發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及肽和嵌合或融合蛋白并涉及這些蛋白在引起細(xì)胞應(yīng)答和體液應(yīng)答從而預(yù)防和治療牙齦卟啉單胞菌(p.gingivalis)相關(guān)狀態(tài)和疾病中的用途。

發(fā)明背景

慢性牙周炎是牙支持組織炎性疾病，其導(dǎo)致牙槽骨吸收并最終導(dǎo)致牙齒脫落。在所有的社群中，該疾病都是主要的公共健康問(wèn)題，并且據(jù)估計(jì)高達(dá)15％的成年人群患病，其中5-6％為重癥。

慢性牙周炎的發(fā)展和進(jìn)行與齦下菌斑中特定的革蘭氏陰性細(xì)菌有關(guān)。齦下菌斑中存在的牙齦卟啉單胞菌(porphyromonasgingivalis)與該疾病是顯著相關(guān)的。

據(jù)報(bào)道，治療(刮牙和根面平整術(shù))后牙周炎患者齦下菌斑中牙齦卟啉單胞菌依然存在，這與進(jìn)行性牙槽骨喪失顯著相關(guān)。此外，齦下菌斑中牙齦卟啉單胞菌細(xì)胞數(shù)的增加已證實(shí)與通過(guò)附著喪失、牙周袋深度和探針出血所檢測(cè)的疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。

牙齦卟啉單胞菌的口腔感染已證實(shí)在小鼠、大鼠和非人的靈長(zhǎng)類動(dòng)物中誘導(dǎo)牙周骨喪失。此外，牙周疾病和牙齦卟啉單胞菌感染與心血管疾病和某些癌癥存在正向的關(guān)聯(lián)。

據(jù)報(bào)道，多種毒力因子與牙齦卟啉單胞菌的致病性有關(guān)，包括：lps、菌毛、血凝素、溶血素和胞外水解酶(尤其是arg-x和lys-x特異性蛋白酶)，也被稱為“牙齦卟啉單胞菌胰酶樣酶”。

公共健康問(wèn)題的重要性在于需要對(duì)牙齦卟啉單胞菌感染提供強(qiáng)保護(hù)性應(yīng)答的抗血清，尤其是特異性抗體，以及提供該抗血清的方法。

現(xiàn)有的一個(gè)問(wèn)題是在需要從大量的毒力因子中進(jìn)行選擇的情況下，不清楚如何獲得對(duì)于牙齦卟啉單胞菌感染的強(qiáng)保護(hù)性應(yīng)答。

對(duì)毒力因子中表位的相對(duì)免疫原性以及給定因子上表位的相對(duì)免疫原性也不是很了解，特別是在不清楚是否仍需鑒定其他表位的情況下。

一個(gè)具體的問(wèn)題是：很多毒力因子由多個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成并且難以表達(dá)以提供與牙齦卟啉單胞菌上發(fā)現(xiàn)的構(gòu)象接近的構(gòu)象。此外，當(dāng)這些結(jié)構(gòu)域表達(dá)為分離的單元，即與其他毒力因子結(jié)構(gòu)域分離時(shí)，它們傾向于折疊成不同于牙齦卟啉單胞菌上所發(fā)現(xiàn)的的構(gòu)象的構(gòu)象。

此外，在修飾毒力因子的免疫原性的多種不同選擇中，不清楚哪一種最可能提供保護(hù)性免疫應(yīng)答。

在進(jìn)行本發(fā)明的工作中，本發(fā)明人已經(jīng)鑒定出具有與構(gòu)成牙齦卟啉單胞菌胰酶樣酶的區(qū)的氨基酸序列相同或享有同源性的氨基酸序列的肽，所述區(qū)在所述酶中界定了用于在含有l(wèi)ys或arg的肽中切割位于lys或arg的c端的肽鍵的位點(diǎn)，并且本發(fā)明人將該肽并入嵌合或融合蛋白，當(dāng)將所述嵌合或融合蛋白用作疫苗時(shí)，其比從天然牙齦卟啉單胞菌胰酶樣酶形成的純化的蛋白酶-粘附素復(fù)合物或殺死的全細(xì)胞提供更好的針對(duì)牙周組織破壞的保護(hù)。

發(fā)明概述

一方面，本發(fā)明提供了用于誘導(dǎo)對(duì)于牙齦卟啉單胞菌的免疫應(yīng)答的嵌合或融合蛋白，所述蛋白包含第一肽和第二肽，所述第一肽與第二肽直接連接或通過(guò)連接子連接，其中：

(a)所述第一肽包含：

(i)與seqidno:1所示的序列相同或同源的序列的一部分或全部；或

(ii)與seqidno:2所示的序列相同或同源的序列的一部分或全部；以及

(b)所述第二肽包含：

(i)與牙齦卟啉單胞菌lys-x-蛋白酶的粘附素結(jié)構(gòu)域的序列相同或同源的序列的一部分或全部；或

(ii)與牙齦卟啉單胞菌arg-x-蛋白酶的粘附素結(jié)構(gòu)域的序列相同或同源的序列的一部分或全部；或

(iii)與牙齦卟啉單胞菌haga粘附素結(jié)構(gòu)域的序列相同或同源的序列的一部分或全部。

另一方面，本發(fā)明提供了用于誘導(dǎo)對(duì)于牙齦卟啉單胞菌的免疫應(yīng)答的嵌合或融合蛋白，所述蛋白包含肽和多肽，所述肽與所述多肽直接連接或通過(guò)連接子連接，其中：

(a)所述肽包含：

(i)與seqidno:1所示的序列相同或同源的序列的一部分或全部；或

(ii)與seqidno:2所示的序列相同或同源的序列的一部分或全部；以及

(b)所述多肽包含：

(i)與牙齦卟啉單胞菌lys-x-蛋白酶的粘附素結(jié)構(gòu)域的序列相同或同源的序列的一部分或全部；或

(ii)與牙齦卟啉單胞菌arg-x-蛋白酶的粘附素結(jié)構(gòu)域的序列相同或同源的序列的一部分或全部；或

(iii)與牙齦卟啉單胞菌haga粘附素結(jié)構(gòu)域的序列相同或同源的序列的一部分或全部。

另一方面，本發(fā)明提供了用于誘導(dǎo)對(duì)于牙齦卟啉單胞菌的免疫應(yīng)答的肽，所述肽具有下述序列：

(i)與seqidno:64-66中的一項(xiàng)所示的序列相同或同源的序列；以及

(ii)與seqidno:67或68所示的序列相同或同源的序列。

一方面，可以以嵌合或融合蛋白的形式提供具有與seqidno:64-68中的一項(xiàng)所示的序列相同或同源的序列的肽，在所述嵌合或融合蛋白中，所述肽與第二肽直接連接或通過(guò)連接子連接，其中所述第二肽包含：

(i)與牙齦卟啉單胞菌lys-x-蛋白酶的粘附素結(jié)構(gòu)域的序列相同或同源的序列的一部分或全部；或

(ii)與牙齦卟啉單胞菌arg-x-蛋白酶的粘附素結(jié)構(gòu)域的序列相同或同源的序列的一部分或全部；或

(iii)與牙齦卟啉單胞菌haga粘附素結(jié)構(gòu)域的序列相同或同源的序列的一部分或全部。

另一方面，本發(fā)明提供組合物，諸如抗原組合物，尤其是疫苗組合物，所述組合物包含上文概括描述的嵌合或融合蛋白或肽，任選地與佐劑聯(lián)合。

在本方面中，本發(fā)明還提供了預(yù)防或降低個(gè)體中牙齦卟啉單胞菌相關(guān)狀態(tài)或疾病的發(fā)生率或嚴(yán)重程度的方法，包括給予所述個(gè)體上述嵌合或融合蛋白或組合物。

在本方面中，本發(fā)明還提供了上述嵌合或融合蛋白或上述組合物在用于預(yù)防或降低個(gè)體中牙齦卟啉單胞菌相關(guān)狀態(tài)或疾病的發(fā)生率或嚴(yán)重程度的藥物中的用途或者在制備所述藥物中的用途。

另一方面，本發(fā)明提供了針對(duì)上文概括描述的嵌合或融合蛋白或肽而產(chǎn)生的抗體，尤其是單克隆抗體。

在本方面中，本發(fā)明還提供了預(yù)防或降低個(gè)體中牙齦卟啉單胞菌相關(guān)疾病或狀態(tài)的嚴(yán)重程度的方法，其包括將上述抗體給予所述個(gè)體。

在本方面中，本發(fā)明還提供了上述抗體在用于預(yù)防或降低個(gè)體中牙齦卟啉單胞菌相關(guān)狀態(tài)或疾病的發(fā)生率或嚴(yán)重程度的藥物中的用途或者在制備所述藥物中的用途。

另一方面，本發(fā)明還提供了核酸分子，其包含編碼上文概括描述的嵌合或融合蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列任選地與至少一種調(diào)節(jié)元件可操作地連接。

在本方面中，本發(fā)明還提供了包含所述核酸分子的載體，以及包含所述核酸分子的原核或真核細(xì)胞。

在本方面中，本發(fā)明還提供了預(yù)防或降低個(gè)體中牙齦卟啉單胞菌相關(guān)狀態(tài)或疾病的發(fā)生率或嚴(yán)重程度的方法，包括將上述核酸分子、上述載體或上述原核或真核細(xì)胞給予所述個(gè)體。

在本方面中，本發(fā)明還提供了上述核酸分子、上述載體或上述原核或真核細(xì)胞在用于預(yù)防或降低個(gè)體中牙齦卟啉單胞菌相關(guān)狀態(tài)或疾病的嚴(yán)重程度的藥物中的用途或者在制備所述藥物中的用途。

在其他方面中，本發(fā)明提供了診斷或監(jiān)測(cè)個(gè)體中牙齦卟啉單胞菌相關(guān)狀態(tài)或疾病的方法，包括將上述嵌合或融合蛋白用于檢測(cè)來(lái)自所述個(gè)體的生物樣品中抗牙齦卟啉單胞菌抗體。

在本方面中，本發(fā)明還提供了上述嵌合或融合蛋白在檢測(cè)來(lái)自個(gè)體的生物樣品中抗牙齦卟啉單胞菌抗體中的用途。

另一方面，本發(fā)明提供了診斷或監(jiān)測(cè)個(gè)體中牙齦卟啉單胞菌相關(guān)狀態(tài)或疾病的方法，包括將上述抗體用于檢測(cè)來(lái)自所述個(gè)體的生物樣品中牙齦卟啉單胞菌的存在。

在本方面中，本發(fā)明還提供了上述抗體在檢測(cè)來(lái)自個(gè)體的生物樣品中牙齦卟啉單胞菌的存在中的用途。

另一方面，本發(fā)明提供了具有與牙齦卟啉單胞菌lys-x-蛋白酶或arg-x-蛋白酶的序列相同或同源的序列的一部分或全部的肽或編碼所述肽的核酸在制備用于誘導(dǎo)對(duì)于牙齦卟啉單胞菌的免疫應(yīng)答的嵌合或融合蛋白中的用途。在本方面中，所述肽可以具有seqidno:17、18、25或26中的一項(xiàng)所示的序列。

附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1顯示了重組kgp蛋白的sds-page凝膠考馬斯亮藍(lán)染色。泳道1＝kas2-kla1、泳道2＝kla1、泳道3＝ksa1、泳道4＝kas1-ksa1。分子量標(biāo)記表示為kda。

圖2顯示了kas2肽和福爾馬林殺死的牙齦卟啉單胞菌w50細(xì)胞的抗體識(shí)別。(a)在elisa中，用針對(duì)福爾馬林殺死的牙齦卟啉單胞菌w50細(xì)胞產(chǎn)生的抗血清(fk-w50)、重組蛋白kas1-ksa1、kas2-kla1和合成的kas2-dt綴合物以及pbs探測(cè)kas2肽。(b)在elisa中，用針對(duì)福爾馬林殺死的牙齦卟啉單胞菌w50細(xì)胞產(chǎn)生的抗血清(fk-w50)、重組蛋白kas1-ksa1、kas2-kla1、kla1和pbs探測(cè)福爾馬林殺死的牙齦卟啉單胞菌w50細(xì)胞。將抗體應(yīng)答表示為減去背景水平的兩倍而獲得的elisa滴度od415，每個(gè)滴度代表3個(gè)值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

