本發(fā)明涉及pinnatepentafoliata2基因在調(diào)控豆科植物小葉數(shù)量中的應(yīng)用，尤其涉及敲除pinnatepentafoliata2基因在提高豆科植物小葉數(shù)量中的應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

豆科牧草苜蓿是世界上栽培最早，分布最廣，也是最為重要的一種多年生優(yōu)質(zhì)牧草。但是，國(guó)產(chǎn)苜蓿產(chǎn)量少、品質(zhì)差、貨源不穩(wěn)定，這已成為限制我國(guó)草食畜牧業(yè)和奶業(yè)發(fā)展的一個(gè)不可忽視的因素。目前我國(guó)苜蓿的商業(yè)生產(chǎn)正在迅速增長(zhǎng)，但由于國(guó)內(nèi)對(duì)高質(zhì)量苜蓿日益增長(zhǎng)的巨大需求，國(guó)產(chǎn)苜蓿的短缺情況并沒(méi)有得到緩解。因此苜蓿的產(chǎn)量和品質(zhì)改良是我國(guó)草業(yè)、畜牧業(yè)和奶業(yè)發(fā)展的重大迫切需求。

苜蓿是以收獲葉、莖為主的牧草，葉對(duì)苜蓿產(chǎn)草量的貢獻(xiàn)率最多可達(dá)60％。葉片不僅是苜蓿生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量構(gòu)成和品種特性的重要指標(biāo)，更是栽培管理及病蟲害監(jiān)測(cè)的主要研究對(duì)象。在苜蓿品質(zhì)評(píng)價(jià)體系中，葉莖比(葉片與莖稈重量的比值)是其中一個(gè)重要的指標(biāo)。苜蓿70％的蛋白質(zhì)儲(chǔ)藏于葉片中，而且葉片纖維含量?jī)H為莖稈的1/3。因此葉莖比值越大，苜蓿的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值就越高，適口性就越好，同時(shí)利用價(jià)值也就相對(duì)越高。苜蓿多葉性狀目前已被作為一種形態(tài)學(xué)標(biāo)記，被認(rèn)為具有高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)的潛力。選育葉量豐富、葉莖比高的苜蓿新品種一直是育種工作者追求的目標(biāo)。

植物的葉發(fā)育模式分為單葉和復(fù)葉。單葉結(jié)構(gòu)指得是在一個(gè)葉柄上只有一個(gè)小葉片，而復(fù)葉結(jié)構(gòu)指得是在一個(gè)葉柄上有多個(gè)小葉片生成。蒺藜苜蓿的葉為復(fù)葉結(jié)構(gòu)，包括三個(gè)小葉片。苜蓿的多葉性狀是由多基因控制的，其產(chǎn)生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程而且同時(shí)受環(huán)境和基因兩方面的影響。到目前為止，只有少數(shù)多葉苜蓿品種被商業(yè)化。這些品種中大部分植株具有多葉性狀，但植株個(gè)體多葉頻率高低不均：有的植株僅數(shù)個(gè)復(fù)葉為多葉型，多數(shù)復(fù)葉仍為三出復(fù)葉；也有植株不同枝條上混雜出現(xiàn)多葉型復(fù)葉和三出復(fù)葉，而多葉頻率高的植株則非常少見。這些缺陷導(dǎo)致現(xiàn)有的多葉型苜蓿品種在生產(chǎn)性能方面并未表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)。

