本申請(qǐng)是申請(qǐng)人于2012年9月26日提交的題為“用于治療代謝疾病的融合蛋白”的中國(guó)專利申請(qǐng)201280057789.3的分案申請(qǐng)。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及包含已知改善施用對(duì)象的代謝譜的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(fgf21)的新型融合蛋白。

發(fā)明背景

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fgf)家族的特征是22種遺傳上有區(qū)別的同源配體，被分為7個(gè)亞家族。fgf-21與fgf-19和fgf-23最密切相關(guān)，并形成亞家族。該fgf亞家族調(diào)控多種對(duì)經(jīng)典fgf而言不常見(jiàn)的生理學(xué)過(guò)程，即，能量和膽酸的內(nèi)穩(wěn)態(tài)、葡萄糖和脂類代謝，以及磷酸鹽和維生素d的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。此外，與其他fgf不同，該亞家族以內(nèi)分泌的方式發(fā)揮作用(moore,d.d.(2007)science316,1436-8)(beenken等人(2009)naturereviewsdrugdiscovery8,235)。

fgf21是209個(gè)氨基酸的多肽，含有28個(gè)氨基酸的前導(dǎo)序列(seqidno:5)。人fgf21與小鼠fgf21具有約79％氨基酸同一性，與大鼠fgf21具有約80％氨基酸同一性。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(fgf21)被描述為用于治療缺血性血管病、創(chuàng)傷愈合、和與肺、支氣管或肺泡細(xì)胞功能喪失相關(guān)的疾病(nishimura等人(2000)biochimicaetbiophysicaacta,1492:203-206；專利公開(kāi)wo01/36640；和專利公開(kāi)wo01/18172)。雖然fgf-21激活fgf受體和下游信號(hào)傳遞分子，包括frs2a和erk，但尚未檢測(cè)到fgfr與fgf-21的直接相互作用。研究已鑒別了在肝臟、脂肪細(xì)胞和胰腺中高表達(dá)的β-klotho是fgf-21細(xì)胞應(yīng)答的決定子，也是通過(guò)fgfr介導(dǎo)fgf-21信號(hào)傳遞的輔助因子(kurosu,h.等人(2007)jbiolchem282,26687-95)。fgf21是fgfr1(iiic)、fgfr2(iiic)和fgfr3(iiic)β-klotho信號(hào)傳遞復(fù)合物的強(qiáng)力激動(dòng)劑。

fgf-21已表現(xiàn)出誘導(dǎo)不依賴胰島素的葡萄糖攝入。fgf-21還表現(xiàn)出減輕多種糖尿病嚙齒類模型中的高血糖。此外，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)fgf-21的轉(zhuǎn)基因小鼠耐受膳食誘導(dǎo)的代謝異常，并且表現(xiàn)出減少的體重和脂肪質(zhì)量，和胰島素敏感性的增強(qiáng)(badman,m.k.等人(2007)cellmetab5,426-37)。向糖尿病的非人靈長(zhǎng)類施用fgf-21導(dǎo)致空腹血漿葡萄糖、甘油三酯、胰島素和胰高血糖素水平減少，并導(dǎo)致脂蛋白譜的顯著改善，包括hdl膽固醇增加幾乎80％(kharitonenkov,a.等人(2007)endocrinology148,774-81)。目前的研究探討了fgf21作用的分子機(jī)制，已經(jīng)鑒別fgf21是幫助控制適應(yīng)空腹?fàn)顟B(tài)的重要內(nèi)分泌激素。(badman等人(2009)endocrinology150,4931)(inagaki等人(2007)cellmetabolism5,415)這提供了之前缺乏的pparα下游的關(guān)聯(lián)，肝臟藉此與身體的其余部分在調(diào)控能量?jī)?nèi)穩(wěn)態(tài)生物學(xué)中溝通(galman等人(2008)cellmetabolism8,169)(lundasen等人(2007)biochemicalandbiophysicalresearchcommunications360,437)。

fgf21通過(guò)激活ampk/sirt1/pgc1α通路，抑制pparγ表達(dá)和增加線粒體功能，來(lái)調(diào)控脂肪細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)(chau等人(2010)pnas107,12553)。如培養(yǎng)的人肌管和分離的小鼠組織中測(cè)量的，fgf21還增加骨骼肌的葡萄糖攝入。嚙齒類胰島細(xì)胞的fgf21治療導(dǎo)致通過(guò)激活erk1/2和akt通路的改善的功能和存活。(wente等人(2006)diabetes55,2470)fgf21治療還導(dǎo)致嚙齒類肝臟中關(guān)于脂肪發(fā)生和脂肪酸氧化酶的基因表達(dá)改變，可能是通過(guò)hnf4α和foxa2信號(hào)傳遞。

與使用fgf-21直接作為生物治療劑相關(guān)的困難是其半壽期非常短。(kharitonenkov,a.等人(2005)journalofclinicalinvestigation115:1627-1635)在小鼠中，人fgf21的半壽期是0.5至1小時(shí)，而在食蟹猴中，半壽期是2至3小時(shí)。fgf21可以作為多用途的、無(wú)菌藥物制劑使用。然而，已確定防腐劑，即，間甲酚，在上述條件下對(duì)其穩(wěn)定性具有不利影響。

在研發(fā)用作治療1型和2型糖尿病和其他代謝病況的治療劑的fgf21蛋白中，半壽期和穩(wěn)定性的增加是理想的。具有增強(qiáng)的半壽期和穩(wěn)定性的fgf21蛋白將允許對(duì)要施用所述蛋白質(zhì)的患者頻率較低的給藥。明顯的，需要研發(fā)用于治療性蛋白質(zhì)fgf21的穩(wěn)定的水性蛋白質(zhì)制劑。

此外，在研發(fā)fgfg21作為蛋白質(zhì)藥劑中的重大挑戰(zhàn)是解決其物理和化學(xué)的不穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)的組成變化和特征定義了特殊的行為，如折疊、構(gòu)象穩(wěn)定性和解折疊/變性。當(dāng)目標(biāo)是利用水性的蛋白質(zhì)溶液使研發(fā)藥物制劑條件過(guò)程中的蛋白質(zhì)穩(wěn)定時(shí)，應(yīng)該解決這類特征(wang,w.,int.j.ofpharmaceutics,18,(1999))。穩(wěn)定目標(biāo)治療蛋白(例如本發(fā)明的蛋白質(zhì))的理想效果是增加對(duì)蛋白水解和酶促降解的耐受性，從而改善蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和降低蛋白質(zhì)聚集。

發(fā)明概述

本發(fā)明涉及鑒別新型融合蛋白，所述融合蛋白包含成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(fgf21)，并且在藥劑制劑條件下，具有相比野生型fgf21和其變體改良的藥劑特性，例如更穩(wěn)定、具有改善施用對(duì)象的代謝參數(shù)的能力、對(duì)蛋白水解和酶促降解更不易受、更不可能聚集和形成復(fù)合物。本發(fā)明的融合蛋白包含fgf21的截短形式、突變和變體。

還公開(kāi)了這樣的方法，所述方法用于治療fgf21相關(guān)疾病，以及其他代謝的、內(nèi)分泌的和心血管的病癥，如肥胖、1型和2型糖尿病、胰腺炎、血脂異常、非醇型脂肪肝病(nafld)、非醇型脂肪性肝炎(nash)、胰島素耐受、高胰島素血癥、葡萄糖不耐受、高血糖、代謝綜合征、急性心肌梗塞、高血壓、心血管病、動(dòng)脈粥樣硬化、外周動(dòng)脈病、中風(fēng)、心臟衰竭、冠心病、腎病、糖尿病并發(fā)癥、神經(jīng)病、胃輕癱、與胰島素受體的嚴(yán)重失活突變相關(guān)的病癥、和其他的代謝病癥，和降低垂危患者的死亡率和發(fā)病率。

本發(fā)明的融合蛋白可以用作每周一次可注射劑、單獨(dú)或與口服抗糖尿病劑組合，這將改善1型和2型糖尿病患者的血糖控制、體重和脂類譜。蛋白質(zhì)還可用于治療肥胖或其他fgf21相關(guān)性病況。

本發(fā)明的融合蛋白通過(guò)呈遞蛋白質(zhì)克服了與蛋白質(zhì)治療劑相關(guān)的，包括例如與施用野生型fgf21相關(guān)的生理學(xué)不穩(wěn)定性的顯著障礙，所述呈遞的蛋白質(zhì)在藥物制劑條件下，比野生型fgf21更穩(wěn)定、對(duì)蛋白水解和酶促降解更不易受、并且更不可能聚集和形成復(fù)合物。

在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(fgf21)融合蛋白，所述融合蛋白包含表1列舉的，和本文進(jìn)一步描述的一條或多條序列。表1列舉的fgf21序列可以是野生型fgf21序列的變體，例如，具有ncbi參考號(hào)np_061986.1的野生型fgf21序列，并可見(jiàn)于專利公開(kāi)中，例如屬于chironcorporation的us6,716,626b1。

所述融合物可以是在例如變體fgf21序列(例如表1的序列)，和其他分子(非fgf21部分)之間，所述其他分子例如igg恒定結(jié)構(gòu)域或其片段(例如fc區(qū))、人血清白蛋白(has)或白蛋白結(jié)合多肽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，分子的非fgf21部分是fc區(qū)。

其他實(shí)施方案涉及編碼本發(fā)明的融合蛋白的多核苷酸，含有所述多核苷酸的載體和攜帶所述載體的宿主細(xì)胞。

本文提供了用于生成本發(fā)明的融合蛋白的方法，其中所述方法涉及通過(guò)例如在野生型fgf21蛋白的目標(biāo)位置上位點(diǎn)特異性地?fù)饺氚被醽?lái)修飾野生型fgf21蛋白，以及在分子的fgf21部分與其他分子之間的融合，所述其他分子例如igg恒定結(jié)構(gòu)域或其片段(例如fc區(qū))、人血清白蛋白(hsa)或白蛋白-結(jié)合多肽。所述修飾和融合增強(qiáng)了本發(fā)明的融合蛋白相對(duì)于蛋白質(zhì)的野生型形態(tài)的生物學(xué)特性，以及在一些情況下，作為例如標(biāo)簽和蛋白質(zhì)半壽期延長(zhǎng)活性劑的連接點(diǎn)，并用于將所述變體固定在固體支持物的表面的目的。本發(fā)明的相關(guān)實(shí)施方案是生產(chǎn)能夠生產(chǎn)本發(fā)明的所述蛋白質(zhì)的細(xì)胞的方法，和生產(chǎn)能夠生產(chǎn)含有編碼所述變體和融合物的dna的載體的細(xì)胞的方法。

在多個(gè)實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的本發(fā)明的融合蛋白可包含fgf21野生型序列的一個(gè)或多個(gè)片段，包括長(zhǎng)度小至8-12個(gè)氨基酸殘基的片段，并且其中多肽能夠降低哺乳動(dòng)物中的血糖。在多個(gè)實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的本發(fā)明的融合蛋白可包括fgf21野生型序列的一個(gè)或多個(gè)變體，例如，相對(duì)于其野生型序列具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、插入、添加或取代。

在一些實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的本發(fā)明的融合蛋白可以與一種或多種聚合物共價(jià)連接，例如聚乙二醇(peg)或多聚唾液酸，不論是在相對(duì)于野生型fgf21進(jìn)行位點(diǎn)特異性氨基酸修飾的位置上，還是在與這些蛋白質(zhì)的野生型形態(tài)通常共享的氨基酸位置上。peg基團(tuán)是以這樣的方式連接的，所述方式增強(qiáng)，和/或不干擾本發(fā)明的融合蛋白的構(gòu)件部分(例如，fgf21蛋白變體)的生物學(xué)功能。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽可以與異源氨基酸序列融合，任選通過(guò)接頭，如gs、ggggsggggsggggs(seqidno:6)。異源氨基酸序列可以是igg恒定結(jié)構(gòu)域或其片段(例如fc區(qū))、人血清白蛋白(hsa)或白蛋白結(jié)合多肽。本文公開(kāi)的這類融合蛋白也可以形成多聚物。

在一些實(shí)施方案中，異源氨基酸序列(例如，hsa、fc等)與本發(fā)明的融合蛋白的氨基端融合。在其他實(shí)施方案中，融合異源氨基酸序列(例如，hsa、fc等)與本發(fā)明的蛋白質(zhì)的羧基端融合。

另一個(gè)實(shí)施方案涉及治療患者的方法，所述患者表現(xiàn)出一種或多種fgf21相關(guān)疾病，如肥胖、2型糖尿病、1型糖尿病、胰腺炎、血脂異常、非醇型脂肪肝病(nafld)、非醇型脂肪性肝炎(nash)、胰島素耐受、高胰島素血癥、葡萄糖不耐受、高血糖、代謝綜合征、急性心肌梗塞、高血壓、心血管病、動(dòng)脈粥樣硬化、外周動(dòng)脈病、中風(fēng)、心臟衰竭、冠心病、腎病、糖尿病并發(fā)癥、神經(jīng)病、胃輕癱、與胰島素受體的嚴(yán)重失活突變相關(guān)的病癥、和其他的代謝病癥，所述方法包括向所述需要這類治療的患者施用治療有效量的一種或多種本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其藥物組合物。

本發(fā)明還提供了包含本文公開(kāi)的本發(fā)明的融合蛋白和可藥用的配制劑的藥物組合物。這類藥物組合物可用于治療代謝病癥的方法中，并且方法包括向所述有需要的人類患者施用本發(fā)明的藥物組合物?？梢灾委煹拇x病癥的非限制性例子包括1型和2型糖尿病，以及肥胖。

在本發(fā)明的下列詳細(xì)說(shuō)明中，闡明了在本發(fā)明的這些和其他方面。

附圖簡(jiǎn)介

圖1a-1d顯示了v188在ob/ob糖尿病小鼠模型中具有相比v76改善的效果。當(dāng)施用1毫克/千克(mpk)時(shí)，v188表現(xiàn)出比施用5毫克/千克v76更好的結(jié)果。圖1a顯示了餐后血漿葡萄糖的讀數(shù)(圓圈代表載體(pbs-磷酸緩沖鹽溶液)、方塊代表5mpk的v76，三角代表1mpk的v188)。圖1b顯示了餐后血漿胰島素的讀數(shù)(從左至右：載體、5mpk的v76，和1mpk的v188)。圖1c顯示了體重的讀數(shù)(從左至右：載體、5mpk的v76，和1mpk的v188)。圖1d顯示了肝臟脂含量的讀數(shù)(從左至右：載體、5mpk的v76，和1mpk的v188)。

圖2a-2d顯示了v101在ob/ob糖尿病小鼠模型中具有相比v76改善的效果。當(dāng)施用1毫克/千克(mpk)時(shí)，v101表現(xiàn)出比施用5毫克/千克v76更好的結(jié)果。圖2a顯示了餐后血漿葡萄糖的讀數(shù)(圓圈代表載體(pbs-磷酸緩沖鹽溶液)、方塊代表5mpk的v76，三角代表1mpk的v101)。圖2b顯示了餐后血漿胰島素的讀數(shù)(從左至右：載體、5mpk的v76，和1mpk的v101)。圖2c顯示了體重的讀數(shù)(從左至右：載體、5mpk的v76，和1mpk的v101)。圖2d顯示了肝臟脂含量的讀數(shù)(從左至右：載體、5mpk的v76，和1mpk的v101)。

圖3a-3d顯示了v103在ob/ob糖尿病小鼠模型中具有相比v76改善的效果。當(dāng)施用1毫克/千克(mpk)時(shí)，v103表現(xiàn)出比施用5毫克/千克的v76更好的結(jié)果。圖3a顯示了餐后血漿葡萄糖的讀數(shù)(圓圈代表載體(pbs-磷酸緩沖鹽溶液)、方塊代表5mpk的v76，三角代表1mpk的v103)。圖3b顯示了餐后血漿胰島素的讀數(shù)(從左至右：載體、5mpk的v76，和1mpk的v103)。圖3c顯示了體重讀數(shù)(從左至右：載體、5mpk的v76，和1mpk的v103)。圖3d顯示了肝臟脂含量的讀數(shù)(從左至右：載體、5mpk的v76，和1mpk的v103)。

圖4a-4d證實(shí)了本發(fā)明的融合蛋白具有的相比現(xiàn)有技術(shù)中的fgf21融合蛋白更優(yōu)秀的藥代動(dòng)力學(xué)和熱動(dòng)力學(xué)的特性。圖4a顯示了在小鼠中iv注射描述為fc-l(15)-fgf21(l98r、p171g)和fc-l(15)-fgf21(l98r、p171g、a180e)的pct公開(kāi)wo10/129600中的發(fā)明的融合蛋白后，所述融合物的血漿濃度。圖4b顯示了如抗fc-elisa所測(cè)定的小鼠單次iv給藥后本發(fā)明的融合蛋白(v101、v103&v188)的藥代動(dòng)力學(xué)特性，與之前使用抗fgf21抗體elisa的研究中在小鼠中生成的v76藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)相比。圖4c顯示了本發(fā)明的融合蛋白在抗fgf21western印跡中的抽樣調(diào)查，與120小時(shí)和15天時(shí)的抗fc-elisa數(shù)據(jù)一致。印跡中的樣品如下：a代表v101，b代表v103，c代表v188。對(duì)照是v101和血清。圖4d證實(shí)了本發(fā)明的融合蛋白相比v76顯著增加的熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性。從上至下的圖代表了v101、v103和v188，都具有相比v76(tm<50℃(未顯示))和野生型fgf21(tm＝46.5℃±0.3(未顯示))改善的溶解溫度(tm)。

發(fā)明詳述

本發(fā)明的蛋融合白質(zhì)代表了如本領(lǐng)域已知的全長(zhǎng)野生型fgf21多肽的修飾的形態(tài)。以fgf21野生型序列作為參考序列(seqidno:1)，例如當(dāng)需要比較fgf21野生型序列和蛋白質(zhì)變體時(shí)。fgf21野生型序列具有ncbi參考序列號(hào)np_061986.1，并且可見(jiàn)于這類公開(kāi)的專利中，例如屬于chironcorporation的us6,716,626b1(seqidno:1)

下面顯示了編碼全長(zhǎng)fgf21多肽的相應(yīng)mrna序列(ncbi參考序列號(hào)nm_019113.2)(seqidno:2)：

成熟的fgf21序列缺少前導(dǎo)序列，并且還可以包括多肽的其他修飾，如氨基末端(有或無(wú)前導(dǎo)序列)和/或羧基末端的蛋白水解加工、從較大的前體切割較小的多肽、n-連接和/或o-連接的糖基化，和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他翻譯后修飾。成熟的fgf21序列的代表性例子具有下列序列(seqidno:3，其代表全長(zhǎng)fgf21蛋白序列(ncbi參考序列號(hào)np_061986.1)的第29-209位氨基酸)：

下面顯示了編碼成熟的fgf21多肽(seqidno:3)的相應(yīng)cdna序列(seqidno:4)：

本發(fā)明的融合蛋白可包含本文列舉的野生型蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)變體或突變體，例如，fgf21變體。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)變體”、“人變體”、“多肽或蛋白質(zhì)變體”、“變體”、“突變體”及其任何類似的術(shù)語(yǔ)或其特定形態(tài)(例如，“fgf21蛋白變體”、“變體”、“fgf21突變體”等)定義了包含天然存在的(即，野生型)蛋白質(zhì)或多肽對(duì)應(yīng)物或相應(yīng)的天然序列的修飾、截短、其他變體的蛋白質(zhì)或多肽序列。例如，相對(duì)于本文所述的野生型(即，天然存在的)fgf21蛋白，描述了“變體fgf21”或“fgf21突變體”。

表1列舉了本發(fā)明的代表性的融合蛋白序列。所述融合物的描述包括fgf21變體，以及適用時(shí)，接頭。fgf21變體應(yīng)用的改變或取代是相對(duì)于野生型fgf21編號(hào)和描述的。作為示例，“變體101(v101)”(seqidno:10)是具有2個(gè)氨基酸接頭和下列相對(duì)于野生型fgf21的取代的fc-fgf21融合蛋白，所述取代是：q55c、a109t、g148c、k150r、p158s、p174l、s195a、p199g、g202a。

