本申請是國際申請日為2013年03月14日、國際申請?zhí)枮閜ct/us2013/031363、進(jìn)入國家階段的申請?zhí)枮?01380017721.7、發(fā)明名稱為“蛋白酶調(diào)節(jié)的抗體”的pct申請的分案申請。

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技術(shù)領(lǐng)域是血友病和其它凝血病的治療。

附圖說明

圖1.蛋白酶調(diào)節(jié)的抗體的實(shí)施方案的圖解說明。vh，重鏈可變區(qū)；vl，輕鏈可變區(qū)；ch，重鏈恒定區(qū)；cl，輕鏈恒定區(qū)。

圖2.有和沒有凝血酶消化的兩個(gè)蛋白酶調(diào)節(jié)的抗tfpifab片段（“fab-1”和“fab-2”）的蛋白印跡。

圖3.圖形顯示通過elisa測定的有和沒有凝血酶消化的fab-1和fab-2的組織因子途徑抑制劑（tfpi）結(jié)合。

圖4.圖形顯示有和沒有凝血酶消化的fab-1（fab1）和fab-2（fab2）的tfpi結(jié)合的biacore^tm測量。

圖5.在hek2936e細(xì)胞中表達(dá)的純化的igg抗體的sds-page。

圖6.親本igg（“親本igg”；頂部）和igg2-接頭1（底部）的蛋白印跡。泳道1，用凝血酶（1單位）消化；泳道2，無蛋白酶（對照）；泳道3，用牛纖溶酶消化；泳道4，用腸激酶（0.02μg）消化；泳道5，用牛因子xa（1μg）消化；泳道6，用蛋白裂解酶（matriptase，mtsp）（0.5μg）消化；泳道7，用尿激酶（upa）（0.25μg）消化；泳道8，用人鼻病毒3c蛋白酶（hrv3c）（2單位）消化。

圖7.圖形顯示通過elisa測定的有和沒有凝血酶消化的igg的tfpi結(jié)合。

圖8.圖形顯示有和沒有凝血酶消化的親本igg和igg-接頭1的tfpi結(jié)合的biacore^tm測量。

圖9.蛋白印跡，顯示用人蛋白酶的igg-接頭1和wt抗體的蛋白酶消化。

具體實(shí)施方式

本公開提供了蛋白酶調(diào)節(jié)的抗體，其特異性結(jié)合組織因子途徑抑制劑（tfpi）。所述抗體可用于治療出血性疾病，例如血友病。在一些實(shí)施方案中，蛋白酶調(diào)節(jié)的抗tfpi抗體可以被凝血酶和/或纖溶酶切割。通過初始抑制tfpi，這些蛋白酶調(diào)節(jié)的抗tfpi抗體促進(jìn)凝血酶和/或纖溶酶的生成，其依次切割抗體并去除或顯著降低它們對tfpi的結(jié)合活性。此負(fù)反饋允許所述抗體促進(jìn)在安全的治療窗口內(nèi)的凝血。

1.蛋白酶調(diào)節(jié)的抗tfpi抗體

本文公開的蛋白酶調(diào)節(jié)的抗體特異性結(jié)合tfpi，即，它們結(jié)合tfpi的親和力高于（例如，至少兩倍高于）它們對于不相關(guān)抗原（例如bsa，酪蛋白）的結(jié)合親和力。如本文所用術(shù)語“組織因子途徑抑制劑”或“tfpi”指細(xì)胞天然表達(dá)的人tfpi的任何變體、同種型和物種同源物。

在一些實(shí)施方案中，蛋白酶調(diào)節(jié)的抗體結(jié)合tfpi，具有至少約10⁵m^-1至約10¹²m^-1的親和力(例如10⁵m^-1、10^5.5m^-1、10⁶m^-1、10⁶.⁵m^-1、10⁷m^-1、10⁷.⁵m^-1、10⁸m^-1、10⁸.⁵m^-1、10⁹m^-1、10^9.5m^-1、10¹⁰m^-1、10^10.5m^-1、10¹¹m^-1、10^11.5m^-1、10¹²m^-1)?？贵w結(jié)合抗原的親和力(kd)可以使用任何本領(lǐng)域已知的方法測定，例如免疫測定諸如酶聯(lián)免疫特異性測定（elisa）、生物分子相互作用分析（bia）(例如，sjolander&urbaniczky;anal.chem.63:2338-2345,1991;szabo,等,curr.opin.struct.biol.5:699-705,1995)，和用于對表達(dá)抗原的細(xì)胞上結(jié)合的抗體定量的熒光激活細(xì)胞分選(facs)。bia是用于實(shí)時(shí)分析生物特異性相互作用，而不標(biāo)記任何相互作用物的技術(shù)（例如biacore^tm）。光學(xué)現(xiàn)象表面等離子體共振（spr）中的變化可以用作生物分子之間的實(shí)時(shí)反應(yīng)的指示。

蛋白酶調(diào)節(jié)的抗tfpi抗體可以使用基本上全長的免疫球蛋白分子（例如igg1、igg2a、igg2b、igg3、igg4、igm、igd、ige、iga），其抗原結(jié)合片段，例如fab或f(ab′)2或包含抗原結(jié)合位點(diǎn)能夠特異性結(jié)合tfpi的構(gòu)建體，例如scfv、fv或二體（diabody）進(jìn)行構(gòu)建。術(shù)語“抗體”還包括其它蛋白支架，所述其它蛋白支架能夠容納抗體互補(bǔ)決定區(qū)（cdr）插入與天然抗體中發(fā)現(xiàn)的相同活性結(jié)合構(gòu)象，使得對這些嵌合蛋白觀察到的對tfpi的結(jié)合相對于所述cdr衍生自的天然抗體的tfpi結(jié)合活性得以保留。

如本文所用“分離的抗體”是基本上不含具有不同抗原特異性的其它抗體的抗體（例如，結(jié)合tfpi的分離的抗體基本上不含結(jié)合tfpi之外的抗原的抗體）。但是，結(jié)合人tfpi的表位、同種型或變體的分離的抗體可以具有對其它相關(guān)抗原的的交叉反應(yīng)性，例如來自其它物種的抗原（例如，tfpi物種同源物）。分離的抗體可以基本上不含其它細(xì)胞材料和/或化學(xué)品。

本文公開的蛋白酶調(diào)節(jié)的抗體被工程改造以包含被一種或多種蛋白酶識(shí)別的蛋白酶切割位點(diǎn)。如本文所用，“蛋白酶切割位點(diǎn)”指被蛋白酶識(shí)別并切割的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述蛋白酶切割位點(diǎn)位于其可變和恒定區(qū)之間的位置。在一些實(shí)施方案中，所述蛋白酶調(diào)節(jié)的抗tfpi抗體包括可以被凝血酶、纖溶酶和/或因子xa切割的一個(gè)或多個(gè)蛋白酶切割位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，蛋白酶調(diào)節(jié)的抗tfpi抗體的可變和恒定區(qū)之間的氨基酸序列除了蛋白酶切割位點(diǎn)之外還包含多肽接頭（如例如圖1中圖解說明）。所述接頭可以是單個(gè)氨基酸或多肽序列（例如，至多100個(gè)氨基酸）。例如所述接頭可以是ggggs（seqidno：149）。其它可用的接頭包括seqidno：151-176中所示的那些。在其它實(shí)施方案中，不存在接頭，并且切割位點(diǎn)本身插入在可變和恒定區(qū)之間。

已經(jīng)確定了至少兩個(gè)最優(yōu)的凝血酶切割位點(diǎn)：(1)x1-x2-p-r-x3-x4(seqidno:147)，其中x1和x2是疏水氨基酸，并且x3和x4是非酸性氨基酸，和(2)grg。凝血酶特異性在精氨酸殘基后切割。纖溶酶也可以切割上述兩個(gè)切割位點(diǎn)，但是相比凝血酶具有較低的特異性。其它可用的凝血酶切割位點(diǎn)提供為seqidno：1-60。其它可用的纖溶酶切割位點(diǎn)提供為seqidno：12、47、48、53和61-130。在一些實(shí)施方案中，所述切割位點(diǎn)是lvprgs(seqidno:137)。

在一些實(shí)施方案中，使用因子xa切割位點(diǎn)，例如i-(e或d)-g-r(seqidno:148)。其它可用的因子xa切割位點(diǎn)提供為seqidno：29、59和61-69。其它凝血酶和fxa切割位點(diǎn)或序列可以見于先前的發(fā)表，作者為bianchini[bianchiniep等2002jbc]。一種蛋白酶調(diào)節(jié)的抗體可以包括超過一種蛋白酶切割位點(diǎn)。

