本申請(qǐng)是以下申請(qǐng)的分案申請(qǐng)：申請(qǐng)日：2009年12月3日；申請(qǐng)?zhí)枺?00980156467.2(pct/us2009/066654)；發(fā)明名稱：同上。

交叉引用

本申請(qǐng)要求2008年12月4日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/119,973、2009年3月4日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/157,249、2009年4月3日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/166,381和2009年2月23日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/154,594的權(quán)益，這些申請(qǐng)通過(guò)引用其全部?jī)?nèi)容結(jié)合到本申請(qǐng)。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明的實(shí)施方案包括調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因的表達(dá)和/或功能的寡核苷酸和相關(guān)分子。

發(fā)明背景

dna-rna和rna-rna雜交對(duì)核酸功能的許多方面起重要作用，包括dna復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。雜交對(duì)于檢測(cè)具體核酸或改變核酸表達(dá)的各種技術(shù)也很重要。反義核苷酸，例如，通過(guò)雜交至靶rna而破壞基因表達(dá)，從而干擾rna剪接、轉(zhuǎn)錄、翻譯和復(fù)制。反義dna還具有dna-rna雜交體作為核糖核酸酶h消化底物的特征，這種活性存在于大多數(shù)的細(xì)胞類(lèi)型中。反義分子可以被運(yùn)送進(jìn)入細(xì)胞(例如寡脫氧核苷酸(odns))，或者他們可由內(nèi)源基因表達(dá)為rna分子。fda最近批準(zhǔn)了一種反義藥物―vitravene^tm(用于治療巨細(xì)胞病毒視網(wǎng)膜炎)，說(shuō)明反義分子有治療實(shí)用性。

發(fā)明概述

該概述部分概括介紹本發(fā)明，簡(jiǎn)要說(shuō)明本發(fā)明的性質(zhì)及實(shí)質(zhì)。應(yīng)理解的是概述部分不能用來(lái)解釋或限制權(quán)利要求的范圍或含義。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過(guò)使用反義寡核苷酸靶向天然反義轉(zhuǎn)錄物的任何區(qū)域從而抑制天然反義轉(zhuǎn)錄物的作用，導(dǎo)致相應(yīng)的有義基因上調(diào)的方法。本文還考慮到抑制天然反義轉(zhuǎn)錄物可以通過(guò)sirna、核酶和小分子來(lái)實(shí)現(xiàn)，這些也被認(rèn)為屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。

一個(gè)實(shí)施方案提供體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織里腫瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，其包括使所述細(xì)胞或組織與5-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與一種多核苷酸的反向互補(bǔ)序列具有至少50％的序列同一性，所述多核苷酸包含以下核苷酸序列內(nèi)的5-30個(gè)連續(xù)核苷酸：seqidno:4的核苷酸1-1675、或者seqidno:5的核苷酸1-518、或者seqidno:6的核苷酸1-759、或者seqidno:6a的核苷酸1-25892、或者seqidno:6b的核苷酸1-279、或者seqidno:7的核苷酸1-1982、或者seqidno:8的核苷酸1-789或者seqidno:9的核苷酸1-467(圖5)，從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的腫瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸靶向腫瘤抑制基因多核苷酸的天然反義序列，例如seqidno:4、5、6、6a、6b、7、8或9的核苷酸以及它們的任何變體、等位基因、同系物、突變體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。反義寡核苷酸的實(shí)例為seqidno:10-30(圖6-9)。

另一個(gè)實(shí)施方案提供在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的腫瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括：使所述細(xì)胞或組織與5-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與腫瘤抑制基因多核苷酸的反義序列的反向互補(bǔ)序列具有至少50％的序列同一性，從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的腫瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)。

另一個(gè)實(shí)施方案提供了在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的腫瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括：使所述細(xì)胞或組織與5-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與腫瘤抑制基因反義多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少50％的序列同一性，從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的腫瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物包含一種或多種結(jié)合至有義和/或反義腫瘤抑制基因多核苷酸的反義寡核苷酸。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸包含一種或多種修飾的或置換的核苷酸。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸包含一種或多種修飾的鍵。

在再一個(gè)實(shí)施方案中，修飾的核苷酸包含修飾的堿基，其包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸、2’-o-甲基、氟代或碳、亞甲基或其它鎖定核酸(lna)分子。優(yōu)選修飾的核苷酸是鎖定核酸分子，包括α-l-lna。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸通過(guò)皮下、肌內(nèi)、靜脈或腹膜內(nèi)給予患者。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸以藥學(xué)組合物給藥。治療方案包括給予患者至少一次反義化合物；但是，可修改該治療方案以包括在一段時(shí)間內(nèi)多次給藥。該治療可以結(jié)合一種或多種其它類(lèi)型的療法。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸包裹于脂質(zhì)體中或結(jié)合于載體分子(例如膽固醇、tat肽)。

一個(gè)實(shí)施方案提供一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的腫瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括：使所述細(xì)胞或組織與至少一種5-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的反義寡核苷酸接觸，其中所述至少一種寡核苷酸與腫瘤抑制基因多核苷酸的天然反義序列的反向互補(bǔ)序列具有至少50％的序列同一性，從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的腫瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)。

一個(gè)實(shí)施方案提供一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的腫瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括：使所述細(xì)胞或組織與5-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與腫瘤抑制基因多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少50％的序列同一性，從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的腫瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)。

另一個(gè)實(shí)施方案提供了體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的腫瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞或組織與至少一種靶向腫瘤抑制基因多核苷酸的天然反義序列的區(qū)域的反義寡核苷酸接觸；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的腫瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于對(duì)照，在體內(nèi)或體外增加腫瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種反義寡核苷酸靶向腫瘤抑制基因多核苷酸的天然反義序列。