表1：fgf21變體fc融合蛋白

*_表示除非另外說(shuō)明，否則該表中的fgf21野生型序列指ncbi參考序列號(hào)np_061986.1(seqidno:1)。fgf21部分中的所有突變和所述突變的相應(yīng)氨基酸編號(hào)回指seqidno:1，而不指也可包括fc和接頭區(qū)的該表中的全長(zhǎng)序列。

用于本發(fā)明的融合蛋白中的變體或突變體，例如，野生型fgf21的變體的特征是相對(duì)于野生型蛋白質(zhì)至少一個(gè)取代的、添加的和/或去除的氨基酸。此外，變體可包括相對(duì)于野生型蛋白質(zhì)的n-和/或c-末端截短。一般而言，變體具有野生型蛋白質(zhì)的一些改性的結(jié)構(gòu)或功能的特性。例如，變體可具有在濃縮溶液中增強(qiáng)的或改善的物理穩(wěn)定性(例如，較少的疏水性介導(dǎo)的聚集作用)，當(dāng)與血漿孵育時(shí)增強(qiáng)的或改善的血漿穩(wěn)定性，或增強(qiáng)的或改善的生物活性，同時(shí)保留有利的生物活性譜。

構(gòu)成本發(fā)明的融合蛋白的部分及其野生型比較蛋白質(zhì)之間的差異的可接受的氨基酸取代和修飾包括，但不限于，一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，包括用非天然存在的氨基酸類似物取代，和截短。因此，本發(fā)明的融合蛋白(例如，本發(fā)明的融合蛋白)包括但不限于，定點(diǎn)突變體、截短的多肽、抗蛋白水解的突變體、聚集作用降低的突變體、組合突變體，和本文所述的融合蛋白。

蛋白質(zhì)表達(dá)領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可以在任何本發(fā)明的融合蛋白的n-末端導(dǎo)入甲硫氨酸或甲硫氨酸-精氨酸序列，用于在大腸桿菌中表達(dá)，并且被考慮落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。

本發(fā)明的融合蛋白可具有與藥物防腐劑(例如，間甲酚、苯酚、苯甲醇)增加的相容性，因此使得能夠制備保藏的藥物制劑，該制劑在儲(chǔ)藏過(guò)程中維持蛋白質(zhì)的物理化學(xué)特性和生物學(xué)活性。因此，在生理學(xué)和保藏的藥物制劑條件下，相對(duì)于野生型具有增強(qiáng)的藥物穩(wěn)定性的變體在濃縮溶液中都具有改善的物理穩(wěn)定性，同時(shí)維持了生物學(xué)效價(jià)。作為非限制性的例子，相比其對(duì)應(yīng)的野生型對(duì)應(yīng)物或相應(yīng)的天然序列，本發(fā)明的融合蛋白可以更耐受蛋白水解和酶促降解；可以具有改善的穩(wěn)定性；可以較不易聚集。如本文使用的，這些術(shù)語(yǔ)不是互斥的或限制的，給定的變體完全可能具有野生型蛋白質(zhì)的一種或多種改性的特性。

本發(fā)明還涵蓋了編碼本發(fā)明的融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包含例如，與seqidno:3的氨基酸序列具有至少約95％同一性的fgf21氨基酸序列，但其中賦予fgf21蛋白變體理想特性(例如，改善的fgf21-受體效價(jià)、蛋白水解抗性、增加的半壽期或降低的聚集特性，及其組合)的特定殘基沒(méi)有被另外修飾。換言之，除了fgf21突變體序列中為了賦予蛋白水解抗性、降低的聚集作用或其他特性而已經(jīng)被修飾的殘基外，約5％(可選的4％，可選的3％，可選的2％，可選的1％)的fgf21突變體序列中的所有其他氨基酸殘基可被修飾。這樣的fgf21突變體具有野生型fgf21多肽的至少一種活性。

本發(fā)明還涵蓋了包含這樣的核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列與seqidno:2或seqidno:4的核苷酸序列具有至少約85％同一性，更優(yōu)選至少約90至95％同一性，但其中編碼賦予被編碼的蛋白質(zhì)的蛋白水解抗性、降低的聚集特性或其他特性的氨基酸殘基的核苷酸沒(méi)有被另外修飾。換言之，除了編碼fgf21突變體序列中為了賦予蛋白水解抗性、降低的聚集特性或其他特性而已經(jīng)被修飾的殘基的核苷酸外，突變體序列中約15％，更優(yōu)選約10至5％的所有其他核苷酸可被修飾。這樣的核酸分子編碼具有其野生型對(duì)應(yīng)物的至少一種活性的蛋白質(zhì)。

本文提供了用于生成本發(fā)明的融合蛋白的方法，其中這類方法涉及對(duì)蛋白質(zhì)的野生型形態(tài)(例如，本文所述的fgf21野生型蛋白質(zhì))的位點(diǎn)特異性修飾和非位點(diǎn)特異性修飾，例如，野生型蛋白質(zhì)的截短，和在野生型蛋白質(zhì)內(nèi)的目標(biāo)位置位點(diǎn)特異性摻入氨基酸。所述修飾增強(qiáng)了本發(fā)明的融合蛋白相對(duì)于野生型蛋白質(zhì)的生物學(xué)特性，并且，在一些情況下，充當(dāng)例如標(biāo)記和蛋白質(zhì)半壽期延長(zhǎng)活性劑的連接點(diǎn)，并用于將所述變體固定在固體支持物表面上的目的。本發(fā)明相關(guān)的實(shí)施方案是生產(chǎn)能夠生產(chǎn)本發(fā)明所述的融合蛋白的細(xì)胞，和生產(chǎn)能夠生產(chǎn)含有編碼所述變體的dna的載體的細(xì)胞的方法。

在某些實(shí)施方案中，使用這樣的修飾，例如位點(diǎn)特異性修飾，來(lái)連接綴合物(例如，連接peg基團(tuán)與本發(fā)明的蛋白質(zhì)、多肽和/或肽)，用于例如延長(zhǎng)所述蛋白質(zhì)、多肽和/或肽的半壽期或改善所述蛋白質(zhì)、多肽和/或肽的生物學(xué)特性的目的。本文其他地方描述了所述技術(shù)。

在其他實(shí)施方案中，使用這樣的修飾，例如位點(diǎn)特異性修飾，來(lái)連接延長(zhǎng)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的半壽期的其他聚合物、小分子和重組蛋白質(zhì)序列。一個(gè)這樣的實(shí)施方案包括連接脂肪酸或特定的白蛋白結(jié)合化合物與蛋白質(zhì)、多肽和/或肽。在其他實(shí)施方案中，修飾對(duì)特定的氨基酸類型進(jìn)行，并且可以連接蛋白質(zhì)上的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)。

在其他實(shí)施方案中，使用這樣的修飾，例如位點(diǎn)特異性修飾，作為連接工具，用于生產(chǎn)野生型和/或變體多聚體，例如二聚體(同源二聚體或異源二聚體)或三聚體或四聚體。這些多聚的蛋白質(zhì)分子可以額外具有這樣的基團(tuán)(如peg、糖和/或peg-膽固醇綴合物)，所述基團(tuán)與其他蛋白質(zhì)(如fc、人血清白蛋白(has)等)氨基末端或羧基末端連接或融合。

在其他實(shí)施方案中，使用這樣的位點(diǎn)特異性修飾來(lái)生產(chǎn)蛋白質(zhì)、多肽和/或肽，其中位點(diǎn)特異性摻入的吡咯賴氨酸或吡咯賴氨酸類似物或非天然存在的氨基酸(對(duì)-乙酰-phe、對(duì)-疊氮-phe)的位置允許這類蛋白質(zhì)、多肽和/或肽在固體支持物的表面上受控的方向和連接，或者具有連接的基團(tuán)例如peg、糖和/或peg-膽固醇綴合物。

在其他實(shí)施方案中，使用這樣的位點(diǎn)特異性修飾來(lái)位點(diǎn)特異性地交聯(lián)蛋白質(zhì)、多肽和/或肽，從而形成異源寡聚物，包括但不限于異源二聚體和異源三聚體。在其他實(shí)施方案中，使用這樣的位點(diǎn)特異性修飾來(lái)位點(diǎn)特異性地交聯(lián)蛋白質(zhì)、多肽和/或肽，從而形成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)綴合物、蛋白質(zhì)-多肽綴合物、蛋白質(zhì)-肽綴合物、多肽-多肽綴合物、多肽-肽綴合物或肽-肽綴合物。在其他實(shí)施方案中，位點(diǎn)特異性修飾可包括允許在蛋白質(zhì)、多肽或肽的單個(gè)位點(diǎn)上連接多于一種類型的分子的分枝點(diǎn)。

在其他實(shí)施方案中，可以以非位點(diǎn)特異性方式進(jìn)行本文列舉的修飾，并獲得本發(fā)明的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)綴合物、蛋白質(zhì)-多肽綴合物、蛋白質(zhì)-肽綴合物、多肽-多肽綴合物、多肽-肽綴合物或肽-肽綴合物。

定義

本文全文使用了多種定義。大部分詞匯都具有屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員詞匯的含義。在本文的下文或其他地方具體定義的詞匯具有本發(fā)明上下文作為整體所提供的含義，并且通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的意思。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“fgf21”指成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fgf)蛋白質(zhì)家族的成員。fgf21的氨基酸序列(genbank登錄號(hào)np_061986.1)如seqidno:1所述，其相應(yīng)的多核苷酸序列如seqidno:2所述(ncbi參考序列號(hào)nm_019113.2)?！癴gf21變體”、“fgf21突變體”和相似術(shù)語(yǔ)描述了fgf21蛋白的修飾的形態(tài)，例如，構(gòu)件氨基酸殘基被缺失、添加、修飾或取代。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“fgf21受體”指fgf21的受體(kharitonenkov,a,等人(2008)journalofcellularphysiology215:1-7；kurosu,h等人(2007)jbc282:26687-26695；ogawa,y等人(2007)pnas104:7432-7437)。

術(shù)語(yǔ)“fgf21多肽”指在人中表達(dá)的天然存在的多肽。出于本公開(kāi)內(nèi)容的目的，術(shù)語(yǔ)“fgf21多肽”可互換的使用，指任何全長(zhǎng)fgf21多肽，例如，由209個(gè)氨基酸殘基組成且由seqidno:2的核苷酸序列編碼的seqidno:1；多肽的任何成熟形式，其由181個(gè)氨基酸殘基組成，并且其中去除了全長(zhǎng)fgf21多肽的氨基末端的28個(gè)氨基酸殘基(即，構(gòu)成信號(hào)肽)。

如本文使用的，“變體76”是fgf21蛋白變體，特征是通過(guò)cys154連接的40kda分枝的peg，和相對(duì)于177個(gè)氨基酸的野生型蛋白質(zhì)的8個(gè)點(diǎn)突變。本文詳細(xì)的描述了變體的合成，且蛋白質(zhì)序列顯示在表1和seqidno:9中。

術(shù)語(yǔ)“分離的核酸分子”指這樣的本發(fā)明的核酸分子，所述核酸分子(1)已經(jīng)與從源細(xì)胞中分離總核酸時(shí)至少約50％的天然發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)、脂類、碳水化合物或其他材料分離，(2)不與“分離的核酸分子”天然連接的全部或部分多核苷酸連接，(3)與不天然連接的多核苷酸有效連接，或(4)不作為較大的多核苷酸序列的一部分天然存在。優(yōu)選的，本發(fā)明的分離的核酸分子基本上不含在其自然環(huán)境中可見(jiàn)的任何其他污染的核酸分子或其他污染物，所述污染的核酸分子或污染物將干擾其在多肽生產(chǎn)或其治療、診斷、預(yù)后或研究用途中的應(yīng)用。

術(shù)語(yǔ)“載體”用于指任何用于將編碼信息轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞的分子(例如，核酸、質(zhì)粒或病毒)。

術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”指適合轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞和含有核酸序列的載體，所述核酸序列指導(dǎo)和/或控制插入的異源核酸序列的表達(dá)。表達(dá)包括但不限于這樣的過(guò)程，如轉(zhuǎn)錄、翻譯和rna剪切(如果存在內(nèi)含子)。

術(shù)語(yǔ)“有效連接的”在本文中用于指?jìng)?cè)翼序列的排列，其中配制或裝配所述側(cè)翼序列以實(shí)施其正常的功能。融合蛋白的元件可以是彼此有效連接的，使得允許融合蛋白如同其為天然存在的、內(nèi)源性蛋白質(zhì)那樣發(fā)揮功能，和/或以協(xié)同的方式組合所述融合蛋白的不同元件。

在核苷酸水平，與編碼序列有效連接的側(cè)翼序列能夠影響編碼序列的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。例如，當(dāng)啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)編碼序列的轉(zhuǎn)錄時(shí)，編碼序列與啟動(dòng)子是有效連接的。只要能夠正確的發(fā)揮功能，側(cè)翼序列不必與編碼序列連續(xù)。因此，例如，啟動(dòng)子序列和編碼序列之間可以存在間插的非翻譯但轉(zhuǎn)錄的序列，并且啟動(dòng)子序列仍然可以被認(rèn)為是與編碼序列“有效連接的”。

術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”用于指已被轉(zhuǎn)化的，或能夠用核酸序列轉(zhuǎn)化，并然后能夠表達(dá)選擇的目標(biāo)基因的細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)包括親代細(xì)胞的后代，不論后代的形態(tài)學(xué)或遺傳學(xué)組成是否與原始親本相同，只要仍存在選擇的基因。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”指天然存在的氨基酸、以與天然存在的氨基酸相似的方式發(fā)揮功能的非天然氨基酸、氨基酸類似物和氨基酸模擬物，都處于其d型和l型立體異構(gòu)體如果其結(jié)構(gòu)允許這類立體異構(gòu)體形式。在本文中，用名稱、常規(guī)已知的三字母符號(hào)或iupac-iub生物化學(xué)命名委員會(huì)推薦的一字母符號(hào)稱呼氨基酸。

當(dāng)與生物學(xué)材料(如核酸分子、多肽、宿主細(xì)胞等)結(jié)合使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“天然存在的”指在自然界發(fā)現(xiàn)的材料并且不是人為操作的。類似的，“非天然存在的”在本文中用于指在自然界中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的，或經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)修飾或人為合成的材料。當(dāng)與核苷酸結(jié)合使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“天然存在的”指堿基腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鳥(niǎo)嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)。當(dāng)與氨基酸結(jié)合使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“天然存在的”指20種常規(guī)氨基酸(即，丙氨酸(a)、半胱氨酸(c)、天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)、苯丙氨酸(f)、甘氨酸(g)、組氨酸(h)、異亮氨酸(i)、賴氨酸(k)、亮氨酸(l)、甲硫氨酸(m)、天冬酰胺(n)、脯氨酸(p)、谷氨酰胺(q)、精氨酸(r)、絲氨酸(s)、蘇氨酸(t)、纈氨酸(v)、色氨酸(w)和酪氨酸(y))，以及硒代半胱氨酸、吡咯賴氨酸(pyl或o)和吡咯啉-羧基-賴氨酸(pcl或z)。

吡咯賴氨酸(pyl)是在甲烷八疊球菌(methanosarcina)科的產(chǎn)甲烷古菌(methanogenicarchaea)的甲胺甲基轉(zhuǎn)移酶中天然發(fā)現(xiàn)的氨基酸。吡咯賴氨酸是在相應(yīng)mrna中符合讀框的uag密碼子處共翻譯摻入的賴氨酸類似物，被認(rèn)為是第22種天然氨基酸。

至少如pct專利公開(kāi)wo2010/48582(申請(qǐng)人irm,llc)所述，在大腸桿菌中嘗試生物合成吡咯賴氨酸(pyl)導(dǎo)致形成“去甲基化的吡咯賴氨酸”，在本文中被稱為吡咯啉-羧基-賴氨酸或pcl。如本文使用的，“pcl”指pcl-a或pcl-b。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“非天然氨基酸”和“不天然氨基酸”是可互換的，意在代表不能在任何生物體中使用來(lái)自任何生物體的未修飾或修飾的基因，而生物合成生成的氨基酸結(jié)構(gòu)，不論是相同或不同的。術(shù)語(yǔ)指在天然存在的(野生型)fgf21蛋白序列或本發(fā)明的序列中不存在的氨基酸殘基。這包括但不限于，不是20種天然存在的氨基酸,硒代半胱氨酸,吡咯賴氨酸(pyl)或吡咯啉-羧基-賴氨酸(pcl,例如pct專利公開(kāi)wo2010/48582所述)中的一種的修飾的氨基酸和/或氨基酸類似物?？梢酝ㄟ^(guò)取代天然存在的氨基酸，和/或向天然存在的(野生型)fgf21蛋白序列或本發(fā)明的序列中插入非自然氨基酸，導(dǎo)入這類非自然氨基酸殘基。還可以摻入非天然氨基酸殘基，使得給予fgf21分子理想的功能性，例如連接官能團(tuán)(例如，peg)的能力。如本文使用的，當(dāng)與氨基酸結(jié)合使用時(shí)，符號(hào)“u”應(yīng)該意指“非天然氨基酸”和“不天然氨基酸”。

此外，應(yīng)理解這類“不天然氨基酸”需要修飾的trna和修飾的trna合成酶(rs)用于摻入到蛋白質(zhì)中。這些“選擇的”正交trna/rs對(duì)是通過(guò)schultz等人研發(fā)的選擇過(guò)程，或通過(guò)隨機(jī)或靶向突變產(chǎn)生的。作為示例，吡咯啉-羧基-賴氨酸是“天然的氨基酸”，因?yàn)樗峭ㄟ^(guò)從一種生物體轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中的基因生物合成產(chǎn)生的，且因?yàn)樗峭ㄟ^(guò)使用天然的trna和trna合成酶基因摻入到蛋白質(zhì)中的，但是p-氨基苯丙氨(參見(jiàn)generationofabacteriumwitha21aminoacidgeneticcode,mehlra,andersonjc,santorosw,wangl,martinab,kingds,horndm,schultzpg.jamchemsoc.2003jan29；125(4):935-9)則是“不天然氨基酸”，因?yàn)樗m然是生物合成產(chǎn)生，但它是通過(guò)“選擇的”正交trna/trna合成酶對(duì)摻入到蛋白質(zhì)中的。

修飾的編碼的氨基酸包括但不限于羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、o-磷酸絲氨酸、吖丁啶羧酸、2-氨基已二酸、3-氨基已二酸、β-丙氨酸、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基異丁酸、3-氨基異丁酸、2-氨基庚二酸、叔丁基甘氨酸、2,4-二氨基異丁酸、鎖鏈素、2,2’-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、n-乙基甘氨酸、n-甲基甘氨酸、n-乙基天冬酰胺、高脯氨酸、羥賴氨酸、別-羥賴氨酸、3-羥脯氨酸、4-羥脯氨酸、異鎖鏈素、別-異亮氨酸,n-甲基丙氨酸、n-甲基甘氨酸、n-甲基異亮氨酸、n-甲基戊基甘氨酸、n-甲基纈氨酸、naphthalanine、正纈氨酸、正亮氨酸、鳥(niǎo)氨酸、戊基甘氨酸、2-哌啶酸和硫代脯氨酸。術(shù)語(yǔ)“氨基酸”還包括這樣的天然存在的氨基酸，其在某些生物體中是代謝物但不由遺傳密碼編碼用于摻入到蛋白質(zhì)中。這類氨基酸包括但不限于鳥(niǎo)氨酸、d-鳥(niǎo)氨酸或d-精氨酸。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“氨基酸類似物”指具有與天然存在的氨基酸相同基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，僅作為示例，結(jié)合氫原子、羧基、氨基和r基的α-碳。氨基酸類似物包括天然的和不天然的氨基酸，所述氨基酸是可逆或不可逆地化學(xué)封閉的，或者其c-末端的羧基、其n-末端的氨基和/或其側(cè)鏈官能團(tuán)是化學(xué)修飾的。這類類似物包括但不限于甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸砜、s-(羧基甲基)-半胱氨酸,s-(羧基甲基)-半胱氨酸亞砜、s-(羧基甲基)-半胱氨酸砜、天冬氨酸-(β-甲酯)、n-乙基甘氨酸、丙氨酸甲酰胺、高絲氨酸、正亮氨酸和甲硫氨酸甲基锍。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“氨基酸模擬物”指具有與氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，但其以與天然存在的氨基酸相似的方式發(fā)揮功能的結(jié)構(gòu)的化學(xué)化合物。

