專利名稱：大竹蟶糜蛋白酶基因SgChy及其重組蛋白的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學技術領域，具體講是從大竹蟶cDNA文庫中獲得一種糜蛋白酶基因SgChy的全長cDNA序列，對其結(jié)構域進行了重組表達，并分析了該重組產(chǎn)物的糜蛋白酶活性。
背景技術：
絲氨酸蛋白酶(serineprotease)家族包括諸多成員，它們參與消化、凝血、免疫反應、信號轉(zhuǎn)導、激素激活和發(fā)育等過程。糜蛋白酶(chymotrypsin)是絲氨酸蛋白酶中的一種，能切斷蛋白質(zhì)肽鏈中酪氨酸和苯丙氨酸的羧端肽鏈，從而有效酶解蛋白質(zhì)，在蛋白消化中發(fā)揮著重要的作用。糜蛋白酶在現(xiàn)存物種中廣泛存在。目前為止，糜蛋白酶的研究主要集中在哺乳動物中，近年來，陸續(xù)出現(xiàn)了有關魚類和海洋無脊椎動物中糜蛋白酶的研究·報道，研究者從草魚、鯽魚和凡納濱對蝦、扇貝的消化腺，鯉魚的胰腺，鱈魚和虹鱒的幽門和以及鍉魚內(nèi)臟團中分離鑒定出糜蛋白酶，其中對于海洋脊椎動物尤其是海洋魚類糜蛋白酶的研究報道較多，而在海洋無脊椎動物中相關研究比較少，未見關于大竹蟶糜蛋白酶的報道。本發(fā)明對于大竹蟶糜蛋白酶基因的克隆、編碼蛋白的重組以及重組蛋白的酶活性分析，填補了大竹蟶糜蛋白酶研究領域的空白。糜蛋白酶作為一種能分解變性蛋白質(zhì)的蛋白水解酶，具有重要的藥用價值。糜蛋白酶能清創(chuàng)消腫和去除壞死組織的作用，在對于各種炎癥、炎性水腫、血腫、潰瘍及血栓等有較好的療效，可用于創(chuàng)傷或手術后傷口愈合、抗炎、防止局部水腫、積血等；同時，還能促進抗癌藥物向病灶滲透，具有一定的抗癌增效作用，可在局部大劑量使用，治療乳腺癌、宮頸癌和胃癌等多種腫瘤，無任何毒副作用或不良反應。目前國內(nèi)獲得糜蛋白酶多采用從牛胰或豬胰中經(jīng)多重結(jié)晶結(jié)合透析法提取，該方法復雜、耗時長、純化能力弱。本發(fā)明克隆了新的大竹蟶糜蛋白酶基因，對其編碼的蛋白進行了重組表達，獲得了具有酶活性的重組蛋白，為生產(chǎn)糜蛋白酶提供了新思路，也為開發(fā)新的天然海洋藥物奠定了理論基礎。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是要填補有關大竹蟶糜蛋白酶研究的空白，克隆大竹蟶糜蛋白酶基因，對其結(jié)構域進行體外重組并分析其重組蛋白的活性，為開發(fā)天然的海洋藥物奠定基礎。本發(fā)明的目的是由以下技術方案實現(xiàn)的克隆得到了一種大竹蟶糜蛋白酶基因，該基因具有SEQ ID No 1中的核苷酸序列，該序列全長1186bp，5’非編碼區(qū)262bp，3’非編碼區(qū)186bp，有多聚腺苷酸尾巴，開放閱讀框738bp，編碼245個氨基酸；氨基酸序列如SEQID No :2中所示，成熟肽分子量為27. 11^&，等電點為6.08 ;無信號肽，具有I個保守的TrypSPc結(jié)構域。該基因編碼蛋白的重組產(chǎn)物具有糜蛋白酶活性。一種克隆大竹蟶糜蛋白酶基因SgChy并制備其重組蛋白的方法，所述的方法是從構建的大竹蟶cDNA文庫中，利用現(xiàn)代分子生物學技術分析得到糜蛋白酶基因的EST序列，將對應的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后測序得到基因cDNA全長，以原核表達的方法構建其重組質(zhì)粒，誘導表達重組蛋白，重組蛋白經(jīng)純化和復性后檢測其糜蛋白酶活性。本發(fā)明的優(yōu)點克隆了一種大竹蟶糜蛋白酶基因SgChy的cDNA全長，該基因具有SEQ ID No :1中的堿基序列，體外重組了該基因的編碼蛋白，其具有SEQ ID No :2中的氨基酸序列，該重組蛋白具有糜蛋白酶活性。該基因及其重組蛋白活性的研究，對于研制天然海洋消炎和抗癌藥物具有潛在的應用價值。本發(fā)明的實施例結(jié)合實驗及說明書核苷酸序列表進一步說明如下SEQ ID No : I為大竹蟶糜蛋白酶SgChy基因的核苷酸序列。SEQ ID No 2為大竹蟶糜蛋白酶SgChy基因編碼蛋白的氨基酸序列。