在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種反義寡核苷酸靶向包含腫瘤抑制基因多核苷酸的編碼和/或非編碼核酸序列的核酸序列。

在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種反義寡核苷酸靶向腫瘤抑制基因多核苷酸的重疊和/或非重疊序列。

在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，至少一種反義寡核苷酸包含的一種或多種修飾選自：至少一種修飾的糖部分、至少一種修飾的核苷間鍵合、至少一種修飾的核苷酸和它們的組合。

在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，一種或多種修飾包含的至少一種修飾的糖部分選自：2’-o-甲氧乙基修飾的糖部分、2’-甲氧基修飾的糖部分、2’-o-烷基修飾的糖部分、二環(huán)糖部分和它們的組合。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種修飾包含的至少一種修飾的核苷間鍵合選自：硫代磷酸酯、2'-o-甲氧乙基(moe)、2'-氟代、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯(acetamidate)、羧甲酯和它們的組合。

在一個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種修飾包含的至少一種修飾的核苷酸選自：肽核酸(pna)、鎖定核酸(lna)、阿拉伯糖核酸(fana)、類(lèi)似物、衍生物和它們的組合。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種寡核苷酸包含seqidno:10-30所示的至少一種寡核苷酸序列。

本發(fā)明還提供一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中的腫瘤抑制基因的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括：使所述細(xì)胞或組織與至少一種5-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的短干擾rna(sirna)寡核苷酸接觸，所述至少一種sirna對(duì)腫瘤抑制基因多核苷酸的反義多核苷酸是特異性的，其中所述寡核苷酸與腫瘤抑制基因多核苷酸的反義和/或有義核酸分子的至少大約5個(gè)連續(xù)核酸的互補(bǔ)序列有至少50％的序列同一性；和在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中的腫瘤抑制基因的功能和/或表達(dá)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸與腫瘤抑制基因多核苷酸的反義和/或有義核酸分子的至少大約5個(gè)連續(xù)核酸的互補(bǔ)序列有至少80％的序列同一性。

另一個(gè)實(shí)施方案提供一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中的腫瘤抑制基因的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括：使所述細(xì)胞或組織與至少一種對(duì)腫瘤抑制基因多核苷酸的有義和/或天然反義鏈的非編碼和/或編碼序列特異性的大約5-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的反義寡核苷酸接觸，其中所述至少一種反義寡核苷酸與seqidno:1、1a、1b、2、2a、2b、3、3a、4、5、6、6a、6b、7、8和9中的至少一種核酸序列具有至少50％的序列同一性；和在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中的腫瘤抑制基因的功能和/或表達(dá)。

一個(gè)實(shí)施方案提供包含至少一種修飾的合成的修飾的寡核苷酸，其中所述至少一種修飾選自：至少一種修飾的糖部分、至少一種修飾的核苷酸間鍵合、至少一種修飾的核苷酸和它們的組合；和進(jìn)一步地其中所述寡核苷酸是反義化合物，其在體內(nèi)或體外雜交至腫瘤抑制基因多核苷酸，并且與正常對(duì)照相比調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因多核苷酸的表達(dá)和/或功能。

在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種修飾包含的核苷酸間鍵合選自：硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲酯和它們的組合。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸包含至少一個(gè)硫代磷酸酯核苷酸間鍵合。

在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸間鍵合骨架。

在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸包含至少一種修飾的核苷酸，所述修飾的核苷酸選自：肽核酸、鎖定核酸(lna)、類(lèi)似物、衍生物和它們的組合。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸包含多種修飾，其中所述修飾包含的核苷酸間鍵合選自：硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲酯和它們的組合。

在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸包含多種修飾，其中所述修飾包含修飾的核苷酸選自：肽核酸、鎖定核酸(lna)、類(lèi)似物、衍生物和它們的組合。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸包含至少一種選自以下的修飾的糖部分：2’-o-甲氧乙基修飾的糖部分、2’-甲氧基修飾的糖部分、2’-o-烷基修飾的糖部分、二環(huán)糖部分和它們的組合。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸包含多種修飾，其中所述修飾包含修飾的糖部分選自：2’-o-甲氧乙基修飾的糖部分、2’-甲氧基修飾的糖部分、2’-o-烷基修飾的糖部分、二環(huán)糖部分和它們的組合。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸是長(zhǎng)度至少大約5-30個(gè)核苷酸并且雜交至腫瘤抑制基因多核苷酸的反義和/或有義鏈的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與腫瘤抑制基因多核苷酸的反義和/或有義編碼和/或非編碼核酸序列的至少大約5個(gè)連續(xù)核酸的互補(bǔ)序列有至少大約20％的序列同一性。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸與腫瘤抑制基因多核苷酸的反義和/或有義編碼和/或非編碼核酸序列的至少大約5個(gè)連續(xù)核酸的互補(bǔ)序列有至少大約80％的序列同一性。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，在體內(nèi)或體外所述寡核苷酸與至少一種腫瘤抑制基因多核苷酸雜交，并且與正常對(duì)照相比調(diào)節(jié)所述腫瘤抑制基因多核苷酸的表達(dá)和/或功能。

在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸包含seqidno:10-30所示的一種序列。

本發(fā)明進(jìn)一步提供包含對(duì)一種或多種腫瘤抑制基因多核苷酸特異性的一種或多種寡核苷酸的組合物，所述多核苷酸包含反義序列、互補(bǔ)序列、等位基因、同系物、同種型、變體、衍生物、突變體、片段或它們的組合。