除了切割位點(diǎn)，還可以將一個(gè)第二蛋白酶結(jié)合位點(diǎn)稱為外位點(diǎn)（exosite）導(dǎo)入蛋白酶調(diào)節(jié)的tfpi抗體以使切割更加有效。凝血酶的外位點(diǎn)可以來自蛋白酶底物或抑制劑例如par1、纖維蛋白原和水蛭素的天然外位點(diǎn)。所述外位點(diǎn)還可以是天然外位點(diǎn)的衍生物。

蛋白酶調(diào)節(jié)的tfpi抗體可以合成或重組產(chǎn)生?？衫靡恍┘夹g(shù)產(chǎn)生抗體。例如，可使用噬菌體-抗體技術(shù)生成抗體(knappik等,j.mol.biol.296:57-86,2000)。另一個(gè)獲得抗體的方法是篩選來自b細(xì)胞的dna文庫，例如wo91/17271和wo92/01047中所述。在這些方法中，產(chǎn)生噬菌體文庫，其中的成員在它們的外表面展示不同的抗體?？贵w通常展示為fv或fab片段。通過親和力富集選擇結(jié)合所選蛋白的噬菌體展示的抗體。也可以使用三源雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生抗體(例如,oestberg等,hybridoma2:361-367,1983;美國專利4,634,664;美國專利4,634,666)。

還可以從任何表達(dá)抗體的細(xì)胞純化抗體，包括已用編碼抗體的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可以在抗體從中表達(dá)的條件下培養(yǎng)。使用本領(lǐng)域熟知的方法，純化的抗體可以與其它細(xì)胞組分分離，所述其它細(xì)胞組分在細(xì)胞中可以與抗體關(guān)聯(lián)，例如某些蛋白、碳水化合物或脂質(zhì)。這些方法包括但不限于，尺寸排阻層析、硫酸銨分級、離子交換層析、親和層析和制備型凝膠電泳。制備物的純度可以通過任何本領(lǐng)域已知的手段評估，例如sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳。純化的抗體的制備物可以包含超過一種類型的抗體。

可替代地，蛋白酶調(diào)節(jié)的抗tfpi抗體可以使用合成其氨基酸序列的化學(xué)方法產(chǎn)生，例如通過使用固相技術(shù)直接肽合成（例如，merrifield,j.am.chem.soc.85:2149-2154,1963;roberge等,science269:202-204,1995）?？梢允褂檬止ぜ夹g(shù)或通過自動(dòng)化進(jìn)行蛋白合成。任選地，抗體片段可以使用化學(xué)方法單獨(dú)合成和組合以產(chǎn)生全長分子。

蛋白酶調(diào)節(jié)的抗tfpi抗體還可以構(gòu)建為“單鏈fv（scfv）形式”，其中蛋白酶切割位點(diǎn)插入scfv的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)之間的肽接頭中或在其附近。因?yàn)殡慕宇^對于將用于抗原結(jié)合的scfv的兩個(gè)可變區(qū)保持在一起是必需的，所以肽接頭或側(cè)翼區(qū)域的切割使得目標(biāo)蛋白酶失活或下調(diào)scfv對其抗原的結(jié)合。氨基酸序列seqidno:179（其可以由seqidno:180編碼）是以scfv形式的蛋白酶調(diào)節(jié)的抗tfpi抗體的實(shí)例。

在一些實(shí)施方案中，蛋白酶調(diào)節(jié)的tfpi抗體構(gòu)建成“igg形式”，具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，并可以在重鏈、輕鏈或兩者上包含一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)蛋白酶切割位點(diǎn)。在每種情況下，蛋白酶切割位點(diǎn)可以在任一端或兩端側(cè)接接頭。此外，在每種情況下，所述切割位點(diǎn)可以是相同的或不同的?！癷gg-接頭1”（實(shí)施例5）和“igg-接頭2”是以igg形式的蛋白酶調(diào)節(jié)的抗tfpi抗體的實(shí)例：

。

2.負(fù)反饋

蛋白酶調(diào)節(jié)的抗體可以包含作為抗體功能的結(jié)果上調(diào)或生成的蛋白酶的蛋白酶切割位點(diǎn)。這些蛋白酶可以然后切割蛋白酶調(diào)節(jié)的抗體，由此提供負(fù)反饋環(huán)，其可以用于防止蛋白酶調(diào)節(jié)的抗體的過度活性。

例如，可以被凝血酶和/或纖溶酶切割的蛋白酶調(diào)節(jié)的抗tfpi抗體可以展示這樣的負(fù)反饋效果。這樣的蛋白酶調(diào)節(jié)的抗tfpi抗體促進(jìn)凝血酶和/或纖溶酶的生成。凝血酶和纖溶酶會(huì)依次切割蛋白酶調(diào)節(jié)的抗tfpi抗體并去除或顯著降低它們對tfpi的結(jié)合活性。此負(fù)反饋使得所述抗體促進(jìn)在安全的治療窗口內(nèi)的凝血。

3.多核苷酸

本公開還提供編碼蛋白酶調(diào)節(jié)的抗體的多核苷酸。這些多核苷酸可以用于，例如產(chǎn)生大量用于治療用途的抗體。

編碼抗體的cdna分子可以用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)使用mrna作為模板制備。此后，可以使用本領(lǐng)域已知的和公開于手冊（例如，sambrook，等，molecularcloning:alaboratorymanual,(第二版,coldspringharborlaboratorypress;coldspringharbor,n.y.;1989)第1-3卷）的分子生物學(xué)技術(shù)復(fù)制cdna分子?？梢允褂脭U(kuò)增技術(shù)，例如pcr，獲得所述多核苷酸的額外拷貝。可替代地，可以使用合成化學(xué)技術(shù)合成編碼蛋白酶調(diào)節(jié)的抗tfpi抗體的多核苷酸。

為了表達(dá)編碼抗體的多核苷酸，可以將所述多核苷酸插入表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含對于插入的編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的必需元件。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法構(gòu)建包含編碼抗體的序列和適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯控制元件的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組dna技術(shù)，合成技術(shù)和體內(nèi)遺傳重組。這些技術(shù)描述于，例如sambrook,等(1989)和ausubel,等,(currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,newyork,n.y.,1995)。

可以利用多種表達(dá)載體/宿主系統(tǒng)來包含和表達(dá)編碼抗體的序列。這些包括但不限于，微生物，例如用重組細(xì)菌噬菌體、質(zhì)粒或粘粒dna表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；用酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母；用病毒表達(dá)載體（例如，桿狀病毒）轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用病毒表達(dá)載體（例如，花椰菜花葉病毒、camv、煙草花葉病毒、tmv）轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或細(xì)菌表達(dá)載體（例如ti或pbr22質(zhì)粒），或動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)。

控制元件或調(diào)節(jié)序列是那些載體的非翻譯區(qū)——增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、5'和3'非翻譯區(qū)——其與宿主細(xì)胞蛋白相互作用以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和反應(yīng)。這些元件的強(qiáng)度和特異性可以變化。取決于載體系統(tǒng)和宿主，可以使用任何數(shù)目的合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件，包括組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。例如，當(dāng)在細(xì)菌系統(tǒng)中克隆時(shí)，可以使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在昆蟲細(xì)胞中可以使用桿狀病毒多角體啟動(dòng)子?？梢詫⒀苌灾参锛?xì)胞的基因組（例如，熱休克，rubisco和貯藏蛋白基因）的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子或衍生自植物病毒的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子（例如，病毒啟動(dòng)子或前導(dǎo)序列）克隆到載體中。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中，可以使用來自哺乳動(dòng)物基因或來自哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子。如果有必要生成包含編碼抗體的核苷酸序列的多個(gè)拷貝的細(xì)胞系，可以使用具有適當(dāng)?shù)目蛇x擇標(biāo)志物的基于sv40或ebv的載體。

描述另外的有用的分子生物學(xué)技術(shù)（包括抗體的制備）的一般文件是berger和kimmel(guidetomolecularcloningtechniques,methodsinenzymology,vol.152,academicpress,inc.);sambrook,等,(molecularcloning:alaboratorymanual,(secondedition,coldspringharborlaboratorypress;coldspringharbor,n.y.;1989)vol.1-3);currentprotocolsinmolecularbiology,(f.m.ausabeletal.[eds.],currentprotocols,ajointventurebetweengreenpublishingassociates,inc.andjohnwiley&sons,inc.(supplementedthrough2000));harlow等,(monoclonalantibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress(1988),paul[ed.]);fundamentalimmunology,(lippincottwilliams&wilkins(1998));以及harlow,等(usingantibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress(1998))。

