本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體屬于分子免疫學(xué)，涉及藏豬il-12及其重組質(zhì)粒在制備pcv2疫苗免疫佐劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：豬肉產(chǎn)品是城鄉(xiāng)居民肉類消費(fèi)的主要來(lái)源，與人們生活息息相關(guān)。21世紀(jì)以來(lái)，我國(guó)生豬的年存欄數(shù)和出欄數(shù)一直保持占世界總量的50％左右，居世界首位。我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)取得舉世矚目成就的同時(shí)，還存在著許多制約我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的因素，其中疾病是最為主要的因素。目前，我國(guó)豬病診斷和防治水平與世界發(fā)達(dá)國(guó)家相比還存在著較大的差距，豬傳染性疾病仍然十分嚴(yán)重，圓環(huán)病毒2型(porcinecircovirustype2，pcv2)感染是較為常見的一類傳染病。pcv2是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaningmultisystemicwastingsyndrome，pmws)的主要病原，臨床上常與豬高致病性繁殖與呼吸綜合征、豬口蹄疫以及豬細(xì)小病毒病等混合感染、繼發(fā)感染，給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。pcv2不僅是引起pmws的病原體，而且還與豬皮炎與腎病綜合征、肉芽腫性腸炎、豬呼吸道疾病綜合征、母豬繁殖障礙、壞死性淋巴結(jié)炎及仔豬先天性震顫等疾病密切相關(guān)，這些與pcv2相關(guān)的疾病統(tǒng)稱為豬圓環(huán)病毒病(porcinecircovirusdisease，pcvd)。目前，防控pcvd的主要手段是接種疫苗，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在pcv2疫苗研究方便取得了顯著成就，成功研制了包括pcv2滅活疫苗、pcv2弱毒疫苗、pcv2基因工程疫苗、pcv1-2嵌合疫苗以及pcv2標(biāo)記疫苗等。但疫苗的使用存在一定的局限性，在我國(guó)pcv2全病毒滅活疫苗使用較為廣泛，而其他疫苗使用較少。而pcv2滅活苗疫苗免疫豬群后，會(huì)出現(xiàn)豬采食量明顯減少，偶有個(gè)別豬死亡等情況，為此，選擇毒性小，免疫效果好的免疫佐劑是解決這一問(wèn)題的不二途徑。常用免疫佐劑有脂質(zhì)體，殼聚糖等，但對(duì)細(xì)胞因子佐劑的研究較少。細(xì)胞因子是一類由生物體自身的造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的活性多功能蛋白。目前發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子有十幾種，其中白細(xì)胞介素(il)、腫瘤壞死因子(tnf-α)和干擾素(ifn-γ)這幾種對(duì)動(dòng)物極為重要。il-12是il-12細(xì)胞因子家族中的重要一員，是由p40和p35兩個(gè)亞基組成的異致二聚體，能增強(qiáng)nk細(xì)胞的活性，誘導(dǎo)th1細(xì)胞的分化，在許多炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)解中都起著重要的作用。細(xì)胞因子由于其天然存在于生物體內(nèi)，對(duì)免疫具有調(diào)節(jié)作用，近年來(lái)越來(lái)越受到關(guān)注，然而細(xì)胞因子在體內(nèi)的半衰期短，時(shí)效短而成本高，因此，將細(xì)胞因子基因克隆進(jìn)入質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染至生物體內(nèi)表達(dá)為解決這一問(wèn)題提供了思路。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明一個(gè)目的是提供藏豬il-12。本發(fā)明提供的一種蛋白質(zhì)(命名為il-12’)，由il-12蛋白p40亞基、2a(自剪切連接肽)、tpa(信號(hào)肽，作用分泌信號(hào))和il-12蛋白p35亞基組成；所述2a的氨基酸序列為序列2第324-344位；所述tpa的氨基酸序列為序列2第345-369位。上述蛋白質(zhì)中，所述il-12蛋白來(lái)源于藏豬；或，所述蛋白質(zhì)為如下(1)或(2)：(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(2)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白質(zhì)。編碼上述的蛋白質(zhì)的dna分子也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述dna分子是如下1)至3)中任一所述的dna分子：1)序列表中序列1所示的dna分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)所限定的dna分子雜交且編碼由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的dna分子；3)與1)所限定的dna分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且編碼由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的dna分子。上述嚴(yán)格條件可為在6×ssc、0.5％sds的溶液中，在65℃下雜交，然后用2×ssc、0.1％sds和1×ssc、0.1％sds各洗膜一次。含有上述的蛋白質(zhì)的dna分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌或含有所述重組載體的轉(zhuǎn)染試劑也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述重組載體為為將編碼上述的蛋白質(zhì)的dna分子插入真核表達(dá)載體中得到的載體；或，所述重組載體為將編碼上述的蛋白質(zhì)的dna分子插入真核表達(dá)載體中得到的載體；所述真核表達(dá)載體為vr1020質(zhì)粒。上述含有重組載體的轉(zhuǎn)染試劑為用殼聚糖包裹上述的重組載體得到的轉(zhuǎn)染試劑；具體制備方法如下：1、將vril-12溶液(溶劑為水)與適量的tpp溶液混合均勻，并在55℃下恒溫孵育20min，得到質(zhì)粒與tpp的預(yù)混液；vril-12和tpp的質(zhì)量比為1：3；10mg/ml的tpp溶液：將tpp溶解在ddh2o中，使tpp濃度為10mg/ml，得到10mg/ml的tpp溶液；2、在55℃水浴磁力攪拌情況下將上述質(zhì)粒與tpp的預(yù)混液緩慢滴加至殼聚糖溶液中，混合均勻，使得殼聚糖與質(zhì)粒的質(zhì)量比為30:1，然后恒溫孵育10min備用，得到包裹vril-12的殼聚糖納米顆粒；2.4mg/ml的殼聚糖溶液：將殼聚糖溶解在1％(ph5.5)的冰醋酸水溶液中，，使殼聚糖濃度為2.4mg/ml，得到2.4mg/ml的殼聚糖溶液?；蛩龊兄亟M載體的轉(zhuǎn)染試劑為用脂質(zhì)體包裹所述重組載體得到的轉(zhuǎn)染試劑。上述的轉(zhuǎn)染試劑中，所述殼聚糖和所述重組載體的質(zhì)量比為10:1；或所述脂質(zhì)體為dmrie，所述dmrie和質(zhì)粒的質(zhì)量比為2.5：1。