本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及桑樹基因工程領(lǐng)域，具體為一種鑒定桑樹mmpds基因的vigs沉默體系及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

病毒誘導(dǎo)的基因沉默(vigs)現(xiàn)已被開發(fā)為快速鑒定植物基因功能的一種反向遺傳學(xué)新技術(shù)，至今已經(jīng)建立了以rna病毒、dna病毒、衛(wèi)星病毒和dna衛(wèi)星分子為載體的vigs體系。與基因敲除、轉(zhuǎn)基因、突變體篩選等植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，vigs無需構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植株，具有周期短、操作簡便、獲得表型快速、成本低等優(yōu)點，目前，這種反向遺傳學(xué)新技術(shù)已廣泛應(yīng)用于與植物抗病、逆境脅迫、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及生長發(fā)育等相關(guān)基因功能的研究，在植物功能基因組學(xué)的研究中發(fā)揮重要作用。桑樹等林木植物往往童期長，遺傳轉(zhuǎn)化困難，制約了基因功能研究的進(jìn)展，而vigs技術(shù)則有望克服上述瓶頸從而大大促進(jìn)相關(guān)基因的功能鑒定。

在不同的植物中建立vigs體系，一般選用八氫番茄紅素脫氫酶(phytoenedesaturase,pds)基因作為報告基因。mmpds是桑樹中類胡蘿卜素合成途徑的限速酶基因，主要在葉片、莖中表達(dá)，當(dāng)類胡蘿卜素合成受阻時，桑樹葉片會出現(xiàn)光漂白癥狀，表型肉眼容易觀測。本發(fā)明構(gòu)建了攜帶mmpds干擾片段的煙草脆裂病毒重組載體，通過農(nóng)桿菌成功侵染桑樹，建立桑樹高效vigs體系，為桑樹功能基因組學(xué)研究提供技術(shù)支撐。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問題：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，實現(xiàn)簡單、快速、高通量分析、鑒定桑樹mmpds基因，本發(fā)明提供了一種鑒定桑樹mmpds基因的vigs沉默體系及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

技術(shù)方案：一種鑒定桑樹mmpds基因的vigs沉默體系，所述沉默體系具有如seqidno.1所示的基因序列。

一種鑒定桑樹mmpds基因的vigs沉默體系的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)提取桑樹種子萌發(fā)幼苗的rna，反轉(zhuǎn)錄獲得桑樹cdna；

(2)采用引入xbai酶切位點和bamhi酶切位點的特異性引物進(jìn)行桑樹cdna片段pcr擴(kuò)增，純化獲得桑樹mmpds基因干擾片段；

(3)利用vigs病毒載體構(gòu)建含有桑樹mmpds基因的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化成功后，即構(gòu)建得到具有seqidno.1所示的基因序列沉默體系。

優(yōu)選的，所述特異性引物由以下步驟得到：將桑樹mmpds基因、棗樹pds基因、牛奶子pds基因進(jìn)行序列比對，選取三者同源性較高的片段設(shè)計引物。

優(yōu)選的，所述特異性引物的序列為seqidno.2～3：

mmpds-f2:cgggatccaacttgtttggagagcttgg；

mmpds-r2:gctctagactttgacatggcaataaacac。

優(yōu)選的，所述vigs病毒載體為煙草脆裂病毒trv。

所述的vigs沉默體系在鑒定桑樹mmpds基因中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，鑒定桑樹mmpds基因包括以下步驟：

(1)通過凍融法將重組病毒載體ptrv2-mmpds轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，pcr鑒定陽性；

(2)取鑒定為陽性的菌液，注射桑樹子葉背面；

(3)將注射后的植株采用水培方式進(jìn)行培養(yǎng)，并觀察其表型變化。

進(jìn)一步的，所述水培條件為黑暗培養(yǎng)1天后轉(zhuǎn)入光照:黑暗＝16h:8h。

有益效果：(1)本發(fā)明首次實現(xiàn)桑樹mmpds基因vigs沉默體系的構(gòu)建，獲得了具有能夠使桑樹mmpds基因沉默的體系；(2)本發(fā)明通過在特異性引物中引入xbai酶切位點和bamhi酶切位點，并采用煙草脆裂病毒構(gòu)建的桑樹mmpds基因沉默體系，能夠在桑樹植株內(nèi)進(jìn)行系統(tǒng)擴(kuò)散傳播；(3)本發(fā)明所述沉默體系能夠有效降低桑樹mmpds基因的表達(dá)水平，葉綠素被漂白。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例1中pcr擴(kuò)增的mmpds基因干擾片段的瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖2是本發(fā)明實施例2中構(gòu)建的重組病毒載體ptrv2-mmpds農(nóng)桿菌菌液pcr的瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖3是本發(fā)明實施例2將沉默載體侵染桑樹后出現(xiàn)的葉片白化表型形狀，其中a、b為試驗組植株，c為對照組植株；