4.藥物組合物

蛋白酶調(diào)節(jié)的抗tfpi抗體可以在包含藥學(xué)可接受的載體的藥物組合物中提供。所述藥學(xué)可接受的載體優(yōu)選是非熱原的。包含蛋白酶調(diào)節(jié)的抗tfpi抗體的藥物組合物可以單獨(dú)施用或組合至少一種其它試劑（例如穩(wěn)定化組合物）施用，其可以在任何無菌、生物相容的藥物載體中使用，所述載體包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖和水?？梢圆捎酶鞣N水性載體，例如0.4%鹽水、0.3%甘氨酸等。這些溶液是無菌的并且通常無微粒物質(zhì)。這些溶液可以通過常規(guī)、熟知的滅菌技術(shù)（例如，過濾）滅菌。根據(jù)需要所述組合物可以包含藥學(xué)可接受的輔助物質(zhì)以接近生理?xiàng)l件，如ph調(diào)節(jié)劑和緩沖劑等。根據(jù)所選特定施用方式，藥物組合物中蛋白酶調(diào)節(jié)的抗tfpi抗體的濃度可以廣泛地變化，即從少于約0.5％，通常在或至少約1％至高達(dá)15％或20％（重量），并且將主要基于流體體積，粘度等進(jìn)行選擇。參見美國專利號(hào)5,851,525。如果需要，在藥物組合物中可以包括超過一種不同的蛋白酶調(diào)節(jié)的抗tfpi抗體。

除了活性成分之外，藥物組合物可以包含合適的藥學(xué)可接受的載體，所述載體包含促進(jìn)組合物加工成可以作為藥物使用的制劑的賦形劑和助劑。藥物組合物可通過任何數(shù)量的途徑施用，包括但不限于，口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、經(jīng)皮、皮下、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、腸胃外、局部、舌下或直腸方式。

已制備藥物組合物后，它們可以被放置在適當(dāng)?shù)娜萜髦?，??標(biāo)記用于指示狀況的治療。這樣的標(biāo)記將包括施用的量、頻率和方法。

5.方法

包含一種或多種蛋白酶調(diào)節(jié)的抗tfpi抗體的藥物組合物可以單獨(dú)施用給患者，或組合其它試劑、藥物或凝血因子施用給患者以治療血友病或其它凝血障礙。蛋白酶調(diào)節(jié)的抗tfpi抗體的“治療有效劑量”指會(huì)促進(jìn)凝血或減少出血時(shí)間的蛋白酶調(diào)節(jié)的抗tfpi抗體的量。治療有效劑量的確定完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)。

最初可以在細(xì)胞培養(yǎng)測定中或動(dòng)物模型（通常是大鼠、小鼠、兔、犬或豬）中評價(jià)治療有效劑量。可以使用動(dòng)物模型確定適當(dāng)?shù)臐舛确秶褪┯猛緩?。然后可以使用這些信息確定用于在人中施用的有用的劑量和途徑。

可以通過標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)程序在細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中確定蛋白酶調(diào)節(jié)的抗tfpi抗體的治療效力和毒性，例如ed50（50%的群體中治療有效的劑量）和ld50（對50%的群體致命的劑量）。毒性對治療效果的劑量比例是治療指數(shù)，并且其可以表示為比例ld50/ed50。

優(yōu)選展示大治療指數(shù)的藥物組合物。在配制用于人使用的劑量范圍中使用獲得自細(xì)胞培養(yǎng)測定和動(dòng)物研究的數(shù)據(jù)。在這些組合物中包含的劑量優(yōu)選在循環(huán)濃度范圍內(nèi)，其包括具有很少或無毒性的ed50。劑量取決于所采用的劑型、患者敏感度和施用途徑在此范圍內(nèi)變化。

確切的劑量將由醫(yī)生根據(jù)需要治療的患者相關(guān)的因素來確定。調(diào)節(jié)劑量和施用以提供足夠水平的蛋白酶調(diào)節(jié)的tfpi抗體或保持所希望的效果?？煽紤]的因素包括疾病狀態(tài)的嚴(yán)重性，對象的一般健康狀況，對象的年齡、體重和性別，飲食，施用時(shí)間和頻率，一種或多種藥物組合，反應(yīng)敏感性和對治療的耐受性/反應(yīng)。長效藥物組合物可以每3至4天，每周，或每兩周一次施用，取決于特定制劑的半衰期和清除率。

在一些實(shí)施方案中，治療有效的蛋白酶調(diào)節(jié)的抗tfpi抗體的體內(nèi)劑量范圍在約5μg至約100mg/kg，約1mg至約50mg/kg，約10mg至約50mg/kg患者體重。

包含蛋白酶調(diào)節(jié)的抗tfpi抗體的藥物組合物的施用模式可以是任何合適的途徑，其將抗體遞送至宿主（例如，皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或鼻內(nèi)施用）。

在一些實(shí)施方案中，蛋白酶調(diào)節(jié)的抗tfpi抗體不與其它治療劑一起施用。在一些實(shí)施方案中，蛋白酶調(diào)節(jié)的抗tfpi抗體與其它試劑（例如藥物或凝血因子）組合施用，以增強(qiáng)凝血酶的初始產(chǎn)生，同時(shí)保證凝血酶水平保持低于在一些具有凝血功能障礙的人中可能導(dǎo)致血栓的范圍。蛋白酶調(diào)節(jié)的抗tfpi抗體的施用可以在其它試劑的施用之前、之后或基本上同時(shí)。

本說明書中任何內(nèi)容都不應(yīng)被認(rèn)為限制本公開的范圍。提出的所有實(shí)施例都是代表性和非限制性的。由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)所述教導(dǎo)的理解，可以對上述實(shí)施方案進(jìn)行修改或變化。因此，應(yīng)當(dāng)理解，在權(quán)利要求和它們的等價(jià)物的范圍內(nèi)，本文公開的實(shí)施方案可以以具體描述的之外的其它方式實(shí)施。

實(shí)施例1

蛋白酶調(diào)節(jié)的抗tfpifab片段的構(gòu)建

兩種蛋白酶調(diào)節(jié)的抗tfpifab，“fab-1”和“fab-2”基于seqidno:177（重鏈）和seqidno:178（輕鏈）中所示的抗tfpi抗體序列。兩種fab都具有插入到兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的c端的凝血酶/纖溶酶蛋白酶切割位點(diǎn)lvprgs(seqidno:137)。fab-1中的切割位點(diǎn)側(cè)接(gly)4ser接頭。fab-2僅包含六氨基酸切割位點(diǎn)，不存在接頭。凝血酶和纖溶酶將切割相對lvprgs(seqidno:137)的arg（r）殘基的c端。編碼fab的dna由genscript合成，具有優(yōu)化的密碼子，用于細(xì)菌表達(dá)。下表中鑒定了用于fab的氨基酸和dna序列。

用限制性酶bsai和hindiii(newenglandbiolabs)消化fab編碼區(qū)。使用瓊脂糖凝膠純化dna片段并亞克隆到pbadmychisa(invitrogen)中。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)連接和轉(zhuǎn)化克隆的dna。通過dna測序證實(shí)陽性克隆并用于bl21大腸桿菌表達(dá)。

實(shí)施例2

凝血酶切割的fab的蛋白印跡

約2.5μg粗純化的fab-1和fab-2用0、2或10個(gè)單位的凝血酶(novagen)在37℃消化1小時(shí)。消化物在4-15%critereon^tmtgx^tm凝膠(bio-rad)上運(yùn)行。將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上并用抗人fab抗體(southernbiotech)探測。

fab-1和fab-2切割的蛋白印跡顯示于圖2。所有樣品是還原的。當(dāng)用凝血酶處理時(shí)，對于兩種fab均觀察到約12kda的條帶。在無凝血酶消化的樣品中不存在這些條帶，表明凝血酶切割的產(chǎn)物是小尺寸蛋白。

實(shí)施例3

凝血酶消化的fab-1和fab-2的tfpielisa。

約2.5μg部分純化的fab-1和fab-2用2個(gè)單位的生物素化的凝血酶（novagen）在23℃消化過夜。將鏈霉親和素瓊脂糖小珠（100μl）添加到消化物中以耗盡凝血酶。將消化的fab樣品施加到捕獲瓊脂糖小珠/凝血酶復(fù)合物的柱上。洗脫物包含消化的fab。

maxisorp^?96-孔板(nunc)用1μg/ml的tfpi在pbs中在4℃包被過夜。板在室溫下在5%脫脂干乳pbs/0.5%tween-20^?(pbs-t)中封閉1小時(shí)。將未消化和消化的fab-1和fab-2的系列兩倍稀釋添加到孔中（100μl/孔）并在rt孵育1小時(shí)。板用pbs-t洗滌5次。添加二級hrp綴合的抗fab抗體（100μl，1:10,000稀釋）以用amplex^?red(invitrogen)溶液檢測。如圖3所示，凝血酶消化顯著減少了tfpi結(jié)合的信號(hào)。

實(shí)施例4

凝血酶消化的fab-1和fab-2的biacore^tm測量

約2.5μg粗純化的fab-1和fab-2用2個(gè)單位的生物素化的凝血酶（novagen）在23℃消化過夜。將鏈霉親和素瓊脂糖小珠（100μl）添加到消化物中以耗盡凝血酶。將消化的fab樣品施加到捕獲瓊脂糖小珠/凝血酶復(fù)合物的柱上。洗脫物包含消化的fab。

