本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基因編輯系統(tǒng)及應(yīng)用其對(duì)植物基因組進(jìn)行編輯的方法。

背景技術(shù)：

傳統(tǒng)的育種技術(shù)主要依賴于自然界發(fā)生的遺傳變異，通過雜交和回交等手段獲得擁有優(yōu)良性狀的作物品種。但是自然的變異往往是隨機(jī)的、有限的。最近幾十年發(fā)展的轉(zhuǎn)基因技術(shù)為作物育種提供了良好的機(jī)遇，基因工程育種也取得了巨大的成績(jī)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是通過將外源的目的dna片段用人工的手段將其導(dǎo)入到植物的基因組從而獲得某些優(yōu)良性狀如抗蟲、抗除草劑等。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的特點(diǎn)使得獲得的轉(zhuǎn)基因植物含有外源的遺傳物質(zhì)，因此轉(zhuǎn)基因食品的安全也為公眾所擔(dān)憂。近些年發(fā)展起來的基因組編輯(genomeediting)技術(shù)為作物功能基因組研究以及育種提供了新的機(jī)遇。

目前主要的基因組編輯技術(shù)包括三種，即：鋅指核酸酶(zincfingernuclease，zfn)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcriptionactivatorlikeeffectornuclease，talen)和成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)系統(tǒng)(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/crisprassociatedprotein9，crispr/cas9)。這三種技術(shù)均能實(shí)現(xiàn)在基因組中的特異的靶位點(diǎn)產(chǎn)生dna雙鏈斷裂(doublestrandbreak，dsb)，借助細(xì)胞內(nèi)源的dsb修復(fù)機(jī)制，獲得基因組特異位點(diǎn)的插入或缺失等變異，實(shí)現(xiàn)基因組的編輯。由于crispr/cas9系統(tǒng)的利用相對(duì)簡(jiǎn)單和高效，目前已經(jīng)被廣泛用于植物的基礎(chǔ)以及應(yīng)用研究。crispr/cas9系統(tǒng)在主要的農(nóng)作物如水稻、小麥、玉米、大豆等均已經(jīng)獲得了成功的應(yīng)用，展現(xiàn)出了強(qiáng)大的育種應(yīng)用潛力。

crispr/cas9系統(tǒng)的編輯效率對(duì)其在作物基礎(chǔ)研究以及應(yīng)用研究中是必須考慮的一個(gè)因素。高的編輯效率不但可以節(jié)省人力和資源成本，也使得全基因組的大規(guī)?；蚓庉嬋菀讓?shí)現(xiàn)，因而促進(jìn)新的基因或遺傳位點(diǎn)的發(fā)掘。而crispr/cas9系統(tǒng)的編輯效率主要受到以下一些因素的影響：如用于驅(qū)動(dòng)cas9表達(dá)的啟動(dòng)子，用于驅(qū)動(dòng)sgrna表達(dá)的啟動(dòng)子，編輯的靶位點(diǎn)等等。對(duì)這些因素進(jìn)行有針對(duì)性的優(yōu)化(如尋找在愈傷組織中更高效表達(dá)的啟動(dòng)子)將有提高基因編輯效率的潛力。目前crispr/cas9系統(tǒng)對(duì)作物的實(shí)踐研究中用于驅(qū)動(dòng)cas9基因表達(dá)的主要用到兩種組成型表達(dá)的啟動(dòng)子：煙草花葉病毒的35s啟動(dòng)子和玉米的ubiquitin基因啟動(dòng)子。在玉米中，基于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化體系，已有的報(bào)道中產(chǎn)生純合或雙等位突變體植株的平均頻率分別為<1％(35s)、13％(ubi)和30％(ubi)。小麥中已報(bào)道的編輯效率在10％左右，且基于基因槍轉(zhuǎn)化體系?；谵r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系的在小麥中目前還未見有報(bào)道。因此，有必要在農(nóng)作物中發(fā)掘和探索新的啟動(dòng)子用于驅(qū)動(dòng)cas9基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)更高效的基因組編輯，從而節(jié)約時(shí)間和人力成本，也使得作物全基因組的大規(guī)模編輯更容易實(shí)現(xiàn)，促進(jìn)crispr/cas9系統(tǒng)在作物的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究中發(fā)揮更強(qiáng)大的作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種新的基因編輯系統(tǒng)及應(yīng)用其對(duì)植物基因組進(jìn)行編輯的方法，以期解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的至少部分技術(shù)問題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種新的基因編輯系統(tǒng)，其包括sgrna(singleguiderna)轉(zhuǎn)錄單元，以及由順次連接的來源于玉米的dmc1基因啟動(dòng)子和cas9基因組成的dmc1p-cas9轉(zhuǎn)錄單元，其中，sgrna識(shí)別的靶位點(diǎn)符合5’-nx-ngg-3’或者5’-ccn-nx-3’序列規(guī)則，n代表a、t、c和g中的任何一種，14≤x≤30，且x為整數(shù)，nx表示x個(gè)連續(xù)的脫氧核糖核苷酸。