圖3顯示了牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的、用重組蛋白和重組嵌合蛋白、福爾馬林殺死的牙齦卟啉單胞菌和單獨(dú)的佐劑(pbs,ifa)免疫的小鼠或未經(jīng)口感染的(未激發(fā)的)小鼠的上頜骨臼齒的水平骨喪失。在本圖中，將kas2-kla1表示為as2-la1、kla1表示為la1、kas1-ksa1表示為as1-sa1、ksa1表示為sa1。骨喪失的檢測(cè)結(jié)果是從左和右上頜骨的每個(gè)上頜骨臼齒的頰側(cè)的釉質(zhì)牙骨質(zhì)界(cej)至牙槽嵴(abc)以平方毫米(mm²)為單位測(cè)量的面積的平均值。如levene方差同質(zhì)性所檢測(cè)的，數(shù)據(jù)為正態(tài)分布并表示為平均值(n＝12)、單位為mm²，并用單向方差分析和dunnettt3檢驗(yàn)進(jìn)行分析。*表明該組的骨喪失顯著少于(p<0.001)對(duì)照組(感染的)，表明該組的骨喪失顯著多于(p<0.001)as2-la1組。

圖4顯示了牙周炎模型中被免疫的小鼠的血清抗體亞類應(yīng)答。在elisa中使用來(lái)自用重組蛋白ksa1、kla1、kas1-ksa1和kas2-kla1和福爾馬林殺死的牙齦卟啉單胞菌菌株w50免疫的小鼠(a為口腔接種之前、b為口腔接種之后)的血清，用福爾馬林殺死的牙齦卟啉單胞菌菌株w50作為吸附抗原。將抗體應(yīng)答igg(黑色柱)、igg1(灰色柱)、igg2a(白色柱)、igg2b(水平條紋的柱)、igg3(斜條紋的柱)表示為減去背景水平而獲得的elisa滴度(log2)，每個(gè)滴度代表3個(gè)值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

圖5顯示了對(duì)于代表kas2肽序列433-468的重疊肽(overlappingpeptide)的肽特異性抗體反應(yīng)性的pepscan分析。(a)用kas1-ksa1(白色柱)抗血清、kas2-kla1(黑色柱)抗血清探測(cè)的kas2重疊肽(步移為1，重疊為7)。(b)用kas2-dt綴合物抗血清探測(cè)的kas2重疊肽(步移，重疊為7)。每個(gè)柱顯示抗體反應(yīng)性(在415nm處的光密度[od])。

圖6.嵌合體as2-la1在遠(yuǎn)交系小鼠中誘導(dǎo)識(shí)別牙齦卟啉單胞菌全細(xì)胞和rgpa-kgp復(fù)合物的抗體應(yīng)答。用嵌合體as2-la1(50mg/小鼠)免疫cd1遠(yuǎn)交系小鼠，并將收集的血清用在elisa中，用as2-la1(a)、福爾馬林殺死的牙齦卟啉單胞菌菌株w50(b)和rgpa-kgp復(fù)合物(c)作為吸附抗原。在本圖中，將kas2-kla1表示為as2-la1。測(cè)定對(duì)于每種抗原的每種免疫球蛋白同型的滴度，并將數(shù)據(jù)表示為減去背景水平的兩倍而獲得的elisa滴度(‘000)，每個(gè)滴度代表3個(gè)值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

圖7.kgp蛋白酶的蛋白模型。kas2[asn433-lys468](a)、kas4[asp388-val395](b)、kas5[asn510-asp516](c)和kas6[ile570-tyr580](d)。

發(fā)明的詳細(xì)描述

應(yīng)當(dāng)理解，本說(shuō)明書中所公開和定義的發(fā)明適用于所提及的或從全文或附圖中顯而易見的兩個(gè)或更多個(gè)單獨(dú)特征的所有可選的組合。所有這些不同的組合構(gòu)成本發(fā)明各個(gè)可選方面。

本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，位于切割肽鍵的催化位點(diǎn)或活性位點(diǎn)的側(cè)翼或以其他方式界定切割肽鍵的催化位點(diǎn)或活性位點(diǎn)的牙齦卟啉單胞菌胰酶樣酶的區(qū)是高免疫原性的，并確實(shí)足以提供對(duì)牙齦卟啉單胞菌感染的體液應(yīng)答。特別是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，包含一個(gè)或多個(gè)這些區(qū)域的嵌合或融合蛋白提供對(duì)于牙槽骨喪失的保護(hù)作用，該保護(hù)作用大于針對(duì)全細(xì)胞和其他免疫原產(chǎn)生的抗血清所觀察到的保護(hù)作用。該發(fā)現(xiàn)尤其讓人意想不到的是，到目前為止，牙齦卟啉單胞菌胰酶樣酶的催化結(jié)構(gòu)域的已有發(fā)現(xiàn)是具有相對(duì)弱的免疫原性。

一方面，本發(fā)明提供了用于誘導(dǎo)對(duì)于牙齦卟啉單胞菌的免疫應(yīng)答的嵌合或融合蛋白，所述蛋白包含第一肽和第二肽，所述第一肽與第二肽直接連接或通過(guò)連接子連接，其中：

(a)所述第一肽包含：

(i)與seqidno:1所示的序列相同或同源的序列的一部分或全部；或

(ii)與seqidno:2所示的序列相同或同源的序列的一部分或全部；以及

(b)所述第二肽包含：

(i)與牙齦卟啉單胞菌lys-x-蛋白酶的粘附素結(jié)構(gòu)域的序列相同或同源的序列的一部分或全部；或

(ii)與牙齦卟啉單胞菌arg-x-蛋白酶的粘附素結(jié)構(gòu)域的序列相同或同源的序列的一部分或全部；或

(iii)與牙齦卟啉單胞菌haga粘附素結(jié)構(gòu)域的序列相同或同源的序列的一部分或全部。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“肽”是指多至約40個(gè)氨基酸殘基、優(yōu)選為5-40個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列。

在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽用于指代“第二肽”或換句話說(shuō)用于代替“第二肽”。術(shù)語(yǔ)“多肽”是指至少約40個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列。

因此，另一方面，提供了用于誘導(dǎo)對(duì)于牙齦卟啉單胞菌的免疫應(yīng)答的嵌合或融合蛋白，所述蛋白包含肽和多肽，所述肽與所述多肽直接連接或通過(guò)連接子連接，其中：

(a)所述肽包含：

(i)與seqidno:1所示的序列相同或同源的序列的一部分或全部；或

(ii)與seqidno:2所示的序列相同或同源的序列的一部分或全部；以及

(b)所述多肽包含：

(i)與牙齦卟啉單胞菌lys-x-蛋白酶的粘附素結(jié)構(gòu)域的序列相同或同源的序列的一部分或全部；或

(ii)與牙齦卟啉單胞菌arg-x-蛋白酶的粘附素結(jié)構(gòu)域的序列相同或同源的序列的一部分或全部；或

(iii)與牙齦卟啉單胞菌haga粘附素結(jié)構(gòu)域的序列相同或同源的序列的一部分或全部。

另一方面，本發(fā)明提供了用于誘導(dǎo)對(duì)于牙齦卟啉單胞菌的免疫應(yīng)答的肽，所述肽選自：

(i)與seqidno:64-66中的一項(xiàng)所示的序列相同或同源的序列；和

(ii)與seqidno:67或68所示的序列相同或同源的序列。

在本發(fā)明的一方面中，當(dāng)肽具有seqidno:64-68的序列時(shí)，可以以嵌合或融合蛋白的形式提供所述肽，其中所述肽與第二肽直接連接或通過(guò)連接子連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述嵌合或融合蛋白的第二肽包含：

(i)與牙齦卟啉單胞菌lys-x-蛋白酶的粘附素結(jié)構(gòu)域的序列相同或同源的序列的一部分或全部；或

(ii)與牙齦卟啉單胞菌arg-x-蛋白酶的粘附素結(jié)構(gòu)域的序列相同或同源的序列的一部分或全部；或

(iii)與牙齦卟啉單胞菌haga粘附素結(jié)構(gòu)域的序列相同或同源的序列的一部分或全部。

在上述實(shí)施方案中，多肽用于指代第二肽或換句話說(shuō)用于代替第二肽。因此，另一方面，提供了用于誘導(dǎo)對(duì)于牙齦卟啉單胞菌的免疫應(yīng)答的嵌合或融合蛋白，所述蛋白包含肽和多肽，所述肽與所述多肽直接連接或通過(guò)連接子連接，其中：

(a)所述肽包含：

(i)與seqidno:64-66中的一項(xiàng)所示的序列相同或同源的序列；或

(ii)與seqidno:67或68所示的序列相同或同源的序列；以及

(b)所述多肽包含：

(i)與牙齦卟啉單胞菌lys-x-蛋白酶的粘附素結(jié)構(gòu)域的序列相同或同源的序列的一部分或全部；或

(ii)與牙齦卟啉單胞菌arg-x-蛋白酶的粘附素結(jié)構(gòu)域的序列相同或同源的序列的一部分或全部；或

(iii)與牙齦卟啉單胞菌haga粘附素結(jié)構(gòu)域的序列相同或同源的序列的一部分或全部。

如本文所用的，當(dāng)涉及肽或多肽的“同源物”時(shí)，是指肽或多肽所具有的氨基酸序列與先前提及的肽或多肽的氨基酸序列享有同源性或是同源的或具有同一性，對(duì)于所述同一性，當(dāng)通過(guò)blast算法進(jìn)行比較時(shí)，其優(yōu)選為至少90％的序列同一性，更優(yōu)選為至少95％，并更優(yōu)選為至少98％的序列同一性，其中該算法的參數(shù)被選擇為在各自的序列之間、在各自參考序列的全長(zhǎng)上給出最大的匹配。序列同一性是指在兩條被比較序列的氨基酸之間的精確匹配。這類同源物可以來(lái)自天然存在的變體或牙齦卟啉單胞菌lys-x-蛋白酶或arg-x-蛋白酶的分離物。可選擇地，它可以是來(lái)自牙齦卟啉單胞菌lys-x-蛋白酶或arg-x-蛋白酶的肽或多肽的“保守型取代”變體，其中改變了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而沒有改變所述肽或多肽的總體構(gòu)象和功能；所述保守型取代包括但不限于用具有相似性質(zhì)的氨基酸對(duì)氨基酸進(jìn)行取代。具有相似性質(zhì)的氨基酸在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。例如，可互換的極性/親水性氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸和谷氨酸；可互換的非極性/疏水性氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸；可互換的酸性氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸，以及可互換的堿性氨基酸包括組氨酸、賴氨酸和精氨酸。這類保守型取代變體優(yōu)選有少于20個(gè)，更優(yōu)選少于15個(gè)，更優(yōu)選少于10個(gè)，以及最優(yōu)選少于5個(gè)氨基酸改變。

通過(guò)本說(shuō)明書的以下教導(dǎo)，尤其結(jié)合圖7和實(shí)施例9，可以確定界定了酶中切割肽鍵的位點(diǎn)的牙齦卟啉單胞菌胰酶樣酶，尤其是lys-x-蛋白酶(kgp)或arg-x-蛋白酶(rgpa)的區(qū)，其中圖7和實(shí)施例9對(duì)預(yù)測(cè)lys-x-蛋白酶催化位點(diǎn)在牙齦卟啉單胞菌上展現(xiàn)的三維構(gòu)象的過(guò)程進(jìn)行了舉例說(shuō)明。實(shí)施例10提供了arg-x-蛋白酶三維構(gòu)象的建模方法。

在某些實(shí)施方案中，嵌合或融合蛋白或其第一肽或第二肽組分由類肽(peptidomimetic)形成。類肽是模擬給定肽的一個(gè)或多個(gè)諸如構(gòu)象的特征的分子，并且所述類肽由氨基酸殘基組成，其中一些氨基酸殘基可以不是天然存在的。

在鑒定出催化位點(diǎn)的免疫原區(qū)之后，本發(fā)明人測(cè)定了可以引起體液應(yīng)答的各種肽免疫原的序列。具體而言，已經(jīng)將位于催化位點(diǎn)側(cè)翼的或以其他方式界定催化位點(diǎn)的“六個(gè)”區(qū)定義如下：kas1/ras1、kas2/ras2、kas3/ras3、kas4/ras4、kas5/ras5和kas6(參見表1)。通過(guò)該信息，本發(fā)明人能查詢蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)，從而確定與構(gòu)成位于催化位點(diǎn)側(cè)翼的區(qū)的氨基酸序列享有同源性并因此代表見于牙齦卟啉單胞菌上的免疫原性表位的肽。通過(guò)下述結(jié)構(gòu)式鑒定這些肽的序列：