對于biacore^tm分析，使用胺偶聯(lián)以100相對單位（ru）的目標(biāo)水平將人tfpi(americandiagnostica)固定化，并且在流動(dòng)相中注射抗體。使用hbs-p作為運(yùn)行緩沖液。使用其中使表面活化并然后失活的不具有任何固定化的蛋白的空白固定化制備參考通道。進(jìn)行手動(dòng)運(yùn)行以測量fab和緩沖液對照的升高的ru。

如圖4所示，相比未消化的fab-1（25.6ru）和fab2（27.9ru），不含可切割的接頭的親本fab生成24.6ru。凝血酶切割后，fab-1和fab-2的結(jié)合信號(hào)減少超過50%，表明切割的fab-1和fab-2不僅喪失恒定結(jié)構(gòu)域還喪失對tfpi的結(jié)合活性。

實(shí)施例5

igg表達(dá)和純化

基于seqidno:177（重鏈）和seqidno:178（輕鏈）中所示的親本抗tfpi抗體序列構(gòu)建蛋白酶調(diào)節(jié)的抗tfpi免疫球蛋白分子“igg-接頭1”。為了促進(jìn)分子克隆，將blpi位點(diǎn)導(dǎo)入到重鏈編碼序列中。相比fab-1中蛋白酶可切割的接頭的位置，blpi位點(diǎn)的導(dǎo)入使igg-接頭1的接頭位置向恒定區(qū)遷移兩個(gè)氨基酸。

hek2936e細(xì)胞用構(gòu)建的igg表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，并且收獲包含igg抗體的培養(yǎng)物上清液。使用mabselectsure^tm親和柱然后通過superdex^tm200層析純化抗體。在sds-page上純化的igg-接頭1顯示在圖5。

實(shí)施例6

親本igg和igg-接頭1的蛋白印跡

用凝血酶、牛纖溶酶、牛因子xa、蛋白裂解酶（mtsp）、尿激酶（upa）或人鼻病毒3c蛋白酶（hrv3c）消化純化的親本igg和igg-接頭1（0.5μg）。抗體與蛋白酶一起在37℃孵育1小時(shí)。在4-20%critereon^tmtgx^tm凝膠(bio-rad)上運(yùn)行消化物。將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上并用抗人igg重鏈和輕鏈抗體（pierce）探測。igg2和igg2-接頭1的蛋白印跡顯示在圖6中。所有樣品是還原的。

完整的igg在還原條件下產(chǎn)生兩個(gè)條帶。所述兩個(gè)條帶對應(yīng)重鏈（50kd）和輕鏈（25kd）。消化的抗體igg-接頭1顯示相對未消化的抗體的分子量遷移。使用下列蛋白酶消化抗體：凝血酶、纖溶酶、牛因子xa、mtsp和upa。消化的igg-接頭1抗體顯示從50kd至37kd的重鏈的分子量遷移。此大小遷移與vh結(jié)構(gòu)域從重鏈的喪失有關(guān)。還存在25kd輕鏈向約16kda的模糊條帶的分子量遷移，這表明vl結(jié)構(gòu)域從輕鏈上切割下來。蛋白酶不切割親本igg，表明分子量喪失是由于工程改造進(jìn)抗體的切割位點(diǎn)的蛋白酶消化的結(jié)果。

實(shí)施例7

凝血酶消化的親本igg和igg-接頭1的tfpi-結(jié)合elisa

一微克全長抗體、親本igg和igg-接頭1用1單位的生物素化的凝血酶（novagen）在37℃消化1小時(shí)。然后將50μl鏈霉親和素瓊脂糖小珠添加到消化物中以耗盡凝血酶。將消化的igg樣品施加到捕獲瓊脂糖小珠/凝血酶復(fù)合物的柱上。洗脫物包含消化的igg。

maxisorp^?96-孔板(nunc)用1μg/ml的tfpi在pbs中在4℃包被過夜。板在室溫（rt）下在5%脫脂干乳pbs/0.5%tween-20^?(pbs-t)中封閉1小時(shí)。將未消化和消化的親本igg和igg1-接頭1的系列兩倍稀釋添加到孔中（100μl/孔）并在rt孵育1小時(shí)。板在pbs-t中洗滌5次。添加二級hrp綴合的抗fab抗體（100μl，1:10,000稀釋）用于用amplex^?red(invitrogen)溶液檢測。

tfpi結(jié)合elisa的結(jié)果顯示于圖7。顯示了凝血酶消化的igg接頭-1的tfpi結(jié)合的喪失。未消化的igg-接頭1的tfpi結(jié)合與未消化的和凝血酶消化的親本igg的tfpi結(jié)合類似。

實(shí)施例8

親本igg和igg-接頭1的biacore^tm分析

使用胺偶聯(lián)試劑盒(gehealthcare)用低密度人tfpi固定化cm4傳感器芯片。使用不同濃度的抗體進(jìn)行親本igg和igg-接頭1的動(dòng)力學(xué)測定，隨后用ph1.5的甘氨酸緩沖液再生。濃度1μg的親本igg和igg-接頭1抗體用1個(gè)單位的生物素化的凝血酶（novagen）在37℃消化1小時(shí)。將消化或未消化的抗體注射到biacore^tm系統(tǒng)用于tfpi結(jié)合分析。下圖顯示從注射45μl6.25μg/ml抗體或?qū)φ諛悠飞傻男盘?hào)。

在動(dòng)力學(xué)測定中，親本igg和igg2-接頭1分別具有1.536x10⁶/ms和1.902x10⁶/ms的結(jié)合速率（ka）。所述兩種抗體在30分鐘內(nèi)不具有可測量的解離。這表明接頭1的插入不顯著改變所述抗體的結(jié)合活性。

凝血酶切割對抗體的效果顯示于圖8。凝血酶消化略減少親本igg在tfpi上的結(jié)合，而凝血酶消化將igg2-接頭1在tfpi上的結(jié)合從20ru減少到5ru，75%的減少。

實(shí)施例9

蛋白酶/凝血因子處理的igg-接頭1和親本igg的蛋白印跡

使用下列人蛋白酶/凝血因子消化80nm的igg-接頭1和wt抗體：凝血酶(0.1μm)、纖溶酶(0.1μm)、因子viia(0.01μm)、因子ixa(0.089μm)、因子xa(13μm)、因子xia(0.031μm)、因子xiiia(0.03μm)。在4-15%critereon^tmtgx凝膠(bio-rad)上運(yùn)行處理的材料。將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上并用抗人igg抗體(pierce)探測。

人凝血酶、纖溶酶和因子xa消化的igg-接頭1、凝血酶消化最有效（圖9），如通過37kda條帶的外觀所示。蛋白酶不切割親本igg，表明分子量喪失是由于工程改造進(jìn)抗體的切割位點(diǎn)的蛋白酶消化的結(jié)果。