其中，所述dmc1基因啟動(dòng)子表示為dmc1p，其序列優(yōu)選如seqidno.1所示。

本發(fā)明還提供一種包括前述基因編輯系統(tǒng)的重組載體。

本發(fā)明還提供前述重組載體的構(gòu)建方法，其包括如下步驟：

(1)克隆獲得dmc1基因啟動(dòng)子并將其與cas9基因順次連接，組成dmc1p-cas9轉(zhuǎn)錄單元；

(2)構(gòu)建識(shí)別靶位點(diǎn)的sgrna轉(zhuǎn)錄單元，并將dmc1p-cas9轉(zhuǎn)錄單元和sgrna轉(zhuǎn)錄單元同時(shí)導(dǎo)入雙元載體，得到重組載體，其中，sgrna識(shí)別的靶位點(diǎn)符合5’-nx-ngg-3’或者5’-ccn-nx-3’序列規(guī)則，n代表a、t、c和g中的任何一種，14≤x≤30，且x為整數(shù)，nx表示x個(gè)連續(xù)的脫氧核糖核苷酸。

步驟(1)中，所述dmc1基因啟動(dòng)子的序列優(yōu)選如seqidno.1所示。

步驟(1)中，克隆獲得dmc1基因啟動(dòng)子優(yōu)選采用如下方法：以玉米b73的基因組dna為模板，以序列如seqidno.2和seqidno.3所示的引物為擴(kuò)增引物對(duì)進(jìn)行pcr反應(yīng)，擴(kuò)增得到序列如seqidno.1所示的片段，即為dmc1基因啟動(dòng)子。

步驟(1)中，在克隆獲得dmc1基因啟動(dòng)子之后，所述將其與cas9基因順次連接優(yōu)選采用如下方法：將得到的dmc1基因啟動(dòng)子替換35s-cas9-sk載體中的35s啟動(dòng)子，得到pdmc1-cas9-sk重組載體，再利用xmai和ecori兩個(gè)酶切位點(diǎn)將dmc1p-cas9轉(zhuǎn)錄單元轉(zhuǎn)移到雙元載體ptf101.1，得到重組載體pdmc1-cas9。

步驟(2)優(yōu)選采用如下操作：將符合5’-nx-ngg-3’或者5’-ccn-nx-3’序列規(guī)則的靶位點(diǎn)的dna序列通過引物退火連入pu3-sgrna載體中，然后通過hindiii酶切位點(diǎn)將sgrna的轉(zhuǎn)錄單元亞克隆到重組載體pdmc1-cas9中，得到包括sgrna轉(zhuǎn)錄單元，以及由順次連接的來源于玉米的dmc1基因啟動(dòng)子和cas9基因組成的dmc1p-cas9轉(zhuǎn)錄單元的重組載體。

本發(fā)明還提供一種對(duì)前述重組載體的編輯活性進(jìn)行鑒定的方法，其包括：將所述重組載體轉(zhuǎn)化植株原生質(zhì)體，通過鑒定在原生質(zhì)中發(fā)生基因組編輯的效率從而確定所述重組載體的編輯活性。