表1位于kgp和rgpa活性位點(diǎn)側(cè)翼的序列

本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包含這些肽的嵌合蛋白具有多種功效。例如，如本文所述，一些嵌合蛋白產(chǎn)生體液應(yīng)答，其對(duì)于治療或預(yù)防慢性牙周炎中所觀察到的骨喪失是具有高度保護(hù)性的。所述肽也可以用在診斷分析中，其中所述肽能檢測(cè)或監(jiān)測(cè)個(gè)體血清中的特異性，從而指示所述個(gè)體是否被感染，如果被感染了，是否需要治療或如果已提供治療，治療是否有效。

應(yīng)當(dāng)理解，界定了酶中切割位于lys或arg的c端的肽鍵的位點(diǎn)的牙齦卟啉單胞菌胰酶樣酶的區(qū)不包含lys-x-蛋白酶或arg-x-蛋白酶的完整序列。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“異源蛋白”或“嵌合或融合蛋白”是指由功能單元、結(jié)構(gòu)域、氨基酸的序列或區(qū)所組成的蛋白，所述功能單元、結(jié)構(gòu)域、氨基酸的序列或區(qū)可以來(lái)自不同來(lái)源，或來(lái)自相同來(lái)源并進(jìn)行組裝，從而所具有的結(jié)構(gòu)不同于所述單元、結(jié)構(gòu)域、序列或區(qū)所來(lái)自的分子或相關(guān)的分子中所觀察到的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明嵌合或融合蛋白的共有特征是：它們含有至少一個(gè)這樣的肽，所述肽具有與界定了切割肽鍵的催化位點(diǎn)的、牙齦卟啉單胞菌胰酶樣酶的序列相同或享有同源性的氨基酸序列。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)?shù)谝浑陌瑏?lái)自kgp[432-468]區(qū)的肽時(shí)，其優(yōu)選為(i)包含選自vsfanyt和vgfanyt的序列，更優(yōu)選地包含選自gvsfanyt、gvgfanyt、vsfanyta和vgfanyta的序列的肽；或(ii)包含選自etawad、etswad、tawadp和tswadp的序列，優(yōu)選地包含選自setawad、setswad、etawadp、etswadp、tawadpl和tswadpl的序列，更優(yōu)選地包含選自gsetawad、gsetswad、setawadp、setswadp、etawadpl、etswadpl、tawadpll和tswadpll的序列的肽。更優(yōu)選地，該肽選自表1所示的kas1[432-454]肽、kas2[433-468]肽和kas3[436-455]肽?？蛇x擇地，所述第一肽可以是pas1k[432-453]肽，也被稱為pas1(k48)，其在國(guó)際專利申請(qǐng)第pct/au98/00311(wo98/049192)號(hào)中公開。這些肽所對(duì)應(yīng)的序列標(biāo)識(shí)符顯示在表3中。

同樣，在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)?shù)谝浑陌瑏?lái)自rgpa[426-462]區(qū)的肽時(shí)，該肽優(yōu)選地選自表1所示的ras1[426-448]肽、ras2[427-462]肽和ras3[430-449]肽?？蛇x擇地，所述第一肽可以是pas1r[426-446]肽，也被稱為pas1(r45)，其在國(guó)際專利申請(qǐng)第pct/au98/00311(wo98/049192)號(hào)中公開。

在本發(fā)明的嵌合或融合蛋白中，所述第二肽可以是來(lái)自諸如lys-x-蛋白酶(kgp)或arg-x-蛋白酶(rgpa)或haga的牙齦卟啉單胞菌胰酶樣酶的粘附素結(jié)構(gòu)域的肽(參見表2)。這些結(jié)構(gòu)域有時(shí)也被稱為血凝素。在lys-x-蛋白酶中，優(yōu)選的結(jié)構(gòu)域是如表2鑒定出的ka1、ka2、ka3、ka4、ka5。在arg-x-蛋白酶中，優(yōu)選的結(jié)構(gòu)域是如表2鑒定出的ra1、ra2、ra3和ra4。在haga中，優(yōu)選的結(jié)構(gòu)域是haga1、haga1*和haga1**。

表2.kgp和rgpa蛋白酶的粘附素結(jié)構(gòu)域

當(dāng)將諸如kas1、kas2、kas3、kas4、kas5和kas6或ras1、ras2和ras3、ras4和ras5的本發(fā)明的肽包括在嵌合或融合蛋白中時(shí)，可以增強(qiáng)對(duì)于所述本發(fā)明的肽的體液應(yīng)答，除此之外，所述粘附素結(jié)構(gòu)域還含有免疫原性表位，因此導(dǎo)致多特異性的產(chǎn)生，從而引起保護(hù)性免疫原性應(yīng)答。以下發(fā)現(xiàn)是未預(yù)計(jì)到的：當(dāng)將粘附素結(jié)構(gòu)域的免疫原性表位提供在本發(fā)明的嵌合或融合蛋白中時(shí)，所述免疫原性表位保留的形式與其在牙齦卟啉單胞菌胰酶樣酶中的形式接近。

應(yīng)當(dāng)理解，在本發(fā)明的這些實(shí)施方案中，嵌合或融合蛋白可以含有選自kas1/ras1、kas2/ras2、kas3/ras3、kas4/ras4、kas5/ras5和kas6/ras6的肽中的任意一個(gè)或多個(gè)，以及任意一個(gè)或多個(gè)牙齦卟啉單胞菌胰酶樣酶的粘附素結(jié)構(gòu)域，尤其是lys-x-蛋白酶粘附素結(jié)構(gòu)域(ka1、ka2、ka3、ka4和ka5)或arg-x-蛋白酶粘附素結(jié)構(gòu)域(ra1、ra2、ra3和ra4)或haga結(jié)構(gòu)域haga1、haga1*和haga1**中的任意一個(gè)或多個(gè)。

還應(yīng)當(dāng)理解，所述粘附素結(jié)構(gòu)域未必是如牙齦卟啉單胞菌胰酶樣酶中所觀察到的完整結(jié)構(gòu)域。例如，所述粘附素結(jié)構(gòu)域可以是此類結(jié)構(gòu)域的片段，尤其優(yōu)選的片段是lys-x-蛋白酶a1結(jié)構(gòu)域的ksa1和kla1結(jié)構(gòu)域片段(參見表2)。當(dāng)所述結(jié)構(gòu)域是粘附素結(jié)構(gòu)域片段時(shí)，其通常含有一個(gè)或多個(gè)粘附素結(jié)構(gòu)域特異性表位。

粘附素相關(guān)肽所對(duì)應(yīng)的序列標(biāo)識(shí)符顯示在表3中。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二肽或多肽包含seqidno:69-79中的一項(xiàng)或多項(xiàng)或seqidno:83-85中的一項(xiàng)或多項(xiàng)所示的序列。

本發(fā)明的嵌合或融合蛋白還可以包含一個(gè)或多個(gè)選自lys-x-蛋白酶的kgp[432-468]區(qū)的其他的肽和/或一個(gè)或多個(gè)選自arg-x-蛋白酶的rgpa[426-462]區(qū)的其他的肽。

在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，嵌合或融合蛋白包含kas1、kas2、kas3、kas4、kas5和kas6的一種或多種或ras1、ras2、ras3、ras4和ras5的一種或多種，以及ksa1或kla1。

因此，在某些實(shí)施方案中，嵌合或融合蛋白可以包含至少一種其他的肽，其中所述其他的肽包含：

(i)與seqidno:1所示的序列相同或同源的序列的一部分或全部；或

(ii)與seqidno:2所示的序列相同或同源的序列的一部分或全部；或

(iii)與牙齦卟啉單胞菌lys-x-蛋白酶的粘附素結(jié)構(gòu)域的序列相同或同源的序列的一部分或全部；或

(iv)與牙齦卟啉單胞菌arg-x-蛋白酶的粘附素結(jié)構(gòu)域的序列相同或同源的序列的一部分或全部；或

(v)與牙齦卟啉單胞菌haga粘附素結(jié)構(gòu)域的序列相同或同源的序列的一部分或全部。

本文所述的嵌合或融合蛋白中可以包含的結(jié)構(gòu)域、單元、序列或區(qū)域的其他實(shí)例包括用于與受體或配體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，例如fc結(jié)合區(qū)或fc受體；用于改善半壽期的結(jié)構(gòu)域，例如白蛋白；或用于促進(jìn)嵌合或融合蛋白的表達(dá)或純化的結(jié)構(gòu)域。

在本發(fā)明的嵌合或融合蛋白中，第一肽的c末端殘基可以與粘附素結(jié)構(gòu)域多肽的n末端殘基共價(jià)連接，或第一肽的n末端殘基可以與粘附素結(jié)構(gòu)域多肽的c末端殘基共價(jià)連接。在該排列中，所述第一肽和粘附素結(jié)構(gòu)域多肽被認(rèn)為是“直接連接”或“緊鄰”。

在其他的實(shí)施方案中，嵌合或融合蛋白包含用于連接第一肽和粘附素結(jié)構(gòu)域多肽的連接子。所述連接子可以是能將肽與多肽連接的任意連接子，包括氨基酸和非氨基酸連接子。優(yōu)選地，所述連接子是非免疫原性的。合適的連接子的長(zhǎng)度可以多至15個(gè)氨基酸，但是優(yōu)選少于5個(gè)氨基酸。所述連接子的功能可以是使第一肽和粘附素結(jié)構(gòu)域多肽的空間排列比在牙齦卟啉單胞菌胰酶樣酶中正常觀察到的更接近?？蛇x擇地，所述連接子可以將第一肽與粘附素結(jié)構(gòu)域多肽隔開。

可以通過(guò)重組表達(dá)系統(tǒng)(諸如重組dna技術(shù))或通過(guò)化學(xué)合成(諸如固相肽合成)產(chǎn)生本發(fā)明的嵌合或融合蛋白。這些技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。

異源或嵌合蛋白特別有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)榕c單獨(dú)使用嵌合或融合蛋白的第一或第二肽組分所獲得的體液應(yīng)答相比，它增強(qiáng)了所獲得的體液應(yīng)答。

本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包含這些肽的嵌合蛋白具有多種功效。例如，如本文所述，一些嵌合蛋白產(chǎn)生體液應(yīng)答，其對(duì)于治療或預(yù)防慢性牙周炎中所觀察到的骨喪失是具有高度保護(hù)性的。所述肽也可以用在診斷分析中，其中所述肽能檢測(cè)或監(jiān)測(cè)個(gè)體血清中的特異性，從而指示所述個(gè)體是否被感染，如果被感染了，是否需要治療或如果已提供治療，治療是否有效。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述嵌合或融合蛋白誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答，通常為至少最小化或限制以其他方式與牙齦卟啉單胞菌感染有關(guān)的結(jié)締組織損傷的應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述保護(hù)性應(yīng)答至少最小化或限制牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的骨喪失。本文討論了用于測(cè)定牙齦卟啉單胞菌感染介導(dǎo)的骨喪失的模型系統(tǒng)。通常，所述保護(hù)性免疫應(yīng)答主要為體液應(yīng)答。在某些實(shí)施方案中，所述保護(hù)性免疫應(yīng)答還包括細(xì)胞應(yīng)答。

本發(fā)明還提供了包含上文概括描述的嵌合或融合蛋白的組合物。所述組合物通常是抗原性的或免疫原性的。更具體而言，本發(fā)明提供了適于引起對(duì)于牙齦卟啉單胞菌感染的保護(hù)性或治療性免疫應(yīng)答的組合物，所述組合物包含所述嵌合或融合蛋白并任選地與佐劑結(jié)合。這類組合物還可以包含用于調(diào)節(jié)或增強(qiáng)免疫應(yīng)答的另一組分。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物采用疫苗的形式。

各種佐劑已知可以與疫苗組合物聯(lián)合使用。所述佐劑協(xié)助調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，并且有助于使用比單獨(dú)給予疫苗抗原更小量的疫苗抗原或更少的劑量來(lái)獲得更持久和更高的免疫力水平。佐劑的實(shí)例包括弗氏不完全佐劑(ifa)、佐劑65(含有花生油、二縮甘露醇一油酸和單硬脂酸鋁)、油乳化劑、ribi佐劑、復(fù)合多元醇、多胺、阿夫立定(avridine)、quila、皂苷、mpl、qs-21、諸如鋁鹽和鈣鹽的礦物質(zhì)凝膠、諸如羥磷灰石、磷酸鈣、鋁鹽、糖低聚物的納米顆粒、和諸如甘露聚糖、殼聚糖的聚合物。其他的實(shí)例包括水包油乳化劑，諸如saf-1、saf-0、mf59、seppicisa720和其他的顆粒佐劑，諸如iscoms^tm和iscom基質(zhì)^tm。佐劑的其他實(shí)例的廣泛但不完全的列表見于coxandcoulter1992[in:wongwk(ed.)animalsparasitecontrolutilizingtechnology(動(dòng)物寄生蟲控制實(shí)用技術(shù)).boccaraton；crcpress,1992；49-112]。除了佐劑之外，疫苗組合物可以視情況包含常規(guī)的藥學(xué)可接受的載體、賦形劑、填料、緩沖液或稀釋劑?？梢灶A(yù)防性地給予一個(gè)或多個(gè)劑量的含有佐劑的疫苗組合物以預(yù)防牙周炎，或治療性地給予一個(gè)或多個(gè)劑量的含有佐劑的疫苗組合物以治療已患的牙周炎。