序列表

<110>tbd

<120>蛋白酶調(diào)節(jié)的抗體

<130>012973.01274

<160>180

<170>fastseq用于windowsversion4.0

<210>1

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>1

alahisproargileileserala

15

<210>2

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>2

alaargthrargalaargargpro

15

<210>3

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>3

alaseralaargthrthrglyser

15

<210>4

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>4

alathrproargglyalaalapro

15

<210>5

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>5

alavalvalargthrproprolys

15

<210>6

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>6

gluargthrargserpheglnleu

15

<210>7

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>7

pheglyleuargphetyralatyr

15

<210>8

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>8

pheasnproargthrpheglyser

15

<210>9

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>9

pheargprolyshisthrargile

15

<210>10

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>10

pheseralaargglyhisargpro

15

<210>11

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>11

glyaspileargglyproargile

15

<210>12

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>12

glyglyvalargglyproargval

15

<210>13

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>13

glyserpheargalaglyleuphe

15

<210>14

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>14

hislysglyargseralaleuval

15

<210>15

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>15

ilealaglyargserleuasnpro

15

<210>16

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>16

ileaspglyargilevalglugly

15

<210>17

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>17

ilegluproargserphesergln

15

<210>18

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>18

ilelysproargilevalglygly

15

<210>19

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>19

ileglnileargservalalalys

15

<210>20

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>20

ileglnileargservalalalys

15

<210>21

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>21

lysasnvallysserlysilegly

15

<210>22

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>22

lysprolysaspserservalasp

15

<210>23

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>23

leuaspproargserpheleuleu

15

<210>24

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>24

leuglyileargserpheargasn

15

<210>25

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>25

leuproilelysthrphearggly

15

<210>26

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>26

leuargproargphelysileile

15

<210>27

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>27

leuargproargileileglygly

15

<210>28

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>28

leuserproargglyvalhisile

15

<210>29

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>29

leuserproargthrphehispro

15

<210>30

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>30

metthrproargsergluglyser

15

<210>31

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>31

metthrproargserglyglyser

15

<210>32

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>32

metthrproargserargglyser

15

<210>33

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>33

metvalproargalavaltyrleu

15

<210>34

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>34

asnvalproargileleuserpro

15

<210>35

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>35

proalaproargglytyrprogly

15

<210>36

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>36

proaspleuargsercysvalasn

15

<210>37

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>37

proglyproargglypropropro

15

<210>38

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>38

proglyserargserargthrpro

15

<210>39

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>39

proglnglyargilevalglygly

15

<210>40

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>40

proglnglyargthrthralahis

15

<210>41

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>41

proargserpheleuleuargasn

15

<210>42

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>42

glnserproargserpheglnlys

15

<210>43

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>43

glnserproargserpheglnlys

15

<210>44

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>44

glntyrleuargvalproleuval

15

<210>45

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>45

serglupheargcysleuthrpro

15

<210>46

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>46

serileglyargalaserleuhis

15

<210>47

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>47

serlysglyargserleuilegly

15

<210>48

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>48

serargleuargalatyrleuleu

15

<210>49

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>49

thrcysleuargserthrlysphe

15

<210>50

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>50

valcysleuargserpheglnthr

15

<210>51

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>51

valaspproargleuileaspgly

15

<210>52

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>52

valgluvallysserglulysleu

15

<210>53

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>53

valileprolysargileserpro

15

<210>54

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>54

valileproargserglyglyser

15

<210>55

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>55

valasnproargglyilevalthr

15

<210>56

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>56

valglnproargalaglnlysile

15

<210>57

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>57

valserproargalaseralaser

15

<210>58

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>58

valvalproargglyvalasnleu

15

<210>59

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>59

trptyrleuargserasnasngly

15

<210>60

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>60

trptyrleuargserasnthrgly

15

<210>61

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>61

alaphetrplysthraspalaser

15

<210>62

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>62

ilegluglyargthralathrser

15

<210>63

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>63

thralaalaargglnserthrasn

15

<210>64

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>64

ileaspglyargilevalglugly

15

<210>65

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>65

pheasnproargthrpheglyser

15

<210>66

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>66

argvalprolysserpheprophe

15

<210>67

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>67

proglnleuargmetlysasnasn

15

<210>68

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>68

sersertrpargleuthrserser

15

<210>69

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>69

leuglyileargserpheargasn

15

<210>70

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>70

alametserargmetserleuser

15

<210>71

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>71

alaasnasnargaspasnthrtyr

15

<210>72

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>72

alaasnvalargarglysargtyr

15

<210>73

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>73

alaargglyargalapheprogln

15

<210>74

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>74

alathrleulysserarglysmet

15

<210>75

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>75

alathrglnlyslysvalgluarg

15

<210>76

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>76

alathrtrplysthrargtrptyr

15

<210>77

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>77

aspvalglyglutyrasnvalphe

15

<210>78

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>78

glualaargglyservalileleu

15

<210>79

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>79

glualatyrargargphetyrgly

15

<210>80

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>80

gluaspasnargaspsersermet

15

<210>81

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>81

gluthrleulysvalileaspglu

15

<210>82

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>82

pheargalaargalatyrglyphe

15

<210>83

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>83

glyglualaargglyservalile

15

<210>84

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>84

glyglytyrargalaargproala

15

<210>85

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>85

glyileleulysgluasnalaala

15

<210>86

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>86

glyprolysargglythrglupro

15

<210>87

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>87

ileileargargserileglnile

15

<210>88

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>88

ilethrpheargmetasnvalala

15

<210>89

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>89

lyshisserlysarghisilehis

15

<210>90

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>90

lyslysaspargalaargglnglu

15

<210>91

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>91

lyslysproargcysglyvalpro

15

<210>92

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>92

lysglnvallysaspasngluasn

15

<210>93

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>93

leuaspproargserpheleuleu

15

<210>94

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>94

leuproprolysserglnpropro

15

<210>95

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>95

leuserpheargalaargalatyr

15

<210>96

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>96

metsermetargvalargarghis

15

<210>97

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>97

asnserglyargalavalthrtyr

15

<210>98

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>98

proalaproargglytyrprogly

15

<210>99

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>99

proglualalysalasercystyr

15

<210>100

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>100

progluserlysalathrasnala

15

<210>101

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>101

proglyprolysargglythrglu

15

<210>102

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>102

prolysalalysserhisalapro

15

<210>103

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>103

proleuasplyslysarggluglu

15

<210>104

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>104

proleuglnlysglnleuproala

15

<210>105

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>105

proglnpheargilelysglygly

15

<210>106

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>106

proglnleuargleuprohisthr

15

<210>107

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>107

proglnleuargargglytrparg

15

<210>108

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>108

proglnserargservalpropro

15

<210>109

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>109

proargphelysileileglygly

15

<210>110

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>110

protyrleulysvalpheasnpro

15

<210>111

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>111

glnlysserargasnglyleuarg

15

<210>112

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>112

glnleuilelysalaileglnleu

15

<210>113

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>113

glnargtyrlysvalasptyrglu

15

<210>114

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>114

argalaglnargseralaglyala

15

<210>115

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>115

argglyproargvalvalgluarg

15

<210>116

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>116

argproalalysalaalaalathr

15

<210>117

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>117

argarglysargtyralailegln

15

<210>118

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>118

argserserlysglyargserleu

15

<210>119

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>119

argserthrargphealaalathr

15

<210>120

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>120

sercysasplysthrhisthrcys

15

<210>121

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>121

serileasnlysserserproleu

15

<210>122

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>122

serglnproproglulysthrglu

15

<210>123

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>123

serglnarglyshisserlysarg

15

<210>124

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>124

sersermetlysleuserphearg

15

<210>125

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>125

thrgluprolysvallysleupro

15

<210>126

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>126

thrglutyrargleuvalserile

15

<210>127

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>127

thrhisglulysglyargglnser

15

<210>128

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>128

thrtyrserlysalaserthrpro

15

<210>129

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>129

thrtyrserargserargtyrleu

15

<210>130

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>130

valserasnlysvalsermetser

15

<210>131

<211>228

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>fab-1輕鏈

<400>131

sertyrgluleuthrglnproproservalservalserproglygln

151015

thralaargilethrcysserglyaspasnleuprolystyrtyrala

202530

histrptyrglnglnlysproglyglnalaprovalvalvalilephe

354045

tyraspvalasnargproserglyileprogluargpheserglyser

505560

asnserglyasnthralathrleuthrileserglythrglnalamet

65707580

aspglualaasptyrtyrcysglnalatrptrpserserthrproval

859095

pheglyglyglythrlysleuthrvalleuglyglyglyglyserleu

100105110

valproargglyserglyglyglyglyserglyglnprolysalaala

115120125

proservalthrleupheproproserserglugluleuglnalaasn

130135140

lysalathrleuvalcysleuileseraspphetyrproglyalaval

145150155160

thrvalalatrplysalaaspserserprovallysalaglyvalglu

165170175

thrthrthrproserlysglnserasnasnlystyralaalaserser

180185190

tyrleuserleuthrprogluglntrplysserhisargsertyrser

195200205

cysglnvalthrhisgluglyserthrvalglulysthrvalalapro

210215220

thrglucysser

225

<210>132

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)和接頭

<400>132

glyglyglyglyserleuvalproargglyserglyglyglyglyser

151015

<210>133

<211>245

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>fab-1重鏈

<400>133

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr

202530

glymetasptrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

serserileargglyserargglyserthrtyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargleutyrargtyrtrppheasptyrtrpglyglnglythrleu