本發(fā)明還提供一種包括前述重組載體的基因工程菌。

本發(fā)明還提供一種應(yīng)用前述基因編輯系統(tǒng)對(duì)植物基因組進(jìn)行編輯的方法，其包括：將前述基因工程菌轉(zhuǎn)化受體植物組織，獲得被編輯的轉(zhuǎn)基因植物材料。

其中，所述植物優(yōu)選單子葉植物，更優(yōu)選玉米或小麥。

其中，所述受體植物組織優(yōu)選未成熟的幼胚。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明取得了以下積極進(jìn)步效果：

應(yīng)用本發(fā)明的基因編輯系統(tǒng)對(duì)植物基因組進(jìn)行編輯，在玉米中實(shí)現(xiàn)了在t0代獲得高比例的純合或雙等位突變體的植株；對(duì)于t0代獲得的含突變比例低的植株，自交的后代t1代也能產(chǎn)生新的突變植株；對(duì)于小麥基于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化體系可以獲得含有一定比例突變的嵌合體植株，預(yù)期在t1代可以獲得純合或雙等位突變體的植株。對(duì)該啟動(dòng)子應(yīng)用于植物基因組編輯系統(tǒng)，在本發(fā)明之前未有報(bào)道，本發(fā)明屬于首創(chuàng)。本發(fā)明的改良后crispr/cas9系統(tǒng)將有望提高單子葉植物中的基因組編輯效率，促進(jìn)作物遺傳改良以及基礎(chǔ)研究。

附圖說明

圖1顯示實(shí)施例4中以玉米基因1(國際通用編號(hào)為grmzm2g027059)為靶基因獲得的4個(gè)轉(zhuǎn)基因事件的抗性愈傷組織(各取3份樣品)利用pcr(polymerasechainreaction)-酶切的方法進(jìn)行突變鑒定的結(jié)果。

圖2顯示實(shí)施例4中獲得的純合或雙等位基因的突變體的表型結(jié)果。

圖3顯示實(shí)施例4中t1代植株突變鑒定的pcr-酶切后電泳結(jié)果。

圖4顯示實(shí)施例4中t0代轉(zhuǎn)基因小麥植株中缺失突變的結(jié)果。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施例，并參照附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。

本發(fā)明的發(fā)明人在研究的過程中，通過大量的篩選實(shí)驗(yàn)和反復(fù)的實(shí)踐驗(yàn)證，在玉米中發(fā)掘了一個(gè)新的啟動(dòng)子用于驅(qū)動(dòng)cas9基因的表達(dá)，同時(shí)構(gòu)建了方便其應(yīng)用的重組載體和基因工程菌株。農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)表明，和現(xiàn)有技術(shù)中已報(bào)道的其他啟動(dòng)子相比，本發(fā)明能夠顯著提高在植物特別是單子葉植物玉米中利用crispr/cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯的效率，在轉(zhuǎn)基因t0代100％的抗性愈傷能再生獲得純合或雙等位突變體植株，純合或雙等位突變體植株在所有再生獲得的植株中的比例在65％以上。本發(fā)明同時(shí)有望在小麥t1代獲得多基因位點(diǎn)的純合或雙等位突變體植株。

下述各實(shí)施例中，所使用的實(shí)驗(yàn)材料的來源如下：

質(zhì)粒35s-cas9-sk在文獻(xiàn)“fengz.y.etal.,efficientgenomeeditinginplantsusingacrispr/cassystem.cellres2013”中公開過；

質(zhì)粒pu3-sgrna在文獻(xiàn)“fengc.etal.,efficienttargetedgenomemodificationinmaizeusingcrispr/cas9system.jgenet.genomics2016”中公開過；

質(zhì)粒ptf101.1在文獻(xiàn)“pazm.m.etal.,assessmentofconditionsaffectingagrobacteriummediatedsoybeantransformationusingthecotyledonarynodeexplant.euphytica2004”中公開過；

農(nóng)桿菌菌株eha105可以從商業(yè)公司購買，如優(yōu)寶生物公司，產(chǎn)品編號(hào)：st1140；

玉米品種hiii在文獻(xiàn)“armstrongc.l.，greenc.e.&phillipsr.l.developmentandavailabilityofgermplasmwithhightypeiicultureformationresponse.maizegenet.coop.newslett.65，92-93(1991)”中公開過；公眾可從玉米遺傳學(xué)和基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(maizegdb)網(wǎng)站獲??；

