，該亞組是kabat中的亞組κi。在一個實施方案中，對于vh，該亞組是kabat中的亞組iii。

“完整”抗體的一個實例是包含抗原結(jié)合部位以及cl和至少重鏈恒定結(jié)構(gòu)域ch1、ch2和ch3的抗體。恒定結(jié)構(gòu)域可以是天然序列恒定結(jié)構(gòu)域(例如人天然序列恒定結(jié)構(gòu)域)或其氨基酸序列變體。

“抗體片段”包含完整抗體的部分，優(yōu)選完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的實例包括fab、fab’、f(ab’)2和fv片段；雙抗體(db)；串聯(lián)雙抗體(tadb)；線性抗體(例如美國專利號5,641,870，實施例2；zapata等,proteineng.8(10):1057-1062(1995))；單臂抗體；單可變結(jié)構(gòu)域抗體；微抗體；單鏈抗體分子；自抗體片段形成的多特異性抗體(例如，包括但不限于db-fc、tadb-fc、tadb-ch3和(scfv)4-fc)。

本文所用的術(shù)語“半抗體”指與一條免疫球蛋白輕鏈結(jié)合的一條免疫球蛋白重鏈。圖1a中顯示示例性半抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員將易于理解，半抗體可以涵蓋其片段，并且也可以具有由單可變結(jié)構(gòu)域組成的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如源自駝科(camelidae))。

本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，對低ph下從蛋白a柱或其他基質(zhì)洗脫的半抗體的ph優(yōu)化或調(diào)節(jié)誘導含鉸鏈多肽諸如半抗體的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。ph優(yōu)化至中間ph(本公開通篇中有時稱為ph保持或中間ph保持)可以導致半抗體的沉淀或聚集。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明產(chǎn)生異源多聚體蛋白質(zhì)的方法包括步驟：分別在第一或第二加溶劑的存在下、在ph5-9下提供第一或第二含鉸鏈多肽。

本文中所用的加溶劑定義為：防止或減少含鉸鏈多肽(如半抗體)沉淀的試劑。適宜的加溶劑包括但不限于精氨酸和組氨酸，或其鹽或衍生物，及蔗糖。在某些實施方案中，加溶劑是精氨酸和/或組氨酸。在某些實施方案中，加溶劑防止或減少由中間ph保持和/或加熱誘導的沉淀。在某些具體實施方案中，在中間ph保持(即在調(diào)節(jié)至中間ph之前)和/或加熱之前加入加溶劑。在某些實施方案中，精氨酸或組氨酸是精氨酸鹽或組氨酸鹽。在某些其他實施方案中，精氨酸或組氨酸是精氨酸衍生物或組氨酸衍生物。沉淀的減少可以導致希望的組裝終產(chǎn)物的產(chǎn)率提高。

對于一般的蛋白質(zhì)制備和純化，咪唑和胍一直用來溶解蛋白質(zhì)。但是，意外地發(fā)現(xiàn)，咪唑和胍單獨，在沒有組氨酸或精氨酸的情況下，不足以提高本文所述的組裝的異源多聚體蛋白質(zhì)(如雙特異性抗體)的總體產(chǎn)率。在某些實施方案中，咪唑和鳥苷可以變性蛋白質(zhì)。

類似地，諸如鹽酸胍和尿素的去垢劑一般常用來減少聚集/沉淀，但它們可以徹底變性蛋白質(zhì)。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明加溶劑防止或減少沉淀而不變性目的蛋白質(zhì)。因此，在某些具體實施方案中，本發(fā)明加溶劑不是鹽酸胍、胍、咪唑或尿素。在某些其他實施方案中，本發(fā)明的組合物不包含鹽酸胍或尿素。在某些其他實施方案中，加溶劑不是吐溫(tween)或peg。

此外，可以例如在各半抗體的中間ph保持期間或在組裝期間于混合含鉸鏈多肽或半抗體時或緊接混合后，加入穩(wěn)定劑?？梢栽诮M裝之前、組裝期間和/或組裝之后，在本發(fā)明方法的一個或多個或全部步驟的反應中加入穩(wěn)定劑來防止或減少含鉸鏈多肽或半抗體的聚集。

聚集體可以作為高分子量物質(zhì)被檢測到，在半抗體的情況下，可以作為分子量大于150kda的高分子量物質(zhì)被檢測到?？梢酝ㄟ^例如大小排阻層析或其他適宜的方法來檢測和定量聚集體。在某些其他實施方案中，通過大小排阻層析檢測到的聚集體可以通過0.2μm除菌濾器。另一方面，沉淀的蛋白質(zhì)可以由變性蛋白質(zhì)或聚集蛋白質(zhì)組成，其可形成非常巨大的復合物。已測試了幾種試劑，并確定其用作穩(wěn)定劑是無效的或不合適的，例如咪唑、3-(n-嗎啉代)丙磺酸(mops)、2-(n-嗎啉代)乙磺酸(mes)、環(huán)糊精、cuso4和naoac。因此，在某些實施方案中，穩(wěn)定劑不包括無機鹽或過渡金屬。適宜的穩(wěn)定劑包括但不限于pvp、組氨酸和精氨酸。聚集體的減少可以導致希望的組裝終產(chǎn)物的產(chǎn)率提高。

pvp是具有吡咯烷酮基團的水溶性不帶電荷聚合物。在某些實施方案中，其他不帶電荷的極性聚合物、其他試劑或化合物、尤其是與本文中所述的適宜穩(wěn)定劑具有相似的結(jié)構(gòu)和特性的化合物，可以是適用于本發(fā)明的穩(wěn)定劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過本領(lǐng)域已知的方法(包括本文中提供的方法)，分析化合物對聚集水平的影響，從而確定適宜的穩(wěn)定劑。

試劑可以具有加溶劑和穩(wěn)定劑二者的特征。例如，精氨酸可以在中間ph保持和/或加熱期間用作加溶劑來減少半抗體的沉淀，并可以在組裝步驟期間用作穩(wěn)定劑來減少聚集。類似地，組氨酸可以在中間ph保持和/或加熱期間，用作加溶劑來減少半抗體的沉淀以及用作穩(wěn)定劑來減少半抗體的聚集。不受限于任何具體機制，在某些實施方案中，加溶劑和穩(wěn)定劑二者都可以通過防止蛋白質(zhì)表面上可以導致聚集的疏水斑塊的相互作用來發(fā)揮作用。在其他實施方案中，加溶劑和穩(wěn)定劑二者都可以通過形成籠形物來防止不希望的蛋白質(zhì)相互作用，從而發(fā)揮作用。

本文所用的術(shù)語“單鏈半抗體”指包含vl結(jié)構(gòu)域、可選的cl結(jié)構(gòu)域、系鏈、vh結(jié)構(gòu)域、可選的ch1結(jié)構(gòu)域、鉸鏈結(jié)構(gòu)域、ch2結(jié)構(gòu)域和ch3結(jié)構(gòu)域的單鏈多肽，其中按n端至c端方向所述結(jié)構(gòu)域彼此的相對位置如下：vl-系鏈-vh-鉸鏈-ch2-ch3或vl-cl-系鏈-vh-ch1-鉸鏈-ch2-ch3。

表述“單結(jié)構(gòu)域抗體”(sdab)或“單可變結(jié)構(gòu)域(svd)抗體”一般指，其中單個可變結(jié)構(gòu)域(vh或vl)可以賦予抗原結(jié)合的抗體。換言之，為了識別靶抗原，單可變結(jié)構(gòu)域無需與另一可變結(jié)構(gòu)域相互作用。單結(jié)構(gòu)域抗體的實例包括：衍生自駝類(羊駝和駱駝)和軟骨魚(例如護士鯊)的抗體、以及通過重組方法自人和小鼠抗體衍生的那些(nature(1989)341:544-546；devcompimmunol(2006)30:43-56；trendbiochemsci(2001)26:230-235；trendsbiotechnol(2003):21:484-490；wo2005/035572；wo03/035694；febslett(1994)339:285-290；wo00/29004；wo02/051870)。

表述“線性抗體”一般指zapata等,proteineng.8(10):1057-1062(1995)中所述的抗體。簡言之，這些抗體包含一對串聯(lián)fd區(qū)段(vh-ch1-vh-ch1)，其與互補輕鏈多肽一起形成一對抗原結(jié)合區(qū)。線性抗體可以是雙特異性或單特異性的。

本文中提到的“杵入臼”或“knh”技術(shù)指，通過在兩條多肽相互作用的界面上，在一條多肽中引入凸起(杵)，在另一條多肽中引入凹陷(臼)，從而指導兩條多肽在體外或體內(nèi)配對在一起的技術(shù)。例如，已在抗體的fc:fc結(jié)合界面、cl:ch1界面或vh/vl界面中引入knh(例如us2007/0178552；wo96/027011；wo98/050431；zhu等(1997)proteinscience6:781-788)。這尤其可以用于在多特異性抗體制備過程中驅(qū)動兩條不同的重鏈配對在一起。例如，在其fc區(qū)中具有knh的多特異性抗體可以進一步包含與各fc區(qū)連接的單可變結(jié)構(gòu)域，或進一步包含與相似或不同的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域配對的不同重鏈可變結(jié)構(gòu)域。knh技術(shù)還可以用來使兩個不同的受體胞外域或包含不同靶標識別序列的任何其他多肽序列(例如，包括親和體、肽體和其他fc融合物)配對在一起。

木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個相同的抗原結(jié)合片段(稱為“fab”片段)和剩余的“fc”片段(該命名反映其易結(jié)晶的能力)。fab片段由整個l鏈連同一條重鏈的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(vh)和該h鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(ch1)組成。胃蛋白酶處理抗體產(chǎn)生單個大的f(ab’)2片段，其大致對應于兩個由二硫鍵連接的fab片段，具有二價抗原結(jié)合活性，且仍能夠交聯(lián)抗原。fab’片段與fab片段的不同在于，在ch1結(jié)構(gòu)域的羧基端具有幾個額外的殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。fab’-sh是本文對恒定結(jié)構(gòu)域的一個或多個半胱氨酸殘基具有自由巰基的fab’的命名。f(ab’)2抗體片段最初作為其間具有鉸鏈半胱氨酸的fab’片段對產(chǎn)生。還已知抗體片段的其他化學偶聯(lián)。

fc片段包含通過二硫鍵靠在一起的兩條h鏈的羧基端部分?？贵w的效應子功能由fc區(qū)中的序列決定；此區(qū)域也是存在于某些類型的細胞上的fc受體(fcr)所識別的部分。

“fv”由緊密非共價結(jié)合的一個重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和一個輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的二聚體組成。從這兩個結(jié)構(gòu)域的折疊，生出六個高變環(huán)(自h鏈和l鏈各產(chǎn)生三個環(huán))，其貢獻用于抗原結(jié)合的氨基酸殘基并賦予抗體抗原結(jié)合特異性。但是，甚至單可變結(jié)構(gòu)域(或僅包含對抗原具有特異性的三個cdr的半個fv)也具有識別和結(jié)合抗原的能力，雖然親和力常低于整個結(jié)合部位。

“單鏈fv”(也縮寫為“sfv”或“scfv”)是包含連接為單條多肽鏈的vh和vl抗體結(jié)構(gòu)域的抗體片段。優(yōu)選地，sfv多肽進一步在vh和vl結(jié)構(gòu)域之間包含多肽接頭，其使得sfv能夠形成希望的結(jié)構(gòu)用于抗原結(jié)合。sfv的綜述見pluckthun,thepharmacologyofmonoclonalantibodies,113卷,rosenburg和moore編輯,springer-verlag,紐約,269-315頁(1994)；malmborg等,j.immunol.methods183:7-13,1995。

術(shù)語“雙抗體”指通過以下制備的小抗體片段：構(gòu)建在vh和vl結(jié)構(gòu)域之間具有短接頭(約5-10個殘基)的sfv片段(見前一段)，使得達到v結(jié)構(gòu)域的鏈間配對而不是鏈內(nèi)配對，產(chǎn)生二價片段，即具有兩個抗原結(jié)合部位的片段。雙特異性雙抗體是兩個“交換”sfv片段的異二聚體，其中該兩個抗體的vh和vl結(jié)構(gòu)域存在于不同的多肽鏈上。雙抗體更充分地描述于例如ep404,097；wo93/11161；和hollinger等,proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448(1993)中。

術(shù)語“單臂抗體”指，包含(1)通過肽鍵連接至含有ch2結(jié)構(gòu)域、ch3結(jié)構(gòu)域或ch2-ch3結(jié)構(gòu)域的多肽上的可變結(jié)構(gòu)域及(2)第二ch2、ch3或ch2-ch3結(jié)構(gòu)域的抗體，其中可變結(jié)構(gòu)域不通過肽鍵連接至含有該第二ch2、ch3或ch2-ch3結(jié)構(gòu)域的多肽。在一個實施方案中，單臂抗體包含3條多肽：(1)含有可變結(jié)構(gòu)域(例如vh)、ch1、ch2和ch3的第一多肽；(2)含有可變結(jié)構(gòu)域(例如vl)和cl結(jié)構(gòu)域的第二多肽；及(3)含有ch2和ch3結(jié)構(gòu)域的第三多肽。在一個實施方案中，該第三多肽不包含可變結(jié)構(gòu)域。在另一實施方案中，單臂抗體具有部分鉸鏈區(qū)，該部分鉸鏈區(qū)包含兩個半胱氨酸殘基，其形成二硫鍵而連接恒定重鏈。在一個實施方案中，單臂抗體的可變結(jié)構(gòu)域形成抗原結(jié)合區(qū)。在另一實施方案中，單臂抗體的可變結(jié)構(gòu)域是單可變結(jié)構(gòu)域，其中每個單可變結(jié)構(gòu)域都是抗原結(jié)合區(qū)。

本發(fā)明的抗體可以是“嵌合”抗體，其中部分重鏈和/或輕鏈與衍生自特定物種或隸屬于特定抗體種類或亞類的抗體中對應的序列相同或同源，而所述鏈(一條或多條)的其余部分與衍生自另一物種或隸屬于另一抗體種類或亞類的抗體中對應的序列相同或同源，以及這類抗體的片段，只要它們顯示希望的生物學活性(美國專利號4,816,567；和morrison等,proc.natl.acad.sci.usa81:6851-6855(1984))。本文中的目的嵌合抗體包括含有衍生自非人靈長類(例如舊大陸猴、猿等)的可變結(jié)構(gòu)域抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列的靈長類源化抗體。

非人(例如嚙齒動物)抗體的“人源化”形式是含有衍生自非人抗體的最小序列的嵌合抗體。就大部分而言，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體高變區(qū)的殘基被替換為來自具有期望抗體特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)(如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類)的高變區(qū)的殘基。在一些情況下，用對應的非人殘基替換所述人免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)(fr)殘基。此外，人源化抗體可以包含不存在于受體抗體中或供體抗體中的殘基。進行這些修飾來進一步精化抗體性能。通常，人源化抗體將包含至少一個、通常兩個可變結(jié)構(gòu)域的基本上全部，其中高變環(huán)的全部或基本上全部對應于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，而fr的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列的fr。人源化抗體還可以任選地包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。進一步的細節(jié)見jones等,nature321:522-525(1986)；riechmann等,nature332:323-329(1988)；及presta,curr.op.struct.biol.2:593-596(1992)。

本文中所用的“復合物”或“復合的”指，通過并非肽鍵的鍵和/或力(例如范德瓦爾斯力、疏水力、親水力)而彼此相互作用的兩個或多個分子的結(jié)合。在一個實施方案中，復合物是異源多聚體。應理解，本文中所用的術(shù)語“蛋白質(zhì)復合物”或“多肽復合物”包括這樣的復合物，在該蛋白質(zhì)復合物中具有綴合至蛋白質(zhì)的非蛋白質(zhì)實體(例如，包括但不限于化學分子，如毒素或檢測劑)。

本文中所用的術(shù)語“異源多聚體”或“異源多聚體的”描述通過非肽共價鍵(例如二硫鍵)和/或非共價相互作用(例如氫鍵、離子鍵、范德瓦爾斯力和疏水相互作用)彼此相互作用的兩個或更多個多肽，其中這些分子中的至少兩個具有彼此不同的序列。

本文中所用的術(shù)語“異源多聚化結(jié)構(gòu)域”指，為促進異源多聚體形成和阻礙同源多聚體形成，對生物分子的改變或添加。具有形成異二聚體超過同二聚體的強烈偏好的任意異源二聚化結(jié)構(gòu)域都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。舉例說明性實例包括但不限于，例如美國專利申請20030078385(arathoon等-genentech；描述杵入臼)；wo2007147901(等-novonordisk：描述離子相互作用)；wo2009089004(kannan等-amgen：描述靜電引導效應(electrostaticsteeringeffects))；wo2010/034605(christensen等-genentech：描述卷曲螺旋)。還見例如描述亮氨酸拉鏈的pack,p.&plueckthun,a.,biochemistry31,1579-1584(1992)；或描述螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序的pack等,bio/technology11,1271-1277(1993)。短語“異源多聚化結(jié)構(gòu)域”和“異源二聚化結(jié)構(gòu)域”在本文中可互換使用。在某些實施方案中，含鉸鏈多肽包含一個或多個異源二聚化結(jié)構(gòu)域。