在優(yōu)選的組合物中，嵌合或融合蛋白與粘膜佐劑組合，并且通過(guò)口腔、頰或鼻腔途徑進(jìn)行給藥。粘膜佐劑的實(shí)例是納米顆粒、霍亂毒素和熱不穩(wěn)定的大腸桿菌毒素、這些毒素的非毒性b亞基、這些毒素的具有降低的毒性的遺傳突變體?？梢杂脕?lái)口腔/頰/鼻腔遞送抗原性蛋白的其他方法包括將蛋白通過(guò)微囊化作用合并在或吸附在可生物降解的聚合物(諸如丙烯酸酯或聚酯)顆粒或納米顆粒(諸如羥磷灰石)的內(nèi)部或上面，從而有助于微球從胃腸道或其他粘膜表面的攝取并保護(hù)蛋白免于降解。脂質(zhì)體、iscomstm、水凝膠是其他可能方法的實(shí)例，通過(guò)并入諸如ltb、ctb或凝集素的用于將抗原性蛋白遞送至粘膜免疫系統(tǒng)的靶分子可以進(jìn)一步增強(qiáng)這些方法。除了抗原性蛋白和粘膜佐劑或遞送系統(tǒng)之外，所述疫苗組合物可以視情況包含常規(guī)的藥學(xué)可接受的載體、賦形劑、填料、包被、分散介質(zhì)、抗細(xì)菌劑或抗真菌劑和緩沖液或稀釋劑。

在本方面中，本發(fā)明還提供了預(yù)防或降低個(gè)體中牙齦卟啉單胞菌相關(guān)狀態(tài)或疾病的發(fā)生率或嚴(yán)重程度的方法，其包括給予所述個(gè)體上述嵌合或融合蛋白或上述組合物。

所述個(gè)體可以是人或其他動(dòng)物個(gè)體，且優(yōu)選為人。

通常，牙齦卟啉單胞菌相關(guān)狀態(tài)或疾病是慢性牙周炎，然而也可以是骨喪失，尤其是牙槽骨喪失或冠狀動(dòng)脈疾病。

已知許多方法可以用于將疫苗組合物給予人或動(dòng)物個(gè)體，所述方法包括但不限于皮內(nèi)給藥、肌肉內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)給藥、靜脈內(nèi)給藥、皮下給藥、鼻內(nèi)給藥、舌下給藥、頰給藥和口服給藥。這些給藥途徑尤其適用于疫苗接種。

另一方面，本發(fā)明提供了針對(duì)上文概括描述的嵌合或融合蛋白所產(chǎn)生的抗體，優(yōu)選為單克隆抗體。

可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生這些抗體，并且可以將這些抗體用于個(gè)體的被動(dòng)免疫。因此，在本方面中，本發(fā)明還提供了預(yù)防或降低個(gè)體中牙齦卟啉單胞菌相關(guān)疾病或狀態(tài)的嚴(yán)重程度的方法，包括給予所述個(gè)體上述抗體。

另一方面，本發(fā)明提供了包含編碼上文概括描述的嵌合或融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列任選地與至少一種調(diào)節(jié)元件可操作地連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，以分離的或基本上純化的形式提供所述核酸。

例如，可以將所述核酸分子插入合適的表達(dá)載體中，通過(guò)將所述表達(dá)載體插入原核或真核宿主細(xì)胞，可以用于產(chǎn)生作為重組蛋白的嵌合蛋白。重組蛋白的成功表達(dá)需要表達(dá)載體含有轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的調(diào)節(jié)元件，所述調(diào)節(jié)元件與用于表達(dá)的具體宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容并可以被所述宿主細(xì)胞系統(tǒng)識(shí)別。各種宿主細(xì)胞系統(tǒng)可以用來(lái)表達(dá)重組蛋白，包括但不限于，用噬菌體載體、質(zhì)粒載體或粘粒dna轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；含有酵母載體的酵母；含有真菌載體的真菌；用病毒(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系；和用質(zhì)?；虿《颈磉_(dá)載體轉(zhuǎn)染的或用重組病毒(例如，牛痘病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等)感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。

使用分子生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)已知的方法，可以將各種啟動(dòng)子和增強(qiáng)子合并入表達(dá)載體，從而增加重組蛋白的表達(dá)，只要增加的氨基酸序列表達(dá)與所用的具體宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容(例如，對(duì)所述宿主細(xì)胞系統(tǒng)沒有毒性)。

啟動(dòng)子的選擇取決于所用的表達(dá)系統(tǒng)。啟動(dòng)子在強(qiáng)度上，即在促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的能力上可以不同。通常，為了獲得編碼核苷酸序列的高水平轉(zhuǎn)錄和重組蛋白的高水平表達(dá)，使用強(qiáng)啟動(dòng)子是理想的。例如，本領(lǐng)域內(nèi)已知的、通過(guò)其可以在包括大腸桿菌在內(nèi)的宿主細(xì)胞系統(tǒng)中觀察到高水平轉(zhuǎn)錄的細(xì)菌、噬菌體或質(zhì)粒啟動(dòng)子包括lac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、reca啟動(dòng)子、核糖體rna啟動(dòng)子、pr與pl啟動(dòng)子、lacuv5、ompf、bla、lpp等，并可以用于提供插入的編碼氨基酸序列的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。

用于高效轉(zhuǎn)錄或翻譯的其他控制元件包括增強(qiáng)子和調(diào)節(jié)信號(hào)。增強(qiáng)子序列是表現(xiàn)為增加轉(zhuǎn)錄效率的dna元件，其作用方式相對(duì)不依賴于它們相對(duì)于鄰近的編碼核苷酸序列的位置或方向。因此，根據(jù)所用的宿主細(xì)胞表達(dá)載體系統(tǒng)，可以將增強(qiáng)子置于插入的編碼序列的上游或下游來(lái)增加轉(zhuǎn)錄效率。諸如轉(zhuǎn)錄或翻譯起始信號(hào)的其他調(diào)節(jié)位點(diǎn)可以用來(lái)調(diào)節(jié)編碼序列的表達(dá)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，載體可以是病毒疫苗載體或細(xì)菌疫苗載體，且用來(lái)提供重組病毒疫苗、重組細(xì)菌疫苗、重組減毒細(xì)菌疫苗或滅活重組病毒疫苗。牛痘病毒是本領(lǐng)域內(nèi)最熟知的感染性病毒的實(shí)例，對(duì)其進(jìn)行基因工程以表達(dá)源于其他生物體的疫苗抗原。將重組活牛痘病毒用來(lái)免疫宿主，所述重組活牛痘病毒被減毒過(guò)或以其他方式處理過(guò)以使其自身不會(huì)導(dǎo)致疾病。在宿主中，隨后的重組病毒的復(fù)制提供了疫苗抗原對(duì)免疫系統(tǒng)的連續(xù)刺激，由此提供長(zhǎng)效免疫。

其他活疫苗載體包括：腺病毒、巨細(xì)胞病毒，并優(yōu)選諸如牛痘[paolettiandpanicali，美國(guó)專利第4,603,112號(hào)]的痘病毒和減毒沙門氏菌(salmonella)菌株[stockeretal，美國(guó)專利第5,210,035號(hào)、第4,837,151號(hào)和第4,735,801號(hào)和curtissetal,1988,vaccine6:155-160]?；钜呙缣貏e具有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗鼈兂掷m(xù)刺激免疫系統(tǒng)，這能賦予基本上長(zhǎng)效的免疫力。當(dāng)免疫應(yīng)答對(duì)于后續(xù)牙齦卟啉單胞菌感染具有保護(hù)作用時(shí)，活疫苗自身可以用在針對(duì)牙齦卟啉單胞菌的預(yù)防性疫苗中。特別是，活疫苗可以基于口腔的共生物細(xì)菌?？梢杂脭y帶重組嵌合蛋白的載體轉(zhuǎn)化該細(xì)菌，然后將其用來(lái)在口腔中定殖，尤其是口腔粘膜。一旦在口腔粘膜中定殖，所述重組蛋白的表達(dá)將刺激粘膜相關(guān)淋巴組織，從而產(chǎn)生中和抗體。為了進(jìn)一步說(shuō)明本實(shí)施方案，利用本領(lǐng)域內(nèi)公知的分子生物學(xué)技術(shù)，可以將編碼本發(fā)明嵌合蛋白的核苷酸序列插入牛痘病毒基因組dna，所插入的位點(diǎn)允許表位的表達(dá)但不會(huì)對(duì)牛痘病毒載體的生長(zhǎng)或復(fù)制產(chǎn)生不利影響。所得重組病毒可以用作疫苗制劑中的免疫原。同樣的方法可以用來(lái)構(gòu)建滅活重組病毒疫苗制劑，區(qū)別僅在于，所述重組病毒在用作免疫原之前例如通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)已知的化學(xué)方法進(jìn)行滅活，但這基本上不影響表達(dá)的免疫原的免疫原性。為了增強(qiáng)對(duì)疫苗抗原的免疫應(yīng)答，可以將滅活重組疫苗與合適的佐劑一起配制。

本發(fā)明還提供了將包含編碼本發(fā)明嵌合或融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子直接作為疫苗制劑的用途?？梢詫⒖刹僮鞯剡B接于一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)元件的編碼嵌合蛋白的核苷酸序列直接引入(“直接的基因轉(zhuǎn)移”)，從而對(duì)個(gè)體進(jìn)行針對(duì)牙齦卟啉單胞菌病原菌株的疫苗接種。將基因直接轉(zhuǎn)移進(jìn)接種的個(gè)體會(huì)導(dǎo)致被接種個(gè)體的諸如血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞以及主要器官組織中遺傳物質(zhì)的表達(dá)，這已經(jīng)通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)得到證實(shí)，諸如通過(guò)靜脈內(nèi)注射表達(dá)質(zhì)粒：陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物[zhuetal,1993,science261:209-211]。將載體dna遞送進(jìn)靶細(xì)胞的其他有效的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。在一個(gè)實(shí)例中，將含有病毒基因的純化的重組質(zhì)粒dna用于接種疫苗(腸胃外免疫、粘膜免疫或通過(guò)基因槍進(jìn)行免疫)，以誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答[fynanetal.1993,procnatlacadsciusa90:11478-11482]。在另一個(gè)實(shí)例中，可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)已知的標(biāo)準(zhǔn)方案對(duì)從個(gè)體移除的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染或電穿孔，這導(dǎo)致重組載體dna被引入靶細(xì)胞內(nèi)。然后，可以用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法選擇含有重組載體dna的細(xì)胞，諸如通過(guò)使用載體中表達(dá)的選擇標(biāo)記，然后，可以將選擇的細(xì)胞再引入個(gè)體，以表達(dá)重組蛋白。

在本方面中，本發(fā)明還提供了預(yù)防或降低個(gè)體中牙齦卟啉單胞菌相關(guān)狀態(tài)或疾病的發(fā)生率或嚴(yán)重程度的方法，所述方法包括給予所述個(gè)體上述核酸分子、上述載體或上述原核或真核細(xì)胞。

在其他的實(shí)施方案中，提供了包含上述的嵌合或融合蛋白或抗體的藥物組合物。所述組合物還可以包含稀釋液、賦形劑或載體或用于治療牙齦卟啉單胞菌相關(guān)狀態(tài)或疾病的化療劑，并且所述組合物可以被調(diào)整為適于口腔給藥?？蓪⒈景l(fā)明的組合物合并在錠劑或口香糖或其他產(chǎn)品中，例如，通過(guò)將其攪拌進(jìn)溫?zé)崮z基或包被膠基的外表面，所述膠基的實(shí)例為節(jié)路頓膠(jelutong)、橡膠乳膠、乙烯基樹脂等，理想情況伴有常規(guī)的增塑劑或軟化劑、糖或其他甜味劑或諸如葡萄糖、山梨醇等。