100105110

valthrvalserserglyglyglyglyserleuvalproargglyser

115120125

glyglyglyglyseralaserthrlysglyproservalpheproleu

130135140

alaprocysserargserthrsergluserthralaalaleuglycys

145150155160

leuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnser

165170175

glyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnser

180185190

serglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserserasn

195200205

pheglythrglnthrtyrthrcysasnvalasphislysproserasn

210215220

thrlysvalasplysthrvalasptyrlysaspaspaspasplyshis

225230235240

hishishishishis

245

<210>134

<211>1590

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>編碼fab-1的序列

<400>134

ggtctcacatgaaaaaaaccgctatcgctatcgccgtcgcactggctggcttcgcaaccg60

tggcacaggcatcctatgaactgacccaaccgccgagtgtctccgtgtcaccgggtcaga120

cggcacgtattacctgcagcggtgataacctgccgaaatattacgcgcattggtatcagc180

aaaaaccgggccaagccccggtggttgtcatcttttatgacgttaatcgtccgtccggta240

tcccggaacgcttctcgggcagcaactctggtaatacggcaaccctgacgatcagcggca300

cccaggcaatggatgaagctgactattactgtcaagcatggtggagctctacgccggtgt360

ttggcggtggcacgaaactgaccgtgctgggtggcggtggctctctggttccgcgtggct420

ccggtggcggtggctcaggccagccgaaagcagcaccgagtgttaccctgtttccgccga480

gttccgaagaactgcaagcaaacaaagctaccctggtgtgcctgattagcgatttctatc540

cgggcgcagttacggtcgcgtggaaagccgactcatcgccggtgaaagctggtgttgaaa600

ccacgaccccgtcaaaacagtcgaacaataaatatgcagctagctcttacctgtctctga660

ccccggaacagtggaaaagtcatcgcagttactcctgtcaagttacgcacgaaggctcca720

cggtcgaaaaaaccgtggcaccgacggaatgctcatgataagcatgcgtaggagaaaata780

aaatgaaacagtctaccatcgcactggcactgctgccgctgctgtttacgccggtgacca840

aagcagaagttcagctggtcgaaagtggtggcggtctggttcaaccgggcggttcactgc900

gtctgtcgtgcgcagcaagcggttttaccttcagttcctatggtatggattgggtccgtc960

aggcaccgggtaaaggtctggaatgggtgtcatcgattcgtggcagccgcggttctacct1020

attacgccgattcagttaaaggccgttttaccatctctcgcgacaacagtaaaaatacgc1080

tgtatctgcagatgaacagcctgcgcgcggaagataccgccgtgtattactgtgcccgtc1140

tgtatcgctactggttcgactactggggccagggtacgctggtgaccgttagctctggcg1200

gtggcggttcgctggtcccgcgtggcagcggcggtggcggttcagcgagcaccaaaggtc1260

cgagcgtgtttccgctggcaccgtgcagccgctctaccagtgaatccacggcagctctgg1320

gttgtctggtgaaagattattttccggaaccggtcaccgtgagttggaactccggcgcac1380

tgacctcgggtgttcatacgttcccggctgtcctgcagagttccggcctgtatagcctgt1440

catcggtggttaccgttccgagctctaatttcggcacccaaacgtacacctgcaacgtcg1500

atcacaaaccgtctaataccaaagttgacaaaacggttgattacaaagacgacgacgaca1560

aacaccaccaccaccaccattgataagctt1590

<210>135

<211>218

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>fab-2輕鏈

<400>135

sertyrgluleuthrglnproproservalservalserproglygln

151015

thralaargilethrcysserglyaspasnleuprolystyrtyrala

202530

histrptyrglnglnlysproglyglnalaprovalvalvalilephe

354045

tyraspvalasnargproserglyileprogluargpheserglyser

505560

asnserglyasnthralathrleuthrileserglythrglnalamet

65707580

aspglualaasptyrtyrcysglnalatrptrpserserthrproval

859095

pheglyglyglythrlysleuthrvalleuleuvalproargglyser

100105110

glyglnprolysalaalaproservalthrleupheproproserser

115120125

glugluleuglnalaasnlysalathrleuvalcysleuileserasp

130135140

phetyrproglyalavalthrvalalatrplysalaaspserserpro

145150155160

vallysalaglyvalgluthrthrthrproserlysglnserasnasn

165170175

lystyralaalasersertyrleuserleuthrprogluglntrplys

180185190

serhisargsertyrsercysglnvalthrhisgluglyserthrval

195200205

glulysthrvalalaprothrglucysser

210215

<210>136

<211>235

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>fab-2重鏈

<400>136

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr

202530

glymetasptrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

serserileargglyserargglyserthrtyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargleutyrargtyrtrppheasptyrtrpglyglnglythrleu

100105110

valthrvalserserleuvalproargglyseralaserthrlysgly

115120125

proservalpheproleualaprocysserargserthrsergluser

130135140

thralaalaleuglycysleuvallysasptyrpheprogluproval

145150155160

thrvalsertrpasnserglyalaleuthrserglyvalhisthrphe

165170175

proalavalleuglnserserglyleutyrserleuserservalval

180185190

thrvalproserserasnpheglythrglnthrtyrthrcysasnval

195200205

asphislysproserasnthrlysvalasplysthrvalasptyrlys

210215220

aspaspaspasplyshishishishishishis

225230235

<210>137

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位點(diǎn)

<400>137

leuvalproargglyser

15

<210>138

<211>1530

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>fab-2編碼序列

<400>138

ggtctcacatgaaaaaaacggctatcgcaatcgctgtggcactggcaggcttcgcaacgg60

tcgcgcaggcatcctatgaactgacgcaaccgccgagtgtctccgtgtcaccgggtcaga120

cggcacgtattacctgctctggtgataacctgccgaaatattacgcgcattggtatcagc180

aaaaaccgggccaagccccggtggttgtcatcttttatgacgttaatcgtccgtcgggta240

tcccggaacgcttctcgggcagcaactctggtaatacggccaccctgacgatctcaggca300

cccaggcaatggatgaagctgactattactgccaagcatggtggagctctacgccggtgt360

ttggcggtggcacgaaactgaccgttctgctggtcccgcgtggctccggtcagccgaaag420

cagccccgtcagttaccctgtttccgccgagttccgaagaactgcaagcaaacaaagcta480

ccctggtgtgtctgattagcgatttctatccgggcgcagttacggtcgcgtggaaagccg540

actcatcgccggtcaaagctggtgtggaaaccaccaccccgtcaaaacagtcgaacaata600

aatatgcagctagctcttacctgtcgctgaccccggaacagtggaaaagccatcgcagtt660

actcctgccaagttacgcacgaaggctctacggttgaaaaaaccgtcgcaccgacggaat720

gcagttgataagcatgcgtaggagaaaataaaatgaaacagagcaccatcgcactggcac780

tgctgccgctgctgtttacgccggtcaccaaagcagaagtgcagctggttgaatctggtg840

gcggtctggtgcaaccgggcggttcactgcgtctgtcgtgtgcggccagcggctttacct900

tcagttcctatggtatggattgggtccgtcaggcaccgggtaaaggtctggaatgggtgt960

catcgattcgtggcagccgcggttctacctattacgccgattccgttaaaggccgtttca1020

ccatctctcgcgacaacagtaaaaatacgctgtatctgcagatgaacagtctgcgcgcgg1080

aagataccgccgtgtattactgcgcccgtctgtatcgctactggtttgactactggggcc1140

agggtacgctggtgaccgttagctctctggttccgcgtggctcagcgagcaccaaaggtc1200

cgagtgtcttcccgctggcaccgtgcagccgctctaccagtgaatccacggcagctctgg1260

gttgtctggtgaaagattattttccggaaccggtcaccgtgagttggaactccggcgcac1320

tgacctccggtgtgcatacgttcccggctgttctgcagagttccggcctgtattcactgt1380

catcggtggttaccgtgccgagctctaattttggcacccaaacgtacacctgtaacgttg1440

atcacaaaccgagcaataccaaagttgacaaaaccgttgactacaaagacgacgacgaca1500

aacaccaccaccaccaccactgataagctt1530

<210>139

<211>228

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>igg2-接頭1,輕鏈氨基酸序列

<400>139

sertyrgluleuthrglnproproservalservalserproglygln

151015

thralaargilethrcysserglyaspasnleuprolystyrtyrala

202530

histrptyrglnglnlysproglyglnalaprovalvalvalilephe

354045

tyraspvalasnargproserglyileprogluargpheserglyser

505560

asnserglyasnthralathrleuthrileserglythrglnalamet

65707580

aspglualaasptyrtyrcysglnalatrptrpserserthrproval

859095

pheglyglyglythrlysleuthrvalleuglyglyglyglyserleu

100105110

valproargglyserglyglyglyglyserglyglnprolysalaala

115120125

proservalthrleupheproproserserglugluleuglnalaasn

130135140

lysalathrleuvalcysleuileseraspphetyrproglyalaval

145150155160

thrvalalatrplysalaaspserserprovallysalaglyvalglu

165170175

thrthrthrproserlysglnserasnasnlystyralaalaserser

180185190

tyrleuserleuthrprogluglntrplysserhisargsertyrser

195200205

cysglnvalthrhisgluglyserthrvalglulysthrvalalapro

210215220

thrglucysser

225

<210>140

<211>458

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>igg2-接頭1,重鏈氨基酸序列

<400>140

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr

202530

glymetasptrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

serserileargglyserargglyserthrtyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargleutyrargtyrtrppheasptyrtrpglyglnglythrleu