本文所用的術(shù)語“免疫黏附素”指，將異源蛋白質(zhì)(“黏附素”)的結(jié)合特異性與免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域的效應子功能相組合的分子。在結(jié)構(gòu)上，免疫黏附素包含具有希望的結(jié)合特異性的氨基酸序列(該氨基酸序列不同于抗體的抗原識別和結(jié)合部位(即，相對于抗體的恒定區(qū)，是“異源的”))和免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列(例如igg的ch2和/或ch3序列)的融合物。示例性黏附素序列包括含有與目的蛋白質(zhì)結(jié)合的受體或配體的部分的連續(xù)氨基酸序列。黏附素序列還可以是結(jié)合目的蛋白質(zhì)但不是受體或配體序列的序列(例如肽體中的黏附素序列)。這類多肽序列可以通過包括噬菌體展示技術(shù)和高通量分選方法的多種方法來選擇或鑒定。免疫黏附素中的免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列可以獲自任意免疫球蛋白，如igg-1、igg-2、igg-3或igg-4亞型、iga(包括iga-1和iga-2)、ige、igd或igm。

本發(fā)明的“結(jié)合”目的抗原的抗體是這樣的抗體，其以足夠的親和力結(jié)合抗原，使得抗體可以作為診斷劑和/或治療劑用于靶向蛋白質(zhì)或表達抗原的細胞或組織，而不與其他蛋白質(zhì)發(fā)生顯著交叉反應。在這類實施方案中，通過熒光激活細胞分選(facs)分析或放射免疫沉淀(ria)或elisa測定，抗體與“非靶”蛋白結(jié)合的程度將小于抗體與其特定靶蛋白的結(jié)合的約10％。就抗體與靶分子的結(jié)合而言，術(shù)語“特異性結(jié)合”或“特異地結(jié)合”或“特異于”特定多肽或特定多肽靶標上的表位，是指該結(jié)合可測量地不同于非特異性相互作用(例如非特異性相互作用可以是與牛血清白蛋白或酪蛋白的結(jié)合)。特異性結(jié)合可以例如通過與對照分子的結(jié)合相比，測定分子的結(jié)合來測量。例如，特異性結(jié)合可以通過與類似于靶標的對照分子(例如過量的未標記靶標)的競爭來確定。在這種情況下，如果過量的未標記靶標競爭性地抑制標記靶標與探針的結(jié)合，則指示特異性結(jié)合。本文中，術(shù)語“特異性結(jié)合”或“特異地結(jié)合”或“特異于”特定多肽或特定多肽靶標上的表位，可以表現(xiàn)為：例如，分子對靶標具有至少約200nm、備選地至少約150nm、備選地至少約100nm、備選地至少約60nm、備選地至少約50nm、備選地至少約40nm、備選地至少約30nm、備選地至少約20nm、備選地至少約10nm、備選地至少約8nm、備選地至少約6nm、備選地至少約4nm、備選地至少約2nm、備選地至少約1nm，或更高的kd。在一個實施方案中，術(shù)語“特異性結(jié)合”指這樣的結(jié)合，其中分子與特定多肽或特定多肽上的表位結(jié)合，而與任何其他多肽或多肽表位無實質(zhì)性結(jié)合。

“結(jié)合親和力”一般指，分子(例如抗體)的單個結(jié)合部位與它的結(jié)合配偶體(例如抗原)之間非共價相互作用的總和的強度。除非另有說明，本文所用的“結(jié)合親和力”指固有的結(jié)合親和力，其反映結(jié)合對的成員(例如抗體和抗原)之間的1:1相互作用。分子x對它的配偶體y的親和力一般可通過解離常數(shù)(kd)來表示。例如，kd可以是約200nm、150nm、100nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm、10nm、8nm、6nm、4nm、2nm、1nm或更強。親和力可以通過本領(lǐng)域公知的方法來測量，包括本文中描述的那些。低親和力抗體一般緩慢地結(jié)合抗原并傾向于容易解離，而高親和力抗體一般更快地結(jié)合抗原并傾向于保持更長久的結(jié)合。多種測量結(jié)合親和力的方法為本領(lǐng)域已知，其中的任一種都可以用于本發(fā)明的目的。

在一個實施方案中，通過表面等離振子共振測定法，使用biacore^tm-2000或biacore^tm-3000(biacore,inc.,piscataway,nj)，在25℃，用固定抗原的cm5芯片，以～10響應單位(ru)，測量本發(fā)明的“kd”或“kd值”。簡言之，按照廠家的說明，用n-乙基-n’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，活化羧甲基化葡聚糖生物傳感芯片(cm5,biacoreinc.)。用10mm乙酸鈉ph4.8將抗原稀釋為5μg/ml(～0.2μm)，然后按5μl/分鐘的流速注射，以達到約10個響應單位(ru)的偶聯(lián)蛋白質(zhì)。注入抗原后，注入1m乙醇胺來封閉未反應的基團。對于動力學測量，按約25μl/分鐘的流速在25℃注入在含0.05％tween20的pbs(pbst)中fab的兩倍系列稀釋物(例如0.78nm至500nm)。通過同時擬合結(jié)合和解離傳感圖，用簡單的一對一langmuir結(jié)合模型(biacoreevaluationsoftwareversion3.2)，計算結(jié)合速率(kon)和解離速率(koff)。將平衡解離常數(shù)(kd)計算為比值koff/kon。見例如chen等,j.mol.biol.293:865-881(1999)。如果通過以上表面等離振子共振測定的結(jié)合速率超過10⁶m^-1s^-1，則可以通過使用熒光淬滅技術(shù)來確定結(jié)合速率，熒光淬滅技術(shù)測量在濃度遞增的抗原存在下、pbsph7.2中的20nm抗-抗原抗體(fab形式)在25℃的熒光發(fā)射強度(激發(fā)＝295nm；發(fā)射＝340nm；16nm帶通)的增加或減少，如在分光光度計，如配有停流裝置的分光光度計(avivinstruments)或具有攪拌比色杯的8000系列slm-aminco分光光度計(thermospectronic)中測量。

本發(fā)明的“結(jié)合速率”或“kon”也可以用與上文所述相同的表面等離振子共振技術(shù)，使用biacore^tm-2000或biacore^tm-3000(biacore,inc.,piscataway,nj)，用按～10個響應單位(ru)固定抗原的cm5芯片、在25℃測定。簡言之，按照廠家的說明，用n-乙基-n’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)活化羧甲基化葡聚糖生物傳感芯片(cm5,biacoreinc.)。用10mm乙酸鈉ph4.8將抗原稀釋為5μg/ml(～0.2μm)，然后按5μl/分鐘的流速注入，以達到約10個響應單位(ru)的偶聯(lián)蛋白質(zhì)。注入抗原后，注入1m乙醇胺來封閉未反應的基團。對于動力學測量，按約25μl/分鐘的流速在25℃在含0.05％tween20的pbs(pbst)中注入fab的兩倍系列稀釋物(例如0.78nm至500nm)。通過同時擬合結(jié)合和解離傳感圖，用簡單的一對一langmuir結(jié)合模型(biacoreevaluationsoftwareversion3.2)，計算結(jié)合速率(kon)和解離速率(koff)。將平衡解離常數(shù)(kd)計算為比值koff/kon。見例如chen等,j.mol.biol.293:865-881(1999)。但是，如果通過以上表面等離振子共振測定的結(jié)合速率超過10⁶m^-1s^-1，則優(yōu)選通過使用熒光淬滅技術(shù)來測定結(jié)合速率，其中，如在分光光度計，如配有停流裝置的分光光度計(avivinstruments)或具有攪拌比色杯的8000系列slm-aminco分光光度計(thermospectronic)中測量，熒光淬滅技術(shù)測量在濃度遞增的抗原存在下、pbsph7.2中的20nm抗-抗原抗體(fab形式)在25℃的熒光發(fā)射強度(激發(fā)＝295nm；發(fā)射＝340nm；16nm帶通)的增加或減少。

就本發(fā)明的多肽，如抗體、片段或其衍生物而言，除非另有說明，“具有生物活性”和“生物活性”和“生物特征”意指具有與生物分子結(jié)合的能力。

“肽體”(peptibody)指隨機產(chǎn)生的肽與fc結(jié)構(gòu)域的融合物。見2003年12月9日授權(quán)給feige等的美國專利號6,660,843(以其整體引入作為參考)。它們包括與n端、c端、氨基酸側(cè)鏈、或這些位點之一個以上連接的一個或多個肽。肽體技術(shù)使得能夠設(shè)計其中摻入了靶向一種或多種配體或受體的肽、腫瘤歸巢肽、膜轉(zhuǎn)運肽等的治療劑。已證明，肽體技術(shù)可以用于設(shè)計許多這類分子，包括線性肽和二硫鍵限制肽、“串聯(lián)肽多聚體”(即于單鏈的fc結(jié)構(gòu)域上一個以上肽)。見例如美國專利號6,660,843；2003年10月16日公開的美國專利申請?zhí)?003/0195156(對應于2002年11月21日公開的wo02/092620)；2003年9月18日公開的美國專利申請?zhí)?003/0176352(對應于2003年4月17日公開的wo03/031589)；1999年10月22日提交的美國系列號09/422,838(對應于2000年5月4日公開的wo00/24770)；2003年12月11日公開的美國專利申請?zhí)?003/0229023；2003年7月17日公開的wo03/057134；2003年12月25日公開的美國專利申請?zhí)?003/0236193(對應于2004年4月8日提交的pct/us04/010989)；2003年9月18日提交的美國系列號10/666,480(對應于2004年4月1日公開的wo04/026329)；每篇文獻在此以其整體引入作為參考。

“親和體”(affibody)指，通過肽鍵與fc區(qū)連接的蛋白質(zhì)的用途，其中該蛋白質(zhì)用作支架來提供靶分子的結(jié)合表面。所述蛋白質(zhì)通常是天然存在的蛋白質(zhì)，如葡萄球菌蛋白a或igg結(jié)合性b結(jié)構(gòu)域，或從其衍生的z蛋白(見nilsson等(1987),proteng1,107-133和美國專利號5,143,844)，或其片段或衍生物。例如，可以從對一種或多種靶分子具有改變的結(jié)合親和力的z蛋白變體產(chǎn)生親和體，其中為產(chǎn)生能夠結(jié)合靶分子的變體文庫，該z蛋白的一個區(qū)段已通過隨機誘變而發(fā)生突變。親和體的實例包括美國專利號6,534,628、nordk等,proteng8:601-608(1995)和nordk等,natbiotech15:772-777(1997)、biotechnolapplbiochem.2008年6月；50(pt2):97-112。

“分離的”異源多聚體或復合物意指，已從其天然細胞培養(yǎng)環(huán)境的成分中分開和/或回收的異源多聚體或復合物。其天然環(huán)境中的污染成分是將干擾異源多聚體的診斷或治療用途的物質(zhì)，且可以包括酶、激素和其他蛋白質(zhì)性或非蛋白質(zhì)性的溶質(zhì)。在優(yōu)選實施方案中，純化異源多聚體至：(1)通過lowry法測定，蛋白質(zhì)為大于95％重量，且最優(yōu)選大于99％重量；(2)足以通過使用旋杯式測序儀獲得n端或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個殘基的程度；或(3)使用考馬斯藍染色或優(yōu)選銀染，在還原或非還原條件下的sds-page顯示的同質(zhì)性。

本發(fā)明的異源多聚體通常純化至基本同質(zhì)。短語“基本同質(zhì)”、“基本上同質(zhì)的形式”和“基本上同質(zhì)的”用來指示產(chǎn)物基本上不含源自不希望的多肽組合的副產(chǎn)物(例如同源多聚體)。

用純度表示的話，基本同質(zhì)意指，副產(chǎn)物的量不超過10wt％、9wt％、8wt％、7wt％、6wt％、4wt％、3wt％、2wt％或1wt％，或少于1wt％。在一個實施方案中，副產(chǎn)物低于5％。

“生物分子”指核酸、蛋白質(zhì)、糖、脂質(zhì)及其組合。在一個實施方案中，生物分子存在于自然界中。

在用來描述本文公開的各種抗體時，“分離的”意指，該抗體已從表達它的細胞或細胞培養(yǎng)物中獲得鑒定及分離和/或回收。其天然環(huán)境中的污染成分是通常將干擾所述多肽的診斷或治療用途的物質(zhì)，且可以包括酶、激素和其他蛋白質(zhì)性或非蛋白質(zhì)性的溶質(zhì)。在優(yōu)選實施方案中，將抗體純化至：(1)足以通過使用旋杯式測序儀獲得n端或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個殘基的程度；或(2)使用考馬斯藍染色或優(yōu)選銀染、通過非還原或還原條件下的sds-page顯示的同質(zhì)。分離的抗體包括在重組細胞內(nèi)的原位抗體，因為該多肽的天然環(huán)境中的至少一種成分不存在。但是，通常，通過至少一個純化步驟來制備分離的抗體。

本文所用的“連接的”或“連接”意指，第一和第二氨基酸序列之間直接的肽鍵連接，或涉及第三氨基酸序列的連接，其中所述第三氨基酸序列與第一和第二氨基酸序列通過肽鍵連接于其之間。例如，與一個氨基酸序列的c端以及與另一個氨基酸序列的n端通過肽鍵連接的接頭。

本文所用的“接頭”意指，長度為兩個或更多個氨基酸的氨基酸序列。接頭可以由中性極性或非極性氨基酸組成。接頭可以是例如長度2至100個氨基酸，如長度在2至50個氨基酸之間，例如長度為3、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個氨基酸。接頭可以例如通過自切割或酶切割或化學切割來“切割”。氨基酸序列中的切割位點及在這類位點切割的酶和化學品為本領(lǐng)域公知，并還在本文中描述。

本文所用的“系鏈”意指，連接另外兩個氨基酸序列的氨基酸接頭。本文所述的系鏈可以將免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域的n端與免疫球蛋白輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的c端連接。在具體實施方案中，系鏈長度在約15至50個氨基酸之間，例如，長度在20至26個氨基酸之間(例如長度為20、21、22、23、24、25或26個氨基酸)。系鏈可以是“可切割的”，例如，用本領(lǐng)域的方法和試劑標準，自切割或酶切割或化學切割。在某些實施方案中，系鏈包含gly-gly-ser重復序列。

“接頭”或“系鏈”的酶切割可以涉及內(nèi)肽酶的使用，例如lys-c、asp-n、arg-c、v8、glu-c、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝血酶、genenase、因子xa、tev(煙草蝕刻病毒半胱氨酸蛋白酶)、腸激酶、hrvc3(人鼻病毒c3蛋白酶)、激肽原酶以及枯草蛋白酶樣前蛋白轉(zhuǎn)化酶(例如弗林蛋白酶(pc1)、pc2或pc3)或二堿基n-精氨酸轉(zhuǎn)化酶。化學切割可以涉及例如羥胺、n-氯代琥珀酰亞胺、n-溴代琥珀酰亞胺或溴化氰的使用。

本文所用的“l(fā)ys-c內(nèi)肽酶切割位點”是氨基酸序列中可以被lys-c內(nèi)肽酶在c端側(cè)切割的賴氨酸殘基。lys-c內(nèi)肽酶在賴氨酸殘基的c端側(cè)切割。在某些實施方案中，半抗體還在鉸鏈區(qū)中包含k222a突變以去除該內(nèi)源性lys-c內(nèi)肽酶切割位點，從而在用lys-c內(nèi)肽酶切割系鏈后保留半抗體或組裝的雙特異性抗體的結(jié)構(gòu)。

“鉸鏈區(qū)”一般定義為：從人igg1的glu216延伸至pro230(burton,molec.immunol.22:161-206(1985))?？梢酝ㄟ^將形成重鏈間s-s鍵的第一個和最后一個半胱氨酸殘基放置在相同的位置上，將其他igg同種型的鉸鏈區(qū)與igg1序列對齊。

fc區(qū)的“鉸鏈下區(qū)”通常定義為緊接鉸鏈區(qū)c端的殘基段，即fc區(qū)的殘基233至239。在本發(fā)明之前，fcγr結(jié)合通常被歸因于iggfc區(qū)的鉸鏈下區(qū)中的氨基酸殘基。

人iggfc區(qū)的“ch2結(jié)構(gòu)域”通常從igg的約殘基231延伸至約殘基340。ch2結(jié)構(gòu)域是獨特的，因為它不與另一結(jié)構(gòu)域緊密配對。相反，兩個n連接的分枝糖鏈插在完整的天然igg分子的兩個ch2結(jié)構(gòu)域之間。推測該糖可能提供結(jié)構(gòu)域-結(jié)構(gòu)域配對的替代，幫助穩(wěn)定ch2結(jié)構(gòu)域。burton,molec.immunol.22:161-206(1985)。

“ch3結(jié)構(gòu)域”包含fc區(qū)中ch2結(jié)構(gòu)域c端的殘基段(即從igg的約氨基酸殘基341至約氨基酸殘基447)。

本文的術(shù)語“fc區(qū)”用來定義免疫球蛋白重鏈的c端區(qū)域，包括天然序列fc區(qū)和變體fc區(qū)。雖然免疫球蛋白重鏈fc區(qū)的分界可以不同，但人igg重鏈fc區(qū)通常被定義為從cys226位或從pro230位的氨基酸殘基延伸至其羧基端的區(qū)段。fc區(qū)的c端賴氨酸(eu編號系統(tǒng)的殘基447)可以例如在生產(chǎn)或純化抗體期間去除，或通過重組改造編碼抗體重鏈的核酸來去除。因此，完整抗體的組合物可以包括所有k447殘基均被去除了的抗體群體、未去除k447殘基的抗體群體、及包含帶k447殘基和不帶k447殘基的抗體的混合物的抗體群體。

“功能性fc區(qū)”具有天然序列fc區(qū)的“效應子功能”。示例性“效應子功能”包括c1q結(jié)合、cdc、fc受體結(jié)合、adcc、吞噬作用、細胞表面受體(例如b細胞受體；bcr)的下調(diào)等。這類效應子功能一般需要與結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，抗體可變結(jié)構(gòu)域)組合的fc區(qū)，且可以用多種測定法例如本文定義中公開的測定法來評估。