可以制備和使用適于口腔的各種形式的、含有上述藥物組合物的本發(fā)明的口腔組合物，例如包括牙膏、牙粉和液體潔牙劑的潔牙劑、漱口劑、錠劑、口香糖、牙科用糊劑、齒齦按摩乳膏、漱口片劑、乳制品和其他食品。根據(jù)具體口腔組合物的類型和形式，本發(fā)明的口腔組合物還可以包含其他公知的組分。

在本發(fā)明的某些優(yōu)選形式中，所述口腔組合物的性質(zhì)可以基本為液體，諸如漱口劑或清洗劑。在這類制劑中，介質(zhì)通常是水-醇混合物，理想情況包含下述濕潤(rùn)劑。通常，水與醇的重量比為約1:1至約20:1。在該類制劑中，水-醇混合物的總量通常為所述制劑重量的約70％-約99.9％。所述醇通常是乙醇或異丙醇。優(yōu)選乙醇。

本發(fā)明的這類液體和其他制劑的ph一般為約5至約9，且通常為約5.0-7.0?？梢杂盟?例如，檸檬酸或苯甲酸)或堿(例如，氫氧化鈉)或緩沖劑(如用檸檬酸鈉、安息香酸鈉、碳酸鈉或碳酸氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等)控制ph。

在本發(fā)明的其他理想形式中，所述藥物組合物的性質(zhì)可以基本為固體或糊狀，例如牙粉、牙科用片劑或牙膏(牙科用乳膏)或凝膠潔牙劑。這類固體或糊狀口腔制劑的介質(zhì)通常含有牙科上可接受的磨光材料。

在牙膏中，液體介質(zhì)可包含水和濕潤(rùn)劑，它們的量通常為所述制劑重量的約10％-約80％。甘油、丙二醇、山梨醇和聚丙二醇是合適的濕潤(rùn)劑/載體的實(shí)例。水、甘油和山梨醇的液體混合物也是有利的。在透明凝膠中，因?yàn)檎凵渲笖?shù)是重要的考慮因素，所以優(yōu)選采用約2.5-30％w/w的水、0-約70％w/w的甘油和約20-80％w/w的山梨醇。

牙膏、乳膏和凝膠通常含有天然的或合成的增稠劑或膠凝劑，其比例為約0.1％-約10％w/w，優(yōu)選為約0.5％-約5％w/w。合適的增稠劑是合成的鋰蒙脫石，例如laporteindustrieslimited銷售的名為laponite(例如，cp、sp2002、d)的合成膠體鎂堿金屬硅酸鹽復(fù)合物粘土。以重量計(jì)laponited大約為58.00％sio2、25.40％mgo、3.05％na2o、0.98％li2o以及一些水和微量金屬。它的真比重為2.53，并且在8％濕度時(shí)，它有1.0g/ml的表觀松裝密度。

其他合適的增稠劑包括愛爾蘭蘚、iota-角叉膠、黃蓍膠、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羥乙基丙基纖維素、羥丁基甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素(例如，商業(yè)名natrosol)、羧甲基纖維素鈉和硅膠，例如精細(xì)研磨的syloid(例如，244)。還可以包含增溶劑，例如，濕潤(rùn)劑多元醇，例如丙二醇、二丙二醇和己二醇；溶纖劑，例如甲基溶纖劑和乙基溶纖劑；在直鏈中含有至少約12個(gè)碳的植物油和蠟，例如橄欖油、蓖麻油和礦脂；以及酯類，例如乙酸戊酯、乙酸乙酯和苯甲酸芐酯。

應(yīng)當(dāng)理解，常規(guī)情況下，口腔制劑通常是在合適的帶標(biāo)簽的包裝中進(jìn)行銷售或分銷。因此，瓶裝口腔清洗劑會(huì)帶有在本質(zhì)上作為口腔清洗劑或漱口劑對(duì)其進(jìn)行描述的標(biāo)簽，并且所述標(biāo)簽寫有它的使用說(shuō)明；通常，牙膏、乳膏或凝膠在通常為鋁、鉛襯或塑料的收縮管，或用于劑量?jī)?nèi)容物的其他擠壓器、泵取或加壓分配器中，所述收縮管或分配器帶有在本質(zhì)上作為牙膏、凝膠或牙科用乳膏對(duì)其進(jìn)行描述的標(biāo)簽。

在本發(fā)明的組合物中可以使用有機(jī)表面活性劑，以達(dá)到增強(qiáng)的預(yù)防作用，協(xié)助實(shí)現(xiàn)活性劑徹底、完全地分散在整個(gè)口腔中，并且使本發(fā)明的組合物更適合化妝品應(yīng)用。所述有機(jī)表面活性物質(zhì)的性質(zhì)優(yōu)選為陰離子的、非離子的或兩性的，且優(yōu)選不與所述活性劑相互作用。優(yōu)選地將去垢劑物質(zhì)作為表面活性劑，所述去垢劑物質(zhì)賦予組合物去垢和發(fā)泡性質(zhì)。陰離子表面活性劑的合適實(shí)例是高級(jí)脂肪酸單硫酸甘油單脂的水溶性鹽，例如氫化椰子油脂肪酸的單硫酸甘油單脂的鈉鹽；高級(jí)烷基硫酸鹽，例如月桂基磺酸鈉；烷基芳基磺酸鹽，例如十二烷基苯磺酸鈉、高級(jí)烷基磺基醋酸鹽、1,2-二羥基丙磺酸鹽的高級(jí)脂肪酸酯；以及低級(jí)脂肪族氨基羧酸化合物的基本飽和的高級(jí)脂肪族酰胺，諸如在脂肪酸、烷基或?；芯哂?2-16個(gè)碳的那些化合物等。以上提到的酰胺的實(shí)例是n-月桂酰肌氨酸、以及n-月桂酰肌氨酸、n-肉豆蔻酰肌氨酸或n-棕櫚酰肌氨酸的鈉鹽、鉀鹽和乙醇胺鹽，以上應(yīng)當(dāng)基本脫離于肥皂或相似的高級(jí)脂肪酸材料。適于使用的水溶性非離子表面活性劑的實(shí)例是環(huán)氧乙烷和可與其發(fā)生反應(yīng)的各種反應(yīng)性含氫化合物的縮合產(chǎn)物，所述含氫化合物具有長(zhǎng)疏水性鏈(例如，約12-20個(gè)碳原子的脂肪族鏈)，該縮合產(chǎn)物("ethoxamers")含有親水性聚氧乙烯部分，所述縮合產(chǎn)生例如聚(環(huán)氧乙烯)與脂肪酸、脂肪醇、脂肪酰胺、多羥基醇(例如，山梨醇酐單硬脂酸酯)和聚環(huán)氧丙烷(例如，普流尼克(pluronic)材料)的縮合產(chǎn)物。

表面活性劑的量通常為以重量計(jì)約0.1％-5％。值得注意的是，表面活性劑可以促進(jìn)本發(fā)明活性劑的溶解，因而減少所需的增溶濕潤(rùn)劑的量。

在本發(fā)明的口腔制劑中可以摻入各種其他材料，諸如增白劑、防腐劑、硅酮、葉綠素復(fù)合物和/或諸如尿素、磷酸氫二銨的含胺材料，以及以上的混合物。這些佐劑如果存在，則摻入制劑的佐劑的量應(yīng)當(dāng)基本上不會(huì)對(duì)所需的性質(zhì)和特征產(chǎn)生不利影響。

還可以使用任何合適的調(diào)味材料或增甜材料。合適的調(diào)味組分的實(shí)例是調(diào)味油和水楊酸甲酯，所述調(diào)味油例如，綠薄荷油、薄荷油、鹿蹄草油、檫木油、丁香油、鼠尾草油、桉樹油、媒墨角蘭油、肉桂油、檸檬油和橙油。合適的增甜劑包括蔗糖、乳糖、麥芽糖、山梨醇、木糖醇、環(huán)氨酸鈉、紫蘇亭、amp(天冬酰胺苯丙氨酸酯甲酯)、糖精等。適當(dāng)?shù)?，調(diào)味劑和增甜劑可以單獨(dú)或共同占制劑的約0.1％至5％或更多。

可以按照任何本領(lǐng)域內(nèi)已知的制備藥物組合物的方法來(lái)制備意圖用于口腔的組合物，并且為了提供滿足藥學(xué)上外觀和味覺的制劑，該組合物可以含有一種或多種選自以下的試劑：增甜劑、調(diào)味劑、著色劑和防腐劑。片劑含有與適于制備片劑的無(wú)毒的藥學(xué)可接受賦形劑混合的活性組分。這些賦形劑可以是，例如，惰性稀釋劑，例如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；成粒劑和崩解劑，例如，玉米淀粉或褐藻酸；粘合劑，例如，淀粉、明膠或阿拉伯樹膠；和潤(rùn)滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。片劑可以是無(wú)包被的或可以用已知的技術(shù)進(jìn)行包被以延遲在胃腸道或牙周袋中的崩解和吸收，從而在更長(zhǎng)的時(shí)期提供持續(xù)的作用。例如，可以使用時(shí)間延遲材料，諸如單硬脂酸甘油酯或雙硬脂酸甘油酯。

用于口腔的制劑還可以以硬明膠膠囊的形式提供，其中活性組分與諸如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土的惰性固體稀釋劑混合；用于口腔的制劑還可以以軟明膠膠囊的形式提供，其中活性組分與水或諸如花生油、液體石蠟或橄欖油的油介質(zhì)混合。

水性懸液含有活性物質(zhì)與適于制備水性懸液的賦形劑的混合物。這類賦形劑是懸浮劑，例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍膠和阿拉伯樹膠。分散劑或潤(rùn)濕劑可以是天然存在的磷脂，例如，卵磷脂；或環(huán)氧烷烴與脂肪酸的縮合物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯；或環(huán)氧乙烷與長(zhǎng)鏈脂肪醇的縮合物，例如十七乙烯氧基十六烷醇(heptadecaethyleneoxycetanol)；或環(huán)氧乙烷與來(lái)自脂肪酸和己糖醇的部分酯的縮合物，例如聚氧乙烯山梨醇單油酸酯；或環(huán)氧乙烷與來(lái)自脂肪酸和己糖醇酐的部分酯的縮合物，例如聚乙烯脫水山梨聚醇單油酸酯。

水性懸液還可以含有一種或多種防腐劑或抗微生物劑，例如苯甲酸酯，諸如乙基或n-丙基p-羥基苯甲酸酯；另一個(gè)實(shí)例是葡萄糖酸氯己定；水性懸液還可以含有一種或多種著色劑、一種或多種調(diào)味劑和一種或多種增甜劑，諸如蔗糖或糖精。

可以通過(guò)將活性組分懸浮于植物油或礦物油中來(lái)配制油性懸液，所述植物油例如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油；所述礦物油例如液體石蠟。油性懸液可以含有增稠劑，例如蜂蠟、硬石蠟或鯨蠟醇?？梢蕴砑诱{(diào)味劑和諸如上文列出的增甜劑，以提供符合味覺需要的口腔制劑。通過(guò)添加諸如抗壞血酸的抗氧化劑可以使這些組合物防腐。

在其他方面，本發(fā)明提供了診斷或監(jiān)測(cè)個(gè)體中牙齦卟啉單胞菌相關(guān)狀態(tài)或疾病的方法，包括使用上述的嵌合或融合蛋白檢測(cè)來(lái)自所述個(gè)體的生物樣品中的抗牙齦卟啉單胞菌抗體。

另一方面，本發(fā)明提供了診斷或監(jiān)測(cè)個(gè)體中牙齦卟啉單胞菌相關(guān)狀態(tài)或疾病的方法，包括使用上述的抗體檢測(cè)來(lái)自所述個(gè)體的生物樣品中牙齦卟啉單胞菌的存在。

另一方面，本發(fā)明提供了用于誘導(dǎo)對(duì)于牙齦卟啉單胞菌的免疫應(yīng)答的肽，所述肽包括seqidno:17、18、25和26中的一項(xiàng)所示的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽具有與seqidno:17、18、25和26中的一項(xiàng)同源的序列。所述肽的長(zhǎng)度可以為5-40個(gè)氨基酸。

另一方面，本發(fā)明提供了編碼具有seqidno:17、18、25和26中的一項(xiàng)所示序列的肽的核酸。

另一方面，本發(fā)明提供了具有seqidno:17、18、25和26中的一項(xiàng)所示序列的肽或編碼具有seqidno:17、18、25和26中的一項(xiàng)所示序列的肽的核酸在制備用于誘導(dǎo)對(duì)于牙齦卟啉單胞菌的免疫應(yīng)答的嵌合或融合蛋白中的用途。