100105110

valthrvalserseralaserglyglyglyglyserleuvalproarg

115120125

glyserglyglyglyglyserthrlysglyproservalpheproleu

130135140

alaprocysserargserthrsergluserthralaalaleuglycys

145150155160

leuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnser

165170175

glyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnser

180185190

serglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserserasn

195200205

pheglythrglnthrtyrthrcysasnvalasphislysproserasn

210215220

thrlysvalasplysthrvalgluarglyscyscysvalglucyspro

225230235240

procysproalaproprovalalaglyproservalpheleuphepro

245250255

prolysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthr

260265270

cysvalvalvalaspvalserhisgluaspprogluvalglnpheasn

275280285

trptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarg

290295300

glugluglnpheasnserthrpheargvalvalservalleuthrval

305310315320

valhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalser

325330335

asnlysglyleuproalaproileglulysthrileserlysthrlys

340345350

glyglnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserargglu

355360365

glumetthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphe

370375380

tyrproseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnproglu

385390395400

asnasntyrlysthrthrproprometleuaspseraspglyserphe

405410415

pheleutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglngly

420425430

asnvalphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyr

435440445

thrglnlysserleuserleuserprogly

450455

<210>141

<211>684

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>igg2-接頭1，輕鏈dna序列

<400>141

tcctacgagctgacccagcccccttccgtgtccgtgtctcctggccagaccgcccggatc60

acctgttccggcgacaacctgcccaagtactacgcccactggtatcagcagaagcccggc120

caggcccccgtggtggtcatcttctacgacgtgaaccggccctccggcatccccgagaga180

ttctccggctccaactccggcaacaccgccaccctgaccatctccggcacccaggccatg240

gacgaggccgactactactgccaggcttggtggtcctccacccccgtgtttggcggcgga300

acaaagttaaccgtgctgggcggtggaggatcactggttccgcgtggctctggcggtgga360

ggatcaggccagcccaaggccgctccttccgtgaccctgttccccccatcctccgaggaa420

ctgcaggccaacaaggccaccctggtctgcctgatctccgacttctaccctggcgccgtg480

accgtggcctggaaggccgacagctctcctgtgaaggccggcgtggaaaccaccaccccc540

tccaagcagtccaacaacaaatacgccgcctcctcctacctgtccctgacccccgagcag600

tggaagtcccaccggtcctacagctgccaggtcacacacgagggctccaccgtggaaaag660

acagtggcccccaccgagtgctct684

<210>142

<211>1374

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>igg2-接頭1,重鏈dna序列

<400>142

gaggtgcagctggtggaatccggcggaggcctggtccagcctggcggatctctgagactg60

tcctgcgccgcctccggcttcaccttctccagctacggcatggactgggtccgacaggcc120

cctggcaagggcctggaatgggtgtcctccatccggggctctcggggctccacctactac180

gccgactccgtgaagggccggttcaccatctcccgggacaactccaagaacaccctgtac240

ctgcagatgaactccctgcgggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccagactgtac300

cggtattggttcgactactggggccagggcaccctggtcaccgtcagctcagcttctggc360

ggaggcggctctctggtgcctagaggatctggcggcggaggctccaccaagggcccttcc420

gtgttccctctggccccttgctcccggtccacctccgagtctaccgccgctctgggctgc480

ctggtcaaggattacttccccgagcccgtgaccgtgtcctggaactctggcgccctgacc540

agcggcgtgcacaccttccctgccgtgctgcagtcctccggcctgtactccctgtcctcc600

gtcgtgacagtgccctcctccaacttcggcacccagacctacacctgtaacgtggaccac660

aagccctccaacaccaaggtggacaagaccgtggaacggaagtgctgcgtggaatgcccc720

ccctgtcctgcacctcctgtggctggacctagcgtgttcctgttccccccaaagcccaag780

gacaccctgatgatctcccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccac840

gaggaccccgaggtgcagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaag900

accaagcccagagaggaacagttcaactccaccttccgggtggtgtccgtgctgaccgtg960

gtgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtctccaacaagggcctg1020

cctgcccccatcgaaaagaccatcagcaagaccaagggccagccccgcgagccccaggtg1080

tacacactgccacctagccgggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctg1140

gtcaagggcttctacccatccgacattgccgtggaatgggagtccaacggccagcccgag1200

aacaactacaagaccaccccccccatgctggactccgacggctcattcttcctgtactcc1260

aagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatg1320

cacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagccccggc1374

<210>143

<211>218

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>igg2-接頭2,輕鏈氨基酸序列

<400>143

sertyrgluleuthrglnproproservalservalserproglygln

151015

thralaargilethrcysserglyaspasnleuprolystyrtyrala

202530

histrptyrglnglnlysproglyglnalaprovalvalvalilephe

354045

tyraspvalasnargproserglyileprogluargpheserglyser

505560

asnserglyasnthralathrleuthrileserglythrglnalamet

65707580

aspglualaasptyrtyrcysglnalatrptrpserserthrproval

859095

pheglyglyglythrlysleuthrvalleuleuvalproargglyser

100105110

glyglnprolysalaalaproservalthrleupheproproserser

115120125

glugluleuglnalaasnlysalathrleuvalcysleuileserasp

130135140

phetyrproglyalavalthrvalalatrplysalaaspserserpro

145150155160

vallysalaglyvalgluthrthrthrproserlysglnserasnasn

165170175

lystyralaalasersertyrleuserleuthrprogluglntrplys

180185190

serhisargsertyrsercysglnvalthrhisgluglyserthrval

195200205

glulysthrvalalaprothrglucysser

210215

<210>144

<211>448

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>igg2-接頭2,重鏈氨基酸序列

<400>144

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr

202530

glymetasptrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

serserileargglyserargglyserthrtyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargleutyrargtyrtrppheasptyrtrpglyglnglythrleu

100105110

valthrvalserseralaserleuvalproargglyserthrlysgly

115120125

proservalpheproleualaprocysserargserthrsergluser

130135140

thralaalaleuglycysleuvallysasptyrpheprogluproval

145150155160

thrvalsertrpasnserglyalaleuthrserglyvalhisthrphe

165170175

proalavalleuglnserserglyleutyrserleuserservalval

180185190

thrvalproserserasnpheglythrglnthrtyrthrcysasnval

195200205

asphislysproserasnthrlysvalasplysthrvalgluarglys

210215220

cyscysvalglucysproprocysproalaproprovalalaglypro

225230235240

servalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileser

245250255

argthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluasp

260265270

progluvalglnpheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasn

275280285

alalysthrlysproargglugluglnpheasnserthrpheargval

290295300

valservalleuthrvalvalhisglnasptrpleuasnglylysglu

305310315320

tyrlyscyslysvalserasnlysglyleuproalaproileglulys

325330335

thrileserlysthrlysglyglnproarggluproglnvaltyrthr

340345350

leuproproserarggluglumetthrlysasnglnvalserleuthr

355360365

cysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpglu

370375380

serasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprometleu

385390395400

aspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplys

405410415

serargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisglu

420425430

alaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserprogly

435440445

<210>145

<211>654

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>igg2-接頭2，輕鏈dna序列

<400>145

tcctacgagctgacccagcccccttccgtgtccgtgtctcctggccagaccgcccggatc60

acctgttccggcgacaacctgcccaagtactacgcccactggtatcagcagaagcccggc120

caggcccccgtggtggtcatcttctacgacgtgaaccggccctccggcatccccgagaga180

ttctccggctccaactccggcaacaccgccaccctgaccatctccggcacccaggccatg240

gacgaggccgactactactgccaggcttggtggtcctccacccccgtgtttggcggcgga300

acaaagttaaccgtgctgctggttccgcgtggctctggccagcccaaggccgctccttcc360

gtgaccctgttccccccatcctccgaggaactgcaggccaacaaggccaccctggtctgc420

ctgatctccgacttctaccctggcgccgtgaccgtggcctggaaggccgacagctctcct480

gtgaaggccggcgtggaaaccaccaccccctccaagcagtccaacaacaaatacgccgcc540

tcctcctacctgtccctgacccccgagcagtggaagtcccaccggtcctacagctgccag600

gtcacacacgagggctccaccgtggaaaagacagtggcccccaccgagtgctct654

<210>146

<211>1344

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>igg2-接頭2,重鏈dna序列

<400>146

gaggtgcagctggtggaatccggcggaggcctggtccagcctggcggatctctgagactg60

tcctgcgccgcctccggcttcaccttctccagctacggcatggactgggtccgacaggcc120

cctggcaagggcctggaatgggtgtcctccatccggggctctcggggctccacctactac180

gccgactccgtgaagggccggttcaccatctcccgggacaactccaagaacaccctgtac240

ctgcagatgaactccctgcgggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccagactgtac300

cggtattggttcgactactggggccagggcaccctggtcaccgtcagctcagcttctctg360

gtgcctagaggatctaccaagggcccttccgtgttccctctggccccttgctcccggtcc420

acctccgagtctaccgccgctctgggctgcctggtcaaggattacttccccgagcccgtg480

accgtgtcctggaactctggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttccctgccgtgctg540

cagtcctccggcctgtactccctgtcctccgtcgtgacagtgccctcctccaacttcggc600

acccagacctacacctgtaacgtggaccacaagccctccaacaccaaggtggacaagacc660

gtggaacggaagtgctgcgtggaatgccccccctgtcctgcacctcctgtggctggacct720

agcgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccccgaa780

gtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccacgaggaccccgaggtgcagttcaattggtac840

gtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaactcc900

accttccgggtggtgtccgtgctgaccgtggtgcaccaggactggctgaacggcaaagag960

tacaagtgcaaggtctccaacaagggcctgcctgcccccatcgaaaagaccatcagcaag1020

accaagggccagccccgcgagccccaggtgtacacactgccacctagccgggaagagatg1080

accaagaaccaggtgtccctgacctgtctggtcaagggcttctacccatccgacattgcc1140

gtggaatgggagtccaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccccatgctg1200

gactccgacggctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggcag1260

cagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccag1320

aagtccctgtccctgagccccggc1344

<210>147

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>凝血酶切割位點(diǎn)