上述的蛋白質(zhì)或上述的dna分子或上述的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌或含有所述重組載體的轉(zhuǎn)染試劑在制備如下1)-7)中任一中應(yīng)用；1)pcv2疫苗佐劑；2)提高pcv2疫苗免疫效果產(chǎn)品；3)促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的產(chǎn)品；4)增加動(dòng)物體重的產(chǎn)品；5)提高淋巴細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、cd3+t細(xì)胞、cd4+t或cd8+t細(xì)胞的數(shù)量的產(chǎn)品；6)提高血紅蛋白、igg、igg1、igg2a或pcv抗體含量的產(chǎn)品；7)提高il-12、il7、il23、il-4、il15、il6、il10、tlr3、tlr9、tlr1、tlr6、tlr2、tlr7、cd62l、ifn-γ、tnf-α、tgfβ-1、stat1、stat1，stat2，stat3，stat4、cd45、bcl-2或myd88表達(dá)量的產(chǎn)品。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種pcv2疫苗佐劑。本發(fā)明提供的pcv2疫苗佐劑，包括上述的蛋白質(zhì)或上述的dna分子或上述的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌或含有所述重組載體的轉(zhuǎn)染試劑。本實(shí)驗(yàn)首次利用基因克隆技術(shù)得到了藏豬il-12基因的p40和p35的基因片段，并用2a自剪切表達(dá)技術(shù)連接p40和p35基因從而得到了完整的il-12基因序列，再用in-fusion克隆方法將完整的il-12構(gòu)建到真核分泌型表達(dá)載體vr1020中，用殼聚糖包裹il-12質(zhì)粒制備殼聚糖納米顆粒并與pcv疫苗同時(shí)接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，分別采用小鼠和豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，結(jié)果表明il-12真核轉(zhuǎn)染質(zhì)粒能有效增強(qiáng)pcv疫苗的免疫應(yīng)答，為開發(fā)新型高效的pcv免疫佐劑提供了思路。附圖說(shuō)明圖1為p40和p35基因的電泳圖譜(1.0％瓊脂糖凝膠)，m：trans2k，2：p35，3：p40。圖2為p40、p35、2a-tpa片段電泳圖譜(1.0％瓊脂糖凝膠)，m:trans5k，1-2：p40，3-5：2a-tpa，6-7：p35。圖3為gfp在hke293細(xì)胞中表達(dá)情況，a：轉(zhuǎn)染前hek293生長(zhǎng)情況，b：轉(zhuǎn)染24小時(shí)后gfp在hek293細(xì)胞中表達(dá)情況，c：轉(zhuǎn)染48小時(shí)后gfp在hek293細(xì)胞中表達(dá)情況，d：轉(zhuǎn)染72小時(shí)后gfp在hek293細(xì)胞中表達(dá)情況。圖4為pcr產(chǎn)物電泳檢測(cè)圖譜(1.0％瓊脂糖凝膠)，m：trans5k，1：細(xì)胞對(duì)照，2：vr1020空載體對(duì)照，3：vril-12。圖5為淋巴母細(xì)胞增殖情況。圖6為殼聚糖包裹il-12質(zhì)粒的粒徑分布。圖7為藏豬pbmcs細(xì)胞il-12基因的表達(dá)量變化。圖8為藏豬pbmcs細(xì)胞toll-like受體基因的表達(dá)量變化。圖9為藏豬pbmcs細(xì)胞il-7、il-15和il-23的表達(dá)量變化。圖10為藏豬pbmcs細(xì)胞th1型細(xì)胞因子的表達(dá)量變化。圖11為藏豬pbmcs細(xì)胞th2型細(xì)胞因子的表達(dá)量變化。圖12為藏豬pbmcs細(xì)胞tgfβ-1的表達(dá)量變化。圖13為藏豬pbmcs細(xì)胞myd88的表達(dá)量變化。圖14為小鼠體重變化。圖15為小鼠外周血中血細(xì)胞的數(shù)量變化。圖16為小鼠血清中igg、igg1和igg2a的含量變化。圖17為小鼠血清中pcv-2抗體含量的變化。圖18為小鼠外周血中th和tc細(xì)胞亞群的數(shù)量變化。圖19為小鼠外周血中il-12基因的表達(dá)量變化。圖20為小鼠外周血中toll-like受體基因的表達(dá)量變化。圖21為小鼠外周血中免疫記憶相關(guān)基因的表達(dá)量變化。圖22為小鼠外周血中th1型細(xì)胞因子的表達(dá)量變化。圖23為小鼠外周血中th2型細(xì)胞因子的表達(dá)量變化。圖24為小鼠外周血中tgfβ-1的表達(dá)量變化。圖25為小鼠外周血中stat1的表達(dá)量變化。圖26為實(shí)驗(yàn)豬血細(xì)胞數(shù)量變化。圖27為實(shí)驗(yàn)豬外周血中t細(xì)胞變化。圖28為實(shí)驗(yàn)豬血清中igg的變化。圖29為實(shí)驗(yàn)豬血清中抗pcv-2抗體變化。圖30為實(shí)驗(yàn)豬tlr2和tlr7基因表達(dá)量變化。圖31為實(shí)驗(yàn)豬細(xì)胞因子基因表達(dá)量變化。圖32為實(shí)驗(yàn)豬免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子基因的表達(dá)量變化。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、真核重組質(zhì)粒vril-12的構(gòu)建一、提取外周血淋巴細(xì)胞的rna1、藏豬外周血淋巴細(xì)胞的分離與培養(yǎng)(1)采藏豬前腔靜脈血40ml，加1640培養(yǎng)基等量稀釋；(2)在15ml離心管中加入5ml淋巴細(xì)胞分離液，再緩慢加入等量稀釋后的血液，在水平離心機(jī)上室溫1500r離心30min；(3)離心后可見清晰的4層分層(從上至下：血漿層、淋巴細(xì)胞層、分離液層、紅細(xì)胞層)，小心吸取淋巴細(xì)胞層，共2ml；(4)加10ml的1640培養(yǎng)基洗滌，室溫1500r離心10min；(5)棄上清，再加10ml1640培養(yǎng)基，吹打混勻，室溫1500r離心10min；(6)棄上清，加入20ml含10％胎牛血清和雙抗的1640完全培養(yǎng)基吹打混勻，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2×107ml-1，再加入濃度為1mg/ml的lps20ul，使lps的終濃度為1ug/ml，37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。2、藏豬外周血淋巴細(xì)胞的總rna的提取(1)貼壁細(xì)胞收集上清后，剩余的細(xì)胞加入1mltrizol，用槍頭把細(xì)胞從板上吹下，然后轉(zhuǎn)移至1.5mlep管中；(3)加入200ul氯仿，劇烈震蕩15sec，室溫靜置5min，12000g4℃離心15min；(4)小心吸取400ul上清，再加入400ul異丙醇，混勻，室溫靜置10min，12000g4℃離心10min；(5)棄上清，加入1ml75％乙醇，12000g4℃離心5min；(6)棄上清，待rna沉淀自然風(fēng)干后，加入20ulrnase-freewater溶解；(7)rna的純度及濃度通過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，rna的完整性用1.0％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。二、pcr擴(kuò)增p35基因pcr產(chǎn)物1和p40基因pcr產(chǎn)物1將上述一得到的rna用takaraprimescriptrtreagentkit合成cdna。根據(jù)genbank上公布的豬il-12的p40和p35的基因序列，用primer5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物(見表1)。