因此，基于以上原因，對(duì)苜蓿復(fù)葉發(fā)育分子機(jī)制進(jìn)行研究，通過(guò)基因工程直接提高苜蓿小葉片數(shù)量可為苜蓿優(yōu)質(zhì)新品系的分子設(shè)計(jì)改良和育種提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)手段，有助于高效、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的苜蓿新品種的培育。

bel1-like基因家族在葉片發(fā)育過(guò)程中起關(guān)鍵作用。目前尚未見到有關(guān)于bel1-like基因家族在復(fù)葉物種中調(diào)控小葉片數(shù)目的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，針對(duì)現(xiàn)有多葉苜蓿品種多葉頻率不高的不足，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種調(diào)控豆科植物小葉數(shù)量的基因，并提供了一種敲除該基因以獲得可提高小葉片數(shù)量的轉(zhuǎn)基因豆科植物的方法。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

pinnatepentafoliata2基因在調(diào)控豆科植物小葉數(shù)量中的應(yīng)用。

本發(fā)明首次分離得到了蒺藜苜蓿bel1-like基因家族成員pinnatepentafoliata2(ppf2)基因的敲除突變體株系，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，該基因參與了調(diào)控豆科植物的小葉數(shù)量，并可通過(guò)敲除該基因的方式以得到小葉數(shù)量高于野生型植株的轉(zhuǎn)基因豆科植物。

所述pinnatepentafoliata2基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

所述豆科植物，優(yōu)選苜蓿、蒺藜苜蓿、三葉草。

本發(fā)明利用特異性引物(核苷酸序列如seqidno.3和seqidno.4所示)，通過(guò)rt-pcr技術(shù)從蒺藜苜蓿中克隆pinnatepentafoliata2基因；利用構(gòu)建的突變體群體，篩選出pinnatepentafoliata2基因的敲除突變體株系，發(fā)現(xiàn)植株的小葉片數(shù)量由三個(gè)變?yōu)槲鍌€(gè)，少數(shù)為四個(gè)。獲得的植株中多達(dá)97％的葉片的小葉片數(shù)量提高，這一數(shù)據(jù)遠(yuǎn)高于目前現(xiàn)有的多葉苜蓿品種(約40％)。這證明，該基因參與了調(diào)控豆科植物的小葉數(shù)量，敲除該基因，可以得到小葉數(shù)量高于野生型植株的轉(zhuǎn)基因豆科植物，可顯著提高小葉數(shù)量，預(yù)示本發(fā)明實(shí)施后將會(huì)創(chuàng)造新型豆科牧草植物，可用于后續(xù)的牧草品質(zhì)，對(duì)我國(guó)草業(yè)生產(chǎn)具有重大意義。

附圖說(shuō)明

圖1：蒺藜苜蓿pinnatepentafoliata2(ppf2)基因的克隆和突變體的鑒定，其中，a：pinnatepentafoliata2的基因結(jié)構(gòu)及突變體中tnt1轉(zhuǎn)座子的插入位置；b：野生型和突變體的pinnatepentafoliata2基因rt-pcr結(jié)果。pinnatepentafoliata2三個(gè)tnt1插入突變體全部插入在外顯子區(qū)域。rt-pcr方法鑒定pinnatepentafoliata2(ppf2)的三個(gè)突變體，表明pinnatepentafoliata2基因在突變體中的轉(zhuǎn)錄被終止。

圖2：蒺藜苜蓿pinnatepentafoliata2基因突變體的表型分析，其中，a：野生型的三個(gè)小葉的復(fù)葉結(jié)構(gòu)；b：突變體的五個(gè)小葉的復(fù)葉結(jié)構(gòu)；c：野生型和突變體中小葉數(shù)目的比較。蒺藜苜蓿的野生型復(fù)葉結(jié)構(gòu)包括三個(gè)小葉，pinnatepentafoliata2基因突變體植株的小葉數(shù)量由三個(gè)變?yōu)槲鍌€(gè)，少數(shù)為四個(gè)。這說(shuō)明pinnatepentafoliata2基因突變體植株的小葉數(shù)目明顯增多，pinnatepentafoliata2基因敲除之后明顯提高了小葉數(shù)目。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。

下述實(shí)施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無(wú)特別說(shuō)明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)儀器、試劑、材料等，可通過(guò)正規(guī)商業(yè)途徑獲得。下述實(shí)施例中所涉及的實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)方法等，若無(wú)特別說(shuō)明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)方法等。