術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)活性變體”指任何用于本發(fā)明的融合蛋白中的多肽變體，例如，作為融合物的構(gòu)件蛋白，具有其野生型(例如，天然存在的)蛋白質(zhì)或多肽對(duì)應(yīng)物的活性，如調(diào)節(jié)血糖、hba1c、胰島素、甘油三酯或膽固醇水平；增加胰腺功能；降低肝臟的脂類水平；減少體重；改善糖耐受、能量消耗或胰島素敏感性的能力，而不論導(dǎo)入到多肽變體中的修飾的類型或數(shù)量。具有相對(duì)于其野生型形態(tài)一定程度減少的活性水平的多肽變體仍然可以被認(rèn)為是生物學(xué)活性的多肽變體。本發(fā)明的生物學(xué)活性的多肽變體的非限制性的代表例子是這樣的fgf21變體，其是修飾的，且具有與野生型fgf21相似或增強(qiáng)的生物學(xué)特性。

術(shù)語(yǔ)“有效量”和“治療有效量”都指用于支持野生型多肽或蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)物的一種或多種生物學(xué)活性的可觀察水平的本發(fā)明的融合蛋白的量，如降低血糖、胰島素、甘油三酯或膽固醇水平；降低肝臟的甘油三酯或膽固醇水平；降低肝臟的甘油三酯或脂類水平；減少體重；或改善糖耐受、能量消耗或胰島素敏感性的能力。例如，向表現(xiàn)出、患有或傾向患有fgf21-相關(guān)疾病(如1型或2型糖尿病、肥胖或代謝綜合征)的患者施用的“治療有效量”是這樣的量，所述量導(dǎo)致、減輕或者引起與上述病癥相關(guān)的病理學(xué)癥狀、疾病進(jìn)程、生理病況的改善或抵抗死于上述病癥。出于本發(fā)明的目的，“對(duì)象”或“患者”優(yōu)選是人，但也可以是動(dòng)物，更具體的是伴侶動(dòng)物(例如，狗、貓等)、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物(例如，牛、綿羊、豬、馬等)和實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠等)。

術(shù)語(yǔ)“可藥用的運(yùn)載體”或“生理學(xué)可接受的運(yùn)載體”在本文中指適合實(shí)現(xiàn)或增強(qiáng)本發(fā)明的融合蛋白遞送的一種或多種制劑材料。

術(shù)語(yǔ)“抗原”指分子或分子的一部分，其能夠被抗體結(jié)合，并且還能夠用于在動(dòng)物中生產(chǎn)能夠結(jié)合該抗原的表位的抗體?？乖删哂幸粋€(gè)或多個(gè)表位。

術(shù)語(yǔ)“天然fc”指包含獲得自完整抗體的消化，或者通過(guò)其他手段生產(chǎn)的非抗原結(jié)合片段的序列的分子或序列，不論其是單體或多聚體的形式，且可以含有鉸鏈區(qū)。天然fc的原始免疫球蛋白來(lái)源優(yōu)選是人起源的，并可以是任何免疫球蛋白，但igg1和igg2是優(yōu)選的。天然fc分子由可以通過(guò)共價(jià)(即，二硫鍵)和非共價(jià)締合連接成二聚體或多聚體形式的單體多肽組成。在天然fc分子的單體亞基之間的分子間二硫鍵的數(shù)量范圍是從1至4個(gè)，取決于類型(例如，igg、iga和ige)或亞類(例如，igg1、igg2、igg3、iga1和igga2)。天然fc的一個(gè)例子是以二硫鍵連接的二聚體，其獲得自igg的木瓜蛋白酶消化(參見(jiàn)ellison等人,1982,nucleicacidsres.10:4071-9)。用于本文中的術(shù)語(yǔ)“天然fc”一般是單體、二聚體和多聚體形式。

術(shù)語(yǔ)“fc變體”指由天然fc修飾而來(lái)，但仍然包含補(bǔ)救受體fcrn(新生兒fc受體)的結(jié)合位點(diǎn)的分子或序列。國(guó)際公開(kāi)號(hào)wo97/34631和wo96/32478描述了示例性的fc變體，以及與補(bǔ)救受體的相互作用，并通過(guò)引用整合到本文中。因此，術(shù)語(yǔ)“fc變體”可包含從非人的天然fc人源化的分子或序列。此外，天然fc包含可以去除的區(qū)域，因?yàn)檫@些區(qū)域提供了本發(fā)明的融合蛋白的融合分子不需要的結(jié)構(gòu)特征或生物學(xué)活性。因此，術(shù)語(yǔ)“fc變體”包含這樣的分子或序列，所述分子或序列缺少一個(gè)或多個(gè)天然fc位點(diǎn)或殘基，或者其中的一個(gè)或多個(gè)天然fc位點(diǎn)或殘基已被修飾，所述位點(diǎn)或殘基影響或參與：(1)二硫鍵形成，(2)與選擇的宿主細(xì)胞的不相容性，(3)在選擇的宿主細(xì)胞表達(dá)時(shí)n-末端異質(zhì)性，(4)糖基化作用，(5)與補(bǔ)體的相互作用，(6)與補(bǔ)救受體以外的fc受體結(jié)合，或(7)抗體依賴性的細(xì)胞毒性(adcc)。下文進(jìn)一步詳細(xì)描述了fc變體。

術(shù)語(yǔ)“fc結(jié)構(gòu)域”涵蓋了天然fc和fc變體和上述序列。對(duì)于fc變體和天然fc分子，術(shù)語(yǔ)“fc結(jié)構(gòu)域”包括單體或多聚體形式的分子，不論是從完整抗體消化獲得的，或者通過(guò)其他手段生產(chǎn)的。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，fc結(jié)構(gòu)域可以通過(guò)例如，fc結(jié)構(gòu)域和fgf21序列之間的共價(jià)鍵，與fgf21或fgf21突變體(包括fgf21或fgf21突變體的截短的形式)融合。這類融合蛋白可以通過(guò)fc結(jié)構(gòu)域的締合形成多聚體，并且這些融合蛋白及其多聚體也是本發(fā)明的一個(gè)方面。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“修飾的fc片段”應(yīng)該意指包含修飾的序列的抗體的fc片段。fc片段是包含ch2、ch3和鉸鏈區(qū)部分的抗體部分。修飾的fc片段可源自例如igg1、igg2、igg3或igg4。fclala是具有l(wèi)ala突變(l234a、l235a)的修飾的fc片段，其以降低的效率觸發(fā)adcc，并且弱地結(jié)合和激活人補(bǔ)體。hessell等，2007nature449:101-104。fc片段的其他修飾描述在例如美國(guó)專利號(hào)7,217,798中。

術(shù)語(yǔ)“異源”意指這些結(jié)構(gòu)域不是天然發(fā)現(xiàn)與抗體恒定區(qū)締合的。特別的是，這類異源的結(jié)合結(jié)構(gòu)域不具有由4個(gè)框架區(qū)fr1、fr2、fr3和fr4，和之間的3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)組成的抗體可變結(jié)構(gòu)域的典型結(jié)構(gòu)。因此，fusobody的每個(gè)臂包含第一單鏈多肽和第二單鏈多肽，所述第一單鏈多肽包含共價(jià)連接在抗體的恒定ch1重鏈區(qū)的n-末端部分上的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域，而所述第二單鏈多肽包含共價(jià)連接在抗體的恒定cl輕鏈區(qū)的n-末端部分上的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域。共價(jià)連接可以是直接的，例如通過(guò)肽鍵，或者可以是間接的，通過(guò)接頭，例如肽接頭。fusobody的2個(gè)異源二聚體是共價(jià)連接的，例如通過(guò)其鉸鏈區(qū)處的至少一個(gè)二硫鍵，類似抗體結(jié)構(gòu)。本領(lǐng)域已經(jīng)描述了具有fusobody結(jié)構(gòu)的分子實(shí)例，特別是包含異源二聚體受體的配體結(jié)合區(qū)的fusobody(參見(jiàn)例如，國(guó)際專利公開(kāi)號(hào)wo01/46261和wo11/076781)。

術(shù)語(yǔ)“聚乙二醇”或“peg”指聚烷撐二醇化合物或其衍生物，有或無(wú)偶聯(lián)劑或者由偶聯(lián)或激活部分衍生。

術(shù)語(yǔ)“fgf21-相關(guān)病癥”和本文類似使用的術(shù)語(yǔ)包括了肥胖、1型和2型糖尿病、胰腺炎、血脂異常、非醇型脂肪肝病(nafld)、非醇型脂肪性肝炎(nash)、胰島素耐受、高胰島素血癥、葡萄糖不耐受、高血糖、代謝綜合征、急性心肌梗塞、高血壓、心血管病、動(dòng)脈粥樣硬化、外周動(dòng)脈病、中風(fēng)、心臟衰竭、冠心病、腎病、糖尿病并發(fā)癥、神經(jīng)病、胃輕癱、與胰島素受體的嚴(yán)重失活突變相關(guān)的病癥、和其他的代謝病癥。

術(shù)語(yǔ)“與胰島素受體中的嚴(yán)重失活性突變相關(guān)的病癥”和本文類似使用的術(shù)語(yǔ)描述了患有胰島素受體(或其直接下游的可能的蛋白質(zhì))突變的對(duì)象中的病況，所述突變導(dǎo)致了嚴(yán)重的胰島素耐受，但通常(并非一直)沒(méi)有2型糖尿病中常見(jiàn)的肥胖。在許多方面，患有這些病況的對(duì)象表現(xiàn)出1型糖尿病和2型糖尿病的雜合癥狀。因而受累對(duì)象按基本遞增的嚴(yán)重程度分為若干類別，包括：a型糖尿病抗性、c型胰島素抗性(akahair-an綜合征)、rabson-mendenhall綜合征，最后是donohue氏綜合征或矮怪病(leprechaunism)。這些病癥與非常高的內(nèi)源性胰島素水平相關(guān)，和非常常見(jiàn)的與高血糖相關(guān)。因而受累對(duì)象還存在多種與“胰島素毒性”相關(guān)的臨床特征，包括雄激素過(guò)多、多囊卵巢綜合征(pcos)、多毛癥和在皮膚褶皺中的黑棘皮病(過(guò)度的生長(zhǎng)和色素沉積)。

“2型糖尿病”是這樣的病況，其特征是無(wú)視胰島素的可利用度的葡萄糖過(guò)度生產(chǎn)，并且由于不充分的葡萄糖清除導(dǎo)致循環(huán)葡萄糖水平仍然非常高。

“1型糖尿病”是這樣的病況，其特征是由總體缺少的胰島素導(dǎo)致的高血糖水平。是當(dāng)身體的免疫系統(tǒng)攻擊胰腺中的胰島素生產(chǎn)β細(xì)胞并破壞這些細(xì)胞時(shí)發(fā)生的。于是胰腺生產(chǎn)很少或不生產(chǎn)胰島素。

“葡萄糖不耐受”或受損的糖耐受(igt)是血糖代謝障礙的前糖尿病狀態(tài)，與增加的心血管病理風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。前糖尿病病況阻止對(duì)象將葡萄糖有效率地移入細(xì)胞并利用葡萄糖作為有效率的燃料來(lái)源，導(dǎo)致血液中升高的葡萄糖水平和一定程度的胰島素耐受。

“高血糖”定義為血液中過(guò)多的糖(葡萄糖)。

“低血糖”也被稱為低血糖，當(dāng)血糖水平降至太低而不能提供身體活動(dòng)足夠的能源時(shí)發(fā)生。

“高胰島素血癥”定義為血液中高于正常水平的胰島素。

“胰島素耐受”定義為這樣的狀態(tài)，其中，正常量的胰島素產(chǎn)生了低于正常的生物學(xué)應(yīng)答。

“肥胖”就人類對(duì)象而言，可定義為體重比給定群體的理想體重高出20％(r.h.williams,textbookofendocrinology,1974,904-916頁(yè))。

“糖尿病并發(fā)癥”是由高血糖水平和其他的身體功能(如腎、神經(jīng)(神經(jīng)病)、足(足部潰瘍和循環(huán)低下)和眼(例如，視網(wǎng)膜病))導(dǎo)致的問(wèn)題。糖尿病還增加心臟病和骨和關(guān)節(jié)病癥的風(fēng)險(xiǎn)。糖尿病的其他長(zhǎng)期并發(fā)癥包括皮膚問(wèn)題、消化問(wèn)題、性功能障礙和牙齒與牙齦的問(wèn)題。

“代謝綜合征”可定義為下列信號(hào)中的至少3個(gè)的群：腹部肥胖--大部分男性中，40英寸腰或更粗；高血糖--空腹后至少110毫克/分升(mg/dl)；高甘油三酯--血流中至少150mg/dl；低hdl--少于40mg/dl；130/85mmhg或更高的血壓。

“胰腺炎”是胰腺的炎癥。

“血脂異?！笔侵鞍状x的病癥，包括脂蛋白過(guò)度生產(chǎn)或缺陷。血脂異?？梢员憩F(xiàn)為血液中的總膽固醇、低密度脂蛋白(ldl)膽固醇和甘油三酯濃度的升高，和高密度脂蛋白(hdl)膽固醇濃度的減少。

“非醇型脂肪肝病(nafld)”是與醇消耗無(wú)關(guān)的肝病，其特征是肝細(xì)胞的脂肪改變。

“非醇型脂肪性肝炎(nash)”是與醇消耗無(wú)關(guān)的肝病，其特征是肝細(xì)胞的脂肪改變，伴隨小葉內(nèi)炎癥和纖維化。

“高血壓”或高血液壓力是全身動(dòng)脈血壓暫時(shí)或持續(xù)升高至可能導(dǎo)致心血管損害或其他不利結(jié)果的水平。高血壓可人為定義為高于140mmhg的收縮壓或高于90mmhg的舒張壓。

“心血管疾病”是涉及心臟或血管的疾病。

“急性心肌梗塞”當(dāng)在對(duì)部分心臟的血液供應(yīng)中斷時(shí)發(fā)生。如果在足夠長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)沒(méi)有治療所導(dǎo)致的缺血和缺氧，可以導(dǎo)致心臟肌肉組織(心肌)的損害或死亡(梗塞)。

“外周動(dòng)脈病”當(dāng)在將血液攜帶給頭部、內(nèi)臟或四肢的動(dòng)脈中斑塊增多時(shí)發(fā)生。斑塊可以隨時(shí)間變硬，使動(dòng)脈變窄，這限制富氧血流向器官和身體的其他部分。

“動(dòng)脈粥樣硬化”是血管病，其特征是在大型和中型動(dòng)脈的內(nèi)膜上不規(guī)則分布的脂類沉積物，導(dǎo)致動(dòng)脈管腔變窄，并最終發(fā)展為纖維化和鈣化。病損通常是病灶性的，并緩慢且間歇地發(fā)展。血流受限是大部分臨床表現(xiàn)的原因，但臨床表現(xiàn)隨病損的分布和嚴(yán)重程度改變。

“中風(fēng)”是與持續(xù)超過(guò)24小時(shí)的腦循環(huán)損傷相關(guān)的任何急性臨床事件。中風(fēng)涉及不可逆的腦損害，癥狀的類型和嚴(yán)重程度取決于循環(huán)已經(jīng)受損的腦組織的位置和范圍。

“心力衰竭”，也被稱為阻塞性心力衰竭，是心臟不再泵送充足的血液至身體其余部分的病癥。

“冠心病”，也被稱為冠狀動(dòng)脈病，是為心臟供應(yīng)血液和氧氣的小血管變窄。

“腎臟病”或腎病是腎臟的任何疾病。糖尿病性腎病是1型或2型糖尿病人的發(fā)病率和死亡率的主要原因。

“神經(jīng)病”是任何涉及腦神經(jīng)或外周或自主神經(jīng)系統(tǒng)的疾病。

“胃輕癱”是胃蠕動(dòng)減弱，導(dǎo)致延遲的腸排空。

本發(fā)明涵蓋的危重患者一般經(jīng)歷著不穩(wěn)定的高代謝狀態(tài)。該不穩(wěn)定的代謝狀態(tài)是由于底物代謝改變?cè)斐傻?，這可導(dǎo)致一些營(yíng)養(yǎng)物的相對(duì)缺乏。一般而言，脂肪和肌肉都存在增加的氧化作用。

此外，危重患者優(yōu)選是經(jīng)歷全身性炎性應(yīng)答綜合征或呼吸窘迫的患者。發(fā)病率降低意指危重患者出現(xiàn)其他疾病、病況或癥狀的可能性降低，或者其他疾病、病況或癥狀的嚴(yán)重程度降低。例如，降低的發(fā)病率可對(duì)應(yīng)于減少的細(xì)菌血癥或敗血癥或與多器官衰竭相關(guān)的并發(fā)癥發(fā)生。

如本文使用的，除非上下文中另外明確指出，否則單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括了復(fù)數(shù)的指代。因此，例如，“抗體”的稱呼包括了兩個(gè)或多個(gè)這類抗體的混合物。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“約”指數(shù)值的+/-20％，更優(yōu)選+/-10％，或仍然更優(yōu)選+/-5％。

術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白質(zhì)”是可互換使用的，指任何長(zhǎng)度的氨基酸的聚合形式，可以包括編碼和非編碼的氨基酸、天然和非天然存在的氨基酸、化學(xué)或生物化學(xué)修飾的或衍生的氨基酸，和具有修飾的肽骨架的多肽。術(shù)語(yǔ)包括融合蛋白，包括但不限于具有異源氨基酸序列的融合蛋白、具有異源和同源前導(dǎo)序列的融合物、有或無(wú)n-末端甲硫氨酸殘基；免疫標(biāo)記的蛋白質(zhì)等。

術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”、“對(duì)象”、“宿主”和“患者”可互換的使用，指任何需要診斷、治療或療法的對(duì)象，特別是人。其他對(duì)象可包括牛、狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬等。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)象是人。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“樣品”指來(lái)自患者的生物學(xué)材料。本發(fā)明測(cè)定的樣品不限于任何特定的類型。作為非限制性的例子，樣品包括單細(xì)胞、多細(xì)胞、組織、腫瘤、生物體液、生物分子，或任何上述材料的上清液或提取物。例子包括從活組織檢查移出的組織、在切除中移出的組織、血液、尿液、淋巴組織、淋巴液、腦脊液、粘液和糞便樣品。使用的樣品一般根據(jù)測(cè)定模式、檢測(cè)方法和待測(cè)定的腫瘤、組織、細(xì)胞或提取物的性質(zhì)而改變。用于制備樣品的方法是本領(lǐng)域普遍已知的，可以方便地調(diào)整從而獲得與所用方法相容的樣品。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)分子”包括但不限于多肽、核酸和糖類。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”指基因、蛋白質(zhì)或位于細(xì)胞內(nèi)側(cè)、外側(cè)或表面上的任何分子的質(zhì)量或數(shù)量的改變。改變可以是分子的表達(dá)或水平的增加或減少。術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”還包括改變生物學(xué)功能/活性的質(zhì)量或數(shù)量，所述生物學(xué)功能/活性包括但不限于降低血糖、胰島素、甘油三酯或膽固醇水平；降低肝臟的脂類或肝臟甘油三酯的水平；減少體重；改善糖耐受、能量消耗或胰島素敏感性的能力。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)劑”指調(diào)節(jié)一個(gè)或多個(gè)與fgf21相關(guān)性疾病(如1型或2型糖尿病或代謝病況(如肥胖))相關(guān)的生理學(xué)或生物化學(xué)事件的組合物。所述事件包括但不限于降低血糖、胰島素、甘油三酯或膽固醇水平；降低肝臟的脂類或肝臟甘油三酯的水平；減少體重；改善糖耐受、能量消耗或胰島素敏感性的能力。

“基因產(chǎn)物”是由基因表達(dá)或產(chǎn)生的生物聚合產(chǎn)物?；虍a(chǎn)物可以是例如未剪切的rna、mrna、mrna剪切變體、多肽、翻譯后修飾的多肽、剪切變體多肽等。該術(shù)語(yǔ)還涵蓋了使用rna基因產(chǎn)物作為模板生產(chǎn)的生物聚合產(chǎn)物(即，rna的cdna)?；虍a(chǎn)物可以酶促的、重組的、化學(xué)的生產(chǎn)，或者在對(duì)該基因而言是天然的細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)。在一些實(shí)施方案中，如果基因產(chǎn)物是蛋白質(zhì)性質(zhì)的，則其表現(xiàn)出生物學(xué)活性。在一些實(shí)施方案中，如果基因產(chǎn)物是核酸，則其可翻譯成表現(xiàn)出生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)性質(zhì)的基因產(chǎn)物。