表1藏豬pcr引物以cdna為模板，分別用p40和p35對(duì)應(yīng)的特異性引物pcr擴(kuò)增目的基因，體系為20ul(見表2)，得到972bp的p40基因pcr產(chǎn)物1(序列1第1-969位)和771bp的p35基因pcr產(chǎn)物1(序列1第1108-1878位)(圖1)。表2目的基因pcr擴(kuò)增體系pcr循環(huán)條件將上述擴(kuò)增得到的p40基因pcr產(chǎn)物1和p35基因pcr產(chǎn)物1分別連接到t載體(pblue-tvector，北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司，bd-m10015)上，得到p40-t載體和p35-t載體。三、il-12基因的真核重組質(zhì)粒vril-12構(gòu)建1、2a-tpa的合成vril-12根據(jù)文獻(xiàn)的方法設(shè)計(jì)并合成三個(gè)引物，分別命名為2a-tpa-1，2a-tpa-2，2a-tpa-3，用這三個(gè)引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增出2a-tpa的融合基因。引物序列(見表3)：表32a-tpapcr引物pcr反應(yīng)體系為50ul(見表4)：表42a-tpa反應(yīng)體系pcr反應(yīng)條件：2％瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收，得到2a-tpa(其核苷酸序列為序列1第970-1107位)。2、p40基因pcr產(chǎn)物2和p35基因pcr產(chǎn)物2的擴(kuò)增1)引物的設(shè)計(jì)和合成用in-fusion方法，設(shè)計(jì)重疊引物，將p40和35兩個(gè)基因之間連接2a短肽基因后一起插入載體vr1020中，p40基因5’端與載體有16bp重疊，命名為40-f，3’端有10bp與2a-tpa重疊，命名為40-r；2a-tpa5’端與p40有10bp重疊，命名為2a-f，2a-tpa3’端設(shè)計(jì)一個(gè)引物，與p35基因有10bp重疊，命名為2a-r；p35基因5’端與2a-tpa有10bp重疊，命名為35-f，3’端與vr1020有16bp重疊，命名為35-r。引物序列(見表5)：表5引物序列2)目的片段的擴(kuò)增以上述二得到的p40-t載體為模板，以40-f和40-r為引物擴(kuò)增，得到995bpp40擴(kuò)增產(chǎn)物2(圖2)。以上述二得到的p35t載體為模板，以35-f和35-r為引物擴(kuò)增，得到797bpp35擴(kuò)增產(chǎn)物2(圖2)。以上述1得到的2a-tpa為模板，以2a-f和2a-r為引物擴(kuò)增，得到158bp2a-tpa擴(kuò)增產(chǎn)物2(圖2)。3)載體骨架獲得將vr1020質(zhì)粒(vr1020由美國(guó)vical公司提供)用bamhi單酶切，得到vr1020線性載體骨架。4)片段與載體的連接將上述2)得到的p40擴(kuò)增產(chǎn)物2、p35擴(kuò)增產(chǎn)物2、2a-tpa擴(kuò)增產(chǎn)物2和vr1020線性載體骨架連接，得到真核重組質(zhì)粒vril-12。上述連接體系為10ul(見表6)：表6片段與載體連接體系連接條件：50℃，15min。測(cè)序真核重組質(zhì)粒vril-12，該質(zhì)粒為將序列1所示的dna片段插入vr1020質(zhì)粒的bamhi酶切位點(diǎn)間得到的質(zhì)粒。序列1所示的dna片段命名為融合片段il-12’，該融合片段編碼的蛋白命名為il-12’蛋白。其中p40為序列1第1-969位，2a為序列1第970-1032位，tpa為序列1第1033-1107位，p35為序列1第1108-1878位；融合片段編碼的蛋白命名為il-12’蛋白，該蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2(p40為序列2第1-323位，2a為序列2第324-344位，tpa為序列2第345-369位，p35為序列2第370-625位)。四、真核重組質(zhì)粒vril-12的活性檢測(cè)1、真核重組質(zhì)粒vril-12在hek293細(xì)胞中的表達(dá)活性將上述三制備的真核重組質(zhì)粒vril-12和pegfp-n3-gfp表達(dá)質(zhì)粒(clontech，6080-1，作為陽(yáng)性轉(zhuǎn)染對(duì)照)同時(shí)加入，按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(陽(yáng)離子脂質(zhì)體dmrie：購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司，sgmb01-gmb-gcr4118)說(shuō)明書操作轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞(人胚腎細(xì)胞，上海拜力生物胎牛血清公司，hek-293)。1)熒光顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染前觀察細(xì)胞生長(zhǎng)良好，死亡細(xì)胞較少，用熒光顯微鏡分別觀察轉(zhuǎn)染24h、48h和72h后的細(xì)胞。結(jié)果如圖3所示，顯示轉(zhuǎn)染后24h后gfp就開始表達(dá)，說(shuō)明質(zhì)粒在細(xì)胞中能成功表達(dá)。2)、目的基因在hek293中的檢測(cè)分別于上述1轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h收集上清，并收集轉(zhuǎn)染48h后的細(xì)胞。提取轉(zhuǎn)染48h后的細(xì)胞的總rna，反轉(zhuǎn)錄得到cdna作為模板，用il-12特異性引物(35-f和35-r)進(jìn)行pcr擴(kuò)增。以空載體vr1020為對(duì)照。結(jié)果如圖4所示，可以看出，所構(gòu)建的vril-12重組質(zhì)粒能在hek293細(xì)胞中成功表達(dá)。2、淋巴母細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn)vril-12組：(1)按照前面的方法收集藏豬外周血淋巴細(xì)胞；(2)按照排版分別向96孔板實(shí)驗(yàn)孔中加入50μl藏豬外周血淋巴細(xì)胞和50μl上述1收集的轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h收集上清。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，并設(shè)有對(duì)照孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h；(3)48h后，取出96孔板，每孔加入10μlcck8輕輕吹勻繼續(xù)培養(yǎng)2h；(4)取出96孔板，用bio-reader3550檢測(cè)每孔o(hù)d450。vr1020組：與vril-12組不同的是，將轉(zhuǎn)染上清液替換為對(duì)照轉(zhuǎn)染上清液。上述對(duì)照轉(zhuǎn)染上清液為將質(zhì)粒vr1020轉(zhuǎn)染hek29324、48和72小時(shí)后收集的上清液。cell為hek293細(xì)胞，control為vr1020空白質(zhì)粒。通過(guò)cck8檢測(cè)細(xì)胞存活，結(jié)果如圖5所示，vril-12組較對(duì)照組vr1020增殖明顯，這說(shuō)明實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞的上清能顯著刺激豬淋巴細(xì)胞增殖(p<0.05)。證明vril-12能正確表達(dá)出il-12，具有免疫刺激活性；是后面重組質(zhì)粒在體內(nèi)細(xì)胞表達(dá)可作為免疫佐劑的基礎(chǔ)證據(jù)。