另一方面，本發(fā)明提供了具有seqidno:17、18、25和26中的一項(xiàng)所示序列的肽或編碼具有seqidno:17、18、25和26中的一項(xiàng)所示序列的肽的核酸在誘導(dǎo)對(duì)于牙齦卟啉單胞菌的免疫應(yīng)答中的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽與第二肽同時(shí)給藥或相繼給藥，所述第二肽包含：

(i)與牙齦卟啉單胞菌lys-x-蛋白酶粘附素結(jié)構(gòu)域的序列相同或同源的序列的一部分或全部；或

(ii)與牙齦卟啉單胞菌arg-x-蛋白酶粘附素結(jié)構(gòu)域的序列相同或同源的序列的一部分或全部；或

(iii)與牙齦卟啉單胞菌haga粘附素結(jié)構(gòu)域的序列相同或同源的序列的一部分或全部。

表3

通過(guò)下述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，下述實(shí)施例是為了舉例說(shuō)明而不是為了限制本發(fā)明。

實(shí)施例

實(shí)施例1

方法和材料

細(xì)菌菌株和生長(zhǎng)條件

使牙齦卟啉單胞菌w50的凍干培養(yǎng)物于37℃下、在補(bǔ)充了5μg/ml血晶素、0.5μg/ml半胱氨酸的裂解馬血瓊脂平板上厭氧生長(zhǎng)(hb瓊脂，<10代)。3-4天后，將集落接種含有5μg/ml血晶素、0.5μg/ml半胱氨酸的腦心浸液培養(yǎng)基(1)。使批量培育物在mk3厭氧工作站(donwhitleyscientificltd.,adelaide,australia)中厭氧生長(zhǎng)。在指數(shù)生長(zhǎng)期中，通過(guò)離心收集細(xì)胞(7500g，30分鐘，4℃)，并且在厭氧工作站中用pg緩沖液(50mmtris-hcl、150mmnacl、5mmcacl2和5mm半胱氨酸-hcl，ph8.0)洗滌兩次。用分光光度計(jì)(型號(hào)295e,perkin-elmer)在650nm處監(jiān)測(cè)批量培養(yǎng)物的生長(zhǎng)。按照slots(2)所述，通過(guò)革蘭氏染色、顯微鏡檢查并使用各種生化測(cè)試常規(guī)檢測(cè)培養(yǎng)物純度。

含有粘附素序列和n末端添加了kgp蛋白酶序列的粘附素序列的pet28構(gòu)建體的構(gòu)建

使用pet表達(dá)載體(novagen)，將代表活性位點(diǎn)(as)與kgpa1粘附素(a1)結(jié)構(gòu)域的肽和嵌合肽的kgp殘基在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)為帶有6×his標(biāo)簽的重組(r)蛋白。所表達(dá)的r-蛋白是rkas2和rkla1，r-嵌合蛋白是rkas2-kla1、rkas1-ksa1和rkas4-kas3-kas5-kas6-kla1(也被稱為“多kas-kla1”)。代表各種a1和as結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列描述于表1和表2中。

使用表4列出的引物、taqdna聚合酶(invitrogen)和pc-960熱循環(huán)儀(corbettresearchtechnologies)分別從pns1(puc18中的3.5kbbamhilys片段)或牙齦卟啉單胞菌基因組dna擴(kuò)增kgp基因的各種kas和ka1結(jié)構(gòu)域。分別使用引物對(duì)kas2-for與kas2-rev和kla1-for與kla1-rev來(lái)產(chǎn)生編碼kas2和kla1的pcr片段，使用下述條件進(jìn)行反應(yīng)：94℃、3分鐘；每個(gè)循環(huán)為94℃、45秒(變性)，62℃、40秒(退火)和72℃、20秒(延伸)，進(jìn)行28個(gè)循環(huán)；72℃、5分鐘進(jìn)行最后1個(gè)循環(huán)。

按照下述，通過(guò)利用重疊延伸(soeing)的基因剪接產(chǎn)生kas2-kla1嵌合pcr產(chǎn)物：使用引物對(duì)kas2-for與kas2-kla1-嵌合體-rev和kas2-kla1-嵌合體-for與kla1-rev、按上述條件產(chǎn)生pcr產(chǎn)物。然后，將該pcr產(chǎn)物退火，并用引物kas2-for和kla1-rev進(jìn)行最后的pcr(94℃、2分鐘；每個(gè)循環(huán)為94℃、30秒，50℃、30秒和72℃、40秒，進(jìn)行28個(gè)循環(huán)；72℃、5分鐘進(jìn)行最后1個(gè)循環(huán))。

對(duì)于kas1-ksa1pcr產(chǎn)物的制備，進(jìn)行兩次連續(xù)pcr，該pcr中使用kas1-ksa1-rev引物并且相繼使用kas1-ksa1-for引物1和2中的每個(gè)(反應(yīng)條件：94℃、2分鐘；每個(gè)循環(huán)為94℃、15秒，63℃、30秒和72℃、2分鐘，進(jìn)行35個(gè)循環(huán))，從而產(chǎn)生kas1-ksa1pcr產(chǎn)物。kas1-ksa1-for1和kas1-ksa1-for2引物含有與之前pcr產(chǎn)物的5'重疊的3'延伸。

對(duì)于多kas-kla1pcr片段的制備，進(jìn)行四次連續(xù)pcr，該pcr中使用多rev引物并且相繼使用多for引物1、2、3和4中的每個(gè)(反應(yīng)條件：95℃、2分鐘；每個(gè)循環(huán)為95℃、20秒，68℃、1.5分鐘，進(jìn)行35個(gè)循環(huán))，從而產(chǎn)生多kas-kla1pcr產(chǎn)物。每個(gè)多for引物含有與之前pcr產(chǎn)物的5'重疊的3'延伸。

按照生產(chǎn)商的方法，用pcr純化柱(qiagen)純化編碼kas2、kla1、kas2-kla1、kas1-ksa1和多kas-kla1的所有pcr片段，將它們連接到ta克隆載體pgem-teasy(promega)，并轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌jm109。用ncol和xhol消化純化的重組pgemt-easy構(gòu)建體，定向克隆進(jìn)ncol/xhol消化的pet28b(novagen)，并轉(zhuǎn)化進(jìn)非表達(dá)宿主大腸桿菌jm109[dh5α]。按照生產(chǎn)商的說(shuō)明，純化重組pet28構(gòu)建體，將其轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌表達(dá)宿主bl21(de3)[hms174(de3)](novagen)中，并在含有50μg卡那霉素的lb上進(jìn)行選擇。通過(guò)dna序列分析確認(rèn)每個(gè)插入物的完整性。

寡核苷酸引物(表4)被設(shè)計(jì)為合并了限制性酶位點(diǎn)、終止密碼子，并且如果需要的話合并6×his標(biāo)簽。用于rkas2、rkla1和rkas2-kla1的引物被設(shè)計(jì)為將r-蛋白中所包含的無(wú)關(guān)編碼序列限制為不多于3個(gè)氨基酸外加6×his標(biāo)簽。rkas1和rkla1被設(shè)計(jì)為分別在n末端和c末端含有6×his標(biāo)簽，使得可以將它們與在n末端和c末端都具有6×his標(biāo)簽的rkas2-kla1直接比較。在rkas1-ksa1和r多kas-kla1中，his標(biāo)簽見于c末端。

表4.用于擴(kuò)增編碼kgpa1和as的不同片段

和嵌合體的核苷酸序列的寡核苷酸引物

*來(lái)自序列登錄號(hào)為u75366的賴氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶基因的核苷酸(nt)序列編號(hào)

重組蛋白的表達(dá)和純化

通過(guò)使用異丙基β-d-硫代半乳糖苷酶(iptg)進(jìn)行誘導(dǎo)，從pet28::kla1(kas2、kas2-la1、kas1-sa1、多kas-kla1)構(gòu)建體表達(dá)重組蛋白。產(chǎn)生的所有重組蛋白為6×his標(biāo)簽融合蛋白，在變性條件下使用ni-nta純化系統(tǒng)(invitrogen)將其純化。簡(jiǎn)單而言，將大腸桿菌(de3)單一集落轉(zhuǎn)化體接種至20ml含有50μg/ml卡那霉素的luria-bertani(lb)培養(yǎng)基，于37℃振蕩過(guò)夜。然后用該接種物接種至1l含有50μg/ml卡那霉素的lb中。允許該培養(yǎng)物的od600達(dá)到0.5-0.7(對(duì)數(shù)中期)，然后用0.1mm異丙基iptg、于37℃、200rpm振蕩下誘導(dǎo)蛋白表達(dá)2小時(shí)。收獲細(xì)胞(7,500g)，并在變性結(jié)合緩沖液(8m尿素、ph8.0的20mm磷酸鈉和500mmnacl)中重懸，并利用bransonsonifer250細(xì)胞破碎儀(bransonultronicscorporation,danbury,ct)、使用裝置3上的微尖端在冰上超聲破碎細(xì)胞，每次15秒，共3次，每次間隔30秒，然后于4℃下，39,000g離心30分鐘。通過(guò)上樣至預(yù)先平衡的ni-nta瓊脂糖柱從上清中純化重組蛋白，然后用變性洗滌緩沖液(8m尿素、ph6.0的20mm磷酸鈉和500mmnacl)進(jìn)行洗滌以洗脫未結(jié)合的蛋白。然后用10倍體積的結(jié)合緩沖液b洗滌柱，并用變性洗脫緩沖液(8m尿素、ph6.0的20mm磷酸鈉、500mmnacl和0.5m咪唑)洗脫重組蛋白。用2m尿素的pbs透析純化的蛋白，并保存于-80℃。

通過(guò)sds-page分析重組蛋白樣品，并用在線protparam(http://au.expasy.org/tools/protparam.html)確定它們的分子量。通過(guò)bio-rad蛋白測(cè)定、使用bsa作為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定所有樣品的蛋白濃度。

免疫和小鼠牙周炎模型

按照之前的報(bào)道所述(3)進(jìn)行小鼠牙周炎實(shí)驗(yàn)，并且該實(shí)驗(yàn)由墨爾本大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)道德規(guī)范委員會(huì)(universityofmelbourneethicscommitteeforanimalexperimentation)準(zhǔn)許。6-8周齡的balb/c小鼠(每組12只小鼠)飼養(yǎng)在微型隔離間中，用50μg的重組蛋白或rgpa-kgp復(fù)合物之一、2×10⁹福爾馬林殺死的牙齦卟啉單胞菌菌株w50細(xì)胞或pbs對(duì)上述小鼠進(jìn)行皮下免疫(s.c.100μl)；用弗氏不完全佐劑(ifa)乳化每種抗原。30天后，用抗原對(duì)小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫(s.c.注射，ifa乳化)，并且在12天后從眼球后血管叢取血。第二次免疫后4天，給予小鼠去離子水配制的1mg/ml卡那霉素(sigma-aldrich,newsouthwales,australia)，使小鼠自由攝取持續(xù)7天。抗生素治療后3天(取血后2天)，用1×10¹⁰活牙齦卟啉單胞菌w50(25μl)對(duì)小鼠口腔接種4次，每次間隔2天，所述活牙齦卟啉單胞菌w50在含有2％(重量/體積)羧甲基纖維素(cmc；sigma-aldrich,newsouthwales,australia)的pg緩沖液(50mmtris-hcl、150mmnacl、5mmcacl2和5mm半胱氨酸-hcl，ph8.0)中，并且僅使用含有2％(重量/體積)cmc的pg緩沖液對(duì)對(duì)照組進(jìn)行假感染。在厭氧室中制備接種物，然后立即將其施用于上頜臼齒的齒齦邊緣。兩周后，小鼠再接受4次給藥的(每次間隔2天)，每次給藥為含有2％(重量/體積)cmc的pg緩沖液中的1×10¹⁰活牙齦卟啉單胞菌w50細(xì)胞(25μl)。通過(guò)血瓊脂上的計(jì)數(shù)驗(yàn)證每個(gè)接種物的活細(xì)菌數(shù)。用軟的粉狀食物(barastock,australia)喂養(yǎng)小鼠，并將小鼠飼養(yǎng)在配備有加高的絲網(wǎng)底部的籠子中以防止接觸到墊料。最后給藥后4周，從小鼠眼球后血管叢取血并處死小鼠，取出上頜骨并切成兩半，將一半(右側(cè))用于牙槽骨喪失檢測(cè)，另一半(左側(cè))用于實(shí)時(shí)pcr。