在特定的實(shí)施方案中，其中寡核苷酸與seqidno:10-30所示的任一種核苷酸序列相比具有至少大約40％的序列同一性。

在一個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種寡核苷酸包含seqidno:10-30所示的任一種核苷酸序列。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，seqidno:10-30所示的寡核苷酸包含一種或多種修飾或核苷酸置換。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種修飾選自：硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸、鎖定核酸(lna)分子和它們的組合。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供一種預(yù)防或治療與至少一種腫瘤抑制基因多核苷酸和/或其至少一種編碼產(chǎn)物相關(guān)的疾病的方法，所述方法包括：給予患者治療有效劑量的至少一種結(jié)合所述至少一種腫瘤抑制基因多核苷酸的天然反義序列的反義寡核苷酸，并且所述反義寡核苷酸調(diào)節(jié)所述至少一種腫瘤抑制基因多核苷酸的表達(dá)；從而預(yù)防或治療與所述至少一種腫瘤抑制基因多核苷酸和/或其至少一種編碼產(chǎn)物相關(guān)的疾病。

在特定的實(shí)施方案中，與所述至少一種腫瘤抑制基因多核苷酸相關(guān)的疾病選自：凋亡減少或增加相關(guān)性疾病、組織/細(xì)胞老化、癌癥(包括表1所列的癌癥)、自身免疫性疾病、包括aids在內(nèi)的免疫缺陷病、衰老、神經(jīng)變性疾病或障礙(例如阿爾茨海默氏病、運(yùn)動(dòng)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、帕金森氏病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化、亨廷頓氏病等)、過(guò)度增生性疾病(例如瘢痕瘤)、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、冠心病、局部缺血性細(xì)胞死亡、淋巴增生性障礙、動(dòng)脈粥樣硬化、骨質(zhì)疏松癥、骨髓增生異常綜合征、毒素誘發(fā)性疾病、病毒感染、傷口愈合、考登氏病(cd)、lhermitte-duclos病(ldd)、bannayan-zonana綜合征(bzs，也稱為bannayan-riley-ruvalcaba綜合征、ruvalcaba-myhre-smith綜合征和riley-smith綜合征)、移植、凋亡相關(guān)性疾病或障礙、代謝疾病或病癥(例如糖尿病)、腎病或障礙、心肌梗塞/心力衰竭、局部缺血、膿毒癥、其中特別的造血炎癥細(xì)胞過(guò)量的炎性疾病、增殖性疾病或者其中有治療范例通過(guò)增加凋亡治療炎癥性疾病的疾病或障礙。

一個(gè)實(shí)施方案提供一種鑒定和選擇用于體內(nèi)給藥的至少一種寡核苷酸的方法，所述方法包括：選擇與疾病狀態(tài)有關(guān)的目標(biāo)多核苷酸；鑒定至少一種包含與選定目標(biāo)多核苷酸互補(bǔ)或其反義方向的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸的寡核苷酸；檢測(cè)在嚴(yán)格雜交條件下反義寡核苷酸和所述目標(biāo)多核苷酸的雜合體的熱熔點(diǎn)；以及根據(jù)獲得的信息選擇用于體內(nèi)給藥的至少一種寡核苷酸。

以下介紹本發(fā)明其它方面。

附圖簡(jiǎn)述

圖1：

圖1a和1b為實(shí)時(shí)pcr結(jié)果圖，其顯示相對(duì)于對(duì)照，hepg2細(xì)胞用lipofectamine2000導(dǎo)入硫代磷酸寡核苷酸處理后，tp73mrna的倍數(shù)變化。實(shí)時(shí)pcr結(jié)果顯示，用針對(duì)p73as設(shè)計(jì)的寡聚體處理hepg2細(xì)胞48小時(shí)后，p73mrna的水平顯著增加(圖1a)。用針對(duì)p73as的寡聚體處理的同一樣品中，p73asrna的水平顯著減少(圖1b)。圖柱寡聚體1、寡聚體2和寡聚體3分別對(duì)應(yīng)于用seqidno10、11和12處理的樣品。

圖1c為實(shí)時(shí)pcr結(jié)果圖，其顯示相對(duì)于對(duì)照，hepg2細(xì)胞用lipofectamine2000導(dǎo)入sirna寡核苷酸處理后，tp73mrna的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)時(shí)pcr結(jié)果顯示，用針對(duì)p73反義hs.668503設(shè)計(jì)的其中兩種寡聚體和針對(duì)p73反義hs.674463設(shè)計(jì)的其中一種寡聚體處理hepg2細(xì)胞48小時(shí)后，p73mrna的水平顯著增加。圖柱p73hs.668503_1、p73hs.668503_2、p73hs.674463_1和p73hs.674463_2分別對(duì)應(yīng)于用seqidno13、14、15和16處理的樣品。

圖1d為實(shí)時(shí)pcr結(jié)果圖，其顯示相對(duì)于對(duì)照，tm4細(xì)胞用lipofectamine2000導(dǎo)入硫代磷酸寡核苷酸處理后，tp73mrna的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)時(shí)pcr結(jié)果顯示，用針對(duì)小鼠p73反義hs.668503設(shè)計(jì)的其中一種寡聚體和針對(duì)小鼠p73反義wdr8設(shè)計(jì)的其中一種寡聚體處理小鼠tm4細(xì)胞48小時(shí)后，p73mrna的水平顯著增加。圖柱p73小鼠hs.668503_1、p73小鼠hs.668503_10、p73小鼠hs.668503_14、p73小鼠hs.668503_15、p73小鼠wdr8_1、p73小鼠wdr8_7、p73小鼠wdr8_8和p73小鼠wdr8_3分別對(duì)應(yīng)于用seqidno14-24處理的樣品。