五、內(nèi)毒素的檢測(cè)用“凝膠法”檢測(cè)vril-12質(zhì)粒的內(nèi)毒素含量，方法參考《鱟試劑說(shuō)明書》，具體方法如下：(1)陽(yáng)性對(duì)照樣品制備：取內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品(上海哈靈生物科技有限公司，150600)，以檢查用水配制濃度為2倍靈敏度λ＝0.25eu/ml的溶液備用；(2)陰性對(duì)照：檢查用水；(3)檢測(cè)樣品：根據(jù)檢測(cè)樣品內(nèi)毒素限值得要求計(jì)算器有效稀釋倍數(shù)(mvd＝cl/λ)，將樣品稀釋備用；(4)取鱟試劑，折斷安瓿頸并標(biāo)記，其中1支作陽(yáng)性對(duì)照管，1支作陰性對(duì)照管，2支作檢品管，1支作檢品陽(yáng)性對(duì)照管，共5支；(5)按照要求分別在陰性對(duì)照管、陽(yáng)性對(duì)照管和檢品管中加入0.2ml檢查用水、0.1ml檢查用水+0.1ml濃度為2倍λ的內(nèi)毒素溶液、以及0.1ml檢查用水+0.1ml檢測(cè)樣品(vril-12質(zhì)粒)，輕輕搖勻待檢；(6)將上一步待檢樣垂直放入恒溫器中，37℃孵育60分鐘，讀取結(jié)果。結(jié)果未見樣品管有凝膠形成，表明真核重組質(zhì)粒vril-12沒有含內(nèi)毒素。實(shí)施例2、真核重組質(zhì)粒vril-12在作為疫苗佐劑中的應(yīng)用一、疫苗佐劑的制備1、包裹vril-12的殼聚糖納米顆粒(cs-il-12)的制備采用離子交聯(lián)法包裹vril-12質(zhì)粒，制備納米顆粒作為疫苗佐劑，具體方法是：(1)溶液的配制：10mg/ml的tpp溶液：將tpp溶解在ddh2o中，使tpp濃度為10mg/ml，得到10mg/ml的tpp溶液；2.4mg/ml的殼聚糖溶液：將殼聚糖溶解在1％(ph5.5)的冰醋酸水溶液中，，使殼聚糖濃度為2.4mg/ml，得到2.4mg/ml的殼聚糖溶液；用0.22m微孔濾膜過(guò)濾所配溶液以除菌；(2)質(zhì)粒與tpp溶液預(yù)混：將vril-12溶液(溶劑為水)與適量的tpp溶液混合均勻，并在55℃下恒溫孵育20min，得到質(zhì)粒與tpp的預(yù)混液；vril-12和tpp的質(zhì)量比為1：3；殼聚糖包裹質(zhì)粒：在55℃水浴磁力攪拌情況下將上述質(zhì)粒與tpp的預(yù)混液緩慢滴加至殼聚糖溶液中，混合均勻，使得殼聚糖與質(zhì)粒的質(zhì)量比為30:1，然后恒溫孵育10min備用，得到包裹vril-12的殼聚糖納米顆粒；(4)取樣檢測(cè)：取適量包裹vril-12的殼聚糖納米顆粒用馬爾文粒度儀檢測(cè)納米顆粒zeta電位和粒徑大小。結(jié)果如圖6所示，包裹vril-12的殼聚糖納米顆粒的粒徑大小為107.78±14.92nm，zeta電位為+26.4±2.41mv，分散度為0.217±0.011，表明其符合轉(zhuǎn)染細(xì)胞的要求，該顆粒命名為cs-il-12。2、dmrie質(zhì)粒復(fù)合物(dmrie-il-12)的制備將vril-12重組質(zhì)粒4μg用到500μlrpmi1640減血清培養(yǎng)基中進(jìn)行稀釋。對(duì)應(yīng)地，10μldmrie(陽(yáng)離子脂質(zhì)體dmrie：購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司，sgmb01-gmb-gcr4118)分別稀釋到500μlrpmi1640減血清培養(yǎng)基中。分別混合均勻后靜置于室溫5min，將稀釋后的質(zhì)粒加入對(duì)應(yīng)的稀釋的dmrie中，輕輕混合均勻后，靜置于室溫30min備用，得到dmrie質(zhì)粒復(fù)合物(dmrie和質(zhì)粒的質(zhì)量比為2.5：1)，作為轉(zhuǎn)染細(xì)胞試劑。二、包裹vril-12的殼聚糖納米顆粒和dmrie質(zhì)粒復(fù)合物在藏豬pbmcs細(xì)胞中表達(dá)的生物學(xué)效應(yīng)1、轉(zhuǎn)染藏豬pbmcs細(xì)胞按照前面的方法收集藏豬外周血pbmcs，分為如下組：實(shí)驗(yàn)組(cs-il-12+pcv2)：將上述一制備的包裹vril-12的殼聚糖納米顆粒轉(zhuǎn)染藏豬pbmcs培養(yǎng)12h后的細(xì)胞，培養(yǎng)4.5h，加入10μl稀釋104倍的pcv2。實(shí)驗(yàn)組(dmrie-il-12+pcv)：將上述1制備的dmrie質(zhì)粒復(fù)合物(dmrie-il-12)轉(zhuǎn)染藏豬pbmcs培養(yǎng)12h后的細(xì)胞，培養(yǎng)4.5h，加入10μl稀釋104倍的pcv2。pcv2對(duì)照組(pcv2，control)：將10μl的rpmi1640完全培養(yǎng)基和藏豬pbmcs培養(yǎng)12h后的細(xì)胞，培養(yǎng)4.5h，加入10μl稀釋104倍的pcv2?？瞻讓?duì)照組：空白pbmcs。將上述實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別于加入病毒時(shí)間后24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h離心(10000g,30sec)收集細(xì)胞，以1mltrizol裂解細(xì)胞，凍存于-80℃?zhèn)溆?。排版情況見表7。表7藏豬pbmcs轉(zhuǎn)染排版示意cs-il-12+pcv2dmrie-il-12+pcv2pcv2空白對(duì)照cs-il-12+pcv2dmrie-il-12+pcv2pcv2空白對(duì)照cs-il-12+pcv2dmrie-il-12+pcv2pcv2空白對(duì)照上述各組轉(zhuǎn)染方法具體如下：殼聚糖納米顆粒轉(zhuǎn)染pbmcs：將制備好的殼聚糖納米粒溶液用naoh溶液調(diào)ph為6.0左右，轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞培養(yǎng)基換成相應(yīng)的無(wú)血清培養(yǎng)基，然后加入含2ug質(zhì)粒的殼聚糖納米粒溶液轉(zhuǎn)染，3h后換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑dmrie轉(zhuǎn)染pbmcs：(1)pbmcs細(xì)胞的準(zhǔn)備：離心(250g,15min)pbmcs，細(xì)胞經(jīng)rpmi1640無(wú)血清培養(yǎng)基清洗一遍后以rpmi1640無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)，稀釋至細(xì)胞密度為1.5x107個(gè)/ml；(2)轉(zhuǎn)染：將0.2ml細(xì)胞懸液添加到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入dmrie質(zhì)粒復(fù)合物(含2ug質(zhì)粒)，細(xì)胞在37℃，5％co2條件下培養(yǎng)4.5h后，加入2ml預(yù)熱的含15％熱滅活fbs和1.5％青鏈霉素的rpmi1640培養(yǎng)基，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)。2、檢測(cè)免疫相關(guān)基因的表達(dá)分別提取上述2不同組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間段的rna，反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cdna。根據(jù)genbank中報(bào)道的豬基因序列，設(shè)計(jì)合成熒光定量pcr特異性引物，見表8表8熒光定量引物以稀釋后的cdna為模板，分別用表8中特異性引物擴(kuò)增目的基因，熒光定量pcr反應(yīng)體系15μl(見表9)：表9目的基因擴(kuò)增體系反應(yīng)條件：反應(yīng)結(jié)束后，以β-action作為內(nèi)參基因，由2-δδct計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果表明各個(gè)基因pcr的相關(guān)系數(shù)在0.99以上，且擴(kuò)增效率均在95％至105％之間，符合熒光定量要求。