“天然序列fc區(qū)”包含與見于自然界中的fc區(qū)的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人fc區(qū)包括天然序列人igg1fc區(qū)(非a和a同種異型)；天然序列人igg2fc區(qū)；天然序列人igg3fc區(qū)；天然序列人igg4fc區(qū)；及其天然存在的變體。

“變體fc區(qū)”包含由于至少一個氨基酸修飾(優(yōu)選一個或多個氨基酸取代)而不同于天然序列fc區(qū)的氨基酸序列的氨基酸序列。優(yōu)選地，與天然序列fc區(qū)或與親本多肽的fc區(qū)相比，變體fc區(qū)在天然序列fc區(qū)中或在親本多肽的fc區(qū)中具有至少一個氨基酸取代，例如從約一個至約十個氨基酸取代，且優(yōu)選從約一個至約五個氨基酸取代。本文的變體fc區(qū)將優(yōu)選與天然序列fc區(qū)和/或與親本多肽的fc區(qū)具有至少約80％同源性，最優(yōu)選與之具有至少約90％同源性，更優(yōu)選與之具有至少約95％同源性。

本文所用的“fc復合物”指相互作用在一起的fc區(qū)的兩個ch2結(jié)構(gòu)域和/或相互作用在一起的fc區(qū)的兩個ch3結(jié)構(gòu)域，其中該ch2結(jié)構(gòu)域和/或該ch3結(jié)構(gòu)域通過非肽鍵的鍵和/或力(例如范德瓦爾斯力、疏水力、親水力)相互作用。

本文所用的“fc成分”指fc區(qū)的鉸鏈區(qū)、ch2結(jié)構(gòu)域或ch3結(jié)構(gòu)域。

本文所用的“fcch成分”或“fcch”指包含fc區(qū)的ch2結(jié)構(gòu)域、ch3結(jié)構(gòu)域或ch2和ch3結(jié)構(gòu)域的多肽。

抗體“效應子功能”指可歸因于抗體的fc區(qū)(天然序列fc區(qū)或氨基酸序列變體fc區(qū))的那些生物學活性，其隨抗體同種型而變?？贵w效應子功能的實例包括：c1q結(jié)合和依賴補體的細胞毒性、fc受體結(jié)合、依賴抗體的細胞介導的細胞毒性(adcc)、吞噬作用、細胞表面受體(例如b細胞受體)的下調(diào)、和b細胞激活。

在本發(fā)明中，“還原條件”根據(jù)反應中(例如組裝混合物中)的氧化還原電位來定義，其指該反應的氧化還原電位為負(-)。還原條件下的反應的氧化還原電位優(yōu)選在約-50至-600mv、-100至-600mv、-200至-600mv、-100至-500mv、-150至-300mv之間，更優(yōu)選在約-300至-500mv之間，最優(yōu)選約-400mv。

可以用任意適宜的方法來制備期望的還原條件。例如，可以通過向反應(如本發(fā)明的組裝混合物)中加入還原劑來制備期望的還原條件。適宜的還原劑包括但不限于二硫蘇糖醇(dtt)、三(2-羧乙基)膦(tcep)、巰基乙酸、抗壞血酸、硫羥乙酸、谷胱甘肽(gsh)、β-巰基乙胺、半胱氨酸/胱氨酸、gsh/谷胱甘肽二硫化物(gssg)、半胱胺/胱胺、甘氨酰半胱氨酸、和β-巰基乙醇，優(yōu)選gsh。在某些具體實施方案中，還原劑是弱還原劑，包括但不限于gsh、β-巰基乙胺、半胱氨酸/胱氨酸、gsh/gssg、半胱胺/胱胺、甘氨酰半胱氨酸和β-巰基乙醇，且優(yōu)選gsh。在某些優(yōu)選實施方案中，還原劑是gsh。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠選擇在適宜濃度下和適宜實驗條件下的適宜還原劑以在反應中達到期望的還原條件。例如，在20℃，在具有10g/l雙特異性抗體蛋白質(zhì)濃度的溶液中10mml-還原型谷胱甘肽將產(chǎn)生約-400mv的起始氧化還原電位。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用任意適宜的方法來測量給定反應中的氧化還原電位。

可以用本領(lǐng)域已知的任意適宜方法，估計和測量反應的還原條件。例如，可以用刃天青指示劑(在還原條件下從藍色脫色至無色)測量還原條件。對于更精確的測量，可以使用氧化還原電位計(如broadley制造的orpelectrode)。

備選地，可以通過在約10mmhg或更小、優(yōu)選約5mmhg或更小、更優(yōu)選約3mmhg或更小的減小壓力下去除溶解的氣體、尤其是溶解的氧，約1至60分鐘、優(yōu)選約5至40分鐘，以制備還原條件。

在本發(fā)明中，優(yōu)選從一經(jīng)混合該第一和第二含鉸鏈多肽(如半抗體)后至組裝步驟都保持還原條件。在某些實施方案中，優(yōu)選在約50％或更長、更優(yōu)選約70％或更長、還更優(yōu)選約90％或更長的反應時間，保持反應或組裝混合物在還原條件中。尤其優(yōu)選，在約50％或更多、更優(yōu)選約70％或更多、還更優(yōu)選約90％或更多的反應時間內(nèi)，將反應介質(zhì)的氧化還原電位保持在約-200至-600mv、更優(yōu)選-300至-500mv之間、最優(yōu)選約-400mv。

在某些具體實施方案中，還原條件是弱還原條件。本文所用的術(shù)語“弱還原劑”或“弱還原條件”指，在25℃具有負氧化電位的還原劑或由該還原劑制備的還原條件。在ph為7至9、溫度在15℃和39℃之間時，還原劑的氧化電位優(yōu)選在-50至-600mv、-100至-600mv、-200至-600mv、-100至-500mv、-150至-300mv之間、更優(yōu)選約-300至-500mv之間、最優(yōu)選-400mv。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠選擇適宜的還原劑來制備希望的還原條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員明了，可以以較低的濃度使用強還原劑，即在相同的濃度、ph和溫度下比上述還原劑具有更負的氧化電位的還原劑。在優(yōu)選實施方案中，在上述條件下孵育時，蛋白質(zhì)將能夠在還原劑的存在下形成二硫鍵。弱還原劑的實例包括但不限于谷胱甘肽、β-巰基乙胺、半胱氨酸/胱氨酸、gsh/gssg、半胱胺/胱胺、甘氨酰半胱氨酸和β-巰基乙醇。在某些實施方案中，可以用與200x摩爾比的gsh:抗體的氧化電位類似的氧化電位作為弱還原條件的參考點，在該點，預期可用其他還原劑實現(xiàn)有效組裝。

“組裝混合物”是包含第一含鉸鏈多肽、第二含鉸鏈多肽的溶液。在某些實施方案中，組裝混合物存在于還原條件中。在一些實施方案中，組裝混合物存在于弱還原條件中。在某些其他實施方案中，組裝混合物進一步包含弱還原劑。ph在7和9之間、溫度在15℃和39℃之間時，組裝混合物的氧化電位為-50至-600mv、-100至-600mv、-200至-600mv、-100至-500mv、-150至-300mv之間、更優(yōu)選在約-300至-500mv之間、最優(yōu)選約-400mv。

除非另有說明，實施例中提到的市售試劑按照廠家的說明使用。以下實施例和說明書通篇中用atcc保藏號標識的那些細胞的來源是美國典型培養(yǎng)物保藏中心(americantypeculturecollection,manassas,va)。除非另有說明，本發(fā)明使用重組dna技術(shù)的標準方法，如上文及以下教科書中所述的那些：sambrook等,上引文；ausubel等,currentprotocolsinmolecularbiology(greenpublishingassociatesandwileyinterscience,ny,1989)；innis等,pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications(academicpress,inc.,ny,1990)；harlow等,antibodies:alaboratorymanual(coldspringharborpress,coldspringharbor,1988)；gait,oligonucleotidesynthesis(irlpress,oxford,1984)；freshney,animalcellculture,1987；coligan等,currentprotocolsinimmunology,1991。

在本說明書和權(quán)利要求通篇中，詞語“包含”或其變化形式將理解為暗示包括所述整數(shù)或整數(shù)組，但不排除任何其他整數(shù)或整數(shù)組。

ii.異源多聚體蛋白質(zhì)的構(gòu)建

典型地，本文所述的異源多聚體蛋白質(zhì)將包含抗體fc區(qū)的顯著部分。但是，在其他方面，重鏈僅包含ch1、ch2和/或ch3結(jié)構(gòu)域的部分。

異源多聚化結(jié)構(gòu)域

異源多聚體蛋白質(zhì)包含異源多聚化結(jié)構(gòu)域。為了產(chǎn)生異二聚體分子的基本上同質(zhì)的群體，異源二聚化結(jié)構(gòu)域必須具有形成異二聚體超過同二聚體的強烈傾向。雖然本文中示例的異源多聚體蛋白質(zhì)用杵入臼技術(shù)以便于異源多聚化，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應理解，其他異源多聚化結(jié)構(gòu)域也可用于本發(fā)明。

杵入臼

杵入臼作為產(chǎn)生多特異性抗體的方法的用途為本領(lǐng)域公知。見1998年3月24日授權(quán)的、轉(zhuǎn)讓給genentech的美國專利號5,731,168；2009年7月16日公開、轉(zhuǎn)讓給amgen的pct公開號wo2009089004；及2009年7月16日公開、轉(zhuǎn)讓給novonordiska/s的美國專利公開號20090182127。還見marvin和zhu,actapharmacologicasincia(2005)26(6):649-658及kontermann(2005)actapharacol.sin.,26:1-9。本文提供簡要的討論。

“凸起”指至少一個氨基酸側(cè)鏈，其從第一多肽的界面凸出來，因此可置入相鄰界面(即第二多肽的界面)中的互補凹陷內(nèi)來穩(wěn)定異源多聚體，從而例如相比同源多聚體形成，更利于異源多聚體形成。凸起可以存在于原始界面上或可以經(jīng)合成引入(例如通過改變編碼界面的核酸)。通常，改變編碼第一多肽的界面的核酸來編碼凸起。為此，將編碼第一多肽界面中的至少一個“原始”氨基酸殘基的核酸替代為編碼至少一個“輸入”氨基酸殘基的核酸，其中輸入氨基酸殘基具有比原始氨基酸殘基大的側(cè)鏈體積。應理解，可以存在一個以上原始殘基和對應的輸入殘基。取代的原始殘基的數(shù)目的上限是第一多肽界面中的殘基總數(shù)。下表中顯示各種氨基殘基的側(cè)鏈體積。

表1

氨基酸殘基的特性

^a氨基酸分子量減去水的分子量。來自handbookofchemistryandphysics,第43版cleveland,chemicalrubberpublishingco.,1961的值。

^b來自a.a.zamyatnin,prog.biophys.mol.biol.24:107-123,1972的值。

^c來自c.chothia,j.mol.biol.105:1-14,1975的值?？杉氨砻娣e在此參考文獻的圖6-20中定義。

優(yōu)選的用于形成凸起的輸入殘基一般是天然存在的氨基酸殘基，且優(yōu)選選自精氨酸(r)、苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)和色氨酸(w)。最優(yōu)選的是色氨酸和酪氨酸。在一個實施方案中，對于凸起的形成，原始殘基具有小的側(cè)鏈體積，如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或纈氨酸。ch3結(jié)構(gòu)域中用于形成凸起的示例性氨基酸取代包括但不限于t366w取代。

“凹陷”指至少一個氨基酸側(cè)鏈，其從第二多肽的界面凹入，從而可以容納相鄰的第一多肽界面上的對應凸起。凹陷可以存在于原始界面中，或者可以通過合成引入(例如通過改變編碼界面的核酸)。通常，改變編碼第二多肽界面的核酸來編碼凹陷。為此，用編碼至少一個“輸入”氨基酸殘基的dna取代編碼第二多肽界面中的至少一個“原始”氨基酸殘基的核酸，其中輸入氨基酸殘基具有比原始氨基酸殘基小的側(cè)鏈體積。應理解，可以存在一個以上原始殘基和對應的輸入殘基。取代的原始殘基的數(shù)目的上限是第二多肽界面中的殘基的總數(shù)。上文表1中顯示多種氨基殘基的側(cè)鏈體積。優(yōu)選的用于形成凹陷的輸入殘基通常是天然存在的氨基酸殘基，且優(yōu)選選自丙氨酸(a)、絲氨酸(s)、蘇氨酸(t)和纈氨酸(v)。最優(yōu)選的是絲氨酸、丙氨酸或蘇氨酸。在一個實施方案中，對于形成凹陷，原始殘基具有大的側(cè)鏈體積，如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。ch3結(jié)構(gòu)域中用于產(chǎn)生凹陷的示例性氨基酸取代包括但不限于，t366s、l368a、y407a、y407t和y407v取代。在某些實施方案中，杵半抗體包含t366w取代，而臼半抗體包含t366s/l368a/y407v取代。

“原始”氨基酸殘基是被“輸入”殘基取代的氨基酸殘基，輸入殘基可以具有比原始殘基小或大的側(cè)鏈體積。輸入氨基酸殘基可以是天然存在的或非天然存在的氨基酸殘基，但優(yōu)選前者。“天然存在的”氨基酸殘基是由遺傳密碼編碼并在上文表1中列出的那些殘基?！胺翘烊淮嬖诘摹卑被釟埢庵高@樣的殘基，其不由遺傳密碼編碼，但其能夠在多肽鏈中共價結(jié)合鄰近的一個或多個氨基酸殘基。非天然存在的氨基酸殘基的實例是正亮氨酸、鳥氨酸、正纈氨酸、高絲氨酸及其他氨基酸殘基類似物，如描述于例如ellman等,meth.enzym.202:301-336(1991)中的那些。為了產(chǎn)生這類非天然存在的氨基酸殘基，可以使用noren等science244:182(1989)和ellman等,同上引文的方法。簡言之，這涉及用非天然存在的氨基酸殘基化學活化阻抑型trna，然后進行rna的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯。本發(fā)明的方法涉及取代至少一個原始殘基，但可以取代一個以上的原始殘基。通常，取代的原始氨基酸殘基將不超過第一或第二多肽的界面中的總殘基。典型地，取代的原始殘基是“埋藏的”?！奥癫氐摹币庵溉軇┗旧喜豢山咏摎埢?。通常，輸入殘基不是半胱氨酸，以防止可能的氧化或二硫鍵的錯配。

凸起“可置入”凹陷中，意指凸起和凹陷各自在第一多肽和第二多肽界面上的空間位置及凸起和凹陷的大小，使得凸起可以置入凹陷中而不顯著擾亂第一和第二多肽在界面上的正常結(jié)合。由于諸如tyr、phe和trp的凸起通常不從界面的軸垂直伸出且具有優(yōu)選的構(gòu)象，故凸起與對應的凹陷的對齊依賴于根據(jù)三維結(jié)構(gòu)(如通過x射線晶體分析法或核磁共振(nmr)獲得的三維結(jié)構(gòu))模擬凸起/凹陷對。這可以用本領(lǐng)域廣泛接受的技術(shù)來達到。

“原始或模板核酸”意指編碼目的多肽的核酸，其可以被“改變”(即遺傳改造或突變)以編碼凸起或凹陷。原始或起始核酸可以是天然存在的核酸，或者可以包含之前已進行了改變的核酸(例如人源化抗體片段)?！案淖儭焙怂嵋庵福ㄟ^插入、缺失或取代至少一個編碼目的氨基酸殘基的密碼子來突變原始核酸。通常，用編碼輸入殘基的密碼子替代編碼原始殘基的密碼子。用于以這種方式遺傳修飾dna的技術(shù)綜述于mutagenesis:apracticalapproach,m.j.mcpherson編輯,(irlpress,oxford,uk.(1991)中，且包括例如位點定向誘變、盒誘變和聚合酶鏈反應(pcr)誘變。通過突變原始/模板核酸，從而相應地改變原始/模板核酸編碼的原始/模板多肽。

可以通過合成手段，例如通過重組技術(shù)、體外肽合成、之前描述的用于引入非天然存在的氨基酸殘基的那些技術(shù)，通過肽的酶偶聯(lián)或化學偶聯(lián)，或這些技術(shù)的一些組合，將凸起或凹陷“引入”第一或第二多肽的界面。因此，“引入的”凸起或凹陷是“非天然存在的”或“非天然的”，意指它不存在于自然界中或原始多肽(例如人源化單克隆抗體)中。

通常，用于形成凸起的輸入氨基酸殘基具有相對小數(shù)目的“旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體”(例如約3-6)。“旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體”是氨基酸側(cè)鏈在能量上有利的構(gòu)象。多種氨基酸殘基的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的數(shù)目綜述于ponders和richards,j.mol.biol.193:775-791(1987)中。

iii.載體、宿主細胞和重組方法

為了重組產(chǎn)生本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)(例如雙特異性抗體)，分離編碼它的核酸，并插入可復制載體用于進一步克隆(dna的擴增)或用于表達。編碼抗體的dna易于用常規(guī)方法(例如通過使用能夠特異性結(jié)合編碼抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)分離和測序。許多載體可用。載體的選擇部分取決于要使用的宿主細胞。通常，優(yōu)選的宿主細胞為原核生物或真核生物(通常為哺乳動物，但也包括真菌(例如酵母)、昆蟲、植物和來自其他多細胞生物的有核細胞)來源。應理解，任何同種型的恒定區(qū)都可以用于此目的，包括igg、igm、iga、igd和ige恒定區(qū)，且這些恒定區(qū)可以獲自任何人或動物物種。在某些實施方案中，恒定區(qū)來自igg，尤其是igg1、igg2或igg4。