將右半上頜骨在去離子水中沸煮(1分鐘)，機(jī)械去肉，并浸入2％(重量/體積)氫氧化鉀中(16小時(shí)、25℃)。然后洗滌該半塊上頜骨(用去離子水洗滌兩次)，并將其浸入3％(重量/體積)過(guò)氧化氫中(6小時(shí)、25℃)。洗滌該半塊上頜骨(用去離子水洗滌兩次)后，用0.1％(重量/體積)的亞甲基藍(lán)水溶液對(duì)其進(jìn)行染色，并用安裝在解剖顯微鏡上的olympusdp12數(shù)碼相機(jī)捕獲每個(gè)半塊上頜骨的頰側(cè)的數(shù)碼圖像，用olysiabioreport軟件3.2版(olympusaustraliaptyltd.,newsouthwales,australia)評(píng)價(jià)水平骨喪失。水平骨喪失是發(fā)生在水平面上、垂直于牙槽嵴(abc)的喪失，其導(dǎo)致嵴高度的降低。將每個(gè)半塊上頜骨排列，使的每顆齒的圖像的臼齒頰尖側(cè)和舌尖側(cè)相疊，并且捕獲的圖像在框內(nèi)標(biāo)有測(cè)微計(jì)標(biāo)尺，使得可以將每個(gè)圖像的測(cè)量結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化。用olysiabioreport軟件3.2版成像軟件測(cè)量了每個(gè)臼齒的從釉質(zhì)牙骨質(zhì)界至abc的面積。由一個(gè)檢測(cè)者使用隨機(jī)化的并且盲法的方案測(cè)定骨喪失檢測(cè)結(jié)果兩次。

通過(guò)elisa確定亞類抗體

為了確定小鼠血清的亞類抗體應(yīng)答，按照以下一式三份地進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)：用含有5μg/ml的福爾馬林殺死的牙齦卟啉單胞菌w50溶液包被平底聚乙烯微量滴定板的孔(dynatechlaboratories,mclean,va)，所述牙齦卟啉單胞菌w50配制在ph7.0、含有0.1％(體積/體積)吐溫20的磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)(0.01mna2hpo4、1.5mmkh2po4、0.15mnacl)(pbst)中。去除包被溶液后，將含有2％(重量/體積)脫脂奶粉的pbst加至孔中，于室溫封閉未包被的塑料1小時(shí)。用pbst洗滌孔4次，將含有0.5％(重量/體積)脫脂乳的pbst(sk-pbst)中的小鼠血清系列稀釋液添加至每孔，并于室溫孵育16小時(shí)。用pbst洗滌孔6次后，添加sk-pbst中的針對(duì)小鼠igm、iga、igg1、igg2a、igg2b或igg3(sigma,newsouthwales,australia)的羊igg的1/2000稀釋液，并允許室溫結(jié)合2小時(shí)。用pbst洗滌板6次，將sk-pbst中的辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)兔抗羊免疫球蛋白(sigma,newsouthwales,australia)的1/5000稀釋液添加至每孔，并于室溫孵育1小時(shí)。用pbst洗滌孔6次后，通過(guò)將100μlabts底物[含有0.005％(體積/體積)過(guò)氧化氫的80mm檸檬酸中的0.9mm2,2'-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯-噻唑啉-6)磺酸，ph4.0]添加至每孔來(lái)檢測(cè)結(jié)合的抗體。用酶標(biāo)儀(bio-rad酶標(biāo)儀，型號(hào)450)檢測(cè)415nm處的光密度。

sds-page凝膠電泳和western印跡

用xceiisurelockmini-cell電泳系統(tǒng)分析重組蛋白(10μg)。將重組蛋白混于20μl還原樣品緩沖液(10％[重量/體積]sds、0.05％[重量/體積]溴酚藍(lán)、25％[體積/體積]甘油和0.05％[體積/體積]2-巰基乙醇)中。用1.5mtris-hcl將ph調(diào)至ph8.0，然后將溶液于100℃加熱5分鐘。將重組蛋白(10μg/道)上樣至novex12％(重量/體積)tris-甘氨酸預(yù)制小型凝膠上，并用novex電泳系統(tǒng)(novex,sandiego,ca)、使用30-50ma的電流和125v的電壓進(jìn)行電泳。用0.25％w/v考馬斯亮藍(lán)r250將蛋白染色。

kgp蛋白酶活性位點(diǎn)肽(kas-2)序列的表位分析

通過(guò)在多中心(multipin)肽合成系統(tǒng)(chirontechnologies,melbourne,australia)上、使用fmoc化學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)固相肽合成方法合成n末端生物素化的重疊的8個(gè)殘基的肽(1個(gè)殘基偏移，7個(gè)殘基重疊)確定lys特異性蛋白酶活性位點(diǎn)肽kas2(433-468seqidno:28)的抗體結(jié)合位點(diǎn)。將ph7.4的0.1mpbs中的生物素化的肽(5μg/ml)與卵白素包被的平板結(jié)合，于4℃過(guò)夜(nunc,nswaustralia)。用pbst對(duì)孔洗滌4次后，用1:1000稀釋在1％w/v脫脂奶粉中的的小鼠血清、按照chirontechnologies的操作說(shuō)明、通過(guò)elisa進(jìn)行平板結(jié)合肽的表位定位，所述脫脂奶粉配制在含有0.1％v/v吐溫20、ph7.4的0.1mpbs中(sk-pbst)。用pbst將孔洗滌6次后，將抗小鼠igg的羊igg(sigma,newsouthwales,australia)的1/2,000稀釋液添加于sk-pbst中，并允許室溫下結(jié)合2小時(shí)。用pbst將平板洗滌6次，并將sk-pbst中的辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)兔抗羊免疫球蛋白(sigma,newsouthwales,australia)的1/5,000稀釋液添加至每孔，并于室溫孵育1小時(shí)。用pbst將孔洗滌6次后，通過(guò)將100μlabts底物[含有0.005％(體積/體積)過(guò)氧化氫的80mm檸檬酸中的0.9mm2,2'-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯-噻唑啉-6)磺酸，ph4.0]添加至每孔來(lái)檢測(cè)結(jié)合的抗體。用酶標(biāo)儀(bio-rad酶標(biāo)儀，型號(hào)450)測(cè)定415nm處的光密度。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用單因素方差分析(anova)和dunnett'st3檢驗(yàn)(適用于windows的spss,版本12)對(duì)骨喪失數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。使用spss軟件(適用于windows的spss,版本12)、利用student'st檢驗(yàn)對(duì)iga、igm和igg亞類抗體滴度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

實(shí)施例2

重組蛋白(ksa1、kla1、kas1-ksa1和kas2-kla1)的表征和純化

為了表征kgp粘附素a1結(jié)構(gòu)域片段和嵌合體kgp蛋白酶與kgp粘附素a1結(jié)構(gòu)域片段對(duì)抗牙齦卟啉單胞菌感染的保護(hù)能力，我們表達(dá)并純化了以下重組蛋白：ksa1、kla1、kas1-ksa1和kas2-kla1。使用鎳螯合親和層析從包涵體純化重組蛋白(ksa1和kla1)和重組嵌合蛋白(kas1-ksa1和kas2-kla1)，并通過(guò)sds-page分析所述純化的蛋白(圖1)。每一種純化的重組蛋白由對(duì)應(yīng)于kas2-kla1、kla1、ksa1和kas1-ksa1的分子量為40、36、31和32kda的一個(gè)主要蛋白條帶組成，并且這些分子量與用protparam計(jì)算出的his標(biāo)簽重組蛋白的分子量相對(duì)應(yīng)。為了表征重組蛋白的免疫原性，將ksa1、kla1、kas1-ksa1和kas2-kla1用來(lái)免疫小鼠，并將血清用來(lái)探測(cè)用kas2肽包被的平板和用福爾馬林殺死的牙齦卟啉單胞菌w50細(xì)胞包被的平板(圖2)。發(fā)現(xiàn)重組嵌合蛋白kas1-ksa1和kas2-kla1抗血清以與kas2特異性抗血清(kas2-白喉類毒素綴合物)相似的水平識(shí)別kas2肽(圖2a)，而且也識(shí)別福爾馬林殺死的牙齦卟啉單胞菌w50細(xì)胞(圖2b)。然而，針對(duì)重組蛋白kla1的抗血清僅識(shí)別殺死的牙齦卟啉單胞菌w50細(xì)胞(圖2b)。

實(shí)施例3

用重組蛋白(ksa1、kla1、kas1-ksa1和kas2-kla1)進(jìn)行的免疫對(duì)小鼠牙周炎模型中牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的牙槽骨喪失的作用

使用基于bakeretal(4)的報(bào)道而改進(jìn)的牙周骨喪失的小鼠模型，將重組蛋白ksa1、kla1、kas1-ksa1和kas2-kla1、福爾馬林殺死的牙齦卟啉單胞菌菌株w50和rgpa-kgp復(fù)合物用于確定和比較對(duì)牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的牙槽骨喪失所產(chǎn)生的保護(hù)。用重組蛋白ksa1、kla1、kas1-ksa1或kas2-kla1、rgpa-kgp復(fù)合物或福爾馬林殺死的牙齦卟啉單胞菌菌株w50(fk-w50)細(xì)胞或單獨(dú)的pbs佐劑免疫小鼠(第0天和第30天)，然后用活牙齦卟啉單胞菌w50口腔激發(fā)小鼠。用所有重組抗原、rgpa-kgp復(fù)合物和fk-w50細(xì)胞進(jìn)行的免疫保護(hù)balb/c小鼠抵抗牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的牙槽骨喪失，因?yàn)檫@些動(dòng)物表現(xiàn)出顯著(p<0.001)少于pbs免疫組的骨喪失(圖3)。然而，用kas2-kla1免疫的小鼠的骨喪失顯著少于用kla1(p<0.01)、ksa1(p<0.001)、rgpa-kgp復(fù)合物(p<0.001)、fk-w50細(xì)胞免疫的小鼠(p<0.001)和未激發(fā)的小鼠(p<0.001)。用kas2-kla1和kas1-ksa1免疫的小鼠的骨喪失之間不存在顯著差異。此外，用kas1-ksa1免疫的小鼠的骨喪失顯著少于未激發(fā)的小鼠(p<0.01)和用rgpa-kgp復(fù)合物免疫的小鼠(p<0.05)，但與用ksa1、kla1和fk-w50免疫的小鼠不存在顯著差異。用ksa1、kla1、rgpa-kgp復(fù)合物和fk-w50免疫小鼠的骨喪失之間不存在顯著差異。

實(shí)施例4

用重組蛋白(ksa1、kla1、kas1-ksa1和kas2-kla1)進(jìn)行免疫在小鼠牙周炎模型中所誘導(dǎo)的抗體亞類應(yīng)答

在用活牙齦卟啉單胞菌細(xì)胞口腔接種激發(fā)之前和之后，對(duì)小鼠進(jìn)行取血并通過(guò)離心收集血清。圖4表明在小鼠牙周炎模型中，對(duì)于每種免疫原(ksa1、kla1、kas1-ksa1或kas2-kla1或福爾馬林殺死的牙齦卟啉單胞菌菌株w50(fk-w50)細(xì)胞)，對(duì)福爾馬林殺死的牙齦卟啉單胞菌w50細(xì)胞的抗體亞類反應(yīng)性。所有保護(hù)性免疫原誘導(dǎo)對(duì)fk-w50的高igg抗體滴度。此外，每種保護(hù)性免疫原所誘導(dǎo)的主要抗體亞類是igg1，僅伴隨弱免疫反應(yīng)性的igg2a、igg2b和igg3fk-w50特異性抗體(圖4)。在口腔接種之前(圖4a)和之后(圖4b)，每種免疫原所誘導(dǎo)的主要抗體亞類都是igg1。

實(shí)施例5

kas2(433-468)的表位定位

合成了kas2(433-468)的重疊的生物素化的8個(gè)殘基的肽(1個(gè)殘基偏移，7個(gè)殘基重疊)，并將其用來(lái)包被鏈霉親和素包被的平板。然后利用來(lái)自kas1-ksa1、kas2-kla1和kas2-白喉類毒素綴合物免疫的小鼠的抗血清來(lái)鑒定抗體結(jié)合表位(圖5)。光密度(415nm)高于背景2倍被認(rèn)為是陽(yáng)性抗體應(yīng)答(閾值od)。所述抗血清識(shí)別來(lái)自seqidno.28的下述肽序列，即kas1-ksa1識(shí)別肽435-442、436-443、445-452、446-453和447-454(閾值od＝0.07，圖5a)，而kas2-kla1識(shí)別肽435-442、447-454和448-455(閾值id＝0.07，圖5a)。這提示多個(gè)最小表位的識(shí)別，即肽436-442(vsfanyt及其變體vgfanyt)、肽447-452(etawad及其變體etswad)和肽448-453(tawadp及其變體tswadp)。包括肽436-442表位的肽包括gvsfanyt、gvgfanyt、vsfanyta和vgfanyta。包括肽447-452和/或448-453表位的肽包括setawad、setswad、etawadp、etswadp、tawadpl和tswadpl，更具體是gsetawad、gsetswad、setawadp、setswadp、etawadpl、etswadpl、tawadpll和tswadpll。