實(shí)施例1克隆蒺藜苜?；騪innatepentafoliata2

1.蒺藜苜蓿pinnatepentafoliata2基因的克隆

通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站ncbi獲得擬南芥pinnatepentafoliata2的序列，然后利用blast進(jìn)行序列比對(duì)搜索，獲得pinnatepentafoliata2的基因組序列(如seqidno.1所示)，其表達(dá)的蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示。根據(jù)序列設(shè)計(jì)seqidno.3和seqidno.4所示的引物。利用trizol試劑盒提取蒺藜苜蓿rna，rt-pcr方法擴(kuò)增pinnatepentafoliata2基因的全長(zhǎng)cds序列。利用gateway技術(shù)將基因序列連入pearleygate201載體，然后進(jìn)行序列測(cè)定，驗(yàn)證克隆序列的正確性。

實(shí)施例2蒺藜苜蓿pinnatepentafoliata2突變體的獲得和鑒定

利用thermalasymmetricinterlaced-pcr(tail-pcr)技術(shù)，篩選了蒺藜苜蓿tnt1標(biāo)記的突變體庫(kù)，在22000個(gè)突變體株系中篩選出tnt1插入到pinnatepentafoliata2基因中的三個(gè)突變體株系(圖1a)。分子生物學(xué)鑒定結(jié)果表明，在三個(gè)突變體株系中，tnt1分別插入到pinnatepentafoliata2基因的第一個(gè)外顯子和第三個(gè)外顯子，導(dǎo)致該基因表達(dá)被終止(圖1b)。

實(shí)施例3蒺藜苜蓿pinnatepentafoliata2基因突變體植株的表型分析

對(duì)蒺藜苜蓿pinnatepentafoliata2基因突變體植株的表型進(jìn)行分析，結(jié)果表明，敲除pinnatepentafoliata2基因可以顯著增加小葉數(shù)目。野生型的復(fù)葉中包括三個(gè)小葉，而突變體植株中約97％的復(fù)葉中包含有4個(gè)或5個(gè)小葉片，其中84％約為5片小葉(圖2a-b，2c)。

序列表

<110>山東大學(xué)