如本文使用的，“調(diào)節(jié)fgf21活性”指fgf21活性的增加或減少，其可以是例如活性劑與fgf21多核苷酸或多肽相互作用、抑制fgf21、glp-1或毒蜥外泌肽-4轉(zhuǎn)錄和/或翻譯(例如，通過(guò)與fgf21基因，或與fgf21轉(zhuǎn)錄物的反義或sirna相互作用，通過(guò)調(diào)節(jié)促進(jìn)fgf21表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子)等的結(jié)果。例如，調(diào)節(jié)生物學(xué)活性指生物學(xué)活性的增加或減少。可以通過(guò)以下手段評(píng)估fgf21活性，包括但不限于測(cè)定對(duì)象的血糖、胰島素、甘油三酯或膽固醇水平，評(píng)估fgf21多肽水平，或通過(guò)評(píng)估fgf21轉(zhuǎn)錄水平。還可以通過(guò)例如測(cè)量fgf21下游生物標(biāo)志物的水平，和測(cè)量fgf21信號(hào)傳遞的增加，實(shí)現(xiàn)fgf21活性的比較。還可以通過(guò)測(cè)量：細(xì)胞信號(hào)傳遞；激酶活性；脂肪細(xì)胞中攝入的葡萄糖；血液胰島素、甘油三酯或膽固醇水平的波動(dòng)；肝臟脂類或甘油三酯水平的改變；fgf21與fgf21受體之間的相互作用；或fgf21受體的磷酸化，來(lái)評(píng)估fgf21活性。在一些實(shí)施方案中，fgf21受體的磷酸化可以是酪氨酸磷酸化。在一些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)fgf21活性可以導(dǎo)致調(diào)節(jié)fgf21相關(guān)的表型。

還可以通過(guò)例如測(cè)量fgf21下游生物標(biāo)志物的水平，和測(cè)量fgf21信號(hào)傳遞的增加，實(shí)現(xiàn)fgf21活性的比較。還可以通過(guò)測(cè)量：細(xì)胞信號(hào)傳遞；激酶活性；脂肪細(xì)胞中攝入的葡萄糖；血液胰島素、甘油三酯或膽固醇水平的波動(dòng)；肝臟脂類或甘油三酯水平的改變；fgf21與受體(fgfr-1c,fgfr-2c,或fgfr-3c)之間的相互作用；或fgf21受體的磷酸化，來(lái)評(píng)估fgf21活性。在一些實(shí)施方案中，fgf21受體的磷酸化可以是酪氨酸磷酸化。在一些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)fgf21活性可以導(dǎo)致調(diào)節(jié)fgf21相關(guān)的表型。

如本文使用的，“fgf21下游生物標(biāo)志物”是基因或基因產(chǎn)物，或基因或基因產(chǎn)物的可測(cè)量標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，是fgf21的下游標(biāo)志物的基因或活性表現(xiàn)出改變的表達(dá)水平，或在血管組織內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，在存在fgf21調(diào)節(jié)劑的條件下，下游標(biāo)志物的活性是改變的。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)用本發(fā)明的fgf21調(diào)節(jié)劑干擾fgf21信號(hào)傳遞時(shí)，下游標(biāo)志物表現(xiàn)出改變的表達(dá)水平。fgf21下游標(biāo)志物包括但不限于葡萄糖或2-脫氧葡萄糖攝取、perk和其他磷酸化或乙?；牡鞍踪|(zhì)或nad水平。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“上調(diào)”指活性或數(shù)量的增加、激活或刺激。例如，在本發(fā)明的背景下，fgf21調(diào)節(jié)劑可以增加fgf21受體的活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，應(yīng)答于fgf21調(diào)節(jié)劑，一個(gè)或多個(gè)fgfr-1c、fgfr-2c，或fgfr-3c可上調(diào)。上調(diào)還可以指fgf21相關(guān)的活性，例如降低血糖、胰島素、甘油三酯或膽固醇水平；降低肝臟的脂類或甘油三酯水平；減少體重；或改善糖耐受、能量消耗或胰島素敏感性；或?qū)е耭gf21受體磷酸化；或增加fgf21下游標(biāo)志物的能力。fgfr21受體可以是fgfr-1c、fgfr-2c，或fgfr-3c中的一個(gè)或多個(gè)。相比對(duì)照，可以是至少25％、至少50％、至少75％、至少100％、至少150％、至少200％、至少250％、至少400％或至少500％。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“n-末端”指蛋白質(zhì)的至少前20個(gè)氨基酸。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“n-末端結(jié)構(gòu)域”和“n-末端區(qū)”可互換的使用，指從蛋白質(zhì)的第一個(gè)氨基酸處開(kāi)始并在蛋白質(zhì)n-末端一半的任一氨基酸處結(jié)束的蛋白質(zhì)片段。例如，fgf21的n-末端結(jié)構(gòu)域是從seqidno:1的第一位氨基酸至seqidno:1的第10和105位氨基酸之間的任一氨基酸。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“c-末端”指蛋白質(zhì)的至少最后20個(gè)氨基酸。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“c-末端結(jié)構(gòu)域”和“c-末端區(qū)”可互換的使用，指從蛋白質(zhì)c-末端一半的任一氨基酸處開(kāi)始并在蛋白質(zhì)的最后一個(gè)氨基酸處結(jié)束的蛋白質(zhì)片段。例如，fgf21的c-末端結(jié)構(gòu)域在從seqidno:1的第105和200位氨基酸之間的任一氨基酸處開(kāi)始并在seqidno:1的第209位氨基酸處結(jié)束。

術(shù)語(yǔ)“結(jié)構(gòu)域”在本文中指對(duì)生物分子的已知功能或疑似功能有貢獻(xiàn)的生物分子的結(jié)構(gòu)部分。結(jié)構(gòu)域可以擴(kuò)及區(qū)域或其部分，還可以并入全部或部分所述區(qū)域以外，不同于特定區(qū)域的生物分子的部分。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“信號(hào)結(jié)構(gòu)域”(也被稱為“信號(hào)序列”或“信號(hào)肽”)指位于前體蛋白質(zhì)(通常是膜結(jié)合的或分泌的蛋白質(zhì))的n-末端區(qū)的氨基酸序列的連續(xù)片段中的肽結(jié)構(gòu)域，并參與翻譯后蛋白質(zhì)運(yùn)輸。在許多情況下，在完成分選過(guò)程后，通過(guò)專門的信號(hào)肽酶，從全長(zhǎng)蛋白質(zhì)中去除信號(hào)結(jié)構(gòu)域。每個(gè)信號(hào)結(jié)構(gòu)域指明了前體蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的特定目的地。fgf21的信號(hào)結(jié)構(gòu)域是seqidno:1的第1-28位氨基酸。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域”指與膜結(jié)合型受體蛋白質(zhì)接觸的蛋白質(zhì)的任何部分或區(qū)域，導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)答，如信號(hào)傳遞事件。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域”指本發(fā)明的融合蛋白的任何部分或區(qū)域，所述部分或區(qū)域保留了相應(yīng)天然序列的至少一個(gè)定性的結(jié)合活性。

術(shù)語(yǔ)“區(qū)域”指生物分子的初級(jí)結(jié)構(gòu)的物理上連續(xù)的部分。在蛋白質(zhì)的情況下，區(qū)域定義為該蛋白質(zhì)的氨基酸序列的連續(xù)部分。在一些實(shí)施方案中，“區(qū)域”與生物分子的功能相關(guān)。

術(shù)語(yǔ)“片段”在本文中指生物分子的初級(jí)結(jié)構(gòu)的物理上連續(xù)的部分。在蛋白質(zhì)的情況下，部分定義為該蛋白質(zhì)的氨基酸序列的連續(xù)部分并且指至少3-5個(gè)氨基酸，至少8-10個(gè)氨基酸，至少11-15個(gè)氨基酸，至少17-24個(gè)氨基酸，至少25-30個(gè)氨基酸，和至少30-45個(gè)氨基酸。在寡核苷酸的情況下，部分定義為該寡核苷酸的核酸序列的連續(xù)部分并且指至少9-15個(gè)核苷酸，至少18-30個(gè)核苷酸，至少33-45個(gè)核苷酸，至少48-72個(gè)核苷酸，至少75-90個(gè)核苷酸，和至少90-130個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，生物分子的部分具有生物學(xué)活性。在本發(fā)明的上下文中，fgf21多肽片段不包含seqidno:1中所述的整個(gè)fgf21多肽序列。

“天然序列”多肽是具有與自然界來(lái)源的多肽相同的氨基酸序列的多肽。這類天然序列多肽可以從自然界分離，或者可以通過(guò)重組或合成的手段生產(chǎn)。因此，天然序列多肽可以具有天然存在的人多肽、鼠多肽或來(lái)自任何其他哺乳動(dòng)物物種的多肽的氨基酸序列。

如本文使用的，詞組“同源核苷酸序列”或“同源氨基酸序列”或其變化形式，指由至少指明的百分比的核苷酸水平或氨基酸水平的同源性表征的序列，并與“序列同一性”可互換的使用。同源核苷酸序列包括那些編碼蛋白質(zhì)同種型的序列。作為例如rna的可變剪切的結(jié)果，這類同種型可以在同一生物體的不同組織中表達(dá)?？蛇x的，同種型可以由不同的基因編碼。同源核苷酸序列包括編碼人以外的物種(包括，但不限于哺乳動(dòng)物)的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。同源核苷酸序列還包括但不限于本文所示出的核苷酸序列的天然存在的等位改變和突變。同源氨基酸序列包括含有保守性氨基酸取代并且所述多肽具有相同的結(jié)合和/或活性的那些氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，如果與對(duì)比序列具有至少60％或更大的，最多99％的同一性，則核苷酸或氨基酸序列是同源的。在一些實(shí)施方案中，如果與對(duì)比序列享有一個(gè)或多個(gè)，最多60個(gè)核苷酸/氨基酸取代、添加或缺失，核苷酸或氨基酸序列是同源的。在一些實(shí)施方案中，同源氨基酸序列具有不超過(guò)5個(gè)或不超過(guò)3個(gè)保守的氨基酸取代。

可以通過(guò)例如gap程序(wisconsin序列analysispackage,version8forunix,geneticscomputergroup,universityresearchpark,madisonwi)和使用默認(rèn)設(shè)置，來(lái)確定百分比同源性或同一性，該程序使用smith和waterman算法(adv.appl.math.,1981,2,482-489)。在一些實(shí)施方案中，探針和靶之間的同源性在約75％至約85％之間。在一些實(shí)施方案中，核酸具有與seqidno:2或其部分至少約95％，約97％，約98％，約99％和約100％同源的核苷酸。

同源性還可以在多肽水平。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白的構(gòu)件多肽可以與其全長(zhǎng)野生型對(duì)應(yīng)物或相應(yīng)的天然序列、或其部分至少95％同源。本發(fā)明的融合蛋白或其部分和不同氨基酸序列的同一性程度或百分比計(jì)算為兩條序列比對(duì)中準(zhǔn)確匹配的數(shù)量除以“本發(fā)明序列”或“外源序列”的最短長(zhǎng)度。結(jié)果表示為百分比同一性。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“混合”指在相同區(qū)域中組合一個(gè)或多個(gè)化合物、細(xì)胞、分子等在一起的過(guò)程。這可以在例如允許一個(gè)或多個(gè)化合物、細(xì)胞、分子混合的試管、培養(yǎng)皿或任何容器中實(shí)施。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“基本純化的”指從其天然環(huán)境中移出且不含至少60％，至少75％，和至少90％的與其天然相關(guān)的其他組分的化合物(例如，多核苷酸或多肽或抗體)。

術(shù)語(yǔ)“可藥用的運(yùn)載體”指用于施用治療劑，如抗體或多肽、基因和其他治療劑的運(yùn)載體。術(shù)語(yǔ)指任何本身不導(dǎo)致產(chǎn)生對(duì)接受組合物的個(gè)體有害的抗體的藥學(xué)運(yùn)載體，且可以施用而沒(méi)有不過(guò)度的毒性。合適的載體可以是大的、代謝緩慢的大分子，如蛋白質(zhì)、多糖、多聚乳酸、多聚甘油酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物、脂類聚集物和失活的病毒顆粒。這類運(yùn)載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員普遍已知的。治療組合物中的可藥用的運(yùn)載體可包括液體，如水、生理鹽水、甘油和乙醇。這類運(yùn)載體中也可以存在輔助物質(zhì)，如濕潤(rùn)劑或乳化劑、ph緩沖物質(zhì)等。

增強(qiáng)本發(fā)明的融合蛋白的物理穩(wěn)定性

由半胱氨酸殘基提供的天然存在的二硫鍵一般地增加了蛋白質(zhì)的熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性。按融解溫度增加測(cè)量的，增加的熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性的成功例子是酶t4溶菌酶(matsumura等人，pnas86:6562-6566(1989))和芽孢桿菌rna酶(barnase)(johnson等人,j.mol.biol.268:198-208(1997))的多個(gè)二硫鍵突變體。本發(fā)明的一個(gè)方面是在存在防腐劑的條件下fgf21的增強(qiáng)的物理穩(wěn)定性，這是由變體中存在的二硫鍵實(shí)現(xiàn)的，所述二硫鍵限制了野生型fgf21的靈活性從而限制了防腐劑接近蛋白質(zhì)的疏水核心。

因此，本發(fā)明的第二個(gè)方面提供了具有增強(qiáng)的藥學(xué)穩(wěn)定性的人fgf21變體，或其生物學(xué)活性肽，所述增加的藥學(xué)穩(wěn)定性是由摻入額外的二硫鍵賦予的，例如通過(guò)向本發(fā)明的野生型fgf21蛋白質(zhì)或多肽和蛋白質(zhì)變體中摻入或取代入半胱氨酸殘基。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，除本文所述的提示的實(shí)施方案外，可以利用天然的半胱氨酸，半胱氨酸103和半胱氨酸121作為座位導(dǎo)入給予改善的性質(zhì)的新的二硫鍵。

這包括在野生型fgf21中摻入下列中兩個(gè)或多個(gè)的半胱氨酸取代的融合蛋白：谷氨酰胺46、精氨酸47、酪氨酸48、亮氨酸49、酪氨酸50、蘇氨酸51、天冬氨酸52、天冬氨酸53、丙氨酸54,谷氨酰胺55,谷氨酰胺56、蘇氨酸57、谷氨酸58、丙氨酸59、組氨酸60、亮氨酸61、谷氨酸62、異亮氨酸63、纈氨酸69、甘氨酸70、甘氨酸71、丙氨酸72、丙氨酸73、亮氨酸144、組氨酸145、亮氨酸146、脯氨酸147、甘氨酸148、天冬酰胺149、賴氨酸150、絲氨酸151、脯氨酸152、組氨酸153、精氨酸154、天冬氨酸155、脯氨酸156、丙氨酸157、脯氨酸158、精氨酸159、甘氨酸160、脯氨酸161、丙氨酸162、精氨酸163、苯丙氨酸164，其中氨基酸的編號(hào)是基于全長(zhǎng)209個(gè)氨基酸的hfgf21序列seqidno:1。

此外，本發(fā)明的融合蛋白可以摻入野生型人fgf21的變體，或其生物學(xué)活性肽，除了在cys103-cys121處天然存在的二硫鍵之外，所述野生型人fgf21的變體，或其生物學(xué)活性肽被改造的二硫鍵增強(qiáng)，如下:gln46cys-ala59cys,gln46cys-his60cys,gln46cys-leu61cys,gln46cys-glu62cys,gln46cys-ile63cys,arg47cys-ala59cys,arg47cys-his60cys,arg47cys-leu61cys,arg47cys-glu62cys,arg47cys-ile63cys,tyr48cys-ala59cys,tyr48cys-his60cys,tyr48cys-leu61cys,tyr48cys-glu62cys,tyr48cys-ile63cys,leu49cys-ala59cys,leu49cys-his60cys,leu49cys-leu61cys,leu49cys-glu62cys,leu49cys-ile63cys,tyr50cys-ala59cys,tyr50cys-his60cys,tyr50cys-lue61cys,tyr50cys-glu62cys,tyr50cys-ile63cys,leu144cys-gly160cys,leu144cys-pro161cys,leu144cys-ala162cys,leu144cys-arg163cys,leu144cys-phe164cys,his145cys-gly160cys,his145cys-pro161cys,his145cys-ala162cys,his145cys-arg163cys,his145cys-phe164cys,leu146cys-gly160cys,leu146cys-pro161cys,leu146cys-ala162cys,leu146cys-arg163cys,leu146cys-phe164cys,pro147cys-gly160cys,pro147cys-pro161cys,pro147cys-ala162cys,pro147cys-arg163cys,pro147cys-phe164cys,gly148cys-gly160cys,gly148cys-pro161cys,gly148cys-ala162cys,gly148cys-arg163cys,gly148cys-phe164cys,thr57cys-val69cys,thr57cys-gly70cys,thr57cys-gly71cys,thr57cys-ala72cys,thr57cys-ala73cys,glu58cys-val69cys,glu58cys-glu70cys,glu58cys-g71cys,glu58cys-ala72cys,glu58cys-ala73cys,ala59cys-val69cys,ala59cys-gly70cys,ala59cys-gly71cys,ala59cys-ala72cys,ala59cys-ala73cys,his60cys-val69cys,his60cys-gly70cys,his60cys-gly71cys,his60cys-ala72cys,his60cys-ala73cys,leu61cys-val69cys,leu61cys-gly70cys,leu61cys-gly71cys,leu61cys-ala72cys,leu61cys-ala73cys,arg47cys-gly148cys,tyr48cys-gly148cys,leu49cys-gly148cys,tyr50cys-gly148cys,thr51cys-gly148cys,asp52cys-gly148cys,asp53cys-gly148cys,ala54cys-gly148cys,gln55cys-gly148cys,gln56cys-gly148cys,thr57cys-gly148cys,glu58cys-gly148cys,arg47cys-asn149cys,tyr48cys-asn149cys,leu49cys-asn149cys,tyr50cys-asn149cys,thr51cys-asn149cys,asp52cys-asn149cys,asp53cys-asn149cys,ala54cys-asn149cys,gln55cys-asn149cys,gln56cys-asn149cys,thr57cys-asn149cys,glu58cys-asn149cys,arg47cys-lys150cys,tyr48cys-lys150cys,leu49cys-lys150cys,tyr50cys-lys150cys,thr51cys-lys150cys,asp52cys-lys150cys,asp53cys-lys150cys,ala54cys-lys150cys,gln55cys-lys150cys,gln56cys-lys150cys,thr57cys-lys150cys,glu58cys-lys150cys,arg47cys-ser151cys,tyr48cys-ser151cys,leu49cys-ser151cys,tyr50cys-ser151cys,thr51cys-ser151cys,asp52cys-ser151cys,asp53cys-ser151cys,ala54cys-ser151cys,gln55cys-ser151cys,gln56cys-ser151cys,thr57cys-ser151cys,glu58cys-ser151cys,arg47cys-pro152cys,tyr48cys-pro152cys,leu49cys-pro152cys,tyr50cys-pro152cys,thr51cys-pro152cys,asp52cys-pro152cys,asp53cys-pro152cys,ala54cys-pro152cys,gln55cys-pro152cys,gln56cys-pro152cys,thr57cys-pro152cys,glu58cys-pro152cys,arg47cys-his153cys,tyr48cys-his153cys,leu49cys-his153cys,tyr50cys-his153cys,thr51cys-his153cys,asp52cys-his153cys,asp53cys-his153cys,ala54cys-his153cys,gln55cys-his153cys,gln56cys-his153cys,thr57cys-his153cys,glu58cys-his153cys,arg47cys-arg154cys,tyr48cys-arg154cys,leu49cys-arg154cys,tyr50cys-arg154cys,thr51cys-arg154cys,asp52cys-arg154cys,asp53cys-arg154cys,ala54cys-arg154cys,gln55cys-arg154cys,gln56cys-arg154cys,thr57cys-arg154cys,glu58cys-arg154cys,arg47cys-asp155cys,tyr48cys-asp155cys,leu49cys-asp155cys,tyr50cys-asp155cys,thr51cys-asp155cys,asp52cys-asp155cys,asp53cys-asp155cys,ala54cys-asp155cys,gln55cys-asp155cys,gln56cys-asp155cys,thr57cys-asp155cys,glu58cys-asp155cys,arg47cys-pro156cys,tyr48cys-pro156cys,leu49cys-pro156cys,tyr50cys-pro156cys,thr51cys-pro156cys,asp52cys-pro156cys,asp53cys-pro156cys,ala54cys-pro156cys,gln55cys-pro156cys,gln56cys-pro156cys,thr57cys-pro156cys,glu58cys-pro156cys,arg47cys-ala157cys,tyr48cys-ala157cys,leu49cys-ala157cys,tyr50cys-ala157cys,thr51cys-ala157cys,asp52cys-ala157cys,asp53cys-ala157cys,ala54cys-ala157cys,gln55cys-ala157cys,gln56cys-ala157cys,thr57cys-ala157cys,glu58cys-ala157cys,arg47cys-pro158cys,tyr48cys-pro158cys,leu49cys-pro158cys,tyr50cys-pro158cys,thr51cys-pro158cys,asp52cys-pro158cys,asp53cys-pro158cys,ala54cys-pro158cys,gln55cys-pro158cys,gln56cys-pro158cys,thr57cys-pro158cys,glu58cys-pro158cys,arg47cys-arg159cys,tyr48cys-arg159cys,leu49cys-arg159cys,tyr50cys-arg159cys,thr51cys-arg159cys,asp52cys-arg159cys,asp53cys-arg159cys,ala54cys-arg159cys,gln55cys-arg159cys,gln56cys-arg159cys,thr57cys-arg159cys,glu58cys-arg159cys,arg47cys-g160cys,tyr48cys-g160cys,leu49cys-g160cys,tyr50cys-gly160cys,thr51cys-gly160cys,asp52cys-gly160cys,asp53cys-gly160cys,ala54cys-gly160cys,gln55cys-gly160cys,gln56cys-gly160cys,thr57cys-gly160cys,glu58cys-gly160cys,arg47cys-pro161cys,tyr48cys-pro161cys,leu49cys-pro161cys,tyr50cys-pro161cys,thr51cys-pro161cys,asp52cys-pro161cys,asp53cys-pro161cys,ala54cys-pro161cys,gln55cys-pro161cys,gln56cys-pro161cys,thr57cys-pro161cys,glu58cys-pro161cys,arg47cys-ala162cys,tyr48cys-ala162cys,leu49cys-ala162cys,tyr50cys-ala162cys,thr51cys-ala162cys,asp52cys-ala162cys,asp53cys-ala162cys,ala54cys-ala162cys,gln55cys-ala162cys,gln56cys-ala162cys,thr57cys-ala162cys,glu58cys-ala162cys,arg47cys-arg163cys,tyr48cys-arg163cys,leu49cys-arg163cys,tyr50cys-arg163cys,thr51cys-arg163cys,asp52cys-arg163cys,asp53cys-arg163cys,ala54cys-arg163cys,gln55cys-arg163cys,gln56cys-arg163cys,thr57cys-arg163cys,glu58cys-arg163cys。