圖4是本發(fā)明實施例2檢測侵染植株內(nèi)的病毒表達(dá)結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖5是本發(fā)明實施例2采用qrt-pcr檢測桑樹mmpds沉默效果。

具體實施方式

以下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改和替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實施例1沉默體系構(gòu)建

1mmpds基因干擾片段的獲得

1.1設(shè)計引物

將桑樹mmpds基因(ncbi登錄號：xm_010102809.1)、棗樹pds基因(ncbi登錄號：xm_016031629.1)、牛奶子pds基因(ncbi登錄號：gq254067.1)進(jìn)行序列比對，選取三者同源性較高的片段設(shè)計引物，在上游引物上添加xbai酶切位點，在下游引物上添加和bamhi酶切位點，添加后得到引物如下所示seqidno.2～3：

mmpds-f2:cgggatccaacttgtttggagagcttgg；

mmpds-r2:gctctagactttgacatggcaataaacac。

1.2干擾片段克隆

使用takara試劑盒提取桑樹嫩葉rna，提取步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，電泳檢測rna條帶完整；并按照takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將rna反轉(zhuǎn)錄成cdna。以桑樹cdna為模板，利用mmpds-f2/r2為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，測序得到346bp的片段(見圖1所示)，其中，pcr酶使用takara公司生產(chǎn)的extaq，pcr反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火35s，72℃延伸45s，37個循環(huán)；72℃復(fù)性5min；4℃保存。使用takarapcr產(chǎn)物純化試劑盒純化回收pcr產(chǎn)物，得到桑樹mmpds基因干擾片段，即目的基因，純化方法參照試劑盒說明書。

2重組病毒載體的構(gòu)建

本發(fā)明使用的vigs病毒載體為煙草花葉病毒trv，該病毒為rna病毒，具有兩條rna鏈，rna1和rna2，分別構(gòu)建在兩個質(zhì)粒上：ptrv-rna1和ptrv-rna2，用于沉默的片段構(gòu)建在rna2鏈上。

具體實施方法如下：

使用takara公司生產(chǎn)的限制性內(nèi)切酶xbai和bamhi同時對步驟1.2獲得的目的基因干擾片段產(chǎn)物和載體骨架ptrv-rna2進(jìn)行雙酶切，酶切體系50μl，酶切溫度37℃，時間60min，對目的基因干擾片段酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化處理，對質(zhì)粒使用takara膠回收試劑盒切膠回收載體片段，方法參照試劑盒說明書。然后使用takarat4連接酶連接載體和干擾片段，方法參照試劑盒說明書，反應(yīng)體系：20μl，連接溫度16℃，連接時間8h，得到連接產(chǎn)物。取5μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(dh5α，天根公司)，菌液pcr鑒定陽性克隆后，提取質(zhì)粒測序驗證，得到連接成功的重組病毒載體，并命名為ptrv2-mmpds，得到沉默體系。

實施例2桑樹mmpds基因的鑒定

1重組病毒載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

將實施例1制備的沉默體系，即實施例1中步驟2構(gòu)建的重組病毒載體ptrv2-mmpds、ptrv1和ptrv2(陰性對照)各lμg分別加入到0.1ml農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min，使重組病毒載體進(jìn)入細(xì)胞中，再將其放入液氮中速凍1min，立即37℃水浴5min，使細(xì)胞融化，再向細(xì)胞中加800μl無抗生素的yeb液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)2-3h，轉(zhuǎn)速為150r/min。然后在4000r/min轉(zhuǎn)速條件下離心1min，棄去上清，使其重新懸浮于100μlyeb液體培養(yǎng)基中，得到質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌菌液。取100μl菌液均勻地涂于含50mg/l卡那霉素(kan，sigma)25mg/l慶大霉素(gm，sigma)、和25mg/l利福平(rif，sigma)的抗性yeb平板上，28℃培養(yǎng)2天，挑取單菌落接種到1ml相應(yīng)抗性液體yeb培養(yǎng)基中，28℃震蕩培養(yǎng)過夜，對其進(jìn)行pcr鑒定陽性克隆菌液后(見圖2所示)，得到gv3101-ptrv2-mmpds農(nóng)桿菌菌液，及gv3101-ptrv2農(nóng)桿菌菌液，將其直接接種至新鮮yeb液體培養(yǎng)基中，準(zhǔn)備侵染。

2侵染植株

2.1材料準(zhǔn)備

將桑樹種子灑在營養(yǎng)土中，上面再覆蓋薄薄一層營養(yǎng)土，澆足水，放置于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為：光照16h，25℃，黑暗8h，22℃。發(fā)芽后7-10天，等兩片子葉完全展開后，可用于侵染實驗。