<221>變體

<222>(1)...(2)

<223>xaa=疏水氨基酸

<221>變體

<222>(5)...(6)

<223>xaa=非酸性氨基酸

<400>147

xaaxaaproargxaaxaa

15

<210>148

<211>4

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>因子xa切割位點(diǎn)

<221>變體

<222>(2)...(2)

<223>xaa=glu或asp

<400>148

ilexaaglyarg

1

<210>149

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接頭

<400>149

glyglyglyglyser

15

<210>150

<211>58

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>seqidno:133的氨基酸95-152

<400>150

tyrcysalaargleutyrargtyrtrppheasptyrtrpglyglngly

151015

thrleuvalthrvalserseralaserglyserglyglyglyleuval

202530

proargglyserglyglyglyglyserthrlysglyproservalphe

354045

proleualaprocysserargserthrser

5055

<210>151

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接頭

<400>151

alalysthrthrprolysleuglugluglyglupheserglualaarg

151015

<210>152

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接頭

<400>152

alalysthrthrprolysleuglugluglyglupheserglualaarg

151015

val

<210>153

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接頭

<400>153

alalysthrthrprolysleuglygly

15

<210>154

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接頭

<400>154

seralalysthrthrprolysleuglygly

1510

<210>155

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接頭

<400>155

seralalysthrthrpro

15

<210>156

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接頭

<400>156

argalaaspalaalapro

15

<210>157

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接頭

<400>157

argalaaspalaalaprothrvalser

15

<210>158

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接頭

<400>158

argalaaspalaalaalaalaglyglyproglyser

1510

<210>159

<211>27

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接頭

<400>159

argalaaspalaalaalaalaglyglyglyglyserglyglyglygly

151015

serglyglyglyglyserglyglyglyglyser

2025

<210>160

<211>18

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接頭

<400>160

seralalysthrthrprolysleuglugluglygluphesergluala

151015

argval

<210>161

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接頭

<400>161

alaaspalaalapro

15

<210>162

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接頭

<400>162

alaaspalaalaprothrvalserilephepropro

1510

<210>163

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接頭

<400>163

thrvalalaalapro

15

<210>164

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接頭

<400>164

thrvalalaalaproservalpheilephepropro

1510

<210>165

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接頭

<400>165

glnprolysalaalapro

15

<210>166

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接頭

<400>166

glnprolysalaalaproservalthrleuphepropro

1510

<210>167

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接頭

<400>167

alalysthrthrpropro

15

<210>168

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接頭

<400>168

alalysthrthrproproservalthrproleualapro

1510

<210>169

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接頭

<400>169

alalysthrthralapro

15

<210>170

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接頭

<400>170

alalysthrthralaproservaltyrproleualapro

1510

<210>171

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接頭

<400>171

alaserthrlysglypro

15

<210>172

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接頭

<400>172

alaserthrlysglyproservalpheproleualapro

1510

<210>173

<211>15

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接頭

<400>173

glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyser

151015

<210>174

<211>15

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接頭

<400>174

glygluasnlysvalglutyralaproalaleumetalaleuser

151015

<210>175

<211>15

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接頭

<400>175

glyproalalysgluleuthrproleulysglualalysvalser

151015

<210>176

<211>15

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接頭

<400>176

glyhisglualaalaalavalmetglnvalglntyrproalaser

151015

<210>177

<211>442

<212>prt

<213>智人

<400>177

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr

202530

glymetasptrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

serserileargglyserargglyserthrtyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargleutyrargtyrtrppheasptyrtrpglyglnglythrleu

100105110

valthrvalserseralaserthrlysglyproservalpheproleu

115120125

alaprocysserargserthrsergluserthralaalaleuglycys

130135140

leuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnser

145150155160

glyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnser

165170175

serglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserserasn

180185190

pheglythrglnthrtyrthrcysasnvalasphislysproserasn

195200205

thrlysvalasplysthrvalgluarglyscyscysvalglucyspro

210215220

procysproalaproprovalalaglyproservalpheleuphepro

225230235240

prolysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthr

245250255

cysvalvalvalaspvalserhisgluaspprogluvalglnpheasn

260265270

trptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarg

275280285

glugluglnpheasnserthrpheargvalvalservalleuthrval

290295300

valhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalser

305310315320

asnlysglyleuproalaproileglulysthrileserlysthrlys

325330335

glyglnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserargglu

340345350

glumetthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphe

355360365

tyrproseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnproglu

370375380

asnasntyrlysthrthrproprometleuaspseraspglyserphe

385390395400

pheleutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglngly

405410415

asnvalphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyr

420425430

thrglnlysserleuserleuserprogly

435440

<210>178

<211>212

<212>prt

<213>智人

<400>178

sertyrgluleuthrglnproproservalservalserproglygln

151015

thralaargilethrcysserglyaspasnleuprolystyrtyrala

202530

histrptyrglnglnlysproglyglnalaprovalvalvalilephe

354045

tyraspvalasnargproserglyileprogluargpheserglyser

505560

asnserglyasnthralathrleuthrileserglythrglnalamet

65707580

aspglualaasptyrtyrcysglnalatrptrpserserthrproval

859095

pheglyglyglythrlysleuthrvalleuglyglnprolysalaala

100105110

proservalthrleupheproproserserglugluleuglnalaasn

115120125

lysalathrleuvalcysleuileseraspphetyrproglyalaval

130135140

thrvalalatrplysalaaspserserprovallysalaglyvalglu

145150155160

thrthrthrproserlysglnserasnasnlystyralaalaserser

165170175

tyrleuserleuthrprogluglntrplysserhisargsertyrser

180185190

cysglnvalthrhisgluglyserthrvalglulysthrvalalapro

195200205

thrglucysser

210

<210>179

<211>239

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶可切割的抗tfpiscfv抗體

<400>179

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr

202530

glymetasptrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

serserileargglyserargglyserthrtyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargleutyrargtyrtrppheasptyrtrpglyglnglythrleu

100105110

valthrvalserserglyglyglyglyserleuvalproargglyser

115120125

glyglyglyglysersertyrgluleuthrglnproproservalser

130135140

valserproglyglnthralaargilethrcysserglyaspasnleu

145150155160

prolystyrtyralahistrptyrglnglnlysproglyglnalapro

165170175

valvalvalilephetyraspvalasnargproserglyileproglu

180185190

argpheserglyserasnserglyasnthralathrleuthrileser

195200205

glythrglnalametaspglualaasptyrtyrcysglnalatrptrp

210215220

serserthrprovalpheglyglyglythrlysleuthrvalleu

225230235

<210>180

<211>717

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶可切割的抗tfpiscfv抗體編碼序列

<400>180

gaagttcagctggtcgaaagtggtggcggtctggttcaaccgggcggttcactgcgtctg60

tcgtgcgcagcaagcggttttaccttcagttcctatggtatggattgggtccgtcaggca120

ccgggtaaaggtctggaatgggtgtcatcgattcgtggcagccgcggttctacctattac180

gccgattcagttaaaggccgttttaccatctctcgcgacaacagtaaaaatacgctgtat240

ctgcagatgaacagcctgcgcgcggaagataccgccgtgtattactgtgcccgtctgtat300

cgctactggttcgactactggggccagggtacgctggtgaccgttagctctggtggcggt360

ggctctctggttccgcgtggctccggtggcggtggctcatcctatgaactgacccaaccg420

ccgagtgtctccgtgtcaccgggtcagacggcacgtattacctgcagcggtgataacctg480

ccgaaatattacgcgcattggtatcagcaaaaaccgggccaagccccggtggttgtcatc540

ttttatgacgttaatcgtccgtccggtatcccggaacgcttctcgggcagcaactctggt600

aatacggcaaccctgacgatcagcggcacccaggcaatggatgaagctgactattactgt660

caagcatggtggagctctacgccggtgtttggcggtggcacgaaactgaccgtgctg717