本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了包含野生型人fgf21的變體，或其生物學(xué)活性肽的融合蛋白，所述融合蛋白包含與本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案中指出的任何氨基酸位置處的任何帶電和/或極性但不帶電的氨基酸的取代與本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案中指出的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸位置處的半胱氨酸取代的組合。

本發(fā)明的融合蛋白相對(duì)于野生型蛋白質(zhì)比較物及其變體的改善

本領(lǐng)域普遍已知，研發(fā)蛋白質(zhì)藥物的重要挑戰(zhàn)是處理蛋白質(zhì)的物理和化學(xué)不穩(wěn)定性。當(dāng)預(yù)計(jì)將蛋白質(zhì)藥物制劑用于多種用途時(shí)，該挑戰(zhàn)甚至更明顯，可注射制劑需要穩(wěn)定的、濃縮的和保藏的溶液，同時(shí)保持有利的生物活性譜。文獻(xiàn)中的野生型fgf21的生物物理特征確立了當(dāng)濃縮的蛋白質(zhì)溶液(>5mg/ml)暴露于脅迫條件(如高溫或低ph)時(shí)，導(dǎo)致加快的締合和聚集(即，低下的物理穩(wěn)定性和生物制藥特性)。fgf21的濃縮蛋白質(zhì)溶液暴露于制藥防腐劑(例如，間甲酚)也對(duì)物理穩(wěn)定性具有負(fù)面影響。

因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是在生理學(xué)和防腐制劑條件下，增強(qiáng)濃縮溶液的物理穩(wěn)定性，同時(shí)維持化學(xué)穩(wěn)定性和生物學(xué)效價(jià)。認(rèn)為締合和聚集可能是由疏水性相互作用導(dǎo)致的，因?yàn)樵诮o定的蛋白質(zhì)濃度，溫度和離子強(qiáng)度對(duì)物理穩(wěn)定性具有可觀的影響。就大部分情況而言，靶向非保守的、假定的表面暴露的氨基酸殘基。分析這些殘基的局部環(huán)境，并選擇在結(jié)構(gòu)上被視為不重要的那些進(jìn)行誘變。一種開(kāi)始特異性改變的方法是通過(guò)導(dǎo)入谷氨酸殘基進(jìn)一步降低蛋白質(zhì)的pi(“谷氨酸掃描”)。假設(shè)帶電的取代基的導(dǎo)入將通過(guò)電荷-電荷排斥作用抑制疏水介導(dǎo)的聚集，并潛在的改善防腐劑相容性。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員還將認(rèn)識(shí)到，在充分程度的誘變下，通過(guò)導(dǎo)入正電荷，有或沒(méi)有同時(shí)減少負(fù)電荷，可以將pi改變到堿性ph范圍內(nèi)，從而允許電荷-電荷排斥作用。

與野生型fgf21作為生物治療劑的治療性應(yīng)用相關(guān)的其他困難是例如其體內(nèi)半壽期非常短(在小鼠和靈長(zhǎng)類中，分別在0.5和2h的量級(jí))。因此需要研發(fā)通過(guò)更高效價(jià)或更長(zhǎng)半壽期而更有效的后續(xù)化合物。本發(fā)明的融合蛋白是作為以更高效價(jià)和在半壽期延長(zhǎng)的制劑中實(shí)現(xiàn)fgf21治療的理想效果的方式研發(fā)的。

如本文進(jìn)一步所述，相比野生型fgf21短得多的半壽期和pct公開(kāi)wo10/129600中的融合蛋白fc-l(15)-fgf21(l98r、p171g、a180e)的17小時(shí)的半壽期而言，本發(fā)明的融合蛋白在小鼠內(nèi)具有大于2周的半壽期。本發(fā)明的融合蛋白還證實(shí)了比peg化的v76改善的半壽期和藥代動(dòng)力學(xué)特性，如本文所述和2010年11月19日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)61/415,476所述。

此外，1mpk的本發(fā)明的fc-fgf21融合蛋白比5mpk的v76更有效降低葡萄糖、胰島素、體重和肝脂肪。在ob/ob小鼠的為期12天的治療研究中，融合蛋白表現(xiàn)出相對(duì)于載體的下列％改變(所有的融合蛋白都以1.0mg/kg施用，并且v76以5.0mg/kg施用)：

相對(duì)于載體的總葡萄糖(auc)％改變：v76是-42％；v101是-53％，v103是-46％，而v188是-42％；

相對(duì)于載體的總血漿胰島素％改變：v76是-46％；v101是-82％，v103是-69％，而v188是-59％；

相對(duì)于載體的總體重％改變：v76是-7％；v101是-12％，v103是-12％，而v188是-11％；和

相對(duì)于載體的總肝脂肪％改變：v76是-30％；v101是-44％，v103是-50％，而v188是-51％；

類似的，體外測(cè)定揭示了本發(fā)明的融合蛋白相比v76同樣5倍或更高的效價(jià)：

在人脂肪細(xì)胞測(cè)定法的perk中(平均ec50±sem)，v76是21±2nm(n＝3)；v101是1.0±0.1nm(n＝3)，v103是1.3±0.2nm(n＝3)，而v188是1.4±0.4nm(n＝3)；

在用人βklotho測(cè)定法的hek293的perk中(平均ec50±sem)，v76是13±4nm(n＝5)，v101是0.60±0.06nm(n＝5)，v103是0.9±0.3nm(n＝5)，而v188是0.4±0.1nm(n＝3)；

在小鼠脂肪細(xì)胞測(cè)定法的葡萄糖攝取中(平均ec50±sem)，v76是5±1nm(n＝3)，v101是0.60±0.06nm(n＝3)，v103是0.60±0.07nm(n＝3)，而v188是0.48±0.14nm(n＝3)。

雖然本發(fā)明的實(shí)施方案涉及在生理學(xué)和保藏的藥物制劑條件下的物理和化學(xué)穩(wěn)定性，保持本發(fā)明的融合蛋白與例如野生型fgf21相比的生物學(xué)效價(jià)也是重要的考慮因素。因此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)的生物學(xué)效價(jià)由蛋白質(zhì)影響葡萄糖攝取和/或降低血漿葡萄糖水平的能力定義，如本文實(shí)施例中所示。

可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何手段生成和/或分離根據(jù)本發(fā)明施用的本發(fā)明的蛋白質(zhì)、多肽和/或肽。用于生產(chǎn)變體的最優(yōu)選的方法是通過(guò)重組dna方法，且是本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍已知的。這類方法描述在molecularbiology的currentprotocols中(johnwiley&sons,inc.)，其通過(guò)引用整合到本文中。

此外，優(yōu)選的實(shí)施方案包括源自本文所述變體的生物學(xué)活性肽。這類肽將含有所述取代中的至少一個(gè)，且變體將具有生物學(xué)活性?？梢杂杀绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何和所有手段生產(chǎn)肽，其例子包括但不限于酶促消化、化學(xué)合成或重組dna方法。

本領(lǐng)域已確立某些成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的肽的片段是生物學(xué)活性的。參見(jiàn)例如baird等人，proc.natl.acad.sci(usa)85:2324-2328(1988)和j.cell.phys.suppl.5:101-106(1987)。因此，對(duì)變體的片段或肽的選擇是基于本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)的。例如，已知二肽肽酶iv(dpp-iv或dpp-4)是絲氨酸型蛋白酶，參與神經(jīng)肽、內(nèi)分泌肽和細(xì)胞因子的失活(damme等人chem.immunol.72:42-56,(1999))。fgf21的n-末端(hisproilepro)含有可以潛在地是dpp-iv的底物的2個(gè)二肽，導(dǎo)致在n-末端截短4個(gè)氨基酸的fgf21片段。預(yù)料不到的是，野生型fgf21的這一片段被證實(shí)保留了生物學(xué)活性，因此，在n-末端截短至多4個(gè)氨基酸的本發(fā)明的蛋白質(zhì)是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案。

本發(fā)明還涵蓋了編碼上述變體的多核苷酸，可以是rna的形式或dna的形式，所述dna包括cdna、基因組dna和合成dna。dna可以是雙鏈的或單鏈的。編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的編碼序列可以作為遺傳密碼冗余性或簡(jiǎn)并性的結(jié)果而改變。

編碼本發(fā)明的融合蛋白的多核苷酸可包括下列：僅變體的編碼序列、變體的編碼序列和額外的編碼序列，如功能性多肽，或前導(dǎo)序列或分泌序列或原蛋白質(zhì)序列；變體的編碼序列和非編碼序列，如內(nèi)含子或變體的編碼序列的5’和/或3’非編碼序列。因此，術(shù)語(yǔ)“編碼變體的多核苷酸”涵蓋了這樣的多核苷酸，其不僅可包括變體的編碼序列，還包括包含額外的編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。

本發(fā)明還涉及所述編碼含有提示的取代的肽的片段、類似物和衍生物的多核苷酸的變體。多核苷酸的變體可以是人fgf21序列的天然存在的等位變體、上述非天然存在的變體，或截短的變體。因此，本發(fā)明還包括編碼上述變體的多核苷酸，以及這類多核苷酸的變體，所述變體編碼公開(kāi)的變體的片段、衍生物或類似物。這類核苷酸變體包括缺失變體、取代變體、截短的變體，和添加或插入變體，只要存在第一或第二實(shí)施方案的提示的氨基酸取代中的至少一種。

在將序列與表達(dá)控制序列有效連接后(即，放置在確保功能的位置上)，可在宿主中表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸。這些表達(dá)載體通常在宿主生物體中是可復(fù)制的，是作為附加體或作為宿主染色體dna的整合部分。通常，表達(dá)載體將含有選擇標(biāo)志物，例如四環(huán)素、新霉素和二氫葉酸還原酶，來(lái)允許檢測(cè)用想要的dna序列轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。fgf21變體可以在恰當(dāng)?shù)膯?dòng)子控制下，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)、酵母、細(xì)菌或其他細(xì)胞中表達(dá)。也可以應(yīng)用無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)生產(chǎn)這類蛋白質(zhì)，使用源自本發(fā)明的dna構(gòu)建體的rna。

大腸桿菌是克隆本發(fā)明的多核苷酸的特別有用的原核宿主。其他適合使用的微生物宿主包括枯草芽孢桿菌(bacillussubtilus)、鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimurium)、和沙雷氏菌屬(serratia)、假單胞菌屬(pseudomonas)、鏈球菌屬(streptococcus)和葡萄球菌屬(staphylococcus)的多個(gè)物種，但其他也可以用作選擇對(duì)象。在這些原核宿主中，還可以制備通常含有與宿主細(xì)胞相容的表達(dá)控制序列(例如，復(fù)制起點(diǎn))的表達(dá)載體。此外，可以存在多種普遍已知的啟動(dòng)子中的任一種，如乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)、β-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子系統(tǒng)或來(lái)自噬菌體λ或t7的啟動(dòng)子系統(tǒng)。啟動(dòng)子，任選地與操縱子序列，通常控制表達(dá)，并且具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列等，用于起始和完成轉(zhuǎn)錄和翻譯。

蛋白質(zhì)表達(dá)領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，甲硫氨酸或甲硫氨酸-精氨酸序列可以在成熟序列(seqidno:3)的n-末端導(dǎo)入用于在大腸桿菌中表達(dá)，并考慮落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，除非另外指出，否則在大腸桿菌中表達(dá)的本發(fā)明的蛋白質(zhì)在n-末端具有導(dǎo)入的甲硫氨酸序列。

其他微生物，如酵母或真菌，也可用于表達(dá)。巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)、釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)和安格斯畢赤酵母(pichiaangusta)是優(yōu)選的酵母宿主的例子，其含有具有表達(dá)控制序列(如啟動(dòng)子)，需要時(shí)包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖分解酶，復(fù)制起點(diǎn)、終止序列等的合適載體。黑曲霉(aspergillusniger)、里氏木霉(trichodermareesei)；和裂褶菌(schizophyllumcommune)是真菌宿主的例子，但也可以應(yīng)用其他菌作為選擇對(duì)象。

還可以使用哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)和生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。真核細(xì)胞實(shí)際上是優(yōu)選的，因?yàn)楝F(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)研發(fā)了多種能夠分泌完整的變體的合適的宿主細(xì)胞系，包括cho細(xì)胞系、多種cos細(xì)胞系、nso細(xì)胞、敘利亞倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系、hela細(xì)胞或人胚腎細(xì)胞系(即，hek293、hek293ebna)。

用于這些細(xì)胞的表達(dá)載體可包括表達(dá)控制序列，如復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和必要的加工信息位點(diǎn)，如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、rna剪切位點(diǎn)、多聚腺苷酸化位點(diǎn)，和轉(zhuǎn)錄終止子序列。優(yōu)選的表達(dá)控制序列是源自sv40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、勞氏肉瘤病毒等的啟動(dòng)子。優(yōu)選的多聚腺苷酸化位點(diǎn)包括源自sv40和牛生長(zhǎng)激素的序列。

可以將含有目標(biāo)多核苷酸序列(例如，本發(fā)明的融合蛋白和表達(dá)控制序列)的載體通過(guò)普遍已知的方法轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中，所述方法取決于細(xì)胞宿主的類型。例如，氯化鈣轉(zhuǎn)染是通常用于真核細(xì)胞的，而磷酸鈣處理或電穿孔則可用于其他細(xì)胞宿主。

可以使用多種蛋白質(zhì)純化的方法，這類方法是本領(lǐng)域已知的，描述在例如deutscher,methodsinenzymology182:83-9(1990)和scopes,proteinpurification:principlesandpractice,springer-verlag,ny(1982)。選擇的純化步驟將取決于例如用于本發(fā)明的融合蛋白的生產(chǎn)過(guò)程的性質(zhì)。

本發(fā)明的蛋白質(zhì)、多肽和/或肽，例如本發(fā)明的雙活性融合蛋白，應(yīng)該以與良好的醫(yī)學(xué)實(shí)踐一致的方式配制和給藥，考慮患者的臨床病況、遞送蛋白質(zhì)組合物的位點(diǎn)、施用方法、施用的計(jì)劃，和實(shí)踐人員已知的其他因素。因此，通過(guò)這類考慮確定用于本文目的的本發(fā)明的融合蛋白的“治療有效量”。

可以通過(guò)實(shí)現(xiàn)一般預(yù)期目的：治療1型和2型糖尿病、肥胖、代謝綜合征或危重患者的任何手段，施用本發(fā)明的蛋白質(zhì)的藥物組合物。非限制性的可允許的施用手段包括例如，通過(guò)吸入或栓劑或例如通過(guò)灌洗陰道、直腸、尿道、口腔和舌下組織，口腔、鼻、局部、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)、不經(jīng)腸道、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、胸骨內(nèi)、通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)注射，淋巴管內(nèi)、間質(zhì)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、滑膜內(nèi)、經(jīng)上皮和經(jīng)皮向粘膜組織施用。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)灌洗、口腔或動(dòng)脈內(nèi)施用藥物組合物。其他合適的導(dǎo)入方法還可以包括可充電的或可生物降解的裝置，和緩釋或持續(xù)釋放的聚合物裝置。本發(fā)明的藥物組合物還可以作為與其他已知代謝劑的組合療法的一部分施用。

施用劑量取決于接受者的年齡、健康和體重、同步治療的種類(如果有的話)、治療的頻率，和理想效應(yīng)的性質(zhì)。本發(fā)明范圍內(nèi)的組合物包括所有其中存在fgf21變體的組合物，所述fgf21變體的量有效實(shí)現(xiàn)了治療1型或2型糖尿病、肥胖或代謝綜合征的理想醫(yī)學(xué)效果。雖然個(gè)體需求在每個(gè)患者中不同，確定所有組分的有效量的最佳范圍屬于普通醫(yī)生的能力范圍內(nèi)。

可以根據(jù)已知方法配制本發(fā)明的蛋白質(zhì)，以制備制藥上有效的組合物。理想的制劑是可用高純度的恰當(dāng)稀釋劑或水性溶液重建的穩(wěn)定的凍干產(chǎn)物，任選地具有可藥用的運(yùn)載體、防腐劑、賦形劑或穩(wěn)定劑(remington’spharmaceuticalsciences第16版(1980))。可以組合本發(fā)明的蛋白質(zhì)與可藥用的緩沖劑，并且調(diào)節(jié)ph以提供可接受的穩(wěn)定性和對(duì)于施用而言可接受的ph。

對(duì)于不經(jīng)腸道的施用，在一個(gè)實(shí)施方案中，一般如下配制本發(fā)明的融合蛋白：在可注射形式(溶液、懸浮液或乳化液)的單位劑量中，以理想的純度混合一種或多種所述蛋白質(zhì)與可藥用的運(yùn)載體，即，在所應(yīng)用的劑量和濃度下對(duì)接受者無(wú)毒且與制劑的其他成分相容的運(yùn)載體。優(yōu)選的，可以添加一種或多種可藥用的抗微生物劑。苯酚、間甲酚和苯甲醇是優(yōu)選的可藥用的抗微生物劑。