圖2為實(shí)時(shí)pcr結(jié)果圖，其顯示相對(duì)于對(duì)照，huvec細(xì)胞用lipofectamine2000導(dǎo)入硫代磷酸寡核苷酸處理后，p53mrna的倍數(shù)變化。實(shí)時(shí)pcr結(jié)果顯示，用針對(duì)p53as設(shè)計(jì)的所有sirna處理huvec細(xì)胞48小時(shí)后，p53mrna的水平顯著增加(寡聚體1p＝0.003，寡聚體2p＝0.001和寡聚體2p＝0.03)。圖柱寡聚體1、寡聚體2和寡聚體3分別對(duì)應(yīng)于用seqidno:25、26和27處理的樣品。

圖3為實(shí)時(shí)pcr結(jié)果圖，其顯示相對(duì)于對(duì)照，hepg2細(xì)胞用lipofectamine2000導(dǎo)入硫代磷酸寡核苷酸處理后，ptenmrna的倍數(shù)變化。實(shí)時(shí)pcr結(jié)果顯示，用針對(duì)pten反義hs.624903設(shè)計(jì)的其中一種寡聚體處理hepg2細(xì)胞48小時(shí)后，ptenmrna水平顯著增加。圖柱ptenhs.607931_2、ptenhs.624903_2、ptenhs.624903_3分別對(duì)應(yīng)于用seqidno28、29和30處理的樣品。

圖4顯示：

seqidno:1：人腫瘤抑制基因(tp73)轉(zhuǎn)錄物變體1，mrna。(ncbi注冊(cè)號(hào)：nm_005427.2)。

seqidno:1a顯示p73的基因組序列(外顯子用大寫(xiě)字母表示，內(nèi)含子用小寫(xiě)字母表示)。

seqidno:1b顯示p73的小鼠基因組序列(外顯子用大寫(xiě)字母表示，內(nèi)含子用小寫(xiě)字母表示)。

seqidno:2：人腫瘤蛋白p53(tp53)，轉(zhuǎn)錄物變體1，mrna。(ncbi注冊(cè)號(hào)：nm_000546.4)

seqidno:2a：顯示p53的基因組序列(外顯子用大寫(xiě)字母表示，內(nèi)含子用小寫(xiě)字母表示)。

seqidno:2b顯示p53同種型d的基因組序列(ncbi注冊(cè)號(hào)：nm_001126115)。

seqidno:3：人磷酸酶和張力蛋白同系物(pten)，mrna。(ncbi注冊(cè)號(hào)：nm_000314)。

seqidno:3a：顯示pten的基因組序列(外顯子用大寫(xiě)字母表示，內(nèi)含子用小寫(xiě)字母表示)。

圖5顯示：

seqidno:4：天然反義序列p73as(ncbi注冊(cè)號(hào)：nm_017818.2)

seqidno:5：p73天然反義序列hs.668503

seqidno:6：p73天然反義序列hs.674463

seqidno:6a：p73小鼠天然反義序列

seqidno:6b：p73小鼠天然反義序列：hs.668503(大寫(xiě)字母表示cdna和基因組序列中匹配的堿基)

seqidno:7：p53天然反義序列(ncbi注冊(cè)號(hào)：nm_018081.2)

seqidno:8：pten天然反義序列(hs.624903)

seqidno:9：pten天然反義序列(hs.607931)

圖6顯示反義寡核苷酸seqidno:10-16?！畆’代表rna和*代表硫代磷酸酯鍵。

圖7顯示反義寡核苷酸seqidno:17-24。*代表硫代磷酸酯鍵。

圖8顯示針對(duì)天然反義序列nm_018081的p53反義寡核苷酸seqidno:25-27。

圖9顯示針對(duì)天然反義序列hs.624903和hs.607931的pten反義寡核苷酸seqidno:28-30?！畆’代表rna。

圖10顯示有義寡核苷酸seqidno:31-34。‘r’代表rna。

有義寡核苷酸seqidno:31是反義寡核苷酸seqidno:13的反向互補(bǔ)序列，

有義寡核苷酸seqidno:32是反義寡核苷酸seqidno:14的反向互補(bǔ)序列，

有義寡核苷酸seqidno:33是反義寡核苷酸seqidno:15的反向互補(bǔ)序列；和

有義寡核苷酸seqidno:34是反義寡核苷酸seqidno:16的反向互補(bǔ)序列。

圖11顯示由appliedbiosystemstaqmangeneexpressionassay設(shè)計(jì)的測(cè)定的seqidno:35和36。

seqidno.:35是p73靶序列，外顯子2(hs00232088_ml)

seqidno.:36是p73as靶序列，外顯子7(hs00215135_ml和hs00892470_g1)

圖12顯示由appliedbiosystemstaqmangeneexpressionassay設(shè)計(jì)的測(cè)定的seqidno:37和38。

seqidno.:37是p53靶序列(hs00153340_ml)

seqidno.:38是p53as(wdr79)靶序列(hs00216360_m1)