通過(guò)基于tukey多重比較的單因素方差分析和雙因素方差分析方法，分析比較不同組別之間基因的表達(dá)量差異。當(dāng)p<0.05時(shí)，認(rèn)為不同組之間基因的相對(duì)表達(dá)量有顯著性差異。由圖7(control為空白細(xì)胞培養(yǎng)上清液)可見，藏豬pbmcs轉(zhuǎn)染il-12質(zhì)粒后，實(shí)驗(yàn)組il-12基因的表達(dá)量顯著性高于對(duì)照組(p<0.05)；且實(shí)驗(yàn)組之間有顯著性差異，dmrie-il-12組顯著高于cs-il-12組(前者高效但價(jià)格高不實(shí)用貴重，后者cs-il-12經(jīng)濟(jì)安全有效)(p<0.05)。由圖8(control為空白細(xì)胞培養(yǎng)上清液)可見，藏豬pbmcs轉(zhuǎn)染il-12質(zhì)粒后，實(shí)驗(yàn)組toll-like受體基因tlr3和tlr9的表達(dá)量顯著性對(duì)照組tlr3和tlr9的表達(dá)量(p<0.05)；且實(shí)驗(yàn)組之間有顯著性差異，dmrie-il-12組顯著高于cs-il-12組(p<0.05)。由圖9(control為空白細(xì)胞培養(yǎng)上清液)可見，藏豬pbmcs轉(zhuǎn)染il-12質(zhì)粒后，實(shí)驗(yàn)組免疫記憶相關(guān)基因il7、il15和il23的表達(dá)量顯著性對(duì)照組(p<0.05)；且各實(shí)驗(yàn)組之間il7、il15和il23的表達(dá)量有顯著性差異，cs-il-12組顯著高于dmrie-il-12組(p<0.05)；il7在96h時(shí)dmrie-il-12組顯著高于cs-il-12組(p<0.05)；il15在72h時(shí)dmrie-il-12組顯著高于cs-il-12組(p<0.05)；il23在48h和96h時(shí)dmrie-il-12組顯著高于cs-il-12組(p<0.05)。由圖10(control為空白細(xì)胞培養(yǎng)上清液)可見，藏豬pbmcs轉(zhuǎn)染il-12質(zhì)粒后，實(shí)驗(yàn)組th1型細(xì)胞因子il2和tnf-α的表達(dá)量顯著性對(duì)照組il2和tnf-α的表達(dá)量(p<0.05)；且各實(shí)驗(yàn)組之間il2和tnf-α的表達(dá)量有顯著性差異，dmrie-il-12組顯著高于cs-il-12組(p<0.05)；il2在168h時(shí)cs-il-12組顯著高于dmrie-il-12組(p<0.05)；tnf-α在72h和144h時(shí)cs-il-12組顯著高于dmrie-il-12組(p<0.05)。由圖11(control為空白細(xì)胞培養(yǎng)上清液)可見，藏豬pbmcs轉(zhuǎn)染il-12質(zhì)粒后，實(shí)驗(yàn)組th2型細(xì)胞因子il4、il6和il10的表達(dá)量顯著性對(duì)照組(p<0.05)；且實(shí)驗(yàn)組之間il4和il6的表達(dá)量有顯著性差異，dmrie-il-12組顯著高于cs-il-12組(p<0.05)；il6在48h時(shí)cs-il-12組顯著高于dmrie-il-12組(p<0.05)；il10在72h、120h和144h時(shí)cs-il-12組顯著高于dmrie-il-12組(p<0.05)，在24h、48h和168h時(shí)dmrie-il-12組顯著高于cs-il-12組(p<0.05)。由圖12(control為空白細(xì)胞培養(yǎng)上清液)可見，藏豬pbmcs轉(zhuǎn)染il-12質(zhì)粒后，實(shí)驗(yàn)組反饋調(diào)節(jié)基因tgfβ-1的表達(dá)量顯著性對(duì)照組(p<0.05)；且實(shí)驗(yàn)組之間有顯著性差異，dmrie-il-12組顯著高于cs-il-12組(p<0.05)；tgfβ-1在72h和144h時(shí)cs-il-12組顯著高于dmrie-il-12組(p<0.05)。由圖13(control為空白細(xì)胞培養(yǎng)上清液)可見，藏豬pbmcs轉(zhuǎn)染il-12質(zhì)粒后，實(shí)驗(yàn)組免疫信號(hào)傳導(dǎo)分子myd88的表達(dá)量顯著性對(duì)照組myd88的表達(dá)量(p<0.05)；且實(shí)驗(yàn)組之間myd88的表達(dá)量有顯著性差異，cs-il-12組顯著高于dmrie-il-12組(p<0.05)；myd88在48h和168h時(shí)dmrie-il-12組顯著高于cs-il-12組(p<0.05)。三、疫苗佐劑在小鼠體內(nèi)表達(dá)的生物學(xué)效應(yīng)1、實(shí)驗(yàn)小鼠分組免疫50只28日雌性齡昆明小白鼠，體重約25-30g,隨機(jī)分組5組，每組10只小鼠。實(shí)驗(yàn)組編號(hào)為a1和a2組，對(duì)照組編號(hào)分別為c1和c2，小鼠免疫注射安排見表10。注射前記為0周，注射后1-5周每周定時(shí)采一次血，每組約采血350μl，免疫動(dòng)物前后分別每周固定時(shí)間稱量每只小鼠的體重，并做好記錄。表10小鼠分組及免疫接種安排免疫接種前后，每周固定時(shí)間稱取每只小鼠的體重，每組小鼠的體重計(jì)算平均值和方差，小鼠體重變化見圖14。結(jié)果表明小鼠的體重隨飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組小鼠體重與對(duì)照組之間無(wú)顯著差異(p>0.05)。2、實(shí)驗(yàn)小鼠血常規(guī)分析取50ul新鮮血液，通過(guò)血細(xì)胞自動(dòng)分類檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠血液中淋巴細(xì)胞數(shù)目、血紅細(xì)胞數(shù)目和血紅蛋白含量等血液變化水平的情況，測(cè)定各實(shí)驗(yàn)小鼠在實(shí)驗(yàn)期間的外周血液免疫學(xué)變化情況。血常規(guī)分析小鼠外周血中血細(xì)胞的數(shù)目變化(見圖15)。結(jié)果顯示免疫接種后，實(shí)驗(yàn)組淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組(p<0.05)，實(shí)驗(yàn)組之間無(wú)顯著差異(p>0.05)；實(shí)驗(yàn)組嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組(p<0.05)，實(shí)驗(yàn)組之間cs/p-il-12組顯著高于cs-il-12組(p<0.05)；實(shí)驗(yàn)組血紅蛋白含量和紅細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組之間相比無(wú)顯著差異(p>0.05)。3、流式細(xì)胞分析取50μl新鮮抗凝血，以抗小鼠熒光標(biāo)記的cd4+、cd3+和cd8+單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞染色，流式細(xì)胞術(shù)區(qū)分實(shí)驗(yàn)小鼠免疫細(xì)胞中的th和tc亞群細(xì)胞，通過(guò)其動(dòng)態(tài)變化來(lái)觀察細(xì)胞免疫應(yīng)答的變化情況。