改造宿主細胞，使得它表達包含異源二聚化結(jié)構(gòu)域的含鉸鏈多肽，其中宿主細胞不表達包含第二異源二聚化結(jié)構(gòu)域的含鉸鏈多肽。

a.用原核宿主細胞生產(chǎn)異源多聚體蛋白質(zhì)

i.載體構(gòu)建

編碼本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)(例如抗體)的多肽成分的多核苷酸序列可以用標準重組技術(shù)獲得?？梢詮睦绠a(chǎn)生抗體的細胞(如雜交瘤細胞)分離和測序希望的多核苷酸序列。備選地，可以用核苷酸合成儀或pcr技術(shù)合成多核苷酸。一旦獲得，即可以將編碼多肽的序列插入能夠在原核宿主中復制和表達異源多核苷酸的重組載體。本領(lǐng)域可得和已知的許多載體可以用于本發(fā)明的目的。適宜載體的選擇將主要取決于待插入載體的核酸的大小及待用載體轉(zhuǎn)化的具體宿主細胞。取決于載體的功能(擴增或表達異源多核苷酸，或二者)和它與它所駐留的具體宿主細胞的相容性，每個載體包含多種成分。載體成分通常包括但不限于：復制起點、選擇標記基因、啟動子、核糖體結(jié)合位點(rbs)、信號序列、異源核酸插入片段和轉(zhuǎn)錄終止序列。

通常，將包含源自與宿主細胞相容的物種的復制子和控制序列的質(zhì)粒載體與這些宿主結(jié)合使用。載體通常攜帶復制位點、以及能夠在轉(zhuǎn)化細胞中提供表型選擇的標記序列。例如，通常用衍生自大腸桿菌物種的質(zhì)粒pbr322轉(zhuǎn)化大腸桿菌。pbr322包含編碼氨芐青霉素(amp)和四環(huán)素(tet)抗性的基因，從而提供用于鑒定轉(zhuǎn)化細胞的容易手段。pbr322、其衍生物、或其他微生物質(zhì)?；蚴删w也可以包含，或經(jīng)修飾以包含，能夠被微生物用于表達內(nèi)源蛋白質(zhì)的啟動子?？梢杂糜诒磉_具體抗體的pbr322衍生物的實例詳細描述于carter等的美國專利號5,648,237中。

此外，含有與宿主生物相容的復制子和控制序列的噬菌體載體可以用作轉(zhuǎn)化載體，與這些宿主組合。例如，諸如λgem.tm.-11的噬菌體可以用于制備能夠用來轉(zhuǎn)化諸如大腸桿菌le392的易感宿主細胞的重組載體。

本發(fā)明的表達載體可以包含兩個或更多個啟動子-順反子對，分別編碼各多肽成分。啟動子是位于順反子上游(5’)的非翻譯調(diào)節(jié)序列，調(diào)節(jié)順反子的表達。原核啟動子典型地分為兩類：誘導型和組成型。誘導型啟動子是響應培養(yǎng)條件的變化(例如營養(yǎng)物的存在或缺乏或溫度的變化)而起始處于其控制下的順反子的提高水平的轉(zhuǎn)錄的啟動子。

多種潛在的宿主細胞識別的大量啟動子為本領(lǐng)域公知?？梢酝ㄟ^限制酶消化從來源dna移出啟動子并將該分離的啟動子插入本發(fā)明的載體，將所選擇的啟動子有效連接至編碼例如輕鏈或重鏈的順反子dna。天然啟動子序列和許多異源啟動子都可以用來指導靶基因的擴增和/或表達。在一些實施方案中，利用異源啟動子，因為與天然靶多肽啟動子相比，它們通常允許所表達的靶基因獲得更大的轉(zhuǎn)錄和更高的產(chǎn)率。

適合用于原核宿主的啟動子包括phoa啟動子、β-galactamase和乳糖啟動子系統(tǒng)、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)和雜合啟動子，如tac或trc啟動子。但是，在細菌中具有功能的其他啟動子(如其他已知的細菌或噬菌體啟動子)也是適宜的。它們的核苷酸序列已公開，從而使得技術(shù)人員能夠用接頭或銜接子提供所需的任何限制位點，將它們有效連接至編碼異源多聚體蛋白質(zhì)(例如靶輕鏈和重鏈)的基因的順反子(siebenlist等,(1980)cell20:269)。

在本發(fā)明的一個方面，重組載體內(nèi)的每個順反子都包含指導所表達的多肽跨膜轉(zhuǎn)運的分泌信號序列成分。通常，該信號序列可以是載體的成分，或者它可以是插入載體的靶多肽dna的部分。選擇用于本發(fā)明的目的的信號序列應是可被宿主細胞識別和加工(即通過信號肽酶切割)的信號序列。對于不識別和加工異源多肽的天然信號序列的原核宿主細胞，用選自例如堿性磷酸酶、青霉素酶、lpp或熱穩(wěn)定腸毒素ii(stii)前導序列、lamb、phoe、pelb、ompa和mbp的原核信號序列取代該天然信號序列。在本發(fā)明的一個實施方案中，用于表達系統(tǒng)的兩個順反子中的信號序列是stii信號序列或其變體。

在另一方面，本發(fā)明的免疫球蛋白的產(chǎn)生可以發(fā)生在宿主細胞的胞質(zhì)中，因此無需在每個順反子內(nèi)存在分泌信號序列。在這方面，免疫球蛋白輕鏈和重鏈在胞質(zhì)內(nèi)表達、折疊并組裝形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(例如大腸桿菌trxb-菌株)提供有利于二硫鍵形成的胞質(zhì)條件，從而允許所表達的蛋白質(zhì)亞基的正確折疊和組裝。見proba和pluckthungene,159:203(1995)。

適合用于表達本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)(例如抗體)的原核宿主細胞包括古細菌(archaebacteria)和真細菌(eubacteria)，如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物。有用的細菌的實例包括埃希氏菌屬(escherichia)(例如大腸桿菌)、芽孢桿菌屬(bacilli)(例如枯草芽孢桿菌(b.subtilis))、腸細菌、假單胞菌屬物種(pseudomonasspecies)(例如銅綠假單胞菌(p.aeruginosa))、鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimurium)、粘質(zhì)沙雷氏菌(serratiamarcescans)、克雷伯氏菌屬(klebsiella)、變形桿菌屬(proteus)、志賀氏菌屬(shigella)、根瘤菌屬(rhizobia)、透明顫菌屬(vitreoscilla)或副球菌屬(paracoccus)。在一個實施方案中，使用革蘭氏陰性細胞。在一個實施方案中，用大腸桿菌作為本發(fā)明的宿主。大腸桿菌菌株的實例包括菌株w3110(bachmann,cellularandmolecularbiology,第2卷(washington,d.c.:americansocietyformicrobiology,1987),1190-1219頁；atcc保藏號27,325)及其衍生菌株，包括具有基因型w3110δfhua(δtona)ptr3laciqlacl8δomptδ(nmpc-fepe)degp41kan^r的菌株33d3(美國專利號5,639,635)。其他菌株及其衍生菌株，諸如大腸桿菌294(atcc31,446)、大腸桿菌b、大腸桿菌λ1776(atcc31,537)和大腸桿菌rv308(atcc31,608)也是適宜的。在一個實施方案中，大腸桿菌δlpp尤其有用。這些實例是舉例說明性的而不是限制性的。用于構(gòu)建任意上述細菌的具有確定基因型的衍生菌株的方法為本領(lǐng)域已知，并描述于例如bass等,proteins,8:309-314(1990)中。通常有必要考慮復制子在細菌細胞中的可復制性來選擇適當?shù)募毦＠?，在用眾所周知的質(zhì)粒諸如pbr322、pbr325、pacyc177或pkn410來提供復制子時，可以適宜地用大腸桿菌、沙雷氏菌屬(serratia)或沙門氏菌屬(salmonella)物種作為宿主。通常，宿主細胞應分泌最小量的蛋白水解酶，且可能期望將額外的蛋白酶抑制劑摻入細胞培養(yǎng)物中。

ii.多肽生產(chǎn)

用上述表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，并培養(yǎng)在根據(jù)誘導啟動子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴增編碼期望序列的基因的需要改進的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中。

轉(zhuǎn)化意指將dna引入原核宿主，使得該dna可作為染色體外元件或通過染色體整合而復制。取決于所使用的宿主細胞，用適于該細胞的標準技術(shù)進行轉(zhuǎn)化。利用氯化鈣的鈣處理通常用于含有實質(zhì)性細胞壁屏障的細菌細胞。另一轉(zhuǎn)化方法利用聚乙二醇/dmso。另一常用的技術(shù)是電穿孔。

將用來產(chǎn)生本發(fā)明多肽的原核細胞培養(yǎng)在本領(lǐng)域已知且適合用于培養(yǎng)所選擇的宿主細胞的培養(yǎng)基中。適宜的培養(yǎng)基的實例包括加入了必要的營養(yǎng)補充物的luria培養(yǎng)基(lb)。在一些實施方案中，培養(yǎng)基還包含根據(jù)表達載體的構(gòu)建而選擇的選擇劑，以選擇性地允許含有該表達載體的原核細胞生長。例如，向培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素，用于生長表達氨芐青霉素抗性基因的細胞。

除碳、氮和無機磷酸來源外，還可以包括適當濃度的任何必要的補充物，其可以單獨引入或作為與另一補充物或培養(yǎng)基(如復合氮源)的混合物引入?？蛇x地，培養(yǎng)基可以包含選自谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巰基乙酸、二硫赤蘚糖醇和二硫蘇糖醇的一種或多種還原劑。

在適宜的溫度下培養(yǎng)原核宿主細胞。對于大腸桿菌生長，例如，優(yōu)選的溫度范圍從約20℃至約39℃，更優(yōu)選從約25℃至約37℃，甚至更優(yōu)選在約30℃。主要取決于宿主生物，培養(yǎng)基的ph可以是從約5至約9的任何ph。對于大腸桿菌，ph優(yōu)選從約6.8至約7.4，更優(yōu)選約7.0。

如果在本發(fā)明的表達載體中使用誘導型啟動子，則在適用于激活該啟動子的條件下誘導蛋白質(zhì)表達。在本發(fā)明的一個方面，用phoa啟動子來控制多肽的轉(zhuǎn)錄。因此，將轉(zhuǎn)化的宿主細胞培養(yǎng)在磷酸限制培養(yǎng)基中進行誘導。優(yōu)選地，該磷酸限制培養(yǎng)基是c.r.a.p培養(yǎng)基(見例如simmons等,j.immunol.methods(2002),263:133-147)。如本領(lǐng)域已知，根據(jù)所利用的載體構(gòu)建體，可以使用多種其他誘導物。

在一個實施方案中，分別培養(yǎng)第一和第二含鉸鏈多肽的宿主細胞，所表達的本發(fā)明多肽分泌進入宿主細胞的周質(zhì)，并分別從宿主細胞的周質(zhì)回收。在第二實施方案中，分別培養(yǎng)第一和第二含鉸鏈多肽的宿主細胞，在分離含鉸鏈多肽之前，將兩種宿主細胞培養(yǎng)物混合在一起并沉淀細胞。在第三實施方案中，分別培養(yǎng)第一和第二含鉸鏈多肽的宿主細胞，分別離心和重懸，然后在分離含鉸鏈多肽之前混合在一起。在第四實施方案中，在同一培養(yǎng)容器中一起培養(yǎng)第一和第二含鉸鏈多肽的宿主細胞。蛋白質(zhì)回收通常涉及破裂微生物細胞膜，一般通過諸如滲透壓休克、超聲處理或裂解的手段。一旦破裂細胞，即可以通過離心或過濾來去除細胞碎片或完整細胞?？梢岳缤ㄟ^親和樹脂層析，進一步純化蛋白質(zhì)。備選地，蛋白質(zhì)可以轉(zhuǎn)運或分泌入培養(yǎng)基，并從其中分離。帶有外源序列標簽(或表位標簽)表達的重組蛋白質(zhì)可以便于純化步驟?？寺『图兓型庠葱蛄袠撕?包括但不限于his標簽和gst標簽)的蛋白質(zhì)的技術(shù)為本領(lǐng)域公知。可以從培養(yǎng)物去除細胞，過濾并濃縮培養(yǎng)物上清用于進一步純化所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)?？梢杂弥T如聚丙烯酰胺凝膠電泳(page)和western印跡測定等公知方法，進一步分離和鑒定所表達的多肽。分離的多肽用來產(chǎn)生異源多聚體蛋白質(zhì)。

在本發(fā)明的一個方面中，通過發(fā)酵方法，大量生產(chǎn)異源多聚體蛋白質(zhì)(例如抗體)。多種大規(guī)模補料分批發(fā)酵方法可用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)。大規(guī)模發(fā)酵具有至少1000升的容量，優(yōu)選約1,000至100,000升的容量。這些發(fā)酵罐用攪拌槳來分布氧氣和營養(yǎng)物，尤其是葡萄糖(優(yōu)選的碳/能量來源)。小規(guī)模發(fā)酵一般指體積容量不超過約100升的發(fā)酵罐中的發(fā)酵，該發(fā)酵罐可以在約1升至約100升的范圍內(nèi)。

在發(fā)酵方法中，通常將細胞在適宜條件下培養(yǎng)至希望的密度(例如約180-220的od550，細胞在該階段處于早期平臺期)后，起始蛋白質(zhì)表達的誘導。如本領(lǐng)域已知和本文所述，根據(jù)所利用的載體構(gòu)建體，可以使用多種誘導物。細胞可以在誘導前培養(yǎng)更短的時期。通常誘導細胞約12-50小時，但也可以使用更長或更短的誘導時間。

為了改善本發(fā)明多肽的產(chǎn)率和質(zhì)量，可以修飾多種發(fā)酵條件。例如，為了改善分泌性異源多聚體蛋白質(zhì)(例如抗體)的正確組裝和折疊，可以用過表達諸如dsb蛋白質(zhì)(dsba、dsbb、dsbc、dsbd和/或dsbg)或fkpa(具有分子伴侶活性的肽酰脯氨酰順反異構(gòu)酶)的分子伴侶蛋白質(zhì)的額外載體來共轉(zhuǎn)化宿主原核細胞。已證明分子伴侶蛋白質(zhì)有利于細菌宿主細胞中產(chǎn)生的異源蛋白質(zhì)的正確折疊和溶解。chen等(1999)jbiochem274:19601-19605；georgiou等,美國專利號6,083,715；georgiou等,美國專利號6,027,888；bothmann和pluckthun(2000)j.biol.chem.275:17100-17105；ramm和pluckthun(2000)j.biol.chem.275:17106-17113；arie等(2001)mol.microbiol.39:199-210。

為了最小化所表達的異源蛋白質(zhì)(尤其是對蛋白酶解敏感的那些蛋白質(zhì))的蛋白酶解，可以將蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌株用于本發(fā)明。例如，可以修飾宿主細胞菌株，在編碼已知的細菌蛋白酶(如蛋白酶iii、ompt、degp、tsp、蛋白酶i、蛋白酶mi、蛋白酶v、蛋白酶vi及其組合)的基因中產(chǎn)生一個或多個遺傳突變。一些大腸桿菌蛋白酶缺陷菌株可得，并描述于例如,joly等(1998)proc.natl.acad.sci.usa95:2773-2777；georgiou等的美國專利號5,264,365；georgiou等,美國專利號5,508,192；hara等,microbialdrugresistance,2:63-72(1996)中。

在一個實施方案中，將蛋白水解酶缺陷并用過表達一種或多種分子伴侶蛋白質(zhì)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株用作本發(fā)明的表達系統(tǒng)中的宿主細胞。在第二實施方案中，大腸桿菌菌株為外膜脂蛋白缺陷(δlpp)。

iii.異源多聚體蛋白質(zhì)純化

在一個實施方案中，進一步純化本文中產(chǎn)生的異源多聚體蛋白質(zhì)，以獲得基本上同質(zhì)的制品用于其他測定和用途?？梢岳帽绢I(lǐng)域已知的標準蛋白質(zhì)純化方法。以下方法是適宜的純化方法的示例：在免疫親和或離子交換柱上分級分離、乙醇沉淀、反相hplc、硅石上或諸如deae的離子交換樹脂上的層析、層析聚焦、sds-page、硫酸銨沉淀和使用例如sephadexg-75的凝膠過濾。

在一方面，用固定在固相上的蛋白a來進行例如本發(fā)明的半抗體或全長抗體產(chǎn)物的免疫親和純化。蛋白a是以高親和力結(jié)合抗體fc區(qū)的來自金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)的41kd細胞壁蛋白質(zhì)。lindmark等(1983)j.immunol.meth.62:1-13。固定蛋白a的固相優(yōu)選是含有玻璃或硅石表面的柱，更優(yōu)選可控孔度玻璃柱或硅酸柱。在一些應用中，已用諸如甘油的試劑包被柱，以圖防止污染物的非特異性附著。

作為純化的第一步，將源自上述細胞培養(yǎng)物的制備物上樣至固定了蛋白a的固相上，以允許目的抗體與蛋白a特異性結(jié)合。然后洗滌固相，去除非特異性結(jié)合于固相的污染物。通過洗脫，從固相回收異源多聚體蛋白質(zhì)(例如抗體)。

b.用真核宿主細胞生產(chǎn)異源多聚體蛋白質(zhì)