任選的，可以添加一種或多種可藥用的鹽以調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度或滲透壓?？梢蕴砑右环N或多種賦形劑以進(jìn)一步調(diào)節(jié)制劑的等滲性。甘油、氯化鈉和甘露醇是等滲性調(diào)節(jié)賦形劑的例子。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地優(yōu)化用于包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)的治療組合物的制藥上有效的劑量和施用方案，如由良好醫(yī)學(xué)實(shí)踐和個(gè)體患者的臨床病況所確定。本發(fā)明蛋白質(zhì)的典型劑量范圍是成人從約0.01mg/天至約1000mg/天(或約0.05mg/周至約5000mg/周，每周施用1次)。優(yōu)選的，劑量范圍是從約0.1mg/天至約100mg/天(或約0.5mg/周至約500mg/周，每周施用1次)，更優(yōu)選從約1.0mg/天至約10mg/天(或約5mg/周至約50mg/周，每周施用1次)。最優(yōu)選的，劑量是約1-5mg/天(或約5mg/周至約25mg/周，每周施用1次)。施用的fgf21變體的恰當(dāng)劑量將導(dǎo)致降低的血糖水平，增加空腹的能量消耗和更有效的葡萄糖利用，因而可用于治療1型或2型糖尿病、肥胖和代謝綜合征。

此外，由于在使用營(yíng)養(yǎng)支持的危重患者中常見(jiàn)高血糖和胰島素抗性，一些icu施用胰島素，來(lái)治療飼喂的危重患者的過(guò)高的高血糖。事實(shí)上，近期研究記載了使用外源性胰島素維持血糖在不超過(guò)110mg/分升的水平降低了手術(shù)重癥監(jiān)護(hù)病房中的危重患者的發(fā)病率和死亡率，不論所述患者是否具有糖尿病史(vandenberghe等人nengljmed.,345(19):1359,(2001))。因而，本發(fā)明的蛋白質(zhì)是獨(dú)特地適合幫助恢復(fù)代謝不穩(wěn)定的危重患者中的代謝穩(wěn)定性的。本發(fā)明的蛋白質(zhì)(如含有fgf21變體的蛋白質(zhì))是獨(dú)特的，在于其刺激葡萄糖攝取并增強(qiáng)胰島素靈敏度，且不誘導(dǎo)高血糖。

在本發(fā)明的另一個(gè)方面，考慮使用本發(fā)明的蛋白質(zhì)作為藥物，用于治療肥胖、1型和2型糖尿病、胰腺炎、血脂異常、非醇型脂肪肝病(nafld)、非醇型脂肪性肝炎(nash)、胰島素耐受、高胰島素血癥、葡萄糖不耐受、高血糖、代謝綜合征、急性心肌梗塞、與胰島素受體的嚴(yán)重失活突變相關(guān)的病況、和其他代謝病癥。

位點(diǎn)特異性fgf21突變體

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白包括額外的fgf21突變體或具有非天然氨基酸的fgf21類似物。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白包含具有野生型fgf21的一個(gè)或多個(gè)下列額外修飾的的fgf21激動(dòng)劑：

(i)額外的二硫鍵、非天然氨基酸或修飾以促進(jìn)二聚化，如在r154c處形成二硫鍵，或在另一個(gè)位點(diǎn)導(dǎo)入半胱氨酸，或通過(guò)融合的fc結(jié)構(gòu)域二聚化，或通過(guò)交聯(lián)劑(如雙功能peg)形成二聚體；

(ii)fgf21的片段；

(iii)選擇的具有fgf21活性(與β-klotho結(jié)合，結(jié)合和激活fgfr)的蛋白質(zhì)；和

(iv)fgf21模擬抗體(多種模式，如fab、unibody、svfc等)。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白包含一個(gè)或多個(gè)下列接頭：簡(jiǎn)單的酰胺鍵、短肽(特別是ser/gly重復(fù))、fgf21翻譯序列的額外殘基，或多至完整蛋白質(zhì)的較大接頭(如fc結(jié)構(gòu)域、結(jié)合has的螺旋束，hsa等)。還可以通過(guò)其他化學(xué)手段連接兩個(gè)部分，如通過(guò)非天然氨基酸或標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)接頭(馬來(lái)酰亞胺-cys、nhs-lys、“點(diǎn)擊”等)。

本發(fā)明的其他實(shí)施方案包括但不限于下列用于延長(zhǎng)半壽期的連接：結(jié)合has的脂類或小分子或微團(tuán)與融合物的單體或二聚體形態(tài)連接。

在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以對(duì)本發(fā)明的蛋白質(zhì)、多肽和/或肽進(jìn)行其他連接，實(shí)現(xiàn)延長(zhǎng)半壽期和其他改良的生物學(xué)特性。可包括連接peg-膽固醇綴合物(包括微團(tuán)和脂質(zhì)體)與本發(fā)明的蛋白質(zhì)、多肽和/或肽，和/或連接糖類(糖基化)與本發(fā)明的蛋白質(zhì)、多肽和/或肽。在仍然其他的實(shí)施方案中，應(yīng)用類似的技術(shù)向蛋白質(zhì)、多肽和/或肽添加綴合物，例如，多唾液酸(psa)、羥乙基淀粉(hes)、白蛋白結(jié)合配體，或碳水化合物盾。

hes化技術(shù)通過(guò)還原性烷基化作用，例如偶聯(lián)分枝的羥乙基淀粉(hes)鏈(60kda或100kda，來(lái)自玉米淀粉的高分枝的支鏈淀粉片段)與蛋白質(zhì)、多肽和/或肽。多唾液酸化作用以與peg化相似的方式用多唾液酸(psa)綴合目標(biāo)蛋白質(zhì)、多肽和/或肽。psa聚合物是天然存在于體內(nèi)的帶負(fù)電的、非免疫原性的聚合物，并且可以10-50kd的分子量獲得。

在本發(fā)明的仍然其他的實(shí)施方案中，可以對(duì)本發(fā)明的蛋白質(zhì)、多肽和/或肽進(jìn)行其他連接或修飾，以實(shí)現(xiàn)延長(zhǎng)半壽期和其他改善的生物學(xué)特性。這些包括生成重組peg(rpeg)基團(tuán)，及其與本發(fā)明的蛋白質(zhì)、多肽和/或肽的連接。如公司amunix,inc.研發(fā)的。rpeg技術(shù)是基于具有peg-樣特性的蛋白質(zhì)序列，所述序列在遺傳上與生物藥劑融合，避免了額外的化學(xué)綴合步驟。rpeg是半壽期延長(zhǎng)的艾塞那肽構(gòu)建體，其含有疏水性氨基酸的長(zhǎng)的非結(jié)構(gòu)性尾部，并且能夠增加蛋白質(zhì)或肽的血清半壽期并減慢其吸收速率，因此顯著降低了峰-谷比。rpeg具有增加的水動(dòng)力學(xué)半徑，并且顯示了是其實(shí)際分子量約15倍的表觀分子量，模擬了peg化實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)的血清半壽期的方式。

截短的fgf21多肽

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及成熟的fgf21多肽(seqidno:3)的截短形式。本發(fā)明的這一實(shí)施方案產(chǎn)生自鑒別截短的fgf21多肽的工作，所述截短的fgf21多肽能夠提供與未截短形式的成熟fgf21多肽相似的，在一些情況下更優(yōu)秀的活性。

如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“截短的fgf21多肽”指這樣的fgf21多肽，其中已經(jīng)從fgf21多肽的氨基末端(或n-末端)去除了氨基酸殘基，已經(jīng)從fgf21多肽的羧基末端(或c-末端)去除了氨基酸殘基，或者已經(jīng)從fgf21多肽的氨基末端和羧基末端去除了氨基酸殘基。如本文所述制備本文公開(kāi)的多種截短。

可以使用體外磷酸化-erk測(cè)定法，測(cè)定n-末端截短的fgf21多肽和c-末端截短的fgf21多肽的活性?？捎糜跈z驗(yàn)截短的fgf21多肽的活性的體外測(cè)定法的具體細(xì)節(jié)可見(jiàn)于實(shí)施例中。

還可以在體內(nèi)測(cè)定法中評(píng)估本發(fā)明的截短的fgf21多肽的活性，例如ob/ob小鼠。一般而言，為了評(píng)估截短的fgf21多肽的體內(nèi)活性，可以將截短的fgf21多肽腹膜內(nèi)施用給測(cè)試動(dòng)物。在理想的孵育期之后(例如1小時(shí)或更久)，可以提取血樣，并可以測(cè)量血葡萄糖水平。

a.n-末端截短

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，n-末端截短包含來(lái)自成熟fgf21多肽的n-末端的1、2、3、4、5、6、7或8個(gè)氨基酸殘基。具有少于9個(gè)氨基酸殘基的n-末端截短的截短的fgf21多肽保留了成熟fgf21多肽降低個(gè)體的血葡萄糖的能力。因此，在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋了具有n-末端截短1、2、3、4、5、6、7或8個(gè)氨基酸殘基的截短形式的成熟fgf21多肽或fgf21蛋白變體。

b.c-末端截短

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，c-末端截短包含來(lái)自成熟fgf21多肽的c-末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)氨基酸殘基。在體外elk-熒光素酶測(cè)定法(yiej.等人，febsletts583:19-24(2009))中，具有少于13個(gè)氨基酸殘基的c-末端截短的截短的fgf21多肽表現(xiàn)出的功效是野生型fgf21功效的至少50％，提示這些fgf21突變體保留了成熟fgf21多肽降低個(gè)體的血葡萄糖的能力。因此，在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋了具有c-末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)氨基酸殘基的截短形式的成熟fgf21多肽或fgf21蛋白變體。

c.n-末端和c-末端截短

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，截短的fgf21多肽可具有n-末端和c-末端截短的組合。具有n-末端和c-末端截短的組合的截短的fgf21多肽共享具有單獨(dú)的n-末端或c-末端截短的相對(duì)應(yīng)的截短的fgf21多肽的活性。換言之，具有少于9個(gè)氨基酸殘基的n-末端截短和少于13個(gè)氨基酸殘基的c-末端截短的截短的fgf21多肽擁有與具有少于9個(gè)氨基酸殘基的n-末端截短的截短的fgf21多肽或具有少于13個(gè)氨基酸殘基的c-末端截短的截短的fgf21多肽相似的或更大的降血糖活性。因此，在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋了具有n-末端截短1、2、3、4、5、6、7或8個(gè)氨基酸殘基和c-末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)氨基酸殘基的截短形式的成熟fgf21多肽或fgf21蛋白變體。

對(duì)于本發(fā)明的所有的fgf21變體，截短的fgf21多肽可任選地包含氨基末端的甲硫氨酸殘基，其可通過(guò)直接突變導(dǎo)入，或者是細(xì)菌表達(dá)過(guò)程的結(jié)果。

可以如本文所述的實(shí)施例中所述，制備本發(fā)明的截短的fgf21多肽。熟悉標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以應(yīng)用所述知識(shí)，結(jié)合本文公開(kāi)的內(nèi)容，制備和使用本發(fā)明的截短的fgf21多肽?？墒褂糜糜谥亟Mdna、寡核苷酸合成、組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化(例如電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。參見(jiàn)例如sambrook等人，molecularcloning:alaboratorymanual，見(jiàn)上文，其出于任何目的通過(guò)引用整合到本文中。可以根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明，如本領(lǐng)域常規(guī)實(shí)踐的那樣，實(shí)施酶促反應(yīng)和純化技術(shù)。除非提供了特殊的定義，否則本文所述的分析化學(xué)、合成有機(jī)化學(xué)、藥物化學(xué)和制藥化學(xué)的實(shí)驗(yàn)室方法和技術(shù)相關(guān)內(nèi)容中使用的術(shù)語(yǔ)都是本領(lǐng)域普遍已知的和常規(guī)使用的?？梢允褂糜糜诨瘜W(xué)合成；化學(xué)分析；藥劑制備、配方和遞送；和患者治療的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。

本發(fā)明的截短的fgf21多肽還可以與另一種實(shí)體融合，所述實(shí)體可以賦予截短的fgf21多肽額外的特性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，截短的fgf21多肽可以與igg恒定結(jié)構(gòu)域或其片段(例如fc區(qū))、人血清白蛋白(has)、或白蛋白結(jié)合多肽融合?？梢允褂靡阎姆肿由飳W(xué)方法和/或本文提供的指導(dǎo)實(shí)現(xiàn)這類融合。本文中更詳細(xì)的討論了這類融合多肽的好處，以及制備這類融合多肽的方法。

fgf21融合蛋白

如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“fgf21融合多肽”或“fgf21融合蛋白”指在本文所述的任何fgf21蛋白質(zhì)變體的n-末端或c-末端處融合一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基(如異源蛋白質(zhì)或肽)。

可以通過(guò)在例如本文定義的fgf21蛋白質(zhì)變體的n-末端或c-末端處融合異源序列，制備fgf21融合蛋白。如本文所述，異源序列可以是氨基酸序列或含有非氨基酸的聚合物。異源序列可以直接與fgf21蛋白變體融合，或者通過(guò)接頭或銜接子分子融合。接頭或銜接子分子可以是一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基(或-mer)，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9個(gè)殘基(或-mer)，優(yōu)選從10至50個(gè)氨基酸殘基(或-mer)，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50個(gè)殘基(或-mer)，和更優(yōu)選從15至35個(gè)氨基酸殘基(或-mer)。接頭或銜接子分子還可以設(shè)計(jì)為具有dna限制性內(nèi)切酶或蛋白酶的切割位點(diǎn)，以允許分開(kāi)融合的實(shí)體。

異源肽和多肽包括但不限于，允許檢測(cè)和/或分離fgf21蛋白變體的表位；跨膜受體蛋白質(zhì)或其部分，如胞外結(jié)構(gòu)域或跨膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域；與跨膜受體蛋白結(jié)合的配體或其部分；具有催化活性的酶或其部分；促進(jìn)寡聚化的多肽或肽，如亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域；增加穩(wěn)定性的多肽或肽，如免疫球蛋白恒定區(qū)；功能性或非功能性抗體，或其重鏈或輕鏈；和具有不同于本發(fā)明的fgf21蛋白變體的活性，如治療活性的多肽。本發(fā)明還涵蓋了與人血清白蛋白(has)融合的fgf21突變體。

a.fc融合物

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將fgf21蛋白變體與人igg的fc區(qū)的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域融合?？贵w包含2個(gè)功能上獨(dú)立的部分，被稱為“fab”的可變結(jié)構(gòu)域，其結(jié)合抗原，和被稱為“fc”的恒定結(jié)構(gòu)域，其涉及效應(yīng)子功能，如補(bǔ)體激活和吞噬細(xì)胞攻擊。fc具有長(zhǎng)血清半壽期，而fab是短壽命的(capon等人，1989,nature337:525-31)。當(dāng)與治療性蛋白質(zhì)連接在一起時(shí)，fc結(jié)構(gòu)域可以提供更長(zhǎng)的半壽期或摻入以下功能，例如結(jié)合fc受體、結(jié)合蛋白a、固定補(bǔ)體，和甚至可能的胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)(capon等人，1989)。

貫穿于本公開(kāi)內(nèi)容，fc-fgf21指fc序列與fgf21的n-末端融合的融合蛋白。類似的，貫穿于本公開(kāi)內(nèi)容，fgf21-fc指fc序列與fgf21的c-末端融合的融合蛋白。

本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案是包含如本文定義的fgf21變體的fc-fgf21融合蛋白。特別優(yōu)選的實(shí)施方案是包含如本文定義的修飾的fc片段(例如fclala)和fgf21變體的fc-fgf21融合蛋白。

可以通過(guò)例如使用蛋白a親和柱純化融合蛋白。已發(fā)現(xiàn)與fc區(qū)融合的肽和蛋白質(zhì)表現(xiàn)出比非融合的對(duì)應(yīng)物實(shí)質(zhì)上更長(zhǎng)的體內(nèi)半壽期。與fc區(qū)的融合還允許融合多肽二聚化/多聚化。fc區(qū)可以是天然存在的fc區(qū)，或者可以經(jīng)改變而改善某些品質(zhì)，如治療品質(zhì)、循環(huán)時(shí)間、或降低的凝聚。

pct公開(kāi)號(hào)wo00/024782中詳細(xì)討論了通過(guò)與抗體的“fc”結(jié)構(gòu)域融合的蛋白質(zhì)治療劑的有用修飾。該文件討論了與“載體”，如聚乙二醇(peg)、葡聚糖或fc區(qū)的連接。

b.融合蛋白接頭

當(dāng)形成本發(fā)明的融合蛋白時(shí)，可以但不必需應(yīng)用接頭。當(dāng)存在時(shí)，接頭的化學(xué)結(jié)構(gòu)可以不是關(guān)鍵的，因?yàn)槠渲饕鳛殚g隔子發(fā)揮作用。接頭可以由通過(guò)肽鍵連接在一起的氨基酸組成。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，接頭由通過(guò)肽鍵連接的從1-20個(gè)氨基酸組成，其中氨基酸選自20種天然存在的氨基酸。在多個(gè)實(shí)施方案中，1-20個(gè)氨基酸選自氨基酸甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和賴氨酸。在一些實(shí)施方案中，接頭由大多數(shù)立體結(jié)構(gòu)上無(wú)阻礙的氨基酸組成，如甘氨酸和丙氨酸。在一些實(shí)施方案中，接頭是聚甘氨酸、聚丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸的組合(如聚(gly-ala))、或甘氨酸和絲氨酸的組合(如聚(gly-ser))。盡管已發(fā)現(xiàn)15個(gè)氨基酸殘基的接頭對(duì)于fgf21融合蛋白特別有效，本發(fā)明考慮任何長(zhǎng)度或組成的接頭。

本文所述的接頭是示例性的，并且本發(fā)明也考慮長(zhǎng)得多并且包括其他殘基的接頭。本發(fā)明還考慮非肽類接頭。例如，可以使用烷基接頭。這類烷基接頭可以進(jìn)一步被任何無(wú)立體結(jié)構(gòu)阻礙的基團(tuán)取代，所述基團(tuán)包括但不限于低級(jí)烷基(例如c1-c6)、低級(jí)?；?、鹵素(例如cl、br)、cn、nh2或苯基。示例性的非肽接頭是聚乙二醇接頭，其中接頭具有100至5000kd，例如100至500kd的分子量。

化學(xué)修飾的融合蛋白

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以參考本文所述的公開(kāi)內(nèi)容，制備本文所述的融合蛋白的化學(xué)修飾形式，包括例如本文所述的fgf21融合物的截短的和變體形式。改變這類化學(xué)修飾的融合蛋白，使得化學(xué)修飾的突變體在與突變體天然連接的分子的類型或位置上不同于未修飾的突變體。化學(xué)修飾的突變體可包括通過(guò)缺失一個(gè)或多個(gè)天然連接的化學(xué)基團(tuán)而形成的分子。

在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)共價(jià)連接一個(gè)或多個(gè)聚合物，修飾本發(fā)明的蛋白質(zhì)。例如，選擇的聚合物通常是水溶性的，使得其連接的蛋白質(zhì)在水性環(huán)境，如生理環(huán)境中不沉淀。包括在合適的聚合物的范圍內(nèi)的是聚合物的混合物。優(yōu)選的，為了終產(chǎn)物制品的治療用途，聚合物將是可藥用的。與本發(fā)明的蛋白質(zhì)綴合的不溶于水的聚合物也形成本發(fā)明的一個(gè)方面。

每種示例性聚合物可以是任何分子量，且可以是分枝的或不分枝的。每種聚合物通常具有在約2kda至約100kda之間的平均分子量(術(shù)語(yǔ)“約”表示，在水溶性聚合物的制品中，一些分子重于，而一些輕于所述分子量)。每種聚合物的平均分子量?jī)?yōu)選在約5kda至約50kda之間，更優(yōu)選在約12kda至約40kda之間，最優(yōu)選在約20kda至約35kda之間。

合適的水溶性聚合物或其混合物包括但不限于n-連接或o-連接的碳水化合物、糖、磷酸鹽、聚乙二醇(peg)(包括已經(jīng)用于衍生蛋白質(zhì)的peg的形式，包括單-(c1-c10)、烷氧基，或芳氧基-聚乙二醇)、單甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖(如低分子量葡聚糖，例如約6kd)、纖維素或基于其他碳水化合物的聚合物、聚-(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇同聚物、聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物、聚氧乙基化的(polyoxyethlated)多元醇(例如，甘油)和聚乙烯醇。本發(fā)明還涵蓋了可用于制備共價(jià)連接的fgf21蛋白變體多聚體的雙功能交聯(lián)分子。本發(fā)明還涵蓋了與多唾液酸共價(jià)連接的fgf21突變體。