<120>pinnatepentafoliata2基因在調(diào)控豆科植物小葉數(shù)量中的應(yīng)用

<141>2017-08-08

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1957

<212>dna

<213>medicagotruncatula

<400>1

atgatgtcaaactccatgacccatcaaaatcaatttgagaaccaagaactactaggtggt60

ggttatgtttcatcttctttgagaaacaacaatgcatatcatgaatcacttggaacattt120

tctaacaatattgggctagcacaaggttctgagatgagtcacacaagacatttgatggat180

ctacttggtgcagcaaacgagaataatcaccagacacaacaaggcctatccctttcttta240

ggctctcacatgcttgttgatgaatacagaaaccgttccttaaatcaaggtcttatgatc300

aatccaagttacttcatgcctggtcaagatcagacacgtgagccttgtaatcaacctgtg360

gtggagaatctaacaagtgattattttttcagtggtggaagtggaacttttgcttcaggt420

tctaataataataactcattattattgaaccgttctacttctacttcttatggaagtgag480

agttttggttccgttattgggaactctagataccttaaaccagtacagtcacttcttgaa540

gatcttgttgatgttggtggaaatgtgattgatagaatgaatgaaaaatatgctgagaag600

ttgtttcatgggagtagaacaggtgctagaacactctcctctgagctcaaagcagagttg660

aggattcatggacatttattggctgacaaacatgaacatcaagtcaaaattgcaaagctc720

atttcattgttggatgaggttggttggtcttctcttcctgattttatgttcactagtact780

aataaagaaaattgcatcatacttgagtagtattcgaattaagtgctagagtttatcaaa840

taagtgtttatgtataaattatttttaaaacaaaaatcaaattgttttggtatgaactat900

ataaatgttttcataagctatctttgagaatttatagacatggtataagctatttctatc960

aaatggttgtgcttaattttcaggttgagggtagatatgagaagtactaccatcaaatgg1020

aagaagtagtatcatcttttgaaatgatagcaggtttgggagctgcaaagtgttacactg1080

ctctggcacttcaagcaatgtctaggcatttttgtagcttaagagatgccataatgtccc1140

aaataaatgctgagaaaagaaaactgtttcaggatgtacctaaaattaatagtggattgt1200

ctcaactgagcttatttgagagagataataatagacagactagaatgtctctccaacaac1260

ttggagtcattcaaaaccaacgacaagtttggagacctattagagggttacctgaaacat1320

ctgtagcaattcttcgtgcttggctctttgagcactttcttcatccgtaagcttatatca1380

aaattctgtttttgtttttatgttatgtcattttcttgtcttattaatgaaatgctaatt1440

tgatgtctgatttttgcagctatcctaatgattctgagaagttaatcctggcttcccaaa1500

caggtttaaccaaaaaccaagtaattccttatccaaaaactacccctttcctttttttct1560

aatgatatgttaatttagcctcttaagcatttattatagtagtagagactaaggcgacaa1620

atttctttcactttttcttttatgggtaggaatcgagttagggtctcaaatttacaacaa1680

tcacatatagtgcacgtcgataaattccgacaaaataaaacacttcaaacattaacttga1740

gtgttttttttttttttcaaagttatttatgatggtcatgttgttgatgtatggagtgtt1800

ggttcaggtgtcaaactggttcattaatgcaagggtacggctatggaaaccaatgataga1860

agaaatgtacaaagaagagtttggagactcttcggaagactccaacccaccagctaacaa1920

ttttatgtcaagggaagatgtcactgtggaggattag1957

<210>2

<211>443

<212>prt

<213>medicagotruncatula

<400>2

metmetserasnsermetthrhisglnasnglnphegluasnglnglu

151015

leuleuglyglyglytyrvalserserserleuargasnasnasnala

202530

tyrhisgluserleuglythrpheserasnasnileglyleualagln

354045

glyserglumetserhisthrarghisleumetaspleuleuglyala

505560

alaasngluasnasnhisglnthrglnglnglyleuserleuserleu

65707580

glyserhismetleuvalaspglutyrargasnargserleuasngln

859095

glyleumetileasnprosertyrphemetproglyglnaspglnthr

100105110

arggluprocysasnglnprovalvalgluasnleuthrserasptyr

115120125

phepheserglyglyserglythrphealaserglyserasnasnasn

130135140

asnserleuleuleuasnargserthrserthrsertyrglyserglu

145150155160

serpheglyservalileglyasnserargtyrleulysprovalgln

165170175

serleuleugluaspleuvalaspvalglyglyasnvalileasparg

180185190

metasnglulystyralaglulysleuphehisglyserargthrgly

195200205

alaargthrleusersergluleulysalagluleuargilehisgly

210215220

hisleuleualaasplyshisgluhisglnvallysilealalysleu

225230235240

ileserleuleuaspgluvalgluglyargtyrglulystyrtyrhis

245250255

glnmetglugluvalvalserserpheglumetilealaglyleugly

260265270

alaalalyscystyrthralaleualaleuglnalametserarghis

275280285

phecysserleuargaspalailemetserglnileasnalaglulys

290295300

arglysleupheglnaspvalprolysileasnserglyleusergln

305310315320

leuserleuphegluargaspasnasnargglnthrargmetserleu

325330335

glnglnleuglyvalileglnasnglnargglnvaltrpargproile

340345350

argglyleuprogluthrservalalaileleuargalatrpleuphe

355360365

gluhispheleuhisprotyrproasnaspserglulysleuileleu

370375380

alaserglnthrglyleuthrlysasnglnvalserasntrppheile

385390395400

asnalaargvalargleutrplysprometilegluglumettyrlys

405410415

gluglupheglyaspsersergluaspserasnproproalaasnasn

420425430

phemetserarggluaspvalthrvalgluasp

435440

<210>3

<211>24

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>3

atgatgtcaaactccatgacccat24

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>4

ctaatcctccacagtgacatcttc24