載體成分通常包括但不限于以下的一個或多個：信號序列、復制起點、一個或多個標記基因、增強子元件、啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列。

i.信號序列成分

用于真核宿主細胞的載體也可以包含在成熟蛋白質(zhì)或目的多肽的n端具有特異性切割位點的信號序列或其他多肽。所選擇的異源信號序列優(yōu)選是宿主細胞識別和加工(即通過信號肽酶切割)的信號序列。在哺乳動物細胞表達中，可用哺乳動物信號序列、以及病毒分泌前導序列，例如單純皰疹gd信號。將該前體區(qū)的dna符合讀框地連接至編碼一種或多種希望的異源多聚體蛋白質(zhì)(例如抗體)的dna。

ii.復制起點

通常，哺乳動物表達載體無需復制起點成分。例如，sv40起點可以典型地被使用，但僅是因為它包含早期啟動子。

iii.選擇基因成分

表達載體和克隆載體可以包含選擇基因，也稱為選擇標記。典型的選擇基因編碼這樣的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)(a)賦予對抗生素或其他毒素(例如氨芐青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四環(huán)素)的抗性；(b)相關(guān)時，彌補營養(yǎng)缺陷；或(c)提供不能從復雜培養(yǎng)基獲得的關(guān)鍵營養(yǎng)物。

選擇方案的一個實例利用藥物來阻滯宿主細胞的生長。用異源基因成功轉(zhuǎn)化的那些細胞產(chǎn)生賦予藥物抗性的蛋白質(zhì)，從而在該選擇方案下存活。這種顯性選擇的實例使用藥物新霉素、霉酚酸和潮霉素。

適用于哺乳動物細胞的選擇標記的另一實例是使得能夠鑒定有能力攝取抗體核酸的細胞的那些選擇標記，如dhfr、胸苷激酶、金屬硫蛋白-i和-ii(優(yōu)選靈長類金屬硫蛋白基因)、腺苷脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶等。

例如，首先通過在包含氨甲喋呤(mtx)(dhfr的競爭性拮抗劑)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所有轉(zhuǎn)化體，鑒定轉(zhuǎn)化了dhfr選擇基因的細胞。在利用野生型dhfr時，適當?shù)乃拗骷毎侨狈hfr活性的中國倉鼠卵巢(cho)細胞系(例如atcccrl-9096)。

備選地，用編碼抗體、野生型dhfr蛋白質(zhì)和另一選擇標記(如氨基糖苷3’-磷酸轉(zhuǎn)移酶(aph))的dna序列轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化的宿主細胞(尤其是包含內(nèi)源dhfr的野生型宿主)，可以通過在包含用于該選擇標記的選擇劑(如氨基糖苷抗生素，例如卡那霉素、新霉素或g418)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞而選擇。見例如美國專利號4,965,199。

iv.啟動子成分

表達載體和克隆載體通常包含宿主生物可識別的啟動子，其與一個或多個期望的含鉸鏈多肽(例如抗體)核酸有效連接。用于真核生物的啟動子序列是已知的?；旧纤姓婧嘶蚨荚诰嚯x轉(zhuǎn)錄起始位點上游約25至30個堿基的位置具有富含at的區(qū)域。見于許多基因的轉(zhuǎn)錄起點上游70至80個堿基的另一序列是cncaat區(qū)，其中n可以是任意核苷酸。大多數(shù)真核基因的3’端是aataaa序列，其可以是將polya尾加至編碼序列的3’端的信號。所有這些序列都適宜插入真核表達載體。

可以例如通過獲自病毒(例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭狀病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(sv40))基因組、獲自異源哺乳動物啟動子(例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子)、或獲自熱休克啟動子的啟動子，控制哺乳動物宿主細胞中希望的一種或多種含鉸鏈多肽(例如半抗體)從載體的轉(zhuǎn)錄，條件是啟動子與宿主細胞系統(tǒng)相容。

sv40病毒的早期和晚期啟動子可以作為sv40限制片段方便地獲得，該限制片段還包含sv40病毒復制起點。人巨細胞病毒的立即早期啟動子可以作為hindiiie限制片段方便地獲得。美國專利號4,419,446中公開了用牛乳頭狀病毒作為載體在哺乳動物宿主中表達dna的系統(tǒng)。美國專利號4,601,978中描述了對此系統(tǒng)的修改。還見reyes等,nature297:598-601(1982)，其涉及人β-干擾素cdna在來自單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動子的控制下在小鼠細胞中表達。備選地，可以用勞斯肉瘤病毒長末端重復序列作為啟動子。

v.增強子元件成分

將增強子序列插入載體，可以增加高等真核生物對編碼希望的一種或多種含鉸鏈多肽(例如抗體)的dna的轉(zhuǎn)錄?，F(xiàn)已知來自哺乳動物基因(例如珠蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰島素基因)的許多增強子序列。另外，還可以使用來自真核細胞病毒的增強子。實例包括位于復制起點晚期一側(cè)(bp100-270)的sv40增強子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、復制起點晚期一側(cè)的多瘤增強子、和腺病毒增強子。關(guān)于用于增強真核啟動子的激活的元件的描述，還見yaniv,nature297:17-18(1982)。只要可以實現(xiàn)增加作用，增強子可以拼接在載體中抗體多肽編碼序列5’或3’的位置，但通常在啟動子5’的位置。

vi.轉(zhuǎn)錄終止成分

用于真核宿主細胞的表達載體通常還將包含終止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mrna所必需的序列。通常可從真核或病毒dna或cdna的5’和偶爾地3’非翻譯區(qū)獲得這類序列。這些區(qū)域包含在編碼抗體的mrna的非翻譯部分中轉(zhuǎn)錄為的聚腺苷酸化片段的核苷酸區(qū)段。一種有用的轉(zhuǎn)錄終止成分是牛生長激素聚腺苷酸化區(qū)域。見wo94/11026及其中公開的表達載體。

vii.宿主細胞的選擇和轉(zhuǎn)化

適合用于克隆或表達本文載體中的dna的宿主細胞包括本文所述的高等真核細胞，包括脊椎動物宿主細胞。在培養(yǎng)物(組織培養(yǎng)物)中繁殖脊椎動物細胞已成為常規(guī)方法。有用的哺乳動物宿主細胞系的實例是sv40轉(zhuǎn)化的猴腎cv1細胞系(cos-7，atcccrl1651)；人胚腎細胞系(293或為在懸浮培養(yǎng)物中生長而亞克隆的293細胞，graham等,j.genvirol.36:59(1977))；幼倉鼠腎細胞(bhk，atccccl10)；中國倉鼠卵巢細胞/-dhfr(cho，urlaub等,proc.natl.acad.sci.usa77:4216(1980))；小鼠支持細胞(tm4，mather,biol.reprod.23:243-251(1980))；猴腎細胞(cvlatccccl70)；非洲綠猴腎細胞(vero-76，atcccrl-1587)；人宮頸癌細胞(hela，atccccl2)；犬腎細胞(mdck，atccccl34)；buffalo大鼠肝細胞(brl3a，atcccrl1442)；人肺細胞(w138，atccccl75)；人肝細胞(hepg2，hb8065)；小鼠乳腺腫瘤(mmt060562，atccccl51)；tri細胞(mather等,annalsn.y.acad.sci.383:44-68(1982))；mrc5細胞；fs4細胞；和人肝癌細胞系(hepg2)。

為生產(chǎn)期望的含鉸鏈多肽(例如抗體，一種或多種)，用上述表達或克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，并在根據(jù)誘導啟動子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴增期望序列編碼基因的需要改進的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

viii.培養(yǎng)宿主細胞

可以在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于產(chǎn)生期望的本發(fā)明一種或多種含鉸鏈多肽(例如抗體)的宿主細胞。諸如ham'sf10(sigma)、minimalessentialmedium(mem)(sigma)、rpmi-1640(sigma)和dulbecco'smodifiedeagle'smedium(dmem，sigma)等市售培養(yǎng)基適用于培養(yǎng)宿主細胞。此外，可以將ham等,meth.enz.58:44(1979)；barnes等,anal.biochem.102:255(1980)；美國專利號4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；wo90/03430；wo87/00195；或美國專利再版30,985中所述的任何培養(yǎng)基用作宿主細胞的培養(yǎng)基。可以根據(jù)需要向任意這些培養(yǎng)基中補充激素和/或其他生長因子(如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖液(如hepes)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如gentamycintm藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩爾范圍的終濃度存在的無機化合物)和葡萄糖或等同的能量來源。還可以按適當濃度包含本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其他必需的補充物。諸如溫度、ph等培養(yǎng)條件可以是選擇用于表達的宿主細胞之前所用的那些條件，且對普通技術(shù)人員而言顯而易見。

ix.異源多聚體蛋白質(zhì)的純化

在使用重組技術(shù)時，含鉸鏈多肽可以在胞內(nèi)產(chǎn)生，或者直接分泌進入培養(yǎng)基。如果含鉸鏈多肽在胞內(nèi)產(chǎn)生，作為第一步，例如通過離心或超濾，去除顆粒碎片(宿主細胞或裂解片段)。在含鉸鏈多肽分泌進入培養(yǎng)基時，通常首先用市售蛋白質(zhì)濃縮濾器(例如amicon或milliporepellicon超濾單元)濃縮來自這類表達系統(tǒng)的上清?？梢栽谌我馇笆霾襟E中包含蛋白酶抑制劑(如pmsf)來抑制蛋白酶解，且可以包含抗生素來防止外來污染物的生長。

可以用例如離子交換、疏水相互作用層析、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析來純化從細胞制備的異源多聚體組合物，親和層析是優(yōu)選的純化技術(shù)。還考慮上述技術(shù)的組合。蛋白a作為親和配體的適合性取決于抗體中存在的任何免疫球蛋白fc結(jié)構(gòu)域的種類和同種型。可以用a蛋白來純化基于人γ1、γ2或γ4重鏈的抗體(lindmark等,j.immunol.meth.62:1-13(1983))。建議g蛋白用于所有小鼠同種型和人γ3(guss等,emboj.5:15671575(1986))。親和配體所附著的基質(zhì)最常是瓊脂糖，但其他基質(zhì)也可用。與用瓊脂糖可以達到的流速和處理時間相比，機械穩(wěn)定的基質(zhì)(如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯)允許更快的流速和更短的處理時間。在抗體包含ch3結(jié)構(gòu)域時，可以用bakerbondabxtm樹脂(j.t.baker,phillipsburg,nj)進行純化。取決于待回收的抗體，也可用其他用于蛋白質(zhì)純化的技術(shù)，如離子交換柱上的分級分離、乙醇沉淀、反相hplc、硅石上的層析、肝素sepharosetm上的層析、陰離子或陽離子交換樹脂(如聚天冬氨酸柱)上的層析、層析聚焦、sds-page和硫酸銨沉淀。

任何一個或多個初步純化步驟后，可以對包含目的抗體和污染物的混合物進行低ph疏水作用層析，該層析使用ph在約2.5-4.5之間的洗脫緩沖液，優(yōu)選在低鹽濃度(例如約0-0.25m鹽)下進行。(對于任意前述具體方法)備選地或額外地，異源多聚體蛋白質(zhì)的產(chǎn)生可以包括透析含有多肽混合物的溶液。

x.使用桿狀病毒生產(chǎn)抗體

可以通過用例如lipofectin(可從gibco-brl購得)，將編碼抗體或抗體片段的質(zhì)粒和baculogold^tm病毒dna(pharmingen)共轉(zhuǎn)染入昆蟲細胞諸如草地貪夜蛾(spodopterafrugiperda)細胞(例如sf9細胞；atcccrl1711)或黑腹果蠅(drosophilamelanogaster)s2細胞，產(chǎn)生重組桿狀病毒。在一個具體實例中，將抗體序列融合在包含于桿狀病毒表達載體內(nèi)的表位標簽(epitopetag)上游。這類表位標簽包括聚組氨酸標簽。可以利用多種質(zhì)粒，包括衍生自諸如pvl1393(novagen)或pacgp67b(pharmingen)的市售質(zhì)粒的質(zhì)粒。簡言之，可以用與5’和3’區(qū)域互補的引物通過pcr來擴增編碼抗體或其片段的序列。5’引物可以摻入側(cè)翼(選擇的)限制酶位點。然后可以用所選擇的限制酶消化產(chǎn)物，并亞克隆入表達載體。

用表達載體轉(zhuǎn)染后，在28℃孵育宿主細胞(例如sf9細胞)4-5天，收獲釋放的病毒，并用于進一步擴增。病毒感染和蛋白質(zhì)表達可以按例如o’reilley等(baculovirusexpressionvectors:alaboratorymanual.oxford:oxforduniversitypress(1994))所述進行。

然后可以例如按以下方式，通過ni2+-螯合親和層析來純化所表達的帶聚組氨酸標簽的抗體?？梢园磖upert等(nature362:175-179(1993))所述，從重組病毒轉(zhuǎn)染的sf9細胞制備提取物。簡言之，洗滌sf9細胞，重懸在超聲處理緩沖液(25mlhepesph7.9；12.5mmmgcl2；0.1mmedta；10％甘油；0.1％np-40；0.4mkcl)中，冰上超聲處理兩次20秒。通過離心澄清超聲處理產(chǎn)物，將上清50倍稀釋在上樣緩沖液(50mm磷酸；300mmnacl；10％甘油ph7.8)中，濾過0.45μm濾器。制備柱床體積為5ml的ni2+-nta瓊脂糖柱(可從qiagen購得)，用25ml水洗滌，并用25ml上樣緩沖液平衡。按每分鐘0.5ml的流速將經(jīng)過濾的細胞提取物上樣至柱上。用上樣緩沖液洗滌柱至基線a280，在此點開始級分收集。然后，用洗脫非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)的第二洗滌緩沖液(50mm磷酸；300mmnacl；10％甘油ph6.0)，洗滌柱。再次達到a280基線后，用含0至500mm咪唑梯度的第二洗滌緩沖液，洗柱。收集1ml級分，并通過sds-page和銀染或使用ni2+-nta綴合的堿性磷酸酶(qiagen)以western印跡來分析?；旌虾邢疵摰膸is10標簽的抗體的級分，并對上樣緩沖液透析。

備選地，可以用包括例如蛋白a或蛋白g柱層析的已知層析技術(shù)進行抗體的純化。在一個實施方案中，可以通過洗脫入含有離液劑或溫和去垢劑的溶液中來從柱的固相回收目的抗體。示例性離液劑和溫和去垢劑包括但不限于鹽酸胍、尿素、高氯酸鋰(lithiumperclorate)、精氨酸、組氨酸、sds(十二烷基硫酸鈉)、tween、triton和np-40，其全都是市售可得的。

iv.靶分子

本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)可以靶向的分子的實例包括但不限于可溶性血清蛋白質(zhì)和它們的受體及其他膜結(jié)合的蛋白質(zhì)(例如黏附素)。見wo2011/133886，其在此以其整體引入作為參考。

在另一實施方案中，本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)能夠結(jié)合選自以下的一種、兩種或多種細胞因子、細胞因子相關(guān)蛋白質(zhì)和細胞因子受體：bmpi、bmp2、bmp3b(gdfio)、bmp4、bmp6、bmp8、csfi(m-csf)、csf2(gm-csf)、csf3(g-csf)、epo、fgfi(afgf)、fgf2(bfgf)、fgf3(int-2)、fgf4(hst)、fgf5、fgf6(hst-2)、fgf7(kgf)、fgf9、fgf10、fgf11、fgf12、fgf12b、fgf14、fgf16、fgf17、fgf19、fgf20、fgf21、fgf23、igf1、igf2、ifnai、ifna2、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifnbi、ifng、ifnwi、feli、feli(epselon)、feli(zeta)、il1a、il1b、il2、il3、il4、il5、il6、il7、il8、il9、il10、il11、il12a、il12b、il13、il14、il15、il16、il17、il17b、il18、il19、il20、il22、il23、il24、il25、il26、il27、il28a、il28b、il29、il30、pdgfa、pdgfb、tgfa、tgfb1、tgfb2、tgfb3、lta(tnf-b)、ltb、tnf(tnf-a)、tnfsf4(ox40配體)、tnfsf5(cd40配體)、tnfsf6(fasl)、tnfsf7(cd27配體)、tnfsf8(cd30配體)、tnfsf9(4-1bb配體)、tnfsfio(trail)、tnfsf1i(trance)、tnfsf12(apo3l)、tnfsf13(april)、tnfsf13b、tnfsf14(hvem-l)、tnfsf15(vegi)、tnfsf18、hgf(vegfd)、vegf、vegfb、vegfc、ilir1、il1r2、il1rl1、il1rl2、il2ra、il2rb、il2rg、il3ra、il4r、il5ra、il6r、il7r、il8ra、il8rb、il9r、ili0ra、ili0rb、il11ra、il12rb1、il12rb2、il13ra1、il13ra2、il15ra、il17r、il18r1、il20ra、il21r、il22r、il1hy1、il1rap、il1rapl1、il1rapl2、il1rn、il6st、il18bp、il18rap、il22ra2、aifi、hgf、lep(瘦蛋白)、ptn和thpo。