圖13顯示有義寡核苷酸seqidno:39-41?！畆’代表rna。

有義寡核苷酸seqidno:39是反義寡核苷酸seqidno:28的反向互補(bǔ)序列，

有義寡核苷酸seqidno:40是反義寡核苷酸seqidno:29的反向互補(bǔ)序列；和

有義寡核苷酸seqidno:41是反義寡核苷酸seqidno:30的反向互補(bǔ)序列。

發(fā)明詳述

本發(fā)明的幾個(gè)方面在下面參照實(shí)例應(yīng)用進(jìn)行例證性說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解的是所列的無(wú)數(shù)具體細(xì)節(jié)、關(guān)系和方法是為了完整理解本發(fā)明。但是，相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員容易認(rèn)識(shí)到省去一個(gè)或多個(gè)具體細(xì)節(jié)或采用其它方法，本發(fā)明也可以實(shí)施。本發(fā)明不受動(dòng)作或事件的順序限制，因?yàn)槟承﹦?dòng)作可以不同的順序發(fā)生和/或與其它動(dòng)作或事件同時(shí)發(fā)生。另外，實(shí)施本發(fā)明方法并不需要所有例證的動(dòng)作或事件。

本文公開(kāi)的所有基因、基因名稱和基因產(chǎn)物意指本文公開(kāi)的組合物和方法適用的任何物種的對(duì)應(yīng)同系物。因此，所述術(shù)語(yǔ)包括但不限于人和小鼠的基因和基因產(chǎn)物。應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)公開(kāi)來(lái)自具體物種的基因或基因產(chǎn)物時(shí)，該公開(kāi)僅僅是示例性的，不能解釋為一種限制，除非文中明確表示一種限制。因此，例如本文公開(kāi)的基因，其在一些實(shí)施方案中與哺乳動(dòng)物核酸和氨基酸序列相關(guān)，還包括來(lái)自其它動(dòng)物的同源和/或直向同源基因和基因產(chǎn)物，其它動(dòng)物包括但不限于其它哺乳動(dòng)物、魚(yú)類(lèi)、兩棲類(lèi)、爬行類(lèi)和鳥(niǎo)類(lèi)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，基因或核酸序列都是人基因或核酸序列。

定義

本文所用的術(shù)語(yǔ)只是為了描述具體實(shí)施方案的目的，并無(wú)意限制本發(fā)明。本文所用的單數(shù)形式"一種"、“所述”和"該"包括復(fù)數(shù)形式，除非文中另有明確說(shuō)明。另外，在發(fā)明詳述和/或權(quán)利要求書(shū)中使用了術(shù)語(yǔ)"包括"、"具有"、"有"或它們的變體，這類(lèi)術(shù)語(yǔ)類(lèi)似于術(shù)語(yǔ)"包含"。

術(shù)語(yǔ)"大約"或"近似"意指本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定的具體值的允許誤差范圍，其部分取決于如何測(cè)量或確定該值，即測(cè)量系統(tǒng)的限制。例如"大約"按照本領(lǐng)域的實(shí)踐可意指1以內(nèi)或超過(guò)1的標(biāo)準(zhǔn)差。或者，"大約"可意指給定值的至多20％的范圍，優(yōu)選至多10％，更優(yōu)選至多5％，甚至更優(yōu)選至多1％的范圍?；蛘?，具體對(duì)生物系統(tǒng)或方法而言，該術(shù)語(yǔ)可意指在數(shù)量級(jí)范圍內(nèi)，優(yōu)選5倍值以內(nèi)，更優(yōu)選2倍值以內(nèi)。在應(yīng)用和權(quán)利要求中描述了具體值，除非另有說(shuō)明，否則術(shù)語(yǔ)"大約"指在具體值的允許誤差范圍之內(nèi)。

本文所用的術(shù)語(yǔ)"mrna"意指靶基因目前公知的mrna轉(zhuǎn)錄物，以及任何可以闡明的其它轉(zhuǎn)錄物。

"反義寡核苷酸"或"反義化合物"意指結(jié)合另一種rna或dna(靶rna、dna)的rna或dna分子。例如，如果它是rna寡核苷酸，它則以rna-rna相互作用的方式結(jié)合另一種rna靶，并改變靶rna的活性(eguchi等,(1991)ann.rev.biochem.60,631-652)。反義寡核苷酸能上調(diào)或下調(diào)特定多核苷酸的表達(dá)和/或功能。該定義包括以治療、診斷或其它觀點(diǎn)來(lái)看有用的任何外源rna或dna分子。這種分子包括雜交至靶核酸的至少一部分的分子，例如反義rna或dna分子、干擾rna(rnai)、微小rna、誘餌rna分子、sirna、酶促rna、治療編輯rna和激動(dòng)劑以及拮抗劑rna、反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部指導(dǎo)序列(egs)寡核苷酸、可變剪接子、引物、探針和寡聚化合物。因此，這些化合物可以以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環(huán)形寡聚化合物的形式導(dǎo)入。

在本發(fā)明上下文中，術(shù)語(yǔ)"寡核苷酸"指寡聚體或多聚體核糖核酸(rna)或脫氧核糖核酸(dna)或它們的模擬物。術(shù)語(yǔ)"寡核苷酸"也包含天然的和/或修飾的單體或鍵鏈體的線性或環(huán)狀寡聚體，包括脫氧核糖核苷、核糖核苷、它們的取代和α異頭形式、肽核酸(pna)、鎖定核酸(lna)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等。寡核苷酸能以單體-單體相互作用(例如堿基配對(duì)的華生-克里克(watson-crick)類(lèi)型、堿基配對(duì)的或反類(lèi)型等)的規(guī)律模式特異性地結(jié)合靶多核苷酸。