實(shí)施例6

用于與蛋白綴合的kas和ras肽的合成

手動(dòng)或用cem微波肽合成儀來(lái)合成肽。整個(gè)過(guò)程中使用fmoc化學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)固相肽合成方案。使用rink-linker來(lái)源的am-sure樹脂(aapptec,ky,usa)將肽組裝為羧酰胺形式。用4當(dāng)量fmoc-氨基酸與6當(dāng)量dipea通過(guò)hbtu/hobt活化完成連接。fmoc基團(tuán)由含20％哌啶的1mhobt/dmf移除。

使攜帶kas或ras肽的樹脂在dmf中膨脹，由含有2％v/v哌啶的dmf中的2％v/vdbu將n末端fmoc基團(tuán)去除。然后，用5當(dāng)量sama-opfp和5當(dāng)量hobt使n末端氨基衍生帶有s-乙酰巰基乙酸(sama)基團(tuán)。通過(guò)三硝基苯磺酸(tnbsa)測(cè)試監(jiān)測(cè)所述反應(yīng)。當(dāng)?shù)玫疥幮詔nbsa測(cè)試時(shí)，洗滌樹脂(5×dmf、3×dcm和3×乙醚)。然后真空干燥樹脂。用tfa:苯酚:tips:edt:水(92:2:2:2:2)切割混合物從樹脂載體切割肽，根據(jù)肽的精氨酸含量，切割進(jìn)行2.5小時(shí)或4小時(shí)。切割后，通過(guò)過(guò)濾去除樹脂，并在氮?dú)饬飨聦V出液濃縮至約1ml。將肽產(chǎn)物在冷的醚中沉淀后，將它們離心并洗滌3次。將肽沉淀物溶解在5-10ml含有0.1％v/vtfa的水中，并通過(guò)離心去除不溶的殘留物。通過(guò)rp-hplc純化肽。

多種不同的化學(xué)部分可以用來(lái)對(duì)肽進(jìn)行衍生以用于與蛋白綴合，可以引入反應(yīng)性基團(tuán)，諸如鹵化物(溴代、氯代和碘代)、馬來(lái)酰亞胺、琥珀酰亞胺基、肼基、肟基、硫醇，然后可以將其用于使衍生的肽與諸如kgpa1的蛋白綴合，所述綴合通過(guò)蛋白的天然半胱氨酸殘基或經(jīng)過(guò)衍生而具有的允許進(jìn)行化學(xué)連接而形成肽-蛋白綴合物的互補(bǔ)反應(yīng)性基團(tuán)。

sama-肽與ka1的綴合

向含有10mg/ml重組ka1或rgpa-kgp復(fù)合物的其他粘附素結(jié)構(gòu)域的磷酸鹽緩沖鹽溶液(0.1m磷酸鈉、0.9％nacl，ph7.4)中添加0.1ml的含有1％w/v馬來(lái)酰亞胺基苯甲酰-n-羥基琥珀酰亞胺酯(mbs)的dmf溶液。30分鐘后，去除未反應(yīng)的mbs，并使用綴合緩沖液(0.1m磷酸鈉、5mmedta，ph6.0)中平衡的pd10柱(pharmacia,nsw,australia)、通過(guò)凝膠過(guò)濾收集mbs修飾的ka1。將純化的sama-肽(1.3μmol)溶解于200μl含有0.5mtris、2mmedta，ph6.0的6m鹽酸胍中，用800μlmilliq水稀釋，并通過(guò)添加溶解于milliq水中的25μl2mnh2oh(40當(dāng)量)原位脫保護(hù)。將收集的mbs-ka1立即與脫保護(hù)的sama-肽反應(yīng)，并于室溫?cái)嚢?小時(shí)。使用ph7.4的pbs平衡的pd10柱、通過(guò)凝膠過(guò)濾將肽-ka1綴合物與未反應(yīng)的肽分離并凍干。用ellmans測(cè)試監(jiān)測(cè)所述反應(yīng)。

實(shí)施例7

抗體制備

通過(guò)用蛋白進(jìn)行皮下免疫在小鼠中產(chǎn)生針對(duì)重組蛋白的多克隆抗血清。在第0天時(shí)用配制在弗氏不完全佐劑中的25μg蛋白免疫小鼠，并在第30天時(shí)用配制在弗氏不完全佐劑中的25μg蛋白免疫小鼠。用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行免疫。獲得了具有針對(duì)蛋白的高滴度的多克隆抗血清。如果需要，可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法獲得特異性靶向于重組蛋白的單克隆抗體。

實(shí)施例8

用于產(chǎn)生抗體的免疫

使用在弗氏不完全佐劑(ifa)中乳化的50μgkas2-la1嵌合體和抗原對(duì)6-8周齡的balb/c小鼠或cd1(瑞士遠(yuǎn)交系小鼠)(每組10只小鼠)進(jìn)行皮下免疫(s.c.100μl)。30天后，用抗原(s.c.注射，用ifa乳化)加強(qiáng)；12天后處死小鼠并進(jìn)行心臟取血以收集血清。

通過(guò)elisa確定亞類抗體

為了確定小鼠血清的亞類抗體應(yīng)答，如下一式三份地進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)：用配制在含有0.1％(體積/體積)的吐溫20的ph7.0的磷酸鹽緩沖鹽溶液(pbs)(0.01mna2hpo4、1.5mmkh2po4、0.15mnacl)(pbst)中的5-μg/mlkas2-la1嵌合體或福爾馬林殺死的牙齦卟啉單胞菌w50或rgpa-kgp復(fù)合物溶液包被平底聚乙烯微量滴定板孔(dynatechlaboratories,mclean,va)。去除包被溶液后，將含有2％(重量/體積)脫脂奶粉的pbst加至孔中，于室溫封閉未包被的塑料1小時(shí)。用pbst將孔洗滌4次后，將含有0.5％(重量/體積)脫脂乳的pbst(sk-pbst)中的小鼠血清連續(xù)稀釋液添加至每孔，并于室溫孵育16小時(shí)。用pbst將孔洗滌6次后，將抗小鼠igm、iga、igg1、igg2a、igg2b或igg3的羊igg(sigma,newsouthwales,australia)的1/2,000稀釋液添加至sk-pbst，并允許室溫結(jié)合2小時(shí)。用pbst將平板洗滌6次，并將sk-pbst中的辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)兔抗羊免疫球蛋白(sigma,newsouthwales,australia)的1/5,000稀釋液添加至每孔，并于室溫孵育1小時(shí)。用pbst將孔洗滌6次后，通過(guò)將100μlabts底物[含有0.005％(體積/體積)過(guò)氧化氫的80mm檸檬酸中的0.9mm2,2'-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯-噻唑啉-6)磺酸，ph4.0]添加至每孔來(lái)檢測(cè)結(jié)合的抗體。用酶標(biāo)儀(bio-rad酶標(biāo)儀，型號(hào)450)檢測(cè)415nm處的光密度。

遠(yuǎn)交系(cd1，瑞士)小鼠中用重組蛋白kas2-kla1進(jìn)行免疫所誘導(dǎo)的抗體亞類應(yīng)答

用kas2-la1嵌合體對(duì)cd1(瑞士)小鼠進(jìn)行免疫，對(duì)小鼠進(jìn)行取血并通過(guò)離心收集血清。圖6表明對(duì)kas2-la1嵌合體、福爾馬林殺死的牙齦卟啉單胞菌w50細(xì)胞和rgpa-kgp復(fù)合物的抗體亞類反應(yīng)。kas2-la1嵌合體誘導(dǎo)強(qiáng)igg抗體，主要為識(shí)別kas2-la1嵌合體并與福爾馬林殺死的牙齦卟啉單胞菌w50細(xì)胞和rgpa-kgp復(fù)合物發(fā)生強(qiáng)交叉反應(yīng)的igg1抗體應(yīng)答(圖6)。此外，kas2-la1嵌合體僅誘導(dǎo)弱的免疫反應(yīng)性igg2a、igg2b和igg3抗原特異性抗體(圖6)。

實(shí)施例9

kgp結(jié)構(gòu)模型的開發(fā)和活性位點(diǎn)表面可接近序列的鑒定

我們的工作已經(jīng)表明：kgp蛋白酶活性位點(diǎn)肽是高免疫原性的，并誘導(dǎo)針對(duì)牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的骨喪失的高水平保護(hù)作用。在試圖鑒定其它蛋白酶活性位點(diǎn)肽作為疫苗候選者時(shí)，使用sybyl7.3的orchestrar程序套裝開發(fā)了kgp催化結(jié)構(gòu)域的模型(圖7)。該模型是基于來(lái)自牙齦卟啉單胞菌的rgpb蛋白酶的pdb結(jié)構(gòu)1crv。該蛋白具有23.58％的配對(duì)同一性，且z評(píng)分是25.09(高度可信模型)。meta-ppisp蛋白相互作用服務(wù)器預(yù)測(cè)了kgp的兩個(gè)蛋白-蛋白相互作用表面：底物結(jié)合表面(如rgpb中)和kgp特有的第二表面。rgpb和kgp模型間的主要差異在于使第二相互作用表面和19個(gè)殘基的空位(val526至phe545)處于框內(nèi)的環(huán)，在落入第二相互作用表面中的kgp中不能模擬該19個(gè)殘基的空位。圖7顯示的是kgp模型，較粗的帶表示kgp的蛋白酶活性位點(diǎn)周圍的表面可接近序列，發(fā)現(xiàn)所述表面可接近序列是asp388-gln394、leu421-ala423、ala443-glu447加ala451、asn510-trp513和ile570-gly577加tyr580。從所述模型(圖6)可明顯觀察到，除kas2(a)之外，三個(gè)其他序列kas4(asp388-val395)(b)、kas5(asn510-asp516)(c)和kas6(ile570-tyr580)(d)是重要的并具有成為疫苗靶標(biāo)的足夠長(zhǎng)度。因此，可以依次產(chǎn)生具有這些肽中每一個(gè)的重組嵌合蛋白，并將其連接至kla1的n末端，以產(chǎn)生多kas-kla1，該多kas-kla1可以被用來(lái)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，并從而對(duì)于牙齦卟啉單胞菌相關(guān)疾病或狀態(tài)進(jìn)行保護(hù)。

實(shí)施例10

模擬arg-x-蛋白酶從而鑒定位于催化位點(diǎn)側(cè)翼的免疫原性區(qū)的過(guò)程

按照eichingera、beiselhg、jacobu、huberr、medranofj、banbulaa、potempaj、travisj、bodew,crystalstructureofgingipainr:anarg-specificbacterialcysteineproteinasewithacaspase-likefold(牙齦卟啉蛋白酶r的晶體結(jié)構(gòu)：具有半胱天冬酶樣折疊的arg-特異性細(xì)菌半胱氨酸蛋白酶)emboj.1999年10月15日；18(20):5453-62的方法確定arg-x-蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例11

下述是含有抗體的牙膏配方的實(shí)施例

實(shí)施例12

下述是牙膏配方的實(shí)施例

實(shí)施例13

下述是牙膏配方的實(shí)施例.

實(shí)施例14

下述是牙膏配方的實(shí)施例.

實(shí)施例15

下述是液體牙膏配方的實(shí)施例

實(shí)施例16

下述是漱口劑配方的實(shí)施例

實(shí)施例17

下述是漱口劑配方的實(shí)施例

實(shí)施例18

下述是錠劑配方的實(shí)施例

實(shí)施例19

下述是牙齦按摩乳膏配方的實(shí)施例

實(shí)施例20

下述是口香糖配方的實(shí)施例

實(shí)施例21

下述是藥物配方的實(shí)施例

組分％w/w

人源化特異性單克隆抗體10

無(wú)菌磷酸鹽緩沖鹽水90

實(shí)施例22

下述是牙周凝膠配方的實(shí)施例

應(yīng)當(dāng)理解，盡管在本文中對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)描述，但是這些實(shí)施例僅為示例性目的。對(duì)分子生物學(xué)、牙科診斷學(xué)和相關(guān)學(xué)科領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的對(duì)本發(fā)明實(shí)施方案的其他改動(dòng)也意圖包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

參考文獻(xiàn)

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