在另一實施方案中，靶分子是選自以下的趨化因子、趨化因子受體或趨化因子相關(guān)蛋白質(zhì)：ccli(i-309)、ccl2(mcp-1/mcaf)、ccl3(mip-la)、ccl4(mip-lb)、ccl5(rantes)、ccl7(mcp-3)、ccl8(mcp-2)、cclh(eotaxin)、ccl13(mcp-4)、ccl15(mip-ld)、ccl16(hcc-4)、ccl17(tarc)、ccl18(parc)、ccl19(mdp-3b)、ccl20(mip-3a)、ccl21(slc/exodus-2)、ccl22(mdc/stc-i)、ccl23(mpif-i)、ccl24(mpif-2/eotaxin-2)、ccl25(teck)、ccl26(eotaxin-3)、ccl27(ctack/ilc)、ccl28、cxcli(groi)、cxcl2(gro2)、cxcl3(gr03)、cxcl5(ena-78)、cxcl6(gcp-2)、cxcl9(mig)、cxcl10(ip10)、cxcl11(l-tac)、cxcl12(sdfi)、cxcl13、cxcl14、cxcl16、pf4(cxcl4)、ppbp(cxcl7)、cx3cl1(scydi)、scyei、xcli(lymphotactin)、xcl2(scm-lb)、blri(mdr15)、ccbp2(d6/jab61)、ccr1(ckri/hm145)、ccr2(mcp-irb/ra)、ccr3(ckr3/cmkbr3)、ccr4、ccr5(cmkbr5/chemr13)、ccr6(cmkbr6/ckr-l3/strl22/dry6)、ccr7(ckr7/ebii)、ccr8(cmkbr8/teri/ckr-li)、ccr9(gpr-9-6)、ccrli(vshki)、ccrl2(l-ccr)、xcri(gpr5/ccxcri)、cmklri、cmkori(rdci)、cx3cr1(v28)、cxcr4、gpr2(ccrio)、gpr31、gpr81(fksg80)、cxcr3(gpr9/ckr-l2)、cxcr6(tymstr/strl33/bonzo)、hm74、il8ra(il8ra)、il8rb(il8rb)、ltb4r(gpr16)、tcpio、cklfsf2、cklfsf3、cklfsf4、cklfsf5、cklfsf6、cklfsf7、cklfsf8、bdnf、c5r1、csf3、grccio(cio)、epo、fy(darc)、gdf5、hdfia、dl8、prl、rgs3、rgs13、sdf2、slit2、tlr2、tlr4、tremi、trem2和vhl。

在另一實施方案中，本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)能夠結(jié)合選自以下的一種或多種靶標：abcfi；acvri；acvrib；acvr2；acvr2b；acvrli；ad0ra2a；aggrecan；agr2；aicda；aifi；aigi；akapi；akap2；amh；amhr2；angpti；angpt2；angptl3；angptl4；anpep；apc；apoci；ar；azgpi(鋅-a-糖蛋白)；b7.1；b7.2；bad；baff(blys)；bagi；bah；bcl2；bcl6；bdnf；blnk；blri(mdr15)；bmpi；bmp2；bmp3b(gdfio)；bmp4；bmp6；bmp8；bmpria；bmprib；bmpr2；bpagi(網(wǎng)蛋白)；brcai；c19orflo(il27w)；c3；c4a；c5；c5r1；canti；casp1；casp4；cavi；ccbp2(d6/jab61)；ccli(1-309)；cclii(eotaxin)；ccl13(mcp-4)；ccl15(mip-id)；ccl16(hcc-4)；ccl17(tarc)；ccl18(parc)；ccl19(mip-3b)；ccl2(mcp-1)；mcaf；ccl20(mip-3a)；ccl21(mtp-2)；slc；exodus-2；ccl22(mdc/stc-i)；ccl23(mpif-1)；ccl24(mpif-2/eotaxin-2)；ccl25(teck)；ccl26(eotaxin-3)；ccl27(ctack/ilc)；ccl28；ccl3(mtp-la)；ccl4(mdp-lb)；ccl5(rantes)；ccl7(mcp-3)；ccl8(mcp-2)；ccnai；ccna2；ccndi；ccnei；ccne2；ccri(ckri/hm145)；ccr2(mcp-irb/ra)；ccr3(ckr3/cmkbr3)；ccr4；ccr5(cmkbr5/chemr13)；ccr6(cmkbr6/ckr-l3/strl22/dry6)；ccr7(ckr7/ebii)；ccr8(cmkbr8/teri/ckr-li)；ccr9(gpr-9-6)；ccrli(vshki)；ccrl2(l-ccr)；cd164；cd19；cdic；cd20；cd200；cd22；cd24；cd28；cd3；cd37；cd38；cd3e；cd3g；cd3z；cd4；cd40；cd40l；cd44；cd45rb；cd52；cd69；cd72；cd74；cd79a；cd79b；cd8；cd80；cd81；cd83；cd86；cdhi(e-鈣黏著蛋白)；cdh10；cdh12；cdh13；cdh18；cdh19；cdh20；cdh5；cdh7；cdh8；cdh9；cdk2；cdk3；cdk4；cdk5；cdk6；cdk7；cdk9；cdknia(p21wapl/cipl)；cdknib(p27kipl)；cdknic；cdkn2a(p16ink4a)；cdkn2b；cdkn2c；cdkn3；cebpb；ceri；chga；chgb；幾丁質(zhì)酶；chst10；cklfsf2；cklfsf3；cklfsf4；cklfsf5；cklfsf6；cklfsf7；cklfsf8；cldn3；cldn7(claudin-7)；cln3；clu(簇蛋白)；cmklri；cmkori(rdci)；cnri；col18a1；coliai；col4a3；col6a1；cr2；crp；csfi(m-csf)；csf2(gm-csf)；csf3(gcsf)；ctla4；ctnnbi(b-連環(huán)蛋白)；ctsb(組織蛋白酶b)；cx3cl1(scydi)；cx3cr1(v28)；cxcli(groi)；cxcl10(ip-10)；cxclii(l-tac/ip-9)；cxcl12(sdfi)；cxcl13；cxcl14；cxcl16；cxcl2(gro2)；cxcl3(gro3)；cxcl5(ena-78/lix)；cxcl6(gcp-2)；cxcl9(mig)；cxcr3(gpr9/ckr-l2)；cxcr4；cxcr6(tymstr/strl33/bonzo)；cyb5；cyci；cysltri；dab2ip；des；dkfzp451j0118；dncli；dpp4；e2f1；ecgfi；edgi；efnai；efna3；efnb2；egf；egfr；elac2；eng；eno1；eno2；eno3；ephb4；epo；erbb2(her-2)；ereg；erk8；esri；esr2；f3(tf)；fadd；fasl；fasn；fceria；fcer2；fcgr3a；fgf；fgfi(afgf)；fgf10；fgf11；fgf12；fgf12b；fgf13；fgf14；fgf16；fgf17；fgf18；fgf19；fgf2(bfgf)；fgf20；fgf21；fgf22；fgf23；fgf3(int-2)；fgf4(hst)；fgf5；fgf6(hst-2)；fgf7(kgf)；fgf8；fgf9；fgfr3；figf(vegfd)；feli(epsilon)；fili(zeta)；flj12584；flj25530；flrti(纖連蛋白)；flti；fos；fosli(fra-i)；fy(darc)；gabrp(gabaa)；gagebi；gageci；galnac4s-6st；gata3；gdf5；gfi1；ggt1；gm-csf；gnasi；gnrhi；gpr2(ccrio)；gpr31；gpr44；gpr81(fksg80)；grccio(cio)；grp；gsn(凝溶膠蛋白)；gstpi；havcr2；hdac4；hdac5；hdac7a；hdac9；hgf；hifia；hdpi；組胺和組胺受體；hla-a；hla-dra；hm74；hmoxi；humcyt2a；iceberg；icosl；id2；ifn-a；ifnai；ifna2；ifna4；ifna5；ifna6；ifna7；ifnb1；ifnγ；dfnwi；igbpi；igfi；igfir；igf2；igfbp2；igfbp3；igfbp6；il-i；il10；il10ra；il10rb；il11；il11ra；il-12；il12a；il12b；il12rb1；il12rb2；il13；il13ra1；il13ra2；il14；il15；il15ra；il16；il17；il17b；il17c；il17r；il18；il18bp；il18r1；il18rap；il19；il1a；il1b；ilif10；il1f5；il1f6；il1f7；il1f8；il1f9；il1hyi；il1ri；il1r2；il1rap；il1rapl1；il1rapl2；il1rl1；il1rl2；ilirn；il2；il20；il20ra；il21r；il22；il22r；il22ra2；il23；il24；il25；il26；il27；il28a；il28b；il29；il2ra；il2rb；il2rg；il3；il30；il3ra；il4；il4r；il5；il5ra；il6；il6r；il6st(糖蛋白130)；el7；el7r；el8；il8ra；dl8rb；il8rb；dl9；dl9r；dlk；inha；inhba；insl3；insl4；iraki；erak2；itgai；itga2；itga3；itga6(a6整聯(lián)蛋白)；itgav；itgb3；itgb4(b4整聯(lián)蛋白)；jagi；jaki；jak3；jun；k6hf；kaii；kdr；kitlg；klf5(gcboxbp)；klf6；klkio；klk12；klk13；klk14；klk15；klk3；klk4；klk5；klk6；klk9；krt1；krt19(角蛋白19)；krt2a；khthb6(毛發(fā)特異性h型角蛋白)；lamas；lep(瘦蛋白)；lingo-p75；lingo-troy；lps；lta(tnf-b)；ltb；ltb4r(gpr16)；ltb4r2；ltbr；macmarcks；mag或omgp；map2k7(c-jun)；mdk；mibi；midkine；mef；mip-2；mki67；(ki-67)；mmp2；mmp9；ms4a1；msmb；mt3(metallothionectin-lll)；mtssi；muci(黏蛋白)；myc；myd88；nck2；神經(jīng)蛋白聚糖；nfkbi；nfkb2；ngfb(ngf)；ngfr；ngr-lingo；ngr-nogo66(nogo)；ngr-p75；ngr-troy；nmei(nm23a)；n0x5；nppb；nrobi；nr0b2；nridi；nr1d2；nr1h2；nr1h3；nr1h4；nr1i2；nr1i3；nr2c1；nr2c2；nr2e1；nr2e3；nr2f1；nr2f2；nr2f6；nr3c1；nr3c2；nr4a1；nr4a2；nr4a3；nr5a1；nr5a2；nr6a1；nrpi；nrp2；nt5e；ntn4；odzi；oprdi；p2rx7；pap；parti；pate；pawr；pca3；pcna；pdgfa；pdgfb；pecami；pf4(cxcl4)；pgf；pgr；phosphacan；pias2；pik3cg；plau(upa)；plg；plxdci；ppbp(cxcl7)；ppid；pri；prkcq；prkdi；prl；proc；prok2；psap；psca；ptafr；pten；ptgs2(cox-2)；ptn；rac2(p21rac2)；rarb；rgsi；rgs13；rgs3；rnfiio(znf144)；robo2；s100a2；scgb1d2(親脂素b)；scgb2a1(乳腺珠蛋白2)；scgb2a2(乳腺珠蛋白1)；scyei(內(nèi)皮單核細胞激活細胞因子)；sdf2；serpinai；serpina3；serp1nb5(maspin)；serpinei(pai-i)；serpdmf1；shbg；sla2；slc2a2；slc33a1；slc43a1；slit2；sppi；sprrib(sprl)；st6gal1；stabi；stat6；steap；steap2；tb4r2；tbx21；tcpio；tdgfi；tek；tgfa；tgfbi；tgfbiii；tgfb2；tgfb3；tgfbi；tgfbri；tgfbr2；tgfbr3；thil；thbsi(血小板反應蛋白-1)；thbs2；thbs4；thpo；tie(tie-1)；tmp3；組織因子；tlrio；tlr2；tlr3；tlr4；tlr5；tlr6；tlr7；tlr8；tlr9；tnf；tnf-a；tnfaep2(b94)；tnfaip3；tnfrsfiia；tnfrsfia；tnfrsfib；tnfrsf21；tnfrsf5；tnfrsf6(fas)；tnfrsf7；tnfrsf8；tnfrsf9；tnfsfio(trail)；tnfsfi1(trance)；tnfsf12(apo3l)；tnfsf13(april)；tnfsf13b；tnfsf14(hvem-l)；tnfsf15(vegi)；tnfsf18；tnfsf4(ox40配體)；tnfsf5(cd40配體)；tnfsf6(fasl)；tnfsf7(cd27配體)；tnfsf8(cd30配體)；tnfsf9(4-1bb配體)；tollip；toll樣受體；top2a(拓撲異構(gòu)酶ea)；tp53；tpmi；tpm2；tradd；trafi；traf2；traf3；traf4；traf5；traf6；tremi；trem2；trpc6；tslp；tweak；vegf；vegfb；vegfc；多能聚糖；vhlc5；vla-4；xcli(lymphotactin)；xcl2(scm-lb)；xcri(gpr5/ccxcri)；yyi；及zfpm2。

本發(fā)明所涵蓋的抗體的優(yōu)選靶分子包括cd蛋白質(zhì)，如cd3、cd4、cd8、cd16、cd19、cd20、cd34；cd64、cd200；erbb受體家族的成員，如egf受體、her2、her3或her4受體；細胞黏附分子，如lfa-1、mad、p150.95、vla-4、icam-1、vcam、α4/β7整聯(lián)蛋白和αv/β3整聯(lián)蛋白，包括其α或β亞基(例如抗-cd11a、抗-cd18或抗-cd11b抗體)；生長因子，如vegf-a、vegf-c；組織因子(tf)；α干擾素(αlfn)；tnfα；白細胞介素，如il-1β、il-3、il-4、il-5、il-8、il-9、il-13、il17a/f、il-18、il-13rα1、il13rα2、il-4r、il-5r、il-9r、ige；血型抗原；flk2/flt3受體；肥胖(ob)受體；mpl受體；ctla-4；rankl、rank、rsvf蛋白、蛋白c等。

在一個實施方案中，本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)結(jié)合低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白質(zhì)(lrp-1)或lrp-8或轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、和至少一個選自以下的靶標：1)β-分泌酶(bace1或bace2)、2)α-分泌酶、3)γ-分泌酶、4)tau-分泌酶、5)淀粉樣蛋白前體蛋白(app)、6)死亡受體6(dr6)、7)淀粉樣蛋白β肽、8)α-突觸核蛋白、9)帕金蛋白、10)亨廷頓蛋白、11)p75ntr和12)胱天蛋白酶-6。

在一個實施方案中，本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)結(jié)合選自以下的至少兩種靶分子：il-1α和il-1β；il-12和il-18；il-13和il-9；il-13和il-4；il-13和il-5；il-5和il-4；il-13和il-1β；il-13和il-25；il-13和tarc；il-13和mdc；il-13和mef；il-13和tgf-β；il-13和lhr激動劑；il-12和tweak；il-13和cl25；il-13和sprr2a；il-13和sprr2b；il-13和adam8；il-13和ped2；il17a和il17f；cd3和cd19；cd138和cd20；cd138和cd40；cd19和cd20；cd20和cd3；cd38和cd138；cd38和cd20；cd38和cd40；cd40和cd20；cd-8和il-6；cd20和br3；tnfα和tgf-β；tnfα和il-1β；tnfα和il-2；tnfα和il-3；tnfα和il-4；tnfα和il-5；tnfα和il6；tnfα和il8；tnfα和il-9；tnfα和il-10；tnfα和il-11；tnfα和il-12；tnfα和il-13；tnfα和il-14；tnfα和il-15；tnfα和il-16；tnfα和il-17；tnfα和il-18；tnfα和il-19；tnfα和il-20；tnfα和il-23；tnfα和ifnα；tnfα和cd4；tnfα和vegf；tnfα和mif；tnfα和icam-1；tnfα和pge4；tnfα和peg2；tnfα和rank配體；tnfα和te38；tnfα和baff；tnfα和cd22；tnfα和ctla-4；tnfα和gp130；tnfa和il-12p40；vegf和her2；vegf-a和her2；vegf-a和pdgf；her1和her2；vegf-a和vegf-c；vegf-c和vegf-d；her2和dr5,vegf和il-8；vegf和met；vegfr和met受體；vegfr和egfr；her2和cd64；her2和cd3；her2和cd16；her2和her3；egfr(heri)和her2；egfr和her3；egfr和her4；il-13和cd40l；il4和cd40l；tnfr1和il-1r；tnfr1和il-6r；tnfr1和il-18r；epcam和cd3；mapg和cd28；egfr和cd64；cspgs和rgma；ctla-4和btno2；igf1和igf2；igf1/2和erb2b；mag和rgma；ngr和rgma；nogoa和rgma；omgp和rgma；pdl-i和ctla-4；及rgma和rgmb

可以用可選地綴合至其他分子的可溶性抗原或其片段作為免疫原來產(chǎn)生抗體。對于跨膜分子如受體，可以用這些的片段(例如受體的胞外域)作為免疫原。備選地，可以用表達跨膜分子的細胞作為免疫原。這類細胞可以衍生自天然來源(例如癌細胞系)或可以是已通過重組技術(shù)轉(zhuǎn)化以表達跨膜分子的細胞。用于制備抗體的其他抗原及其形式對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見。

v.實施方案

本發(fā)明提供下文所述的其它實施方案。在第一實施方案中，提供產(chǎn)生異源多聚體蛋白質(zhì)的方法，該方法包括：獲得蛋白a純化的第一含鉸鏈多肽；獲得蛋白a純化的第二含鉸鏈多肽；調(diào)節(jié)各半抗體的ph至4和9之間；混合該第一和第二含鉸鏈多肽來獲得混合的含鉸鏈多肽池；向該混合的含鉸鏈多肽池加入摩爾過量的弱還原劑；用弱還原劑孵育該混合的含鉸鏈多肽池，以形成包含該第一和第二含鉸鏈多肽的異源多聚體蛋白質(zhì)。