玉米品種b73在文獻(xiàn)“russellw.a.registrationofb70andb73parentallinesofmaize.cropsci.12，721(1972)”中公開過；公眾可從玉米遺傳學(xué)和基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(maizegdb)網(wǎng)站獲??；

小麥品種蘇麥3號(hào)記載于“江蘇太湖地區(qū)農(nóng)科所等.小麥赤霉病最優(yōu)抗源-蘇麥3號(hào).江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),1988”一文，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得；

dna提取試劑盒(貨號(hào)：dp305-03)、質(zhì)粒提取試劑盒(dp103-03)、esaygeno快速重組克隆試劑盒(貨號(hào)：vi201-02)等購自天根生化科技(北京)有限公司；

pcr產(chǎn)物克隆用的t載體(貨號(hào)：ct111-01)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；

限制性內(nèi)切酶購自紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司；

引物序列由賽默飛世爾科技(中國)有限公司合成；

測(cè)序由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成；

實(shí)驗(yàn)中用到的其他材料試劑或儀器設(shè)備若未作特殊說明，均表示為本領(lǐng)域常規(guī)市售可得。

實(shí)施例1玉米中dmc1基因啟動(dòng)子的克隆以及pdmc1-cas9重組載體的構(gòu)建

從玉米遺傳學(xué)和基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(maizegdb)網(wǎng)站獲取玉米dmc1基因的序列全長(zhǎng)(基因id為grmzm2g109618)。根據(jù)全長(zhǎng)的序列在該基因的5’端非編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物dmc-f(序列如seqidno.2所示)和dmc-r(序列如seqidno.3所示)作為擴(kuò)增引物對(duì)，以玉米b73(zeamaysl.)基因組dna為模板，pcr擴(kuò)增獲得一個(gè)3614bp長(zhǎng)的片段(序列如seqidno.1所示)，該片段緊鄰起始密碼子。利用引物dmc-f2(序列如seqidno.4所示)和dmc-r2(序列如seqidno.5所示)作為擴(kuò)增引物對(duì)，上述3614bp長(zhǎng)的片段dna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，然后利用esaygeno快速重組克隆試劑盒(購自天根生化科技(北京)有限公司)將擴(kuò)增的片段整合到35s-cas9-sk(xhoⅰ酶切)載體中替換35s啟動(dòng)子，得到重組的pdmc1-cas9-sk載體。然后利用xmaⅰ和ecorⅰ兩個(gè)酶切位點(diǎn)將dmc1p-cas9轉(zhuǎn)錄單元亞克隆到雙元載體ptf101.1上，得到重組載體pdmc1-cas9。

玉米基因組中符合5’-nx-ngg-3’或者5’-ccn-nx-3’(n代表a、t、c和g中的任何一種，14≤x≤30，且x為整數(shù)，nx表示x個(gè)連續(xù)的脫氧核糖核苷酸)序列規(guī)則的位點(diǎn)被選擇為crispr/cas9系統(tǒng)編輯的靶位點(diǎn)。靶位點(diǎn)的dna序列可以通過引物退火連入pu3-sgrna載體(bbsⅰ酶切)。然后通過hindⅲ酶切位點(diǎn)將sgrna的轉(zhuǎn)錄單元亞克隆到前述的pdmc1-cas9載體。然后將pdmc1-cas9載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株eha105，得到的重組基因工程菌株用于玉米的轉(zhuǎn)化。

實(shí)施例2玉米原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

玉米原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法參見已有的報(bào)道(fengc.etal.,efficienttargetedgenomemodificationinmaizeusingcrispr/cas9system.jgenet.genomics2016)。本實(shí)施例中所用玉米材料為b73。試劑配制及主要的步驟如下：

主要溶液配方如下：

(1)酶解液：1.5％纖維素酶，0.4％離析酶r10，0.4m甘露醇，20mm氯化鉀，20mm脂肪酸甲酯磺酸鹽，ph5.7。55℃水浴10min后加入10mm的氯化鈣，0.1％的牛血清蛋白以及5mm的β巰基乙醇；