具體實施例方式本發(fā)明的大竹蟶糜蛋白酶SgChy基因具有SEQ ID No 1的堿基序列，其編碼蛋白具有SEQ ID No :2的氨基酸序列，該重組蛋白具有糜蛋白酶活性。本發(fā)明的SgChy的基因克隆及其蛋白重組方法如下實施例I :所述的SgChy的基因克隆方法(I)大竹経cDNA文庫的構建利用Trizol(Invitrogen)試劑從大竹経混合組織中提取總 RNA,根據(jù) ZAP-cDNA.⑧ Synthesis kit 及 ZAP-cDNA Gigapack III Gold CloningKit (Stratagene)試劑盒的使用說明書純化RNA,通過合成第一鏈、第二鏈,加接頭，Xho I限制酶消化，獲得兩端具有不同粘性末端的完全單向cDNA。將該片段插入Uni-ZAP XRVector (lambda phage)。經(jīng)包裝,滴度測定和擴增，利用 Exassist Helper Phage 和 SOLR菌株從Uni-ZAP XR Vector上體外切割pBluescript⑧噬菌粒，大規(guī)模提取質(zhì)粒DNA進行測序。(2)序列分析與目的基因EST序列的獲得獲得的EST數(shù)據(jù)用Phrap軟件聚類拼接，生成拼接而成的Contigs和未參與拼接的Singletons。將所獲的Contigs與Singletons分別進行BLASTn和BLASTx分析。對由BLASTn和BLASTx得到的結(jié)果，根據(jù)相似性序列的功能分別將Contigs和Singletons做功能分類,通過序列比對查找所需目的基因的EST序列。(3)根據(jù)⑵步獲得的EST序列，轉(zhuǎn)化⑴步得到的對應質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞DH5 a (Transgen)中，培養(yǎng)后挑取選擇陽性克隆，以引物Ml3_F (GTAAAACGACGGCCAG)和M13-R(CAGGAAACAGCTATGACC)對其進行序列測定，獲得目的基因的cDNA全長。SEQ ID No : I為大竹蟶糜蛋白酶SgChy基因的核苷酸序列。SEQ ID No 2為大竹蟶糜蛋白酶SgChy基因編碼蛋白的氨基酸序列。實施例2:大竹蟶糜蛋白酶SgChy基因的體外重組表達(I)利用 PCR 技術，以重組引物 ATGAGATCCATTAATGTCAAGTTGC 和CAGAAGCATGACTTCTTCATCAGAG克隆SgChy的編碼區(qū)成熟肽，反應條件為94 °C預變性5min ;94°C變性30s，60°C退火30s，72 °C延伸60s，進行35個循環(huán)；最后72 °C延伸IOmin0以I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，用膠回收試劑盒(TaKaRa)進行PCR產(chǎn)物的回收和純化，克隆入帶有His標簽的pEASY-El表達載體(Transgen),再轉(zhuǎn)化入Transl-Tlphage resistant感受態(tài)細胞(Transgen)中，LB培養(yǎng)基平板培養(yǎng)后,挑取菌落，以 T7 (TAATACGACTCACTATAGGG)和 CAGAAGCATGACTTCTTCATCAGAG 分別作為正向和反向引物篩選，選取陽性克隆進行序列測定。以質(zhì)粒提取試劑盒(Promega)提取測序正確克隆的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3) -Transetta (Transgen)中，選取陽性克隆在氨節(jié)濃度為50mg/ml的LB液體培養(yǎng)基中220rpm振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37°C。