在第二實施方案中，根據(jù)第一實施方案，該第一和第二含鉸鏈多肽可以選自半抗體、免疫黏附素及其片段。在第三實施方案中，根據(jù)第一實施方案，該第一含鉸鏈多肽是半抗體。在第四實施方案中，根據(jù)第一實施方案，該第二含鉸鏈多肽是fc成分。在第五實施方案中，根據(jù)第三實施方案，該半抗體包含vl結(jié)構(gòu)域、cl結(jié)構(gòu)域、vh結(jié)構(gòu)域、ch1結(jié)構(gòu)域、鉸鏈結(jié)構(gòu)域、ch2結(jié)構(gòu)域和ch3結(jié)構(gòu)域。在第六實施方案中，根據(jù)第五實施方案，該半抗體是進一步包含系鏈的單條多肽鏈，其中按n端至c端所述結(jié)構(gòu)域的相對彼此位置如下：vl-cl-系鏈-vh-ch1-鉸鏈-ch2-ch3。在第七實施方案中，根據(jù)第一實施方案，在蛋白a純化之前混合該第一和第二含鉸鏈多肽，并在蛋白a上共純化。在第八實施方案中，根據(jù)第一實施方案，該第一和第二含鉸鏈多肽包含異源多聚化結(jié)構(gòu)域。在第九實施方案中，根據(jù)第八實施方案，該異源多聚化結(jié)構(gòu)域選自杵入臼突變、亮氨酸拉鏈、靜電等。在第十實施方案中，根據(jù)第九實施方案，該第一含鉸鏈多肽包含杵，而該第二含鉸鏈多肽包含臼。在第十一實施方案中，根據(jù)第一實施方案，在混合后調(diào)節(jié)ph。在第十二實施方案中，根據(jù)第一或第十一實施方案，該方法進一步包括在調(diào)節(jié)ph之前加入l-精氨酸到20mm至1m之間的終濃度。在第十三實施方案中，根據(jù)第一實施方案，該方法進一步包括在15℃至39℃之間的溫度孵育該混合池至少30分鐘。在第十四實施方案中，根據(jù)第一實施方案，組裝混合物具有-200至-600mv之間、更優(yōu)選-300至-500mv之間、最優(yōu)選約-400mv的氧化電位。在第十五實施方案中，根據(jù)第一實施方案，該弱還原劑選自gsh、β-巰基乙胺、半胱氨酸/胱氨酸、gsh/gssg、半胱胺/胱胺、甘氨酰半胱氨酸、和β-巰基乙醇。在第十六實施方案中，根據(jù)第一實施方案，按50-600摩爾過量加入該弱還原劑。在第十七實施方案中，根據(jù)第一實施方案，在混合之前加入該弱還原劑。在第十八實施方案中，根據(jù)第十七實施方案，在混合前不到一小時進行該加入。在第十九實施方案中，根據(jù)第一實施方案，在聚乙烯吡咯烷酮(pvp)的存在下在15℃至39℃之間的溫度進行孵育組裝混合物的步驟。在第二十實施方案中，根據(jù)第十九實施方案，在pvp之前、與pvp同時或在pvp之后加入組氨酸。在第二十一實施方案中，根據(jù)第十九實施方案，加入pvp至不超過40％(w/v)。

在第二十二實施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生雙特異性抗體的方法，該方法包括：

a.獲得蛋白a純化的第一半抗體；

b.獲得蛋白a純化的第二半抗體；

c.向各半抗體中加入l-精氨酸溶液；

d.調(diào)節(jié)各半抗體的ph至4和9之間；

e.混合該第一和第二半抗體池以獲得混合的半抗體池；

f.向該混合的半抗體池加入摩爾過量的弱還原劑；

g.在pvp的存在下在15℃至39℃之間的溫度孵育該混合的半抗體池；

由此產(chǎn)生包含該第一和第二半抗體的雙特異性抗體。

在第二十三實施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生異源多聚體的方法，該方法包括：(a)提供至少兩種不同的含鉸鏈多肽的含l-精氨酸的混合物，其中該混合物具有7至9之間的ph；(b)加入摩爾過量的弱還原劑；和(c)在產(chǎn)生異源多聚體的條件下孵育該混合物。

在第二十四實施方案中，根據(jù)第二十二實施方案，第一半抗體是包含以下的單鏈多肽：(a)含有vl結(jié)構(gòu)域和cl結(jié)構(gòu)域的全長輕鏈；(b)系鏈；(c)含有vh結(jié)構(gòu)域、ch1結(jié)構(gòu)域、鉸鏈、ch2結(jié)構(gòu)域和ch3結(jié)構(gòu)域的全長重鏈；該多肽包含按n端至c端相對彼此位置如下的輕鏈和重鏈結(jié)構(gòu)域：vl-cl-cl/vh-系鏈-vh-ch1-鉸鏈-ch2-ch3。在第二十五實施方案中，根據(jù)第二十四實施方案，單鏈多肽進一步包含異源多聚化結(jié)構(gòu)域。在第二十六實施方案中，根據(jù)第二十五實施方案，異源多聚化結(jié)構(gòu)域是臼(例如凹陷)或杵(例如凸起)。在第二十七實施方案中，根據(jù)第二十六實施方案，在第一半抗體包含杵時，該第二半抗體包含臼。在第二十八實施方案中，根據(jù)第二十六實施方案，在第一半抗體包含臼時，該第二半抗體包含杵。在第二十九實施方案中，根據(jù)第二十四實施方案，系鏈包含ggs重復序列。在第三十實施方案中，根據(jù)第二十四實施方案，系鏈為15-50個氨基酸。

在第三十一實施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生異源多聚體蛋白質(zhì)的方法，該方法包括：(a)獲得蛋白a純化的第一含鉸鏈多肽；(b)獲得蛋白a純化的第二含鉸鏈多肽；(c)在l-精氨酸的存在下調(diào)節(jié)各含鉸鏈多肽的ph至4和9之間；(d)混合該第一和第二含鉸鏈多肽來獲得混合的半抗體池，并孵育以形成包含該第一和第二含鉸鏈多肽的異源多聚體蛋白質(zhì)。

在第三十二實施方案中，根據(jù)第一或第三十一實施方案，至少一個半抗體是包含以下的單鏈多肽：(a)包含vl結(jié)構(gòu)域和cl結(jié)構(gòu)域的全長輕鏈；(b)系鏈；(c)包含vh結(jié)構(gòu)域、ch1結(jié)構(gòu)域、鉸鏈、ch2結(jié)構(gòu)域和ch3結(jié)構(gòu)域的全長重鏈。

在第三十三實施方案中，根據(jù)第一實施方案，第一含鉸鏈多肽是包含按n端至c端方向彼此相對位置如下的輕鏈和重鏈結(jié)構(gòu)域的單鏈多肽：vl-cl-vh-ch1-鉸鏈-ch2-ch3。在第三十四實施方案中，根據(jù)第三十三實施方案，該單鏈多肽進一步包含系鏈，其中按n端至c端方向所述結(jié)構(gòu)域彼此相對位置如下：vl-cl-系鏈-vh-ch1-鉸鏈-ch2-ch3。

在第三十五實施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生異源多聚體的方法，該方法包括提供包含精氨酸的含鉸鏈多肽的混合物，該混合物具有4至9之間的ph，加入弱還原劑并在產(chǎn)生異源多聚體的條件下孵育。

在第三十六實施方案中，本發(fā)明提供已改造來表達半抗體的宿主細胞，其中該半抗體是包含系鏈、vl結(jié)構(gòu)域、cl結(jié)構(gòu)域、vh結(jié)構(gòu)域、ch1結(jié)構(gòu)域、鉸鏈結(jié)構(gòu)域、ch2結(jié)構(gòu)域和ch3結(jié)構(gòu)域的單鏈多肽，其中按n端至c端方向所述結(jié)構(gòu)域的相對彼此位置如下：vl-cl-系鏈-vh-ch1-鉸鏈-ch2-ch3。在第三十七實施方案中，根據(jù)第三十六實施方案，單鏈多肽進一步包含異源多聚化結(jié)構(gòu)域。在第三十八實施方案中，根據(jù)第三十六或第三十七實施方案，該宿主細胞選自原核細胞、真核細胞、哺乳動物細胞或植物細胞。在第三十九實施方案中，根據(jù)第三十八實施方案，該宿主細胞是原核細胞。在第四十實施方案中，根據(jù)第三十九實施方案，該原核細胞是大腸桿菌細胞。在第四十一實施方案中，根據(jù)第四十實施方案，該大腸桿菌細胞為lpp缺陷。在第四十二實施方案中，根據(jù)第三十八實施方案，該宿主細胞是哺乳動物細胞。在第四十三實施方案中，根據(jù)第四十一實施方案，該哺乳動物細胞是cho細胞。在第四十四實施方案中，根據(jù)第三十六或三十七實施方案，該宿主細胞包含編碼該單鏈半抗體的載體。在第四十五實施方案中，根據(jù)第36或第37實施方案，半抗體進一步包含異源多聚化結(jié)構(gòu)域。在第46實施方案中，根據(jù)第45實施方案，異源多聚化結(jié)構(gòu)域選自杵、臼、界面內(nèi)在靜電上不利于同二聚體形成但在靜電上有利于異二聚體形成的一個或多個帶電荷氨基酸、改變來增強分子內(nèi)離子相互作用的一個或多個氨基酸、卷曲螺旋和亮氨酸拉鏈。

在第47實施方案中，本發(fā)明提供包含改造來表達第一單鏈半抗體的第一宿主細胞和改造來表達fc成分的第二宿主細胞的宿主細胞混合物。在第48實施方案中，根據(jù)第36實施方案，通過宿主細胞產(chǎn)生的半抗體包含異源多聚化結(jié)構(gòu)域。

在以下實驗公開內(nèi)容中，應用以下縮寫：eq(等同物)、m(摩爾濃度)、μm(微摩爾濃度)、n(正常)、mol(摩爾)、mmol(毫摩爾)、μmol(微摩爾)、nmol(納摩爾)、g(克)、mg(毫克)、kg(千克)、μg(微克)、l(升)、ml(毫升)、μl(微升)、cm(厘米)、mm(毫米)、μm(微米)、nm(納米)、℃(攝氏度)、h(小時)、min(分鐘)、sec(秒)、msec(毫秒)。

實施例

在以下實施例中更詳細地描述本發(fā)明，這些實施例并非旨在以任何方式限制本發(fā)明所要求保護的范圍。附圖意在視為本發(fā)明的說明書和描述的整體部分。本文引用的所有參考文獻在此明確就其中所述的所有內(nèi)容引入作為參考。

實施例1：表達和純化

此實施例舉例說明半抗體的表達和純化。

在大腸桿菌中構(gòu)建和表達半抗體的示例性方法可以見于例如共同未決申請u.s.2011/0287009中，在此以其整體引入作為參考。改變和調(diào)整培養(yǎng)和表達條件處于本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。

在大腸桿菌細胞中表達半抗體

表達質(zhì)粒的構(gòu)建

將重鏈和輕鏈dna編碼序列都克隆入表達質(zhì)粒，該表達質(zhì)粒包含用于各序列的分開的啟動子元件及用于選擇含有該表達質(zhì)粒的細菌細胞的抗生素抗性。該載體構(gòu)建體還編碼用于將抗體多肽輸出到細菌細胞周質(zhì)空間的熱穩(wěn)定腸毒素ii(stii)分泌信號(picken等,1983,infect.immun.42:269-275和lee等,1983,infect.immun.42:264-268)。各鏈的轉(zhuǎn)錄由phoa啟動子(kikuchi等,1981,nucleicacidsres.,9:5671-5678)控制，翻譯控制由之前描述過的具有經(jīng)測量的相對翻譯強度的stii信號序列變體提供，所述變體在翻譯起始區(qū)(tif)中包含沉默密碼子改變(simmons和yansura,1996,naturebiotechnol.14:629-634及simmons等,2002,j.immunol.methods,263:133-147)。

各半抗體具有按美國專利號7,642,228中所述改造入重鏈中的杵(凸起)或臼(凹陷)。簡言之，首先產(chǎn)生ch3杵突變體。然后通過將靠近配偶體ch3結(jié)構(gòu)域上杵的殘基366、368和407進行隨機化，產(chǎn)生ch3臼突變體文庫。在以下實施例中，在igg1或igg4主鏈中，杵突變是t366w，而臼具有突變t366s、l368a和y407v。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以產(chǎn)生在其他免疫球蛋白同種型中的等同突變。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解，優(yōu)選用于雙特異性抗體的兩個半抗體是相同的同種型。

表達和純化

通過在細菌宿主細胞(例如大腸桿菌)中表達重鏈和輕鏈構(gòu)建體，在分開的培養(yǎng)物中產(chǎn)生含有杵或臼突變的半抗體。將表達質(zhì)粒引入大腸桿菌宿主菌株33d3(ridgway等(1999)59(11):2718)或64b4(w3110.delta.fhua.delta.phoailvg+.delta.prcspr43h1.delta.degp.delta.manalaci.sup.q.delta.ompt)，并在含有羧芐青霉素的lb平板上選擇轉(zhuǎn)化體。然后用轉(zhuǎn)化體來接種含有羧芐青霉素的lb起子培養(yǎng)物，將此培養(yǎng)物30℃震蕩培養(yǎng)過夜。將起子培養(yǎng)物100x稀釋在含有羧芐青霉素的磷酸限制培養(yǎng)基c.r.a.p.(simmons等,2002,j.immunol.methods,263:133-147)中，30℃震蕩培養(yǎng)該培養(yǎng)物24小時。離心培養(yǎng)物，冷凍細胞沉淀，直至開始抗體純化。融化沉淀，并按每5克細胞沉淀100mlteb的體積重量比，重懸在含有用鹽酸調(diào)節(jié)至ph7.5的25mmtris堿、125mmnacl和5mmedta的提取緩沖液(teb或tris提取緩沖液)中，使重懸的混合物通過microfluidicscorporationmodel110fmicrofluidizer(newton,mass.)三次來用微流技術(shù)破碎細胞進行提取。然后通過15,000xg離心20分鐘來澄清細菌細胞提取物，收集上清，并在純化之前濾過0.22微米醋酸濾膜。

分別通過蛋白a親和層析純化各半抗體。將來自杵半抗體的澄清的細胞提取物按2ml/分鐘的流速上樣在來自gehealthcare(pistcataway,n.j.)的1mlhitrapmabselectsure^tm柱上。上樣后，用10柱體積(cv)的40mm醋酸鈉ph6.0、125mm氯化鈉和5mmedta，然后用5柱體積的20mm檸檬酸鈉ph6.0洗滌柱，以便于通過陽離子交換柱捕獲。用10柱體積(cv)的0.2mm醋酸(ph2-3)洗脫親和捕獲的半抗體。

在cho細胞中表達半抗體

表達質(zhì)粒的構(gòu)建

重鏈和輕鏈cdna都處在巨細胞病毒立即早期基因啟動子和增強子(cmv)的控制之下。各cmv轉(zhuǎn)錄起始位點后隨剪接供體和受體序列，其限定了從最終的轉(zhuǎn)錄物去除的內(nèi)含子(lucas等,high-levelproductionofrecombinantproteinsinchocellsusingadicistronicdhfrintronexpressionvector.nucl.acidres.(1996)24:1774-9)。谷氨酰胺合成酶(gs)基因作為選擇標記用于穩(wěn)定細胞系開發(fā)(sanders等,amplificationandcloningofthechinesehamsterglutaminesynthetasegene.theemboj(1984)3:65-71)，并處于sv40早期啟動子和增強子的控制之下。

細胞培養(yǎng)

在37℃和5％co2下，在搖瓶中在基于dmem/f12的專利培養(yǎng)基中培養(yǎng)cho細胞。每三至四天，按3x10⁵/ml的接種密度傳代細胞。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

用lipofectamine2000cd，按照廠家的建議(invitrogen,carlsbad,ca)，轉(zhuǎn)染cho細胞。離心所轉(zhuǎn)染的細胞，并接種入含有多種濃度的蛋氨酸亞砜亞胺(msx)的基于dmem/f-12的選擇(無谷氨酰胺)培養(yǎng)基。接種后約三周，將單克隆挑入96孔板。通過取上清進行elisa分析來針對抗體生產(chǎn)評價所挑取的克隆。將排序靠前的克隆擴大，并根據(jù)抗體效價、有利的代謝(主要是乳酸消耗)和可接受的產(chǎn)品質(zhì)量屬性，進行評價。

表達

在cho細胞中表達每種半抗體。培養(yǎng)2l培養(yǎng)物并收獲。

半抗體的純化

將每種半抗體捕獲在mabselectsure^tm柱上。然后用4柱體積(cv)的以下緩沖液洗滌柱：由50mmtrisph8.0、150mmnacl組成的平衡緩沖液，由0.4m磷酸鉀ph7.0組成的洗滌緩沖液。將每種臂洗脫入0.15m醋酸鈉ph2.9中。

上述表達和純化半抗體的方法通用于不同同種型的igg。

實施例2：加溶劑和ph保持

以下實施例詳述在中間ph孵育半抗體如何驅(qū)動構(gòu)象轉(zhuǎn)變和提高組裝效率，及加入加溶劑諸如精氨酸和組氨酸如何減少中間ph誘導的半抗體沉淀。

由于ch2和ch3結(jié)構(gòu)域的內(nèi)表面(其可能包含正常情況下處于抗體的非溶劑暴露表面中的疏水斑塊)暴露，半抗體蛋白a池是固有不穩(wěn)定的。因此，在調(diào)節(jié)至大于4的ph后，半抗體蛋白a池趨向于沉淀。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，存在小濃度的l-精氨酸(在某些實施例中≥50mm)時，半抗體被穩(wěn)定，并在ph調(diào)節(jié)時保留在溶液中。諸如精氨酸的加溶劑的加入保持了抗體處于溶液中，降低了ph調(diào)節(jié)時的濁度，并提高了雙特異性組裝產(chǎn)率。見圖3。精氨酸還保護雙特異性半抗體和純化的雙特異性抗體免于在冷凍期間形成聚集。在組氨酸中也觀察到類似的沉淀減少作用。