(2)w5溶液：154mm氯化鈉，5mm氯化鉀，125mm氯化鈣，2mm脂肪酸甲酯磺酸鹽，ph5.7；

(3)mmg溶液：4mm脂肪酸甲酯磺酸鹽，0.4m甘露醇，15mm氯化鎂，ph5.7；

(4)40％peg溶液：40％peg4000，100mm氯化鈣，0.6m甘露醇。

實(shí)驗(yàn)步驟如下：

(1)25℃黑暗條件下萌發(fā)幼苗，待幼苗長(zhǎng)至10cm左右選取最幼嫩的葉片切成0.5mm寬的碎片；

(2)切好的葉片放入新配制的酶解液中真空抽氣0.5h，然后在搖床上40rpm酶解4h，最后在80rpm條件下處理5分鐘；

(3)用41μm的尼龍網(wǎng)濾膜過濾酶解后的原生質(zhì)體到圓底離心管中，100g離心3min，吸取上清，用w5溶液洗滌2次；

(4)洗滌后的原生質(zhì)體在冰上放置30min，然后離心，吸去上清，加入適量的mmg溶液重懸至細(xì)胞數(shù)為5×10⁵g/ml；

(5)將實(shí)施例1獲得的重組載體pdmc1-cas9轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株dh5α，以備抽提質(zhì)粒。用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒。取190μl原生質(zhì)體溶液，加入10μl質(zhì)粒(大于5μg)，再加入200μl40％peg溶液，用槍頭輕輕混勻，25℃放置18min；

(6)加入1.4mlw5溶液，顛倒混勻，100g離心3min，棄掉上清，加入1.5mlw5溶液重懸，然后將原生質(zhì)體懸液轉(zhuǎn)移到6孔板中，28℃黑暗下培養(yǎng)1.5d。

實(shí)施例3農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化

玉米遺傳轉(zhuǎn)化的方法主要參考已有的報(bào)道(frameb.r.etal.,agrobacterium-mediatedtransformationofmaizeembryosusingastandardbinaryvectorsystem.plantphysiol.2002)。轉(zhuǎn)化的受體材料為hiii。試劑配制及主要的步驟如下：

主要溶液及培養(yǎng)基配方如下：

(1)n6維生素貯存液(1000×)：2.0g/l甘氨酸，1.0g/l維生素b1，0.5g/l維生素b6，0.5g/l煙酸，過濾除菌；

(2)ms維生素貯存液(1000×)：2.0g/l甘氨酸，0.5g/l維生素b1，0.5g/l維生素b6，0.05g/l煙酸，過濾除菌；

(3)侵染培養(yǎng)基：4.0g/ln6鹽，1ml/ln6維生素貯存液，1.5mg/l2,4-d，0.7g/ll-脯氨酸，68.4g/l蔗糖，36.0g/l葡萄糖，ph5.2，過濾除菌，臨用添加100.0μm的乙酰丁香酮；

(4)共培養(yǎng)培養(yǎng)基：4.0g/ln6鹽，1.5mg/l2,4-d，0.7g/ll-脯氨酸，30.0g/l蔗糖，3.0g/l植物凝膠，ph5.8；高溫高壓滅菌后添加1ml/ln6維生素貯存液，100.0μm乙酰丁香酮，300.0mg/ll-半胱氨酸，5.0μm硝酸銀；

(5)靜息培養(yǎng)基：4.0g/ln6鹽，1.5mg/l2,4-d，0.7g/ll-脯氨酸，30.0g/l蔗糖，0.5g/l脂肪酸甲酯磺酸鹽，8.0g/l瓊脂，ph5.8；高溫高壓滅菌后添加1ml/ln6維生素貯存液，100.0mg/l頭孢噻肟，100.0mg/l萬古霉素，5.0μm硝酸銀；

(6)選擇培養(yǎng)基i：4.0g/ln6鹽，1.5mg/l2,4-d，0.7g/ll-脯氨酸，30.0g/l蔗糖，0.5g/l脂肪酸甲酯磺酸鹽，8.0g/l瓊脂，ph5.8；高溫高壓滅菌后添加1ml/ln6維生素貯存液，100.0mg/l頭孢噻肟，100.0mg/l萬古霉素，5.0μm硝酸銀，1.5mg/l除草劑；