寡核苷酸可以是"嵌合的"，也就是由不同的區(qū)域組成。在本發(fā)明中，"嵌合的(型)"化合物是寡核苷酸，其包含兩種或更多種化學(xué)區(qū)域，例如dna區(qū)域、rna區(qū)域、pna區(qū)域等。每個(gè)化學(xué)區(qū)域由至少一個(gè)單體單位組成，在寡核苷酸化合物情況下單體單位為核苷酸。這些寡核苷酸通常包含至少一個(gè)區(qū)域，其中寡核苷酸被修飾以具有一種或多種所需的特征。所需的寡核苷酸特征包括但不限于例如增加對(duì)核酸酶降解的抗性、增加細(xì)胞攝取和/或增加對(duì)靶核酸的結(jié)合親和力。寡核苷酸的不同區(qū)域可以因此具有不同的特征。本發(fā)明的嵌合寡核苷酸可以上述兩種或更多種寡核苷酸、修飾的寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸類(lèi)似物的混合結(jié)構(gòu)制成。

寡核苷酸可以以"套準(zhǔn)對(duì)齊(register)"的方式連接的區(qū)域組成，即單體連續(xù)連接，例如天然dna，或通過(guò)間隔區(qū)連接。間隔區(qū)構(gòu)成區(qū)域之間的共價(jià)"橋"，并且優(yōu)選其長(zhǎng)度不超過(guò)大約100個(gè)碳原子。間隔區(qū)可以具有不同功能性，例如帶正電荷或負(fù)電荷的，具有特殊核酸結(jié)合特征(嵌入劑、溝結(jié)合劑、毒素、熒光團(tuán)等)，具有親脂性，誘導(dǎo)特殊二級(jí)結(jié)構(gòu)例如誘導(dǎo)α螺旋的含丙氨酸的肽。

本文所用的"腫瘤抑制基因"包括所有的家族成員、突變體、等位基因、片段、種型(species)、編碼和非編碼序列、有義和反義多核苷酸鏈等。

本文所用詞語(yǔ)腫瘤蛋白73、p73、tp73在本申請(qǐng)中可交換使用。

本文所用的詞語(yǔ)trp53、腫瘤抑制基因p53、p53、p53抗原ny-co-13、細(xì)胞腫瘤抗原p53、flj92943、lfs1和磷蛋白p53在本申請(qǐng)中可交換使用。

本文所用的詞語(yǔ)pten、10q23del、bzs、mgc11227、mham、mmac1、在多發(fā)性晚期癌癥1中的突變、磷酸酶和張力蛋白同系物、磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸3-磷酸酶和雙重特異性蛋白磷酸酶pten、pten1、tep1在本申請(qǐng)中可交換使用。

本文所用的術(shù)語(yǔ)"對(duì)…特異(性)的寡核苷酸"或"靶向…的寡核苷酸"指寡核苷酸具有這樣的序列：(i)能與靶基因的一部分形成穩(wěn)定復(fù)合體，或(ii)能與靶基因的mrna轉(zhuǎn)錄物的一部分形成穩(wěn)定雙鏈體。復(fù)合體和雙鏈體的穩(wěn)定性能通過(guò)理論計(jì)算和/或體外測(cè)定確定。測(cè)定雜交復(fù)合體和雙鏈體穩(wěn)定性的示例性測(cè)定在下面的實(shí)施例中介紹。

本文所用的術(shù)語(yǔ)"靶/目標(biāo)核酸"包括dna、從這種dna轉(zhuǎn)錄而來(lái)的rna(包括premrna和mrna)、和從這種rna衍生而來(lái)的cdna、編碼序列、非編碼序列、有義或反義多核苷酸。寡聚化合物與其靶核酸的特異性雜交干擾靶核酸的正常功能。這種通過(guò)化合物調(diào)節(jié)靶核酸的功能(化合物特異性地雜交至核酸)一般稱為"反義"。待被干擾的dna的功能包括，例如復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。待被干擾的rna的功能包括所有重要功能，例如rna轉(zhuǎn)移至蛋白翻譯位點(diǎn)、從rna翻譯蛋白、剪接rna產(chǎn)生一種或多種mrna和由rna參與或促進(jìn)的催化活性。這種干擾靶核酸功能的總體效果是調(diào)節(jié)編碼產(chǎn)物或寡核苷酸的表達(dá)。

rna干擾"rnai"由對(duì)它們的"靶"核酸序列具有序列特異性同源性的雙鏈rna(dsrna)分子介導(dǎo)(caplen,n.j.等(2001)proc.natl.acad.sci.usa98:9742-9747)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，介導(dǎo)物是5-25個(gè)核苷酸的"小干擾"rna雙鏈體(sirna)。sirna來(lái)自被稱為dicer的rnaase酶加工dsrna(bernstein,e.等(2001)nature409:363-366)。sirna雙鏈體產(chǎn)物被募集入稱為risc(rna誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體)的多蛋白sirna復(fù)合體。盡管不希望被任何具體理論所束縛，人們還是認(rèn)為risc被指引至靶核酸(適合的mrna)，其中sirna雙鏈體以序列特異方式相互作用，從而以催化形式介導(dǎo)切割(bernstein,e.等(2001)nature409:363-366；boutla,a.等(2001)curr.biol.11:1776-1780)。適用于本發(fā)明的小干擾rna可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法和普通技術(shù)人員熟悉的方法合成和使用。用于本發(fā)明的方法中的小干擾rna適合包含大約1到大約50個(gè)核苷酸(nt)。在非限制性實(shí)施方案的實(shí)施例中，sirna可以包含大約5-大約40個(gè)nt、大約5-大約30個(gè)nt、大約10-大約30個(gè)nt、大約15-大約25個(gè)nt或者大約20-25個(gè)核苷酸。