流式細(xì)胞術(shù)具體步驟如下：(1)取50μl新鮮抗凝血，加入預(yù)混抗體(含anti-mousecd3e-fitc0.5μl，anti-mousecd8-pe0.625μl，anti-mousecd4-percp-cy5.50.625μl)，震蕩混勻避光30min；(2)加入500μl紅細(xì)胞裂解液，避光靜置10min，3500r離心5min，去上清；(3)加入1mlpbs緩沖液，輕輕懸浮細(xì)胞，除去殘留的紅細(xì)胞碎片，3500r離心5min，去上清；(4)細(xì)胞沉淀加入300μl的pbs混勻，4℃避光保存，24h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠外周血中cd4+t和cd8+t細(xì)胞亞群的數(shù)量變化(見圖18)。結(jié)果表明，免疫接種后，小鼠外周血中的cd4+t和cd8+t細(xì)胞亞群數(shù)量均呈上升趨勢(shì)；實(shí)驗(yàn)組cd4+t和cd8+t細(xì)胞數(shù)量均顯著高于對(duì)照組cd4+t和cd8+t細(xì)胞數(shù)量(p<0.05)，且實(shí)驗(yàn)組之間cs/p-il-12組顯著高于cs-il-12組(p<0.05)。4、血清中igg、igg1、igg2a和pcv-ab的測(cè)定取100μl新鮮抗凝血，3500r離心10min分離血清，血清保存于-80℃?zhèn)溆?。參照elisa試劑盒說(shuō)明書測(cè)定血清中igg、igg1、igg2a和pcv-ab的含量。elisa檢測(cè)小鼠血清中igg、igg1和igg2a的含量變化(見圖16)。結(jié)果表明，免疫接種后，對(duì)照組小鼠igg、igg1和igg2a含量均無(wú)明顯的上升和6下降，而實(shí)驗(yàn)組含量有明顯上升；實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中igg含量顯著高于對(duì)照組(p<0.05)，實(shí)驗(yàn)組之間cs-il-12組顯著高于cs/p-il-12組(p<0.05)；實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中igg1和igg2a含量顯著高于對(duì)照組(p<0.05)，實(shí)驗(yàn)組之間無(wú)顯著差異(p>0.05)。elisa檢測(cè)免疫接種后小鼠血清中的pcv抗體含量(見圖17)。結(jié)果表明，免疫接種pcv疫苗后，小鼠血清中均檢測(cè)出有效的pcv抗體；實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中pcv抗體顯著高于對(duì)照組pcv抗體含量(p<0.05)，實(shí)驗(yàn)組之間cs/p-il-12組顯著高于cs-il-12組pcv抗體含量(p<0.05)。5、免疫相關(guān)基因表達(dá)量檢測(cè)提取上述1各組免疫后1-5周小鼠血液的rna，反轉(zhuǎn)錄得到cdna。r根據(jù)genbank中報(bào)道的小鼠基因序列，設(shè)計(jì)合成定量pcr特異性引物，見表11。表11小鼠免疫相關(guān)基因引物定量pcr檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)量變化。由圖19可見，免疫接種后，實(shí)驗(yàn)組小鼠il-12細(xì)胞因子的表達(dá)量顯著性對(duì)照組il-12的表達(dá)量(p<0.05)；對(duì)照組之間il-12的表達(dá)量無(wú)顯著差異(p>0.05)；實(shí)驗(yàn)組之間，分別在免疫接種的第7天、第21天和第28天cs/p-il-12組il-12的表達(dá)量顯著高于cs-il-12組(p<0.05)。由圖20可見，免疫接種后，實(shí)驗(yàn)組小鼠toll-like受體基因tlr1和tlr6的表達(dá)量顯著性對(duì)照組tlr1和tlr6的表達(dá)量(p<0.05)；對(duì)照組之間tlr1和tlr6的表達(dá)量無(wú)顯著差異(p>0.05)；在第21天，tlr1和tlr6的表達(dá)量達(dá)到最大值；實(shí)驗(yàn)組之間tlr1和tlr6的表達(dá)量無(wú)顯著差異(p>0.05)。由圖21可見，免疫接種后，實(shí)驗(yàn)組小鼠免疫記憶相關(guān)基因cd62l和il15的表達(dá)量顯著性對(duì)照組(p<0.05)；對(duì)照組之間cd62l和il15的表達(dá)量無(wú)顯著差異(p>0.05)；cd62l的表達(dá)量在第7天和第14天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組之間cs/p-il-12組的表達(dá)量顯著高于cs-il-12組cd62l的表達(dá)量(p<0.05)；cd62l的表達(dá)量在第35天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組cd62l的表達(dá)量無(wú)顯著差異(p>0.05)；il15的表達(dá)量在第14天、第28天和第35天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組之間cs-il-12組的表達(dá)量顯著高于cs/p-il-12組il15的表達(dá)量(p<0.05)。由圖22可見，免疫接種后，實(shí)驗(yàn)組小鼠th1型細(xì)胞因子ifn-γ和tnf-α的表達(dá)量顯著性對(duì)照組ifn-γ和tnf-α的表達(dá)量(p<0.05)；對(duì)照組之間ifn-γ和tnf-α的表達(dá)量無(wú)顯著差異(p>0.05)；實(shí)驗(yàn)組之間，cs-il-12組的ifn-γ的表達(dá)量顯著高于cs/p-il-12組ifn-γ的表達(dá)量(p<0.05)；tnf-α的表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)組之間tnf-α的表達(dá)量無(wú)顯著差異(p>0.05)。由圖23可見，免疫接種后，實(shí)驗(yàn)組小鼠th2型細(xì)胞因子il6和il10的表達(dá)量顯著性對(duì)照組il6和il10的表達(dá)量(p<0.05)；對(duì)照組之間il6和il10的表達(dá)量無(wú)顯著差異(p>0.05)；il6的表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)組之間il6的表達(dá)量無(wú)顯著差異(p>0.05)；il10的表達(dá)量在第7天、第28天和第35天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組之間cs/p-il-12組il10的表達(dá)量顯著高于cs-il-12組il10的表達(dá)量(p<0.05)；il10的表達(dá)量在第14天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組之間cs-il-12組il10的表達(dá)量顯著高于cs/p-il-12組il10的表達(dá)量(p<0.05)。由圖24可見，免疫接種后，實(shí)驗(yàn)組小鼠反饋調(diào)節(jié)基因tgfβ-1的表達(dá)量顯著性對(duì)照組tgfβ-1的表達(dá)量(p<0.05)；對(duì)照組之間tgfβ-1的表達(dá)量無(wú)顯著差異(p>0.05)；實(shí)驗(yàn)組之間tgfβ-1的表達(dá)量無(wú)顯著差異(p>0.05)。由圖25可見，免疫接種后，實(shí)驗(yàn)組小鼠信號(hào)傳導(dǎo)分子stat1的表達(dá)量顯著性對(duì)照組stat1的表達(dá)量(p<0.05)；對(duì)照組之間stat1的表達(dá)量無(wú)顯著差異(p>0.05)；在第7天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組stat1的表達(dá)量無(wú)顯著差異(p>0.05)；在第14天和第28天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組之間cs/p-il-12組stat1的表達(dá)量顯著高于cs-il-12組stat1的表達(dá)量(p<0.05)；在第35天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組之間cs-il-12組stat1的表達(dá)量顯著高于cs/p-il-12組stat1的表達(dá)量(p<0.05)。