(7)選擇培養(yǎng)基ii：4.0g/ln6鹽，1.5mg/l2,4-d，0.7g/ll-脯氨酸，30.0g/l蔗糖，0.5g/l脂肪酸甲酯磺酸鹽，8.0g/l瓊脂，ph5.8；高溫高壓滅菌后添加1ml/ln6維生素貯存液，100.0mg/l頭孢噻肟，100.0mg/l萬古霉素，5.0μm硝酸銀，3.0mg/l除草劑；

(8)再生培養(yǎng)基i：4.3g/lms鹽，1.0ml/lms維生素貯存液，100.0mg/l肌醇，60.0g/l蔗糖，3.0g/l植物凝膠，ph5.8；高溫高壓滅菌后添加100.0mg/l頭孢噻肟，3.0mg/l除草劑；

(9)再生培養(yǎng)基ii：4.3g/lms鹽，1.0ml/lms維生素貯存液，100.0mg/l肌醇，30.0g/l蔗糖，3.0g/l植物凝膠，ph5.8；高溫高壓滅菌。

主要實(shí)驗(yàn)步驟如下：

(1)農(nóng)桿菌侵染

在侵染實(shí)驗(yàn)的前一天接種實(shí)施例1得到的重組eha105基因工程菌株到10ml的yep培養(yǎng)基中，在搖床中28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)16-20h。離心收集農(nóng)桿菌，重懸到侵染培養(yǎng)基中(od550值為0.3-0.4)。從玉米幼穗中剝出未成熟的幼胚(1.5-2.0mm)，幼胚隨后置于含有農(nóng)桿菌的侵染培養(yǎng)基的2mlep管中，顛倒5-10次然后靜置5min。

(2)共培養(yǎng)

侵染后的幼胚隨后置于無菌的濾紙上并緊接著轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，幼胚的盾片朝上。然后放到培養(yǎng)箱中20℃黑暗下培養(yǎng)3天。

(3)靜息培養(yǎng)

經(jīng)過3天的共培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)移所有的幼胚到靜息培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中，28℃黑暗下培養(yǎng)7天。

(4)抗性愈傷的選擇培養(yǎng)

經(jīng)過7天的靜息培養(yǎng)，轉(zhuǎn)移所有的幼胚到選擇培養(yǎng)基i，置于培養(yǎng)箱中，28℃黑暗下培養(yǎng)14天。然后轉(zhuǎn)移所有的愈傷組織到選擇培養(yǎng)基ii，置于培養(yǎng)箱中28℃黑暗下培養(yǎng)14天。愈傷組織在選擇培養(yǎng)基ii中重復(fù)繼代3-5次，直至陸續(xù)選出所有的抗性愈傷組織。

(5)抗性愈傷組織的再生

經(jīng)過選擇培養(yǎng)，篩選到的抗性愈傷組織培養(yǎng)到足夠大后轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基i，置于培養(yǎng)箱中25℃黑暗下培養(yǎng)14天。然后選取含有體細(xì)胞胚的愈傷組織轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基ii，置于培養(yǎng)箱中25℃光照下培養(yǎng)，直到再生出所有的幼苗。

實(shí)施例4基因編輯效率檢測(cè)

(1)收集實(shí)施例2中的已轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體或?qū)嵤├?中的轉(zhuǎn)基因玉米愈傷、植株葉片的樣品以及轉(zhuǎn)基因小麥樣品。用dna抽提試劑盒(購自天根生化科技(北京)有限公司)提取基因組dna；