2.2侵染菌液準(zhǔn)備

將小量搖好且鑒定正確的農(nóng)桿菌液gv3101-ptrv2-mmpds和gv3101-ptrv2接到25ml含有50mg/lkan、25mg/lgm和25mg/lrif抗生素的yep液體培養(yǎng)基中28℃過夜培養(yǎng)。第二天早上，將搖好的菌液倒入50ml離心管中，室溫7000rmp離心5min，棄上清，用重懸液懸浮菌體，調(diào)整od600＝1.0左右。(重懸液終濃度10mmmgcl2，10mmmes，150μmas)，渦旋混勻后，室溫靜置3h以上。

2.3菌液注射植株

取等體積的gv3101-trv1載體農(nóng)桿菌重懸液與帶有目的基因的重組病毒載體gv3101-ptrv2-mmpds農(nóng)桿菌重懸液充分混合，進(jìn)行注射感染。用一次性1ml注射器(不帶針頭)吸取適量感染菌液，先輕微摩擦制造傷口，再將菌液通過壓迫直接注射植物葉片(子葉)背面，使菌液在葉片中擴(kuò)散。注射gv3101-ptrv2菌液的設(shè)為陰性對照組，注射不含菌液的重懸液設(shè)為空白對照組。將注射感染后的植株培養(yǎng)在鐵盤中，澆足水，黑暗放置一天后轉(zhuǎn)入16h：8h的光照：黑暗條件，觀察桑樹葉片表型變化。

3表型觀察及檢測

3.1白化表型

葉片經(jīng)注射侵染后可觀察到明顯的圓形痕跡，葉面充滿液體。侵染15d后，發(fā)現(xiàn)接種重組gv3101-ptrv2-mmpds病毒載體的實驗組開始出現(xiàn)葉片白化癥狀，侵染20d后，白化現(xiàn)象沿葉脈向四周逐漸系統(tǒng)擴(kuò)散，說明沉默載體開始發(fā)揮作用，如圖3a和3b所示，而陰性對照組和空白對照組沒有任何變化，見圖3c、3d所示，葉片沒有出現(xiàn)白化現(xiàn)象。

3.2病毒檢測

取空白對照組葉片，編為wt組，取空載陰性對照組葉片，變?yōu)閏k組，取實驗組白化葉片編為w(white)組，每組設(shè)3個重復(fù)，使用takararna提取試劑盒分別提取wt組、ck組和w組葉片的rna，并反轉(zhuǎn)錄成cdna，方法參照試劑盒說明書。設(shè)計特異引物用于pcr檢測病毒，引物如下seqidno.4～5：

trvcpf：cggtcctgctgacttgat；

trvcpr：tcccttggttcgtcgtaa。

pcr反應(yīng)程序：94℃，5min；94℃，30s，54℃，35s，72℃，40s，37cycles；72℃，5min；4℃，∞。

檢測結(jié)果如圖4，沒有注射菌液的wt1-3都沒有檢測到病毒條帶，注射了gv3101-ptrv2菌液的ck1-3和注射了gv3101-ptrv2-mmpds的w1-3都能檢測到病毒條帶，說明該病毒載體確實在桑樹實驗組里進(jìn)行了繁殖傳播。

3.3病毒載體沉默效果檢測

為了檢測病毒載體的沉默效果，采用熒光定量pcr的實驗來檢測，設(shè)計引物qmmpdsf/r用于檢測桑樹mmpds的表達(dá)量，來反映重組病毒載體的沉默效果，內(nèi)參使用β-actin，引物序列如下seqidno.6～9：

qmmpdsf：ctgacatggccagagaaagt；

qmmpdsr：cgatcaggtatgccctgttt；

β-actinf：agcaactgggatgacatggaga；

β-actinr：cgaccactggcgtaaaggga。

熒光定量儀器為96real-timepcrsystem(roche,usa)，酶為faststartuniversalsybrgreenmastermixkit(roche,usa)，方法參照試劑盒說明書。

檢測結(jié)果如圖5所示，由圖5可以看出桑樹實驗組的mmpds基因的表達(dá)量相對于陰性對照組極顯著降低，表明桑樹mmpds的表達(dá)被抑制，結(jié)合桑樹實驗組的表型，說明本實驗里克隆的桑樹mmpds基因是正確的，本體系確實可以用于鑒定桑樹的基因功能。

sequencelisting

<110>江蘇科技大學(xué)

<120>一種鑒定桑樹mmpds基因的vigs沉默體系及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

<130>

<160>9

<170>patentinversion3.3

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<212>dna

<213>人工序列

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tttgcaatgcctaacaaacctggagagttcagccgatttgatttccctgaagtgctgcca120

gcacccttaaatggaatatgggccatcttaaggaacaatgagatgctgacatggccagag180

aaagtcaagtttgcaatcggactgctgccagcaatacttggtggccagccttatgttgaa240

gcacaagatggtttaaccgttaaagaatggatgataaaacagggcatacctgatcgcgta300

actgatgaggtgtttattgccatgtcaaag330

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