使用自動(dòng)比對(duì)核酸序列和指明同一性或同源性區(qū)域的計(jì)算機(jī)程序可以幫助選擇適合的寡核苷酸。這類(lèi)程序用于比較例如搜索數(shù)據(jù)庫(kù)(例如genbank)或測(cè)序pcr產(chǎn)物所獲得的核酸序列。比較不同物種之間的核酸序列允許選擇物種間表現(xiàn)出適度同一性的核酸序列。在沒(méi)有進(jìn)行基因測(cè)序的情形下，進(jìn)行dna印跡(southernblots)使得可以確定靶物種和其它物種基因之間的同一性程度。通過(guò)進(jìn)行如本領(lǐng)域公知的不同嚴(yán)格程度的dna印跡，可能獲得同一性的近似值。這些方法允許選擇表現(xiàn)出與待控制對(duì)象的靶核酸序列具有高度互補(bǔ)性的寡核苷酸，以及選擇與其它物種的相應(yīng)核酸序列具有較低程度的互補(bǔ)性的寡核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到選擇用于本發(fā)明的合適基因區(qū)域相當(dāng)大的自由度。

"酶促rna"意指rna分子具有酶活性(cech,(1988)j.american.med.assoc.260,3030-3035)。酶促核酸(核酶)通過(guò)首先結(jié)合靶rna起作用。這種結(jié)合通過(guò)酶促核酸的靶結(jié)合部分實(shí)現(xiàn)，該靶結(jié)合部分與所述rna分子的起切割靶rna作用的酶活性部分非?？拷?。因此酶促核酸首先識(shí)別靶rna，然后通過(guò)堿基配對(duì)結(jié)合靶rna，一旦結(jié)合到正確的位點(diǎn)，即發(fā)揮酶促作用切割靶rna。

"誘餌rna"意指模擬針對(duì)配體的天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域的rna分子。因此誘餌rna與天然結(jié)合靶競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合特異性配體。例如，已經(jīng)證實(shí)過(guò)表達(dá)的hiv反式激活應(yīng)答(tar)rna能作為"誘餌"，并且有效結(jié)合hivtat蛋白，從而阻止其結(jié)合hivrna編碼的tar序列(sullenger等(1990)cell,63,601-608)。這是一個(gè)具體的實(shí)例說(shuō)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到這僅是一個(gè)實(shí)例，利用本領(lǐng)域公知的方法可容易地產(chǎn)生其它實(shí)施方案。

本文所用的術(shù)語(yǔ)"單體"通常指由磷酸二酯鍵或其類(lèi)似物連接的單體，從而形成大小從幾個(gè)單體單位(例如大約3-4個(gè))到幾百個(gè)單體單位的寡核苷酸。磷酸二酯鍵的類(lèi)似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯、氨基磷酸酯等，下文將進(jìn)行更全面的描述。

術(shù)語(yǔ)"核苷酸"包括天然核苷酸和非天然核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該清楚的是，以前被認(rèn)為是"非天然(的)"的各種核苷酸后來(lái)發(fā)現(xiàn)存在于在自然界中。因此"核苷酸"不僅包括公知的包含嘌呤和嘧啶雜環(huán)的分子，而且包括雜環(huán)類(lèi)似物和其互變異構(gòu)體。其它類(lèi)型核苷酸示例性的實(shí)例是包含以下堿基的分子：腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黃嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-n6-甲基腺嘌呤、7-脫氮黃嘌呤、7-脫氮鳥(niǎo)嘌呤、n4,n4-橋亞乙基胞嘧啶、n6,n6-橋亞乙基-2,6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(c3-c6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假異胞嘧啶、2-羥基-5-甲基-4-三唑并吡啶、異胞嘧啶、異鳥(niǎo)嘌呤、肌苷，以及描述于benner等的美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)5,432,272中"非天然"核苷酸。術(shù)語(yǔ)"核苷酸"包括全部實(shí)例以及其類(lèi)似物和互變異構(gòu)體。特別令人感興趣的核苷酸是那些包含腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶的核苷酸，它們被認(rèn)為是與人類(lèi)治療和診斷應(yīng)用相關(guān)的天然核苷酸。核苷酸包含天然的2'-脫氧和2'-羥基糖(例如描述于kornberg和baker,dnareplication,第二版(freeman,sanfrancisco,1992))和它們的類(lèi)似物。

關(guān)于核苷酸的"類(lèi)似物"包括合成的具有修飾的堿基部分和/或修飾的糖部分的核苷酸(參見(jiàn)例如全面描述的下列文獻(xiàn)：scheit,nucleotideanalogs,johnwiley,newyork,1980；freier&altmann,(1997)nucl.acid.res.,25(22),4429-4443,toulmé,j.j.,(2001)naturebiotechnology19:17-18；manoharanm.,(1999)biochemicaetbiophysicaacta1489:117-139；freiers.m.,(1997)nucleicacidresearch,25:4429-4443,uhlman,e.,(2000)drugdiscovery&development,3:203-213,herdewinp.,(2000)antisense&nucleicaciddrugdev.,10:297-310)；2'-o,3`-c-連接的[3.2.0]二環(huán)阿拉伯糖核苷(參見(jiàn)例如n.kchristiensen.等,(1998)j.am.chem.soc.,120:5458-5463；prakashtp,bhatb.(2007)currtopmedchem.7(7):641-9；choej,等(2009)annualreviewofanalyticalchemistry,2,241-264)。這樣的類(lèi)似物包括被設(shè)計(jì)為提高結(jié)合特征(例如雙鏈體或三鏈體穩(wěn)定性、特異性等)的合成核苷酸。

本文所用的"雜交"意指寡聚化合物的基本互補(bǔ)鏈的配對(duì)。一種配對(duì)機(jī)制包括氫鍵，其可以是寡聚化合物的鏈的互補(bǔ)核苷或核苷酸堿基(核苷酸)之間的華生-克里克、或反氫鍵。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通過(guò)氫鍵形成的配對(duì)互補(bǔ)核苷酸。雜交可以在各種條件下發(fā)生。