(2)用相應(yīng)靶位點(diǎn)的引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得的pcr產(chǎn)物取其中一部分用相應(yīng)靶位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶(購自neb公司)做酶切實(shí)驗(yàn)，酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(圖1)；圖1顯示以玉米基因1(國際通用編號(hào)為grmzm2g027059)為靶基因獲得的4個(gè)轉(zhuǎn)基因事件的抗性愈傷組織(各取3份樣品)突變鑒定結(jié)果；通過pcr擴(kuò)增得到含靶位點(diǎn)的651bp的dna片段，如果序列沒有突變則可以被酶切成501bp和150bp的兩個(gè)片段，反之則不能被切開。圖1中各泳道對(duì)應(yīng)的樣品從左到右為：4個(gè)轉(zhuǎn)基因事件#1、#3、#4、#6(各3份樣品)，對(duì)照和marker，從圖1中可以看出4個(gè)愈傷樣品中其中3個(gè)都含有純合或雙等位突變。

(3)對(duì)于含有純合或雙等位基因的突變的樣品，pcr產(chǎn)物可以直接送到測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序；對(duì)于其他類型的含有突變的樣品，回收酶切未切開的突變序列條帶，克隆到商業(yè)化的t載體，然后挑取單克隆送公司測(cè)序；

(4)分析酶切和測(cè)序的結(jié)果，統(tǒng)計(jì)突變類型和比例。

對(duì)于玉米基因1(國際通用編號(hào)為grmzm2g027059)作為一個(gè)標(biāo)記基因，該基因突變理論上植株會(huì)出現(xiàn)白化的表型。兩批次的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)共獲得10個(gè)轉(zhuǎn)基因事件，其中的9個(gè)事件中均獲得了白化表型的植株，并且經(jīng)鑒定為純合或雙等位基因突變體(圖2)；此外一個(gè)事件中獲得了葉片黃化的植株，經(jīng)鑒定也是雙等位基因突變體。因此，再生獲得含有純合或雙等位基因突變植株的轉(zhuǎn)基因事件為100％；所有的再生植株中純合或雙等位基因突變植株比例大于65％。將t0代中突變比例較低的植株自交或雜交獲得t1代，鑒定結(jié)果表明在t1代部分植株中突變比例較t0代明顯提高(圖3)，圖3顯示的為一棵t0代植株和野生型雜交的后代中靶基因突變的鑒定結(jié)果；左側(cè)為t0代植株鑒定的結(jié)果，泳道對(duì)應(yīng)樣品依次為轉(zhuǎn)基因t0植株、對(duì)照和marker；右側(cè)為t1代植株鑒定的結(jié)果，泳道對(duì)應(yīng)樣品依次為t1代的8棵轉(zhuǎn)基因植株、對(duì)照和marker。

其中，t0代中突變體基因型統(tǒng)計(jì)見表1：

表1實(shí)施例4中的突變體基因型統(tǒng)計(jì)

對(duì)于玉米基因2(國際通用編號(hào)為grmzm2g456570)，已知該基因突變理論上會(huì)產(chǎn)生致死的表型，在其它物種中已證實(shí)這種致死的表型，轉(zhuǎn)化了大量的幼胚但是只獲得兩個(gè)抗性事件的愈傷組織，轉(zhuǎn)化效率顯著降低。這從一定程度地表明大部分的陽性轉(zhuǎn)基因事件中產(chǎn)生了純合或雙等位基因的突變。另外，對(duì)兩個(gè)陽性事件的愈傷組織進(jìn)行突變鑒定發(fā)現(xiàn)在這兩個(gè)樣品為嵌合突變體，突變比例分別也在50％以上。

對(duì)于小麥，我們選擇了蘇麥3號(hào)材料中的fhb1基因等作為靶基因，到目前已經(jīng)鑒定的t0代6棵轉(zhuǎn)基因植株中其中4棵可以檢測(cè)到缺失突變(圖4)。

綜上所述，本發(fā)明提供了一種新的用于植株基因編輯的重組載體。通過在單子葉植物特別是玉米中的實(shí)驗(yàn)表明：利用該重組載體基于農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系，玉米中在t0代可以獲得高比例的純合或雙等位突變體植株材料。并且對(duì)于t0代含低突變比例的植株，自交或雜交得到的t1代中部分植株中突變比例會(huì)顯著提高。

以上所述的具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳細(xì)說明，應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

<110>中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所

<120>一種基因編輯系統(tǒng)及應(yīng)用其對(duì)植物基因組進(jìn)行編輯的方法

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