用實施例1中從蛋白a柱回收的蛋白質(zhì)作為本實施例的起始物質(zhì)。

向蛋白a純化的蛋白質(zhì)中加入l-精氨酸(1m，ph9)至50-600mm的終濃度。隨后根據(jù)需要用1.5mtris堿ph11將溶液滴定至更高的ph。從蛋白a柱酸性洗脫后提高至中間ph的步驟稱為中間ph保持。

由于ch3結(jié)構(gòu)域中的杵和臼突變，與標準抗體相比，雙特異性抗體具有不同的柔性程度。由于此獨特的柔性及ch2和ch3結(jié)構(gòu)域暴露的內(nèi)表面，半抗體看起來在ph調(diào)節(jié)時經(jīng)歷構(gòu)象轉(zhuǎn)變。見圖2。

在本實驗中，在將ph調(diào)節(jié)至大于4的ph時，杵經(jīng)歷了從單體至非共價連接的同二聚體的轉(zhuǎn)變。見圖2b。根據(jù)大小排阻層析保留時間，臼經(jīng)歷了從較小的流體動力學半徑至較大的流體動力學半徑的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。該轉(zhuǎn)變在ph5開始發(fā)生，ph≥7驅(qū)動該轉(zhuǎn)變完成。見圖2a。

通過hplc層析進行了用于測定抗體的聚集和寡聚狀態(tài)的大小排阻層析(sec)。簡言之，在agilenthplc1200系統(tǒng)上將蛋白a純化的抗體加樣至tosohtskgelsw2000柱。按0.5ml/分鐘的流速用0.2mk3po40.25mkclph6.2洗脫蛋白質(zhì)(在大腸桿菌中產(chǎn)生的igg1半抗體)。通過uv吸光度和峰面積積分來定量洗脫的蛋白質(zhì)。見圖2a和b。由于半抗體，尤其是ch3結(jié)構(gòu)域中具有突變的杵和臼半抗體更高的柔性，此轉(zhuǎn)變可以為由ph變化誘導的折疊中間體。

但是，中間ph保持可以導致半抗體沉淀。如圖3a中所示，精氨酸的存在降低了蛋白a純化的igg1杵半抗體的ph誘導的濁度。在此實驗中，用1m精氨酸來滴定大腸桿菌產(chǎn)生的igg1半抗體蛋白a池中的ph。最終的精氨酸濃度在ph滴定至5.5時為約50mm，在ph7.5時為約200mm，在ph8.5時為約400mm(見圖3a)。精氨酸的存在還使杵入臼雙特異性抗體的組裝產(chǎn)率提高了15％(數(shù)據(jù)未顯示)。

類似地，組氨酸能夠降低ph誘導的由沉淀引起的濁度。在mabselectsuretm柱上從大腸桿菌勻漿物純化“杵”igg1半抗體，得到半抗體濃度為12g/l的蛋白a池。加入四分之一體積的鹽酸精氨酸或鹽酸組氨酸至最終的添加劑濃度為200mm，加入等體積的純化水作為“空白”對照。用逐滴加入的濃氫氧化鈉(50％w/vnaoh溶液或19.1n)提高樣品ph，并記錄數(shù)據(jù)點。用orionross81-03微探頭，測量ph。用hach2100實驗室濁度計，測量溶液的濁度。

圖3b中的數(shù)據(jù)顯示，精氨酸(200mm)和組氨酸(200mm)都減少了分離自大腸桿菌的igg1中ph誘導的沉淀?？偨Y(jié)起來，中間ph誘導了有利于雙特異性組裝的半抗體構(gòu)象轉(zhuǎn)變，加至中間ph保持步驟的加溶劑減少了ph誘導的沉淀。

實施例3：還原

以下實施例詳述如何使用還原條件減少聚集而導致形成更多希望的異源多聚體，例如雙特異性抗體。例如，向組裝混合物中加入的谷胱甘肽創(chuàng)造了對杵入臼雙特異性組裝有利的弱還原條件。諸如bmea(β-巰基乙胺)的其他類似種類的還原劑可以具有類似作用。

聚集可以在杵和臼半抗體組裝形成雙特異性抗體的過程中發(fā)生。提高谷胱甘肽水平最小化了組裝期間聚集的量。相反，諸如dtt的強還原劑在高濃度有時可以增加聚集。不受限于具體機制，谷胱甘肽似乎作為正確二硫鍵形成的催化劑發(fā)揮作用來改組二硫鍵，而不是永久性還原二硫鍵。對于谷胱甘肽組裝，為了在目的雙特異性產(chǎn)物中形成鉸鏈區(qū)二硫鍵，無需進行緩沖液更換，而這是使用強還原劑時再氧化所需的。在使用諸如谷胱甘肽的弱還原劑時，也無需加入化學再氧化劑。

谷胱甘肽濃度可以表示為體積摩爾濃度或表示為相對于存在于組裝混合物中的含鉸鏈多肽或半抗體的量的摩爾比。針對組裝混合物中的蛋白質(zhì)濃度，用靶摩爾比的還原劑控制；這防止由可變的蛋白質(zhì)濃度引起的過度還原或還原不足。

在此實施例中，按2至200x摩爾過量向混合的半抗體中加入谷胱甘肽。室溫孵育樣品46小時。在rp-hplc(反相高效液相層析)中，用0.1％三氟乙酸將所有樣品稀釋至1.0mg/ml的最大濃度。通過280nm光度測量來確定蛋白質(zhì)濃度。在樣品分析之前注入0.1％三氟乙酸的四個樣品。這確保柱完全平衡。將蛋白a純化的大腸桿菌產(chǎn)生的igg1半抗體加樣至agilenthplc1200系統(tǒng)上的porosr2/202.1mmdx20mml。按0.5ml/分鐘的流速在20分鐘用38–49％緩沖液a至0.09％三氟乙酸80％乙腈(緩沖液b)的線性梯度洗脫蛋白質(zhì)。通過uv吸光度和峰面積積分來定量所洗脫的蛋白質(zhì)。如圖4a中所示，雙特異性性形成的水平隨谷胱甘肽:ab摩爾比的提高而提高。見圖4a。

進行了用于測定抗體的聚集和寡聚狀態(tài)的大小排阻層析(sec)。簡言之，將蛋白a純化的大腸桿菌產(chǎn)生的igg1半抗體加樣至agilenthplc1200系統(tǒng)上的tosohtskgelsw2000柱。按0.5ml/分鐘的流速用0.2mk3po40.25mkclph6.2洗脫蛋白質(zhì)。通過uv吸光度和峰面積積分來定量所洗脫的蛋白質(zhì)。確認了所觀察到的150kd峰由雙特異性抗體的形成引起。見圖4b。

可以觀察到，存在從不想要的單體(即半抗體，杵或臼)和同二聚體向異源多聚體(即雙特異性抗體)的峰遷移(圖4a和b)?？偨Y(jié)起來，數(shù)據(jù)顯示，提高谷胱甘肽與半抗體的摩爾比減少了聚集，并提高雙特異性形成(圖4b)。

實施例4：溫度

此實施例舉例說明溫度對半抗體穩(wěn)定性和異源多聚體組裝的影響。

半抗體溶液的溫度對組裝速率具有劇烈影響。圖5a中顯示大腸桿菌產(chǎn)生的igg1半抗體在較高溫度下增強的組裝的一個實例。

顯示溫度對雙特異性組裝的影響的另一實例顯示在圖5b中。在此實驗中，按實施例1中所述，在大腸桿菌中產(chǎn)生兩個igg1半抗體并在蛋白a上純化。組合半抗體并分為四個等分試樣，用于在有或無加熱和/或中間ph保持的不同條件下測試雙特異性組裝。

如圖5b中所示，200摩爾過量的谷胱甘肽在不同條件下增強了雙特異性igg1抗體形成的速率。對照條件(室溫，約20℃，半抗體保持在ph4，無中間ph保持)允許組裝雙特異性，但速率較慢。在不到達更高溫度的情況下，室溫保持蛋白a純化的半抗體于中間ph(杵半抗體為ph5；臼半抗體為ph7)16小時提高了雙特異性抗體形成的速率(在圖5b中“ph優(yōu)化”中，組裝混合物在ph8.5)。提高溫度至37℃而無中間ph保持步驟提高了雙特異性抗體組裝的速率超過對照，它相對于室溫下進行的ph保持步驟和組裝也更快。但是，在中間ph保持蛋白a純化的半抗體(如上文)，然后在提高的溫度(即37℃)下在ph8.5組裝時，觀察到了最快的組裝速率。在此條件下，在僅約6小時內(nèi)達到了約80％的雙特異性組裝(圖5b)?？偨Y(jié)起來，加熱提高了總體組裝速率，ph保持和加熱對組裝具有協(xié)同作用。

在igg4雙特異性抗體中也觀察到了加熱增強的組裝。圖6b的結(jié)果顯示，在pvp和組氨酸的存在下，加熱的由大腸桿菌培養(yǎng)物產(chǎn)生的igg4半抗體達到了與大腸桿菌產(chǎn)生的igg1半抗體的組裝相似的組裝結(jié)果。用上述反相hplc分析了雙特異性的量?？偨Y(jié)起來，數(shù)據(jù)顯示，加熱有利于雙特異性形成。

實施例5：穩(wěn)定劑

以下實施例詳述穩(wěn)定劑可以如何減少由組裝和/或中間ph保持期間加熱和/或提高的ph引起的聚集。

聚乙烯吡咯烷酮(pvp)是具有吡咯烷酮基團的水溶性不帶電荷聚合物。pvp減少了在加熱的組裝期間的聚集。不受限于具體機制，pvp可能通過與雙特異性抗體的疏水斑塊相互作用，發(fā)揮作用來穩(wěn)定該雙特異性抗體的折疊中間體或保護半抗體免于聚集。

在實施例3中所述的條件下用sec分析了pvp對聚集體形成的影響。與不加入pvp時4％nmws相比，加入pvp使存在于組裝池中的高分子量物(hmws)最小化至12％hmws(4％pvp(w/v))。見圖6a。所有樣品都是在200mm精氨酸存在下加熱的大腸桿菌產(chǎn)生的igg1。

隨后，測試了igg4雙特異性抗體的組裝。如圖6b中所示，pvp和組氨酸存在下的加熱組裝使大腸桿菌產(chǎn)生的igg4雙特異性組裝極大地提高至與圖5a中所示的大腸桿菌產(chǎn)生的igg1的加熱組裝類似的水平。精氨酸作為加溶劑和ph滴定劑存在于加熱樣品和室溫樣品二者中。除pvp外，在加熱的中間ph保持步驟之前加入另一穩(wěn)定劑組氨酸，以在此步驟中穩(wěn)定半抗體。結(jié)果顯示，pvp和組氨酸都使igg4雙特異性組裝提高至與igg1雙特異性組裝類似的水平(圖6b與5b比較)。

圖6c顯示另一實例，其中pvp最小化igg4雙特異性抗體的加熱組裝期間的hmws形成。

加熱半抗體蛋白a池加速了半抗體在中間ph孵育時的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。但尤其是對于自大腸桿菌產(chǎn)生的igg4半抗體組裝igg4杵和臼雙特異性抗體，加熱可以引起聚集。因此，在組裝期間加熱igg4半抗體時，加入額外的加溶劑和/或穩(wěn)定劑。

室溫孵育48小時后檢測了大腸桿菌igg4臼半抗體的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。在37℃孵育igg4臼半抗體時，在約三小時內(nèi)檢測到了構(gòu)象轉(zhuǎn)變(數(shù)據(jù)未顯示)。但是，如通過sec測定，加熱導致了聚集的增加。見圖7，左圖。在此實驗中，在加熱的中間ph保持步驟中加入組氨酸，測試其對減少半抗體聚集的作用。如圖7中所示，加熱期間組氨酸的存在使聚集水平從11％高分子量物(hmws，無組氨酸)最小化至6％hmws(200mm組氨酸)而不影響半抗體的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。因此，結(jié)果顯示，穩(wěn)定劑在雙特異性抗體組裝以及半抗體的中間ph保持期間都減少聚集體形成。

實施例6-組裝

此實施例提供用于兩種示例性免疫球蛋白同種型(即igg1和igg4)的方案。在兩種不同宿主細胞(即大腸桿菌或cho)之一中，產(chǎn)生了半抗體。應理解，本文所述的方法可以經(jīng)調(diào)整而適用于在相同來源或其他來源中產(chǎn)生的其他抗體同種型。根據(jù)本領(lǐng)域的知識和本申請中公開的教導，通過常規(guī)實驗來修改該方案處于本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。

此外，應理解，抗體的形成包括，在第一宿主細胞(例如cho)中產(chǎn)生的半抗體可以與在第二宿主細胞(例如大腸桿菌)中產(chǎn)生的互補半抗體組裝(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，例如，在cho中產(chǎn)生的杵半抗體可以與在大腸桿菌中產(chǎn)生的臼半抗體組裝，或者反之亦然。

此實施例中所述的全部四種組裝方法都導致了組裝，該組裝在4小時后達到平臺，并產(chǎn)生了少于10％的聚集體和組裝期間最小的聚集。

a.來自大腸桿菌的igg1

半抗體的構(gòu)象變化：如果蛋白a池于小于7的ph，則用1m精氨酸(ph9)調(diào)節(jié)兩個半抗體池的ph至ph7，并在37℃孵育兩個池3小時。備選地，在室溫孵育了這些池48小時。如果這些池已經(jīng)于ph7中48小時或更長，則省卻此步驟。定量使該溶液達到ph7所加入的精氨酸的量。

組合這些(仍然溫暖的)池，用1m精氨酸(ph9)調(diào)節(jié)ph至ph8.5。定量在此階段加入的精氨酸的量。

加入2m精氨酸(ph8.5)，直至精氨酸的終濃度為0.5m。

加入含200mm還原型谷胱甘肽(gsh)的0.5m精氨酸(最終ph8.5)，直至gsh:ab比為200x(例如，每毫克半抗體加入6.88μl該谷胱甘肽溶液)。

37℃孵育該谷胱甘肽半抗體溶液4小時，以允許該半抗體組裝為雙特異性抗體。

b.來自cho的igg1：

按上文針對大腸桿菌所述組裝。對于中間ph保持，可能無需將ph提高至ph7或以上。加入谷胱甘肽后的組裝時間可以在2小時后完成。

c.來自cho的igg4：

在與上文(來自cho的igg1)相同的條件下組裝。可能無需加入組氨酸和pvp。

d.來自大腸桿菌的igg4：

用以上方案組裝來自大腸桿菌的igg4導致了高(即～35％)聚集體水平。這使得有必要修改組裝條件：

據(jù)測定，包含0.2m組氨酸和50mm精氨酸的蛋白a池組合物產(chǎn)生了可接受的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，考察了提供最終結(jié)果的幾種方式，并確定其提供可接受的結(jié)果。

第一種方法在蛋白a純化期間使用改變的洗脫(ph3)和洗滌緩沖液(ph7)，使其包含0.2m組氨酸和50mm精氨酸。這導致包含0.2m組氨酸和50mm精氨酸、ph4的最終蛋白a池，然后用1.5mtris堿(ph11)滴定至ph8。

第二種備選方法利用鹽酸組氨酸的0.8m溶液(其具有0.8m的溶解度)。向蛋白a池(一個或多個)加入三分之一體積的鹽酸組氨酸，達到0.2m組氨酸的終濃度。然后加入1/40體積的2m精氨酸。

第三種備選方法是對蛋白a池進行緩沖液更換，換入0.2m組氨酸和50mm精氨酸緩沖液(優(yōu)選ph8)中。

最后一種備選方法是直接向蛋白a池(一個或多個)加入組氨酸(31.03g/l)，然后加入1/40體積的2m精氨酸。

向蛋白a池(一個或多個)加入四分之一體積spectrumpvpk-15在0.2m組氨酸和50mm精氨酸中的20％w/v溶液。

應指出，pvp在低谷胱甘肽條件下也使igg1組裝期間的聚集最小化。

半抗體的構(gòu)象變化：用含0.2m組氨酸、50mm精氨酸和4％pvpk-15的1.5mtris堿(ph11)調(diào)節(jié)蛋白a池(一個或多個)的ph至ph8.0，并在37℃孵育3小時。備選地，可以在室溫孵育該池48小時。

加入含200mm還原型谷胱甘肽(gsh)的0.2m組氨酸、4％pvp、50mm精氨酸、最終ph8.0，直至gsh:ab比為200x(例如，每毫克半抗體加入6.88μl谷胱甘肽溶液)。如果半抗體池尚未組合，則在此時組合它們。

37℃孵育混合的半抗體4小時，以允許形成雙特異性抗體。此時，百分比雙特異性抗體已達到平臺。

一旦雙特異性抗體的量已達到平臺，即可以將溶液保存在低溫下或調(diào)節(jié)至更低的ph，用于在隨后的層析步驟上處理。

本文公開的方法可以用于制備諸如雙特異性抗體的治療性蛋白質(zhì)。

應理解，本文所述的實施例和實施方案僅是為了舉例說明的目的，鑒于其，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉對本發(fā)明的多種修改或改變，其也將包含在本申請的精神和范圍以及所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。本文引用的所有出版物、專利和專利申請在此為了所有目的以其整體引入作為參考。

序列表

<110>弗·哈夫曼-拉羅切有限公司(f.hoffmann-larocheag)

<120>雙特異性抗體的改進的組裝

<130>p4764r1-wo

<150>61/676837

<151>2012-07-27

<150>61/560704

<151>2011-11-16

<150>61/546503

<151>2011-10-12

<150>61/545863

<151>2011-10-11

<160>1

<170>patentinversion3.5

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>x是任何氨基酸殘基

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(4)

<223>x是任何氨基酸殘基

<400>1

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