多糖聚合物是可用于蛋白質(zhì)修飾的另一類型的水溶性聚合物。因此，與多糖聚合物融合的本發(fā)明的融合蛋白形成了本發(fā)明的實(shí)施方案。葡聚糖是包含主要通過(guò)α1-6鍵連接的單個(gè)葡萄糖亞基的多糖聚合物。葡聚糖本身可以多種分子量獲得，并可以從約1kd至約70kd的分子量方便的獲得。葡聚糖是本身適用作為載體或與另一種載體(例如fc)組合的水溶性聚合物。參見(jiàn)例如國(guó)際公開(kāi)號(hào)wo96/11953。已報(bào)道了與治療性或診斷性免疫球蛋白綴合的葡聚糖的用途。參見(jiàn)例如歐洲專利公開(kāi)號(hào)0315456，其通過(guò)引用整合到本文中。本發(fā)明還涵蓋了約1kd至約20kd的葡聚糖的用途。

一般而言，可以在任何適合反應(yīng)蛋白質(zhì)與活化的多聚物分子的條件下實(shí)施化學(xué)修飾。用于制備化學(xué)修飾的多肽的方法一般包括步驟：(a)在使得fgf21蛋白變體變得與一個(gè)或多個(gè)聚合物分子連接的條件下，使多肽與活化的聚合物分子(如聚合物分子的反應(yīng)性酯類或醛類衍生物)反應(yīng)，和(b)獲得反應(yīng)產(chǎn)物。基于已知的參數(shù)和理想的結(jié)果，確定最佳反應(yīng)條件。例如，聚合物分子與蛋白質(zhì)的比例越大，連接的聚合物分子的百分比就越大。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，化學(xué)修飾的fgf21突變體可以在氨基末端具有單個(gè)聚合物分子部分(參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)5,234,784)。

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以與生物素化學(xué)偶聯(lián)。然后，本發(fā)明的生物素/蛋白質(zhì)允許與鏈霉親和素結(jié)合，獲得三價(jià)的鏈霉親和素/生物素/本發(fā)明的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)還可以與二硝基苯酚(dnp)或三硝基苯酚(tnp)共價(jià)偶聯(lián)，并且用抗dnp或抗tnp-igm沉淀得到的綴合物，以形成10價(jià)的十聚綴合物。

一般而言，可以通過(guò)施用本發(fā)明的化學(xué)修飾的fgf21突變體減輕或調(diào)節(jié)的病況包括本文所述的關(guān)于本發(fā)明的蛋白質(zhì)的那些病況。然而，本文公開(kāi)的化學(xué)修飾的fgf21突變體可具有額外的活性、增強(qiáng)的或降低的生物學(xué)活性或其他特征，如與未修飾的fgf21突變體相比增加的或減少的半壽期。

融合蛋白的治療組合物及其施用

本發(fā)明還提供了包含一種或多種本文所述的本發(fā)明的融合蛋白的治療組合物，所述融合蛋白與根據(jù)施用模式的適合性選擇的制藥上或生理學(xué)上可接受的制劑活性劑或可藥用的運(yùn)載體混合。鑒于例如鑒別表現(xiàn)出增強(qiáng)的特性的融合蛋白，來(lái)具體考慮組合物。

在一些實(shí)施方案中，治療組合物以作為液體溶液或懸浮液的可注射劑制備；也可以制備成適合在注射前溶解或懸浮在液體載體中的固體形態(tài)。可藥用的載體的定義中包括了脂質(zhì)體。可藥用的鹽也可以存在于藥物組合物中，例如礦物酸鹽，如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等；有機(jī)酸的鹽，如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等。關(guān)于制藥可接受的賦形劑的充分討論可獲得自remington:thescienceandpracticeofpharmacy(1995)alfonsogennaro,lippincott,williams,&wilkins。

在應(yīng)用的劑量和濃度，可接受的制劑材料優(yōu)選對(duì)受體是無(wú)毒的。

藥物組合物可含有制劑材料，用于修飾、維持或保持例如組合物的ph、滲透壓、粘度、清澈度、顏色、等滲性、氣味、無(wú)菌、穩(wěn)定性、溶解或釋放速率、吸收或滲透。合適的制劑材料包括但不限于氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸)、抗微生物劑、抗氧化劑(如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)、緩沖劑(如硼酸鹽、碳酸氫鹽、tris-hcl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機(jī)酸)、填充劑(如甘露醇或甘氨酸)、螯合劑(如乙二胺四乙酸(edta))、絡(luò)合劑(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-環(huán)糊精或羥丙基-β-環(huán)糊精)、填料、單糖、二糖和其他碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)、蛋白質(zhì)(如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)、著色劑、芳香劑和稀釋劑、乳化劑、親水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)、低分子量多肽、成鹽的抗衡離子(如鈉)、防腐劑(如苯扎氯銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或過(guò)氧化氫)、溶劑(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(如甘露糖醇或山梨糖醇)、懸浮劑、表面活性劑或濕潤(rùn)劑(如普朗尼克(pluronic)；peg；山梨糖酯；聚山梨醇酯類如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80；triton；氨丁三醇；卵磷脂；膽固醇或tyloxapal)、穩(wěn)定性增強(qiáng)劑(如蔗糖或山梨醇)、張力增強(qiáng)劑(如堿金屬鹵化物；優(yōu)選氯化鈉或氯化鉀；或甘露醇山梨糖醇)、遞送載體、稀釋劑、賦形劑和/或藥物佐劑(參見(jiàn)例如，remington’spharmaceuticalsciences(第18版，a.r.gennaro編著，mackpublishingcompany1990)及其隨后版，出于任何目的通過(guò)引用整合到本文中)。

熟練的技術(shù)人員可根據(jù)例如預(yù)期的施用途徑、遞送模式和理想劑量，確定最佳的藥物組合物(參見(jiàn)例如，remington’spharmaceuticalsciences，見(jiàn)上文)。這類組合物可以影響本發(fā)明的融合蛋白的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速率和體內(nèi)清除速率。

藥物組合物中的主要載體或運(yùn)載體本質(zhì)上可以是水性的或非水性的。例如，用于注射的合適載體或運(yùn)載體可以是水、生理鹽溶液或人工腦脊液，可能補(bǔ)充了不經(jīng)腸道施用的其他組合物中常見(jiàn)的材料。中性的緩沖生理鹽水或與血清白蛋白混合的生理鹽水是另一示例性的載體。其他示例性的藥物組合物包含約ph7.0-8.5的tris緩沖劑，或約ph4.0-5.5的醋酸緩沖劑，其還可包括山梨糖醇或合適的組分。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)混合處于凍干的餅或水性溶液形式的具有理想純度的選擇的組合物與任選的制劑活性劑(remington’spharmaceuticalsciences，見(jiàn)上文)，制備雙功能藥物組合物用于儲(chǔ)藏。此外，可以使用恰當(dāng)?shù)馁x形劑(如蔗糖)，將雙功能蛋白質(zhì)產(chǎn)物配制為凍干產(chǎn)物。

可以選擇含有本發(fā)明的融合蛋白的藥物組合物用于不經(jīng)腸道的遞送。備選的，可以選擇組合物用于吸入，或用于通過(guò)消化道，如口腔遞送。這類可藥用的組合物的制備是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。

制劑組分以施用位點(diǎn)可接受的濃度存在。例如，使用緩沖劑維持組合物處于生理學(xué)ph或略低的ph，通常在從約5至約8的ph范圍內(nèi)。

當(dāng)考慮不經(jīng)腸道的施用時(shí)，用于本發(fā)明的治療性組合物可以是不含致熱源的、腸道外可接受，水性溶液的形式，在可藥用的運(yùn)載體中包含理想的雙功能蛋白質(zhì)。用于不經(jīng)腸道注射的特別合適的載體是無(wú)菌蒸餾水，其中雙功能蛋白質(zhì)被配制為無(wú)菌的等滲溶液，被正確的保藏。而另一種制品可以涉及理想的分子和活性劑的制劑，所述活性劑例如可注射的微球、可生物蝕解的顆粒、多聚化合物(如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠或脂質(zhì)體，所述活性劑提供產(chǎn)物的受控或持續(xù)的釋放，然后通過(guò)積存注射劑遞送所述產(chǎn)物。還可以使用透明質(zhì)酸，其具有促進(jìn)在循環(huán)中持續(xù)期的效果。用于導(dǎo)入理想分子的其他合適手段包括可植入的藥物遞送裝置。

在一個(gè)實(shí)施方案中，可以配制用于吸入的藥物組合物。例如，可以將本發(fā)明的雙功能蛋白質(zhì)配制為用于吸入的干燥粉末。也可以用推進(jìn)劑配制雙功能蛋白質(zhì)的吸入溶液，用于氣霧劑遞送。在仍然另一個(gè)實(shí)施方案中，溶液可以是霧化的。國(guó)際公開(kāi)號(hào)wo94/20069中進(jìn)一步描述了肺部施用，其描述了肺部遞送化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)。

還考慮某些可以口服施用的制劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以用或不用在混合固體劑型(如片劑和膠囊)中常規(guī)使用的運(yùn)載體，配制以該方式施用的本發(fā)明的融合蛋白。例如，當(dāng)使生物利用度最大化和使前全身性降解最小化時(shí)，可以設(shè)計(jì)膠囊以在胃腸道中的點(diǎn)釋放制劑的活性部分。可以包括額外的活性劑以促進(jìn)吸收本發(fā)明的融合蛋白。還可以應(yīng)用稀釋劑、風(fēng)味劑、低熔點(diǎn)蠟、蔬菜油、潤(rùn)滑劑、懸浮劑、片劑崩解劑和粘合劑。

另一種藥物組合物可以涉及有效量的本發(fā)明的蛋白質(zhì)與適用于生產(chǎn)片劑的無(wú)毒的賦形劑的混合物。通過(guò)在無(wú)菌水或另一種恰當(dāng)?shù)妮d體中溶解片劑，可以制備單位劑型的溶液。合適的賦形劑包括但不限于惰性稀釋劑，如碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸氫鈉、乳糖或磷酸鈣；或結(jié)合劑，如淀粉、明膠或阿拉伯樹(shù)膠；或潤(rùn)滑劑，如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。

包含本發(fā)明的融合蛋白的額外的藥物組合物對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的，包括涉及處于持續(xù)或受控遞送制劑的本發(fā)明的融合蛋白的制劑。用于配制多種其他持續(xù)或受控遞送工具的技術(shù)也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，如脂質(zhì)體運(yùn)載體、可生物蝕解的顆粒、或多孔珠和積存注射劑(參見(jiàn)例如，國(guó)際公開(kāi)號(hào)wo93/15722，其描述了用于遞送藥物組合物的多孔聚合物微顆粒的受控釋放，和wischke&schwendeman,2008,int.jpharm.364:298-327，和freiberg&zhu,2004,int.jpharm.282:1-18，其討論了微球/微顆粒制品及用途)。

緩釋制品的額外的例子包括作為成型物件形式的半透性聚合物基質(zhì)，例如膜或微膠囊。緩釋基質(zhì)可包括聚酯、水凝膠、聚丙交酯(美國(guó)專利號(hào)3,773,919和歐洲專利號(hào)0058481)、l-谷氨酸和γ乙基-l-谷氨酸的共聚物(sidman等人,1983,biopolymers22:547-56)、聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)(langer等人,1981,j.biomed.mater.res.15:167-277和langer,1982,chem.tech.12:98-105)、乙烯-醋酸乙烯(langer等人，見(jiàn)上文)或聚-d-3-羥基丁酸(歐洲專利號(hào)0133988)。緩釋組合物還可包括脂質(zhì)體，其可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的若干種方法的任一種制備。參見(jiàn)例如，epstein等人,1985,proc.natl.acad.sci.u.s.a.82:3688-92；和歐洲專利號(hào)0036676、0088046和0143949。

用于體內(nèi)施用的本發(fā)明藥物組合物通常必須是無(wú)菌的。這可以通過(guò)無(wú)菌過(guò)濾膜過(guò)濾來(lái)實(shí)現(xiàn)。當(dāng)凍干組合物時(shí)，可以在凍干和重建之前或之后進(jìn)行利用該方法的滅菌。用于不經(jīng)腸道施用的組合物可以以凍干的形式或溶液儲(chǔ)藏。此外，不經(jīng)腸道的組合物一般放在具有無(wú)菌入口的容器中，例如具有可被皮下注射針頭穿刺的塞子的靜脈輸液袋或輸液瓶。

一旦配制了藥物組合物，則可以作為溶液、懸浮液、凝膠、乳劑、固體或作為脫水的或凍干的粉末儲(chǔ)藏在無(wú)菌瓶中。這類制劑可以以即用形式，或者以需要在施用前重建的形式(例如凍干的)儲(chǔ)藏。

在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)單劑量施用單元的試劑盒。每個(gè)試劑盒可含有具有理想蛋白質(zhì)的第一容器和具有水性制劑的第二容器。本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括了含有單室和多室的預(yù)填裝的注射器(例如，液體注射器和lyosyringe)的試劑盒。

融合蛋白的劑量及其施用

待應(yīng)用的本發(fā)明的藥物組合物的有效量在治療上取決于例如治療內(nèi)容和目標(biāo)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，用于治療的恰當(dāng)?shù)膭┝克綄⒉糠值母鶕?jù)遞送的分子、融合蛋白變體所用于的適應(yīng)癥、施用途徑、患者的大小(體重、體表面積或器官大小)和條件(年齡和健康狀態(tài))而改變。因此，醫(yī)生可以滴定劑量，并修飾施用途徑，以獲得最佳的治療效果。典型的劑量范圍可從約0.1μg/kg至多至約100mg/kg或更高，取決于上述因素。在其他實(shí)施方案中，劑量范圍可從0.1μg/kg多至約100mg/kg；或1μg/kg多至約100mg/kg。

給藥頻率將取決于使用的制劑中的雙功能蛋白質(zhì)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。通常，醫(yī)生將施用組合物直到達(dá)到實(shí)現(xiàn)理想效果的劑量。因此，組合物可以通過(guò)植入裝置或?qū)Ч茈S時(shí)間作為單次劑量、作為兩次或多次劑量(可含有或不含相同量的理想分子)，或作為連續(xù)灌注來(lái)施用。本領(lǐng)域普遍技術(shù)人員常規(guī)地對(duì)恰當(dāng)劑量進(jìn)行進(jìn)一步精細(xì)化，這屬于常規(guī)實(shí)施的任務(wù)的范圍?？梢酝ㄟ^(guò)使用恰當(dāng)?shù)膭┝?應(yīng)答數(shù)據(jù)，確定恰當(dāng)?shù)膭┝俊?/p>

藥物組合物的施用途徑與已知的方法一致，例如口服；通過(guò)靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦內(nèi)(腦實(shí)質(zhì)內(nèi))、腦室內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、門靜脈內(nèi)或病損內(nèi)的途徑注射；通過(guò)緩釋系統(tǒng)(也可以注射的)；或通過(guò)植入裝置。需要時(shí)，可以通過(guò)團(tuán)注射(bolusinjection)或連續(xù)灌注，或通過(guò)植入裝置，來(lái)施用組合物。

可選的或此外，可以通過(guò)植入其上已經(jīng)吸附或囊封了理想分子的膜、海綿或其他恰當(dāng)?shù)牟牧?，局部施用組合物。當(dāng)使用植入裝置時(shí)，裝置可以植入到任何合適的組織或器官中，可以通過(guò)擴(kuò)散、控制時(shí)間的快速濃注或連續(xù)施用，遞送理想的分子。

融合蛋白的治療性用途

本發(fā)明的蛋白質(zhì)可用于治療、診斷、減輕或預(yù)防多種疾病、病癥或病況，包括但不限于代謝病癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，所治療的代謝病癥是糖尿病，例如2型糖尿病。在其他實(shí)施方案中，代謝病癥是肥胖。其他實(shí)施方案包括代謝病況或病癥，如1型糖尿病、胰腺炎、血脂異常、非醇型脂肪肝病(nafld)、非醇型脂肪性肝炎(nash)、胰島素耐受、高胰島素血癥、葡萄糖不耐受、高血糖、代謝綜合征、高血壓、心血管病、急性心肌梗塞、動(dòng)脈粥樣硬化、外周動(dòng)脈病、中風(fēng)、心臟衰竭、冠心病、腎病、糖尿病并發(fā)癥、神經(jīng)病、與胰島素受體的嚴(yán)重失活突變相關(guān)的病癥、胃輕癱和其他的代謝病癥。

在應(yīng)用中，可以通過(guò)向有需要的患者施用治療有效劑量的本文所述的fgf21蛋白變體，治療病癥或病況如1型或2型糖尿病或肥胖。可以如本文所述實(shí)施施用，如通過(guò)iv注射、腹膜內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射或以片劑形式或液體制劑口服。在大部分情況下，理想的劑量可以由醫(yī)生確定，如本文所述，并可以代表fgf21突變體多肽的治療有效劑量。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，fgf21突變體多肽的治療有效劑量將尤其取決于施用計(jì)劃、施用的抗原的單位劑量、核酸分子或多肽是否與其他治療劑組合施用、接受者的免疫狀態(tài)和健康。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“治療有效劑量”意指研究人員、醫(yī)學(xué)博士或其他醫(yī)生發(fā)現(xiàn)在組織系統(tǒng)、動(dòng)物或人中觸發(fā)生物學(xué)或醫(yī)學(xué)應(yīng)答的fgf21突變體多肽的量，包括所治療的疾病或病癥的癥狀的減輕。

現(xiàn)已經(jīng)詳細(xì)描述了本發(fā)明，參考下列實(shí)施例將更清楚地理解本發(fā)明，所述實(shí)施例僅出于示例的目的包含在本文中，并非意在限制本發(fā)明。

除非另外指出，否則本發(fā)明的實(shí)踐將應(yīng)用化學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)和藥理學(xué)的本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的常規(guī)方法。文獻(xiàn)中充分解釋了這類技術(shù)。參見(jiàn)例如remington’spharmaceuticalsciences，第18版(easton,pennsylvania:mackpublishingcompany,1990)；methodsinenzymology(s.colowick和n.kaplan編著，academicpress,inc.)；和handbookofexperimentalimmunology,i-iv卷(d.m.weir和c.c.blackwell編著，1986,blackwellscientificpublications)；和sambrook等人，molecularcloning:alaboratorymanual(第2版，1989)。

實(shí)施例

實(shí)施例1：制備fgf21變體蛋白

fgf21v76的表達(dá)構(gòu)建體：將fgf21變體克隆到achmuller等(2007)(naturemethods4:1037-1043)所述的修飾的大腸桿菌表達(dá)載體pet30a中，生成與六組氨酸標(biāo)簽符合讀框的融合物，之后是在fgf21的n-末端處的n^pro-eddie標(biāo)簽(aa33-209)。

fgf21v76的表達(dá)和純化：將pet30a-his-n^pro-eddie-fgf21表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌bl21star(de3)感受態(tài)細(xì)胞(invitrogen)中。在含有50μg/ml卡那霉素的50mlterrificbroth(tb)中37℃生長(zhǎng)新鮮轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的單克隆過(guò)夜。將預(yù)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到1l含卡那霉素的tb培養(yǎng)基中，并在帶有擋板的燒瓶中37℃和250rpm振蕩下培養(yǎng)。培養(yǎng)6小時(shí)后，通過(guò)添加終濃度為1mm的iptg誘導(dǎo)fgf21的表達(dá)，并在37℃生長(zhǎng)培養(yǎng)物過(guò)夜。然后收獲細(xì)胞，并重懸在50ml冰冷的裂解緩沖液(50mmtris-hcl，ph8，150mmnacl，1mmedta)中，再使用microfluidizer^tm裂解。