當培養(yǎng)液濃度達到0D600為O. 5-0. 7時，加入終濃度為lmmol/L的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)4h。取Iml菌液離心，棄去上清后，加入100 μ I蛋白上樣緩沖液，100°C煮沸l(wèi)Omin，稍離心，棄去上清后，以SDS-PAGE檢測表達產(chǎn)物。剩余菌液離心后，利用His-tag融合蛋白純化試劑盒MagExtractor His-TagNPK-700 (TOYOBO)，按照操作步驟純化蛋白。(2)將(I)步中得到的純化蛋白經(jīng)含2mM的還原型谷胱甘肽、O. 2mM的氧化型谷胱甘肽、ImM EDTA、50mM Tris_HCl、50mM NaCl、10%甘油、1%甘氨酸的尿素-TBS甘油緩沖液(pH 8. O)透析復性，尿素濃度從6M逐漸替換到5M、4M、3M、2M、1M，最后一次透析至無尿素的透析液時不加甘油。純化蛋白在每個濃度梯度中4°C透析12h?！嵤├?:重組大竹蟶糜蛋白酶rSgChy的酶活性測定實施例2 (2)步得到的復性蛋白以15%的SDS-PAGE檢測后，以BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天)測定蛋白濃度，以50mM的Tris緩沖液調(diào)節(jié)蛋白濃度為O. lmg/ml。以含IOmM CaCl2 的 50mM Tris-HCl 緩沖液溶解 N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pnitroanilide (Sigma)溶于，制成終濃度為 O. ImM 的 N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pnitroanilide 溶液，取290 μ I與10 μ I含有I μ g復性蛋白的溶液在96孔酶標板中混合，室溫作用lOmin。以等量牛糜蛋白酶(Sigma)代替復性蛋白作為陽性對照，每個反應設計3個平行。反應后，測定反應物410nm處的吸光值，以實驗組/陽性對照X100%為重組蛋白的酶活性。實驗測得重組大竹蟶糜蛋白酶rSgChy的酶活性為65. 8%?？偨Y(jié)結(jié)果本發(fā)明克隆得到了大竹蟶糜蛋白酶SgChy基因，制備了其重組蛋白并驗證了重組蛋白的酶活性。本領域的普通技術人員都會理解，在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)，對于上述實施例進行修改，添加和替換都是可能的，都沒有超出本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.一種大竹蟶糜蛋白酶基因SgChy，其具有糜蛋白酶活性，來源于大竹蟶CDNA文庫。
2.權利要求I所述大竹蟶糜蛋白酶基因SgChy，其核苷酸序列如SEQID NO 1所示。
3.權利要求2所述大竹蟶糜蛋白酶基因的編碼蛋白，其氨基酸序列如SEQID No:2所/Jn ο
4.權利要求2所述的大竹蟶糜蛋白酶基因在制備糜蛋白酶類藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明是大竹蟶糜蛋白酶基因SgChy的分子克隆和體外重組表達技術，本發(fā)明利用構建的大竹蟶cDNA文庫，克隆得到了大竹蟶糜蛋白酶基因SgChy的cDNA全長序列，該基因的核苷酸序列如SEQ ID No1所示；利用原核重組表達技術表達了其編碼蛋白，該重組蛋白具有糜蛋白酶活性。該基因及其重組蛋白的研究為生產(chǎn)糜蛋白酶提供了新思路，也為開發(fā)新的天然海洋藥物奠定了理論基礎。
文檔編號A61K38/48GK102787131SQ20121032251
公開日2012年11月21日 申請日期2012年9月3日 優(yōu)先權日2012年9月3日
發(fā)明者劉相全, 楊嘉龍, 楊建敏, 王忠全, 韋秀梅 申請人:山東省海洋水產(chǎn)研究所