四、疫苗佐劑在豬體內(nèi)表達(dá)的生物學(xué)效應(yīng)1、動(dòng)物分組選取3周齡未免疫pcv2疫苗的杜大長(zhǎng)三元雜交豬(四川省養(yǎng)豬研究所提供)10頭,隨機(jī)分為2組，每組5頭，其中a組為實(shí)驗(yàn)組，b組為對(duì)照組，處理如下(表12):表12實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及接種制劑接種前記為0周，在第0、1、2、4、8、12周時(shí)取前腔靜脈血液5ml保存于抗凝管中用于后續(xù)分析。免疫前后分別稱量每頭動(dòng)物的體重，并做好記錄。從表13中可以看出，接種前實(shí)驗(yàn)組(a組)與對(duì)照組(d組)之間體重差異不顯著(p>0.05)，在接種后的84天里，a組體重增長(zhǎng)顯著高于d(p<0.05)，結(jié)果表明接種vril-12-cnp對(duì)仔豬生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。表13實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重變化表注：同一欄中標(biāo)記不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。2、血常規(guī)分析具體方法同前。由圖26可見，a組紅細(xì)胞數(shù)量在接種后的第7天、14天、56天和84天都顯著高于d組(p<0.05)。在第7天、14天和35天，a組血紅蛋白含量明顯增加(p<0.05)。a組和d組之間白細(xì)胞數(shù)量差異不顯著(p>0.05)。3、流式細(xì)胞分析具體方法同前。圖27顯示了cd3+t細(xì)胞、cd4+t細(xì)胞和cd8+t細(xì)胞的數(shù)量變化以及cd8+/cd4+比值的變化。三種細(xì)胞數(shù)量在接種后都顯著增長(zhǎng)，a組的cd3+t細(xì)胞、cd4+t細(xì)胞和cd8+t細(xì)胞數(shù)量在接種后的第28天、56天和84天時(shí)都顯著高于對(duì)照組d組(p<0.05)，a組接種后cd8+/cd4+的比率也明顯高于對(duì)照組d組，并且在第56天時(shí)差異顯著(p<0.05)。4、血清中igg和pcv-ab的測(cè)定具體方法同前。血清中免疫球蛋白igg的變化情況如圖28所示，在試驗(yàn)期間(0天到84天)，a組的igg含量都顯著高于d組(p<0.05)。igg的含量從接種后的第14天開始增長(zhǎng)并在第56天達(dá)到最高水平。圖29為特異性抗pcv-2抗體水平的變化情況。第0天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均為pcv2抗體陰性(s/p值小于0.16)，接種后pcv2抗體水平開始增長(zhǎng)，a組在第7天、28天、56天和84天時(shí)的特異性pcv2抗體水平均顯著高于d組(p<0.05)。5、免疫相關(guān)基因表達(dá)量檢測(cè)在免疫第0、1、2、4、8、12周時(shí)取前腔靜脈血液，提取rna，反轉(zhuǎn)錄得到cdna。根據(jù)genbank中報(bào)道的豬的基因序列，設(shè)計(jì)合成定量pcr特異性引物，見表14。表14豬免疫相關(guān)基因引物以cdna為模板，用上述表14的引物進(jìn)行定量pcr檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)量變化，以ppia作為內(nèi)參基因，由2-δδct方法計(jì)算得出基因的相對(duì)的表達(dá)量。圖30所示為toll樣受體基因tlr2和tlr7的表達(dá)量變化。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組a組的tlr2和tlr7基因的表達(dá)量在接種vril-12-cnp后的第7天到第84天均顯著增長(zhǎng)(p<0.05)。tlr2基因在第28天和84天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組增長(zhǎng)水平顯著高于對(duì)照組(p<0.05)，在第7天、28天和84天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的tlr7表達(dá)量在vril-12-cnp的刺激下顯著高于對(duì)照組(p<0.05)。如圖31所示為細(xì)胞因子基因表達(dá)量變化情況，在接種vril-12-cnp后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞因子表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組。a組的il-2基因表達(dá)量在第56天時(shí)顯著高于d組(p<0.05)；il-4基因在第14天、28天以及56天時(shí)都顯著高于d組(p<0.05)；而il-6基因表達(dá)量從第7天開始增長(zhǎng)顯著(p<0.05)；il-12基因在第7天、28天、56天和84天時(shí)的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組d組(p<0.05)。免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子基因stat1，stat2，stat3，stat4，cd45和bcl-2的表達(dá)量變化如圖32所示。實(shí)驗(yàn)組a組的stat1基因表達(dá)量在接種vril-12-cnp后的第7天、14天、56天和84天都顯著高于d組(p<0.05)，stat2，stat3和stat4基因的表達(dá)量在第7天到56天也顯著高于d組(p<0.05)；接種后第14天時(shí)，a組bcl-2基因表達(dá)量顯著高于d組(p<0.05)；a組cd45的表達(dá)量從第7天到84天均顯著高于d組(p<0.05)。序列表<110>四川大學(xué)<120>藏豬il-12重組質(zhì)粒增強(qiáng)pcv2疫苗免疫佐劑的制備方法及應(yīng)用<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>1878<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1atgcaccttcagcagctggttgtctcctggttttccctggtttggctggcatctcccatt60gtggccatatgggaactggagaaaaatgtttatgtcgtagagttggactggtaccccaat120gcccctggagaaatggtggtcctcacctgcaacacccctgaagaagacggcatcacgtgg180acctcagaccagagcagtgaggtcttgggcactggcaaaaccctgaccatccacgtcaaa240gagtttggagatgctggccagtacacctgtcgcaaaggaggcgcagttctgagccagtca300ctcctgctgcttcacaaaaaggaagatggaatttggtccactgatattttaaaagaccag360aaagagcccaaaaacaagagctttctaaaatgtgaggcaaagaattactccggacgtttc420acctgctggtggctgacggcaatcagtactgatttgaaattcagtgtcaaaagcagcaga480ggctccgctgacccccgtggcgtgacatgtggcacggcaatgctctcagaggacctcggg540gagtataagtacagagtggagtgtcaggagggcagtgcctgcccagccgctgaggagagc600ctgcccattgaggtcgtgctggaagctgttcacaagcttaagtatgaaaactacaccagc660agcttcttcatcagggacatcatcaaaccagaccctcccaagaatctgcagctgaaccca720ttaaagaattctcgacacgtggagatcagctgggagtaccctgacacctggagcacccca780cattcctacttttccctgatgtttggtgttcaagttcagggcaagaacaaaagagaaaag840aaagataaactcttcacggaccaaacctcagccaaggttacatgccacaaggatgccaac900atccgcgtgcaagcccgggaccgctactacagctcctcctggagtgaatgggcatctgtg960tcctgcaatggaagcggagagggcaggggaagtcttctaacatgcggggacgtggaggaa1020aatcccgggccaatggatgcaatgaagagagggctctgctgtgtgctgctgctgtgtgga1080gcagtcttcgtttcgcccagcggtaccatgtgttcccctgggttcggcctccaaactagc1140gccctcacctgcgacgtccatccatctgcgtccagccgccgactcgctgtcaccgcagcg1200ccgctcagcatgtgcccgctgcgcaacctcctccttgtggccaccctggtcctcctcaac1260cacctggaccatctcagtttgggcaggagcctccctgcaaccacagcaggcccaggaatg1320ttcaaatgcctcaaccactcccaaaatctgctgaaggccgtcagcaacacacttcagaag1380gccaaacaaaccctagaattttactcctgcacttcagaagagatcgatcatgaagatatc1440accaaagataaaaccagcacagtggaggcctgcttaccacttgaactagccacgaatgag1500agttgcctggctgccagagagacctctttaataactaatggaaattgcctgacttctgga1560aagacctcttttatgacaaccctgtgccttagcagtatctacgaggacttgaagatgtac1620catgtggagttccaggccatgaatgcaaagcttctgatggatcctaagaggcagatcttt1680ctggatcagaacatgctgacagctattactgagctgatgcaggctctgaatttcaacagt1740gagactgtgccacagaagccctccctggaagaactggatttttataagactaaaatcaag1800ctctgcatacttcttcatgccttcagaattcgtgcggtgaccatcgacagaatgatgagc1860tatctgaattcttcctaa1878<210>2<211>625<212>prt<213>人工序列<220><223><400>2methisleuglnglnleuvalvalsertrppheserleuvaltrpleu151015alaserproilevalalailetrpgluleuglulysasnvaltyrval202530valgluleuasptrptyrproasnalaproglyglumetvalvalleu354045thrcysasnthrproglugluaspglyilethrtrpthrseraspgln505560sersergluvalleuglythrglylysthrleuthrilehisvallys65707580glupheglyaspalaglyglntyrthrcysarglysglyglyalaval859095leuserglnserleuleuleuleuhislyslysgluaspglyiletrp100105110serthraspileleulysaspglnlysgluprolysasnlysserphe115120125leulyscysglualalysasntyrserglyargphethrcystrptrp130135140leuthralaileserthraspleulyspheservallysserserarg145150155160glyseralaaspproargglyvalthrcysglythralametleuser165170175gluaspleuglyglutyrlystyrargvalglucysglngluglyser180185190alacysproalaalaglugluserleuproilegluvalvalleuglu195200205alavalhislysleulystyrgluasntyrthrserserphepheile210215220argaspileilelysproaspproprolysasnleuglnleuasnpro225230235240leulysasnserarghisvalgluilesertrpglutyrproaspthr245250255trpserthrprohissertyrpheserleumetpheglyvalglnval260265270glnglylysasnlysargglulyslysasplysleuphethraspgln275280285thrseralalysvalthrcyshislysaspalaasnileargvalgln290295300alaargaspargtyrtyrsersersertrpserglutrpalaserval305310315320sercysasnglyserglygluglyargglyserleuleuthrcysgly325330335aspvalglugluasnproglyprometaspalametlysargglyleu340345350cyscysvalleuleuleucysglyalavalphevalserprosergly355360365thrmetcysserproglypheglyleuglnthrseralaleuthrcys370375380aspvalhisproseralaserserargargleualavalthralaala385390395400proleusermetcysproleuargasnleuleuleuvalalathrleu405410415valleuleuasnhisleuasphisleuserleuglyargserleupro420425430alathrthralaglyproglymetphelyscysleuasnhissergln435440445asnleuleulysalavalserasnthrleuglnlysalalysglnthr450455460leugluphetyrsercysthrserglugluileasphisgluaspile465470475480thrlysasplysthrserthrvalglualacysleuproleugluleu485490495alathrasnglusercysleualaalaarggluthrserleuilethr500505510asnglyasncysleuthrserglylysthrserphemetthrthrleu515520525cysleuserseriletyrgluaspleulysmettyrhisvalgluphe530535540glnalametasnalalysleuleumetaspprolysargglnilephe545550555560leuaspglnasnmetleuthralailethrgluleumetglnalaleu565570575asnpheasnsergluthrvalproglnlysproserleuglugluleu580585590aspphetyrlysthrlysilelysleucysileleuleuhisalaphe595600605argileargalavalthrileaspargmetmetsertyrleuasnser610615620ser625當(dāng)前第1頁(yè)12