通過(guò)在30,000xg4℃離心1小時(shí)，沉淀內(nèi)涵體(ib)。用50mmtris-hcl，ph8，150mmnacl洗滌ib，并然后溶解在30ml溶解緩沖液(10mmtris-hcl，ph8，100mmnah2po4，6mgnhcl)中。通過(guò)在30,000xg25℃離心1小時(shí)，使溶解的ib澄清。將ib溶液裝載到用溶解緩沖液平衡的5mlni-nta高性能樹(shù)脂柱(gehealthcare)上。通過(guò)將ph減少至4.5，洗脫與樹(shù)脂結(jié)合的蛋白質(zhì)。通過(guò)調(diào)節(jié)ph和添加濃度為20mm的二硫蘇糖醇(dtt)，使洗脫液條件化。將條件化的洗脫液緩慢稀釋為1l重折疊緩沖液(50mmtris-hcl，ph8，0.5m精氨酸，20mmdtt)中，隨后在4℃孵育2天。對(duì)稀釋的樣品進(jìn)行濃縮并使用超濾方法緩沖液交換為20mmtris-hcl，ph9。將濃縮的樣品裝載到用20mmtris-hcl(ph9)平衡的10mlqsepharose快速流動(dòng)樹(shù)脂柱(gehealthcare)上。

在用平衡緩沖液洗滌樹(shù)脂后，用20mmtris-hcl，ph9，500mmnacl洗脫與樹(shù)脂結(jié)合的蛋白質(zhì)。為了從重折疊的fgf21蛋白中去除切下來(lái)的his-n^pro融合片段和任何未切割的融合蛋白，將洗脫液裝載到用20mmtris，ph8.0，50mm咪唑平衡的5mlni-nta高性能樹(shù)脂柱(gehealthcare)上，并收集含fgf21的流通級(jí)分。為了降低內(nèi)毒素水平，用以10mmtris，ph8，50mm咪唑，500mmnacl，1mmcacl2平衡的endotraphd樹(shù)脂(hyglos)處理fgf21級(jí)分。用pbs透析低內(nèi)毒素樣品，然后用0.22μm濾器除菌。將純化的fgf21蛋白在液氮中速凍，并儲(chǔ)藏在-80℃。使用9362m^-1cm^-1作為fgf21的摩爾消光系數(shù)，通過(guò)280nm的吸光值，確定蛋白質(zhì)濃度。通過(guò)hplc、sds-page和液相色譜-質(zhì)譜，確定蛋白質(zhì)純度和完整性。

fgf21變體的半胱氨酸peg化：fgf21變體v76(r154c)具有通過(guò)改造的半胱氨酸二聚化的傾向；因此，在peg化前，在冰上用5mm巰基乙醇胺溫和地還原蛋白質(zhì)溶液(通常是在tris緩沖液中5mg/ml)30分鐘，并立即在20mmtris-hcl，ph7中脫鹽。然后，用1.5當(dāng)量的40kda分枝的馬來(lái)酰亞胺-peg試劑(nof，貨號(hào)#gl2-400ma，來(lái)自sunbright系列)在冰上將新還原的蛋白質(zhì)(通常為3mg/ml)立即peg化3小時(shí)。最后，通過(guò)陰離子交換層析(monoq)純化peg化的蛋白質(zhì)，整體產(chǎn)量為約25％。

fc-fgf21融合變體的表達(dá)構(gòu)建體：將編碼氨基酸33-209的人fgf21變體的cdna克隆到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中與包括指導(dǎo)蛋白質(zhì)分泌的前導(dǎo)肽(免疫球蛋白κ鏈)的n-末端序列讀框符合的巨細(xì)胞病毒(cmv)啟動(dòng)子的下游，后接fc結(jié)構(gòu)域和短接頭。

fc-fgf21變體的表達(dá)和純化：在hek293細(xì)胞(美國(guó)典型培養(yǎng)物收藏中心)中表達(dá)fc-fgf21變體蛋白。在freestyle293表達(dá)培養(yǎng)基(invitrogen，貨號(hào)#12338-018)中37℃，8％co2中以懸浮培養(yǎng)生長(zhǎng)細(xì)胞直到轉(zhuǎn)染當(dāng)天。在吊桶式轉(zhuǎn)頭中以1000xg離心細(xì)胞7min，并用自動(dòng)化細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。在900ml的freestyle293培養(yǎng)基中稀釋細(xì)胞至終濃度為1.4x10⁶細(xì)胞/ml，并放入3l無(wú)擋板的燒瓶(corning，貨號(hào)#431252)中。用聚乙烯亞胺(pei)和質(zhì)粒的混合物如下轉(zhuǎn)染細(xì)胞。將3ml無(wú)菌的線性m.w.25,000pei(alfaaesar，貨號(hào)#43896)的1mg/ml儲(chǔ)液加入到50mlfreestyle293培養(yǎng)基中，溫和混合，并在25℃孵育5分鐘。與此同時(shí)，向50mlfreestyle293培養(yǎng)基中加入1mg無(wú)內(nèi)毒素的質(zhì)粒，并用0.22μm濾器無(wú)菌過(guò)濾。然后，將pei混合物加入到無(wú)菌過(guò)濾的dna中，溫和混合，并允許在25℃孵育10分鐘。然后，將pei-質(zhì)粒混合物加入到含有稀釋的hek293細(xì)胞的3l燒瓶中，并置于125rpm，37℃，8％co2的振蕩溫箱中。

在轉(zhuǎn)染后第6天，以2000xg離心細(xì)胞10min，收獲上清液。通過(guò)0.8/0.2um濾器(pallcorporation，貨號(hào)#4628)過(guò)濾，進(jìn)一步澄清上清液。

通過(guò)直接向澄清的上清液中添加1ml重組蛋白asepharosefastflow(ge，貨號(hào)#17-5138-03)/20mg待純化的預(yù)期的蛋白質(zhì)，并在溫和轉(zhuǎn)動(dòng)下4℃孵育1小時(shí)，進(jìn)行fgf21蛋白的批量純化。然后，將上清液混合物倒在一次性的poly-prep層析柱(bio-rad，貨號(hào)#731-1550)上，并棄去流通液。用5倍柱體積的dpbs，ph7.4(invitrogen，貨號(hào)#14190-144)洗滌剩下的珠子。通過(guò)添加20倍柱體積的50mm檸檬酸鈉緩沖液ph3.0，從蛋白a珠子上洗脫蛋白質(zhì)。通過(guò)添加20％tris-hcl緩沖液，ph9.0中和洗脫緩沖液。通過(guò)在highload26/600superdex200pg柱(ge，貨號(hào)#28-9893-36)上運(yùn)行蛋白a批量純化的材料，實(shí)施尺寸排阻層析作為第二精制步驟。用a280定量純化的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。運(yùn)行sds-page，驗(yàn)證純度和分子量。通過(guò)使用endosafepts系統(tǒng)(charlesriverlabs)定量?jī)?nèi)毒素水平。

實(shí)施例2：測(cè)量fgf21依賴性2-脫氧葡萄糖(2-dog)攝取

已經(jīng)顯示在存在和不存在胰島素的條件下，fgf2刺激小鼠3t3-l1脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝入，并以劑量依賴性的方式減少ob/ob和db/db小鼠和8周齡zdf大鼠的餐后和空腹血糖、甘油三酯和胰高血糖素水平，因此，提供了使用fgf21作為用于治療糖尿病和肥胖的療法的基礎(chǔ)(參見(jiàn)例如，專利公開(kāi)wo03/011213，和kharitonenkov等人，(2005)jour.ofclinicalinvest.115:1627-1635)。還觀察到fgf21刺激3t3-l1脂肪細(xì)胞中的fgfr-1和fgfr-2的酪氨酸磷酸化。

3t3-l1成纖維細(xì)胞購(gòu)自atcc(貨號(hào)#cl173)。在150cm培養(yǎng)皿中，生長(zhǎng)細(xì)胞至匯合，并在補(bǔ)充了10％胎牛血清和1％青霉素-鏈霉素的高糖dmem(invitrogen，貨號(hào)#11995065)中維持額外4天。然后，細(xì)胞在補(bǔ)充了4μg/ml胰島素(sigma，貨號(hào)#i-5500)、115μg/mlibmx(sigma，貨號(hào)#i5879)和0.0975μg/ml地塞米松(sigma，貨號(hào)#d1756)的上述培養(yǎng)基中分化3天，之后用完全dmem替代分化培養(yǎng)基。在替換培養(yǎng)基的第二天，將一平板分化的3t3-l1脂肪細(xì)胞接種到4個(gè)96孔板中。

然后在完全培養(yǎng)基中，用fgf21-wt和fgf21變體蛋白處理脂肪細(xì)胞過(guò)夜(參見(jiàn)表2的變體列表；30pm至100nm是使用的典型濃度范圍)。在每孔50μlkrh緩沖液(0.75％nacl；0.038％kcl；0.0196％cacl2；0.032％mgso4；0.025mhepes，ph7.5；0.5％bsa；2mm丙酮酸鈉)中，血清饑餓用fgf21樣品處理過(guò)的脂肪細(xì)胞2小時(shí)。用于空白的孔添加1μl(終濃度5μg/ml)細(xì)胞松弛素b15min。在5.1mm冷的2-dog中1:20稀釋[3h]-2-dog(20.6mci/mmol，1mci/ml)，每孔加入1μl稀釋的2-dog，孵育細(xì)胞5min。用100μl/孔krh緩沖液洗滌細(xì)胞3次。向細(xì)胞中加入40μl/孔1％sds，振蕩細(xì)胞至少10分鐘。加入200μl/孔閃爍液，振蕩平板過(guò)夜，在β顯微讀板器中讀數(shù)。將從用細(xì)胞松弛素b處理過(guò)的整列/行獲得的數(shù)值平均，并從所有其他的數(shù)值中減去。用graphpadprism軟件分析數(shù)據(jù)，其結(jié)果概括在表2中。在誘導(dǎo)鼠3t3-l1脂肪細(xì)胞攝取2-脫氧葡萄糖中，fc-fgf21融合變體v101、v103和v188比peg化的fgf21變體v76優(yōu)秀。

實(shí)施例3：細(xì)胞western(icw)測(cè)定法中的perk

在dmem高糖，10％fbs，1％ps和600ng/mlg418中培養(yǎng)用人β-klotho穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的hek293細(xì)胞，并按每孔30,000個(gè)細(xì)胞接種在多聚d賴氨酸包被的96孔板(bdbioscience，貨號(hào)#356640)中過(guò)夜。細(xì)胞在dmem高糖，0.5％bsa，和10mmhepes中血清饑餓4小時(shí)。在饑餓培養(yǎng)基中，將wtfgf21和fgf21變體(參見(jiàn)表3的變體列表)稀釋成多種濃度(100pm至300nm是使用的典型濃度范圍)。用fgf21刺激細(xì)胞10分鐘。在fgf21或fgf21變體蛋白刺激后，從孔中吸出培養(yǎng)基，用100μl冷的pbs洗滌細(xì)胞1次，然后用100μl4％多聚甲醛室溫固定15分鐘，隨后用100μl冰冷的甲醇孵育額外的10分鐘。

固定后，用pbs中的0.3％tritonx-100洗滌細(xì)胞4次，每次5分鐘。向透性化的細(xì)胞中加入150μlodyssey封閉緩沖液，室溫1.5小時(shí)。在odyssey封閉緩沖液中，將磷酸-erk(perk)抗體稀釋至濃度為0.17μg/ml(1:200稀釋，或所示稀釋度)，并將總erk(terk)抗體稀釋至濃度為2.2μg/ml(1:200稀釋，或所示稀釋度)。每孔加入50μl，留下一列僅用二抗處理，用于歸一化背景。用濕紙巾和蓋子蓋住平板，防止蒸發(fā)，然后4℃孵育過(guò)夜。

之后，吸出一抗，并用pbs中的0.3％tween20洗滌細(xì)胞4次，每次5分鐘。在洗滌過(guò)程中，在含有1:1000稀釋的(或所示稀釋度)山羊抗小鼠alexa680和1:1000稀釋的(或所示稀釋度)irdye800山羊抗兔抗體的odyssey封閉緩沖液中制備二抗反應(yīng)混合物。一旦完成洗滌，向每個(gè)孔加入40μl反應(yīng)混合物。用黑色蓋子覆蓋平板以保護(hù)二抗不受光照，并在搖床上室溫孵育平板1小時(shí)。最后，再次用pbs中的0.3％tween20洗滌細(xì)胞4次，每次5分鐘，然后在li-corbioscienceodysseyinfraredimagingsystem(li-corbiosciences,lincoln,ne)上的700nm(紅)和800nm(綠)通道中掃描。alexa680將terk染成具有遠(yuǎn)紅外熒光(發(fā)射波長(zhǎng)668nm)，而irdye800將perk染成具有綠色熒光(發(fā)射波長(zhǎng)800nm)。為了消除熒光背景，將從僅用二抗處理過(guò)的整列/行獲得的數(shù)值平均并從平板中獲得的所有其他的數(shù)值中減去。為了將每個(gè)樣品中的perk量歸一化，用每個(gè)孔的perk的值除以terk的值。用graphpadprism軟件分析數(shù)據(jù)，其結(jié)果概括在表2中。在該erk磷酸化測(cè)定法中，fc-fgf21融合變體v101、v103和v188比peg化的fgf21變體v76優(yōu)秀。

表2：細(xì)胞western中的erk和小鼠3t3-l1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取測(cè)定法結(jié)果的概括

實(shí)施例4：fgf21變體的體內(nèi)測(cè)試

ob/ob小鼠是2型糖尿病的小鼠模型。小鼠缺少功能性的瘦素并且特征是高血糖、胰島素抗性、攝食過(guò)量、肝脂肪變性和肥胖。使用雄性ob/ob小鼠(10-13周齡)測(cè)量下列peg化的fgf21變體v76和fc-fgf21融合變體v101、v103和v188對(duì)血糖的效果。

皮下施用1mg/kgfgf21變體(v101、v103和v188)或pbs，或皮下施用5mg/kgv76，每周2次，12天(共計(jì)4次劑量)。在研究的第一天，測(cè)量尾部血糖和體重，并將小鼠分入不同的組(n＝8/組)，各組間具有匹配的平均血糖和體重。使用測(cè)糖儀(onetouch)測(cè)量血糖。在第1天給藥前，和第12天，最后一次給藥24小時(shí)后測(cè)量血漿胰島素。這些研究的結(jié)果概括在表5中。

這些研究的結(jié)果概括在表3和圖1-3中。在上述研究中測(cè)量的每個(gè)終點(diǎn)和低5倍的劑量下，fc-fgf21融合變體v101、v103和v188比peg化的fgf21變體v76優(yōu)秀。

表3：在ob/ob小鼠中的12天的研究中，fgf21變體導(dǎo)致的血漿葡萄糖、胰島素、體重(bw)增加、肝tg/脂質(zhì)相對(duì)載體的％改變

實(shí)施例5：小鼠中fgf21融合變體的藥代動(dòng)力學(xué)

為了確定fc-fgf21融合變體v101、v103和v188的藥代動(dòng)力學(xué)譜，iv注射c57bl/6j小鼠1mg/kg測(cè)試物，并在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)放血至第16天(384小時(shí))。將來(lái)自下頜下或眶后叢的血樣收集到edta包被的microtainer管中。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集約50μl血液，產(chǎn)生～25μl血漿。

為了通過(guò)elisa測(cè)量測(cè)試物的血漿濃度，用2μg/ml抗人fc-γ山羊多克隆抗體(30μl/孔)室溫(rt)包被384孔板過(guò)夜，然后用基于酪蛋白的稀釋劑rt封閉2小時(shí)(100μl/孔)。向平板中加入稀釋的樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照(30μl/孔)，rt孵育2小時(shí)。在去除樣品后，用基于磷酸鹽的洗滌溶液洗滌孔3次(100μl/孔)。向平板加入檢測(cè)抗體，hrp標(biāo)記的形態(tài)的捕獲抗體并rt孵育1小時(shí)(30μl/孔)。再用基于磷酸鹽的洗滌溶液洗滌孔3次后(100μl/孔)，加入化學(xué)發(fā)光底物(30μl/孔)，并用恰當(dāng)?shù)淖x板器在5分鐘內(nèi)讀取平板的化學(xué)發(fā)光。如圖4a和4b所示，fc-fgf21融合變體具有相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)中已知的fc-fgf21融合物(圖4a)和相對(duì)于peg化的fgf21變體v76(圖4b)大大延長(zhǎng)的血漿半壽期。

通過(guò)western印跡驗(yàn)證fc-fgf21測(cè)試物的血清水平，用于與由elisa測(cè)量的水平比較，確保在elisa中檢測(cè)到的是全長(zhǎng)fc-fgf21變體而非僅fc。將2μl小鼠血清與2.5μl4x上樣緩沖液，1μl10x變性劑和4μldh2o組合，加熱至95℃5分鐘，并上樣至4-12％梯度聚丙烯酰胺凝膠上，并在100伏特(恒定電壓)電泳1小時(shí)。使用iblot系統(tǒng)(invitrogen，貨號(hào)#ib1001，7分鐘運(yùn)行時(shí)間)，通過(guò)western印跡將樣品轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾紙上。用30mlrockland封閉溶液(貨號(hào)#mb-070)封閉硝酸纖維素濾紙，并用1:2000稀釋的山羊抗fgf21一抗(r&dsystems，貨號(hào)#baf2539)和1:10000稀釋的熒光標(biāo)記的鏈霉親和素作為二抗，按快速iblot系統(tǒng)的操作規(guī)程探測(cè)。在licorodyssey系統(tǒng)中，在700nm成像蛋白質(zhì)水平，并與在同一凝膠上運(yùn)行的2nm對(duì)照v101相比。如圖4c所示，使用抗fgf21抗體在western印跡中可以檢測(cè)到全長(zhǎng)fc-fgf21變體v101、v103和v188，至來(lái)自藥代動(dòng)力學(xué)研究的小鼠血清的第15天。

實(shí)施例6：fc-fgf21融合變體v101、v103和v188是極為熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定的

蛋白質(zhì)可以在特定的溫度范圍解折疊。蛋白質(zhì)解折疊的溫度是描述蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性的內(nèi)在參數(shù)。差異掃描量熱法(dsc)被用于檢測(cè)蛋白質(zhì)的解折疊溫度。該特征溫度被描述為融解溫度(tm)，其是蛋白質(zhì)解折疊過(guò)程中的峰值溫度。

在pbs中將最初的蛋白質(zhì)樣品稀釋至～1mg/ml(0.5mg/ml至1.2mg/ml)的濃度，總體積為0.5ml。向dsc96孔板中加入每孔等份的0.4ml稀釋的蛋白質(zhì)樣品、標(biāo)準(zhǔn)、pbs和di水。然后用封條覆蓋平板。在microcal的96孔差異掃描量熱儀中分析樣品。掃描溫度是從10-110攝氏度，速率為1攝氏度/分鐘。

如圖4d所示，fc-fgf21變體v101、v103和v188的融解溫度非常高。這與fgf21變體v76和野生型fgf21的較低融解溫度(數(shù)據(jù)未顯示)相反。將v101、v103和v188的改善的穩(wěn)定性歸因于特別添加的來(lái)自新的q55c和g148c突變的第二個(gè)二硫鍵。已知該類型的熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性保護(hù)蛋白質(zhì)免受蛋白水解作用，并還可以轉(zhuǎn)變成顯著延長(zhǎng)的體內(nèi)穩(wěn)定性和改善的藥代動(dòng)力學(xué)譜，如圖4b和4c中的數(shù)據(jù)所示例。

序列表

<110>boettcher,brian

daniels,doug

caplan,shari

hamamatsu,norio

weldon,stephen

licht,stuart

<120>用于治療代謝疾病的融合蛋白

<130>pat054783

<150>61/539280

<151>2011-09-26

<160>13

<170>用于windows的fastseq版本4.0

<210>1

<211>209

<212>prt

<213>智人

<400>1

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151015

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505560

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serleuhispheaspproglualacysserphearggluleuleuleu

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hisleuproglyasnlysserprohisargaspproalaproarggly

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proleusermetvalglyproserglnglyargserprosertyrala

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ser

<210>2

<211>940

<212>dna

<213>智人

<400>2

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acctggacaactggaatctggcaccaattctaaaccactcagcttctccgagctcacacc120

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tttttttatttttcttacttgagataataaagagttccagaggagaaaaaaaaaaaaaaa900

aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa940

<210>3

<211>181

<212>prt

<213>智人

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<213>智人

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tcctga546

<210>5

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2025

<210>6

<211>15

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<213>智人

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ggggsggggsggggs15

<210>7

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859095

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100105110

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115120125

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145150155160

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