反義化合物是"可特異性雜交的"是指：反義化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能而引起功能和/或活性的調(diào)節(jié)，并且存在足夠程度的互補(bǔ)性，從而在期望特異性結(jié)合的條件下(即在體內(nèi)測(cè)定或治療處理情形的生理?xiàng)l件下，和在體外測(cè)定中進(jìn)行測(cè)定的條件下)避免反義化合物非特異性地結(jié)合非靶核酸序列。

本文所用的短語(yǔ)"嚴(yán)格(的)雜交條件"或"嚴(yán)格(的)條件"是指這樣的條件：本發(fā)明的化合物將雜交至它的靶序列，且只和最少數(shù)量的其它序列雜交。嚴(yán)格條件是序列依賴的，且在不同的條件下不同，在本發(fā)明中，寡聚化合物雜交至靶序列的"嚴(yán)格條件"取決于寡聚化合物的本質(zhì)和組成以及對(duì)它們進(jìn)行研究的測(cè)定。一般地，嚴(yán)格(的)雜交條件包括低濃度(<0.15m)鹽和無(wú)機(jī)陽(yáng)離子例如na⁺⁺或k⁺⁺(即低離子強(qiáng)度)，溫度高于20℃-25℃但是低于寡聚化合物:靶序列復(fù)合體的tm，以及存在變性劑例如甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲亞砜或去污劑十二烷基硫酸鈉(sds)。例如，對(duì)于每1％甲酰胺，雜交率降低1.1％。高嚴(yán)格雜交條件的實(shí)例是0.1x氯化鈉-檸檬酸鈉緩沖液(ssc)/0.1％(重量/體積)sds，60℃，30分鐘。

本文所用的"互補(bǔ)"指在一條或兩條寡聚體鏈上的兩個(gè)核苷酸之間的精確配對(duì)的能力。例如，如果反義化合物的某一位置上的核酸堿基(nucleobase)能與靶核酸的某一位置的核酸堿基形成氫鍵，所述靶核酸為dna、rna或寡核苷酸分子，那么所述寡核苷酸和靶核酸之間的氫鍵位置就被看作為互補(bǔ)位置。當(dāng)每個(gè)分子的足夠數(shù)量的互補(bǔ)位置被能彼此形成氫鍵的核苷酸占據(jù)時(shí)，則寡聚化合物和其它dna、rna或寡核苷酸分子是彼此互補(bǔ)的。因此，術(shù)語(yǔ)"(可)特異性雜交(的)"和"互補(bǔ)(的)"是用于指示足夠程度的精確配對(duì)或者足夠數(shù)量核苷酸的互補(bǔ)以便寡聚化合物和靶核酸之間發(fā)生穩(wěn)定的特異性結(jié)合。

本領(lǐng)域應(yīng)當(dāng)理解寡聚化合物的序列不需要100％互補(bǔ)于其將特異性雜交的靶核酸序列。而且，寡核苷酸可以雜交一個(gè)或多個(gè)區(qū)段，從而相間隔的區(qū)或相鄰的區(qū)段不參與該雜交事件(例如，環(huán)結(jié)構(gòu)、錯(cuò)配或發(fā)夾結(jié)構(gòu))。本發(fā)明的寡聚化合物與它們將靶向的靶核酸序列內(nèi)的靶區(qū)域具有至少大約70％、或至少大約75％、或者至少大約80％、或者至少大約85％、或者至少大約90％、或者至少大約95％、或者至少大約99％的序列互補(bǔ)性。例如，20個(gè)核苷酸的反義化合物中18個(gè)核苷酸與靶區(qū)域互補(bǔ)并因此而特異性雜交，則該反義化合物表現(xiàn)90％的序列互補(bǔ)性。在該實(shí)例中，余下的非互補(bǔ)核苷酸可以與互補(bǔ)核苷酸是成簇的或分散的，且不需要彼此鄰接或與互補(bǔ)核苷酸鄰接。同樣地，長(zhǎng)度為18個(gè)核苷酸的反義化合物有4個(gè)非互補(bǔ)的核苷酸處于靶核酸序列完全互補(bǔ)的兩個(gè)區(qū)域側(cè)翼，該反義化合物與所述靶核酸的總互補(bǔ)性為77.8％，并且因此屬于本發(fā)明的范圍。反義化合物與靶核酸的某區(qū)域的百分互補(bǔ)性可應(yīng)用本領(lǐng)域公知的blast程序(basiclocalalignmentsearchtools(堿基局部比對(duì)檢索工具))和powerblast程序常規(guī)測(cè)定(altschul等,(1990)j.mol.biol.,215,403-410；zhangandmadden,(1997)genomeres.,7,649-656)。百分同源性、序列同一性或互補(bǔ)性可以通過(guò)例如應(yīng)用smith和waterman算法(adv.appl.math.,(1981)2,482-489)的gap程序(wisconsinsequenceanalysispackage,version8forunix,geneticscomputergroup,universityresearchpark,madisonwis.)利用默認(rèn)設(shè)置確定。

本文所用的術(shù)語(yǔ)"熱熔點(diǎn)(tm)"指在規(guī)定的離子強(qiáng)度、ph和核酸濃度下，50％的互補(bǔ)于靶序列的寡核苷酸與靶序列雜交達(dá)到平衡的溫度。通常，嚴(yán)格條件是：鹽濃度至少是大約0.01到1.0mna離子濃度(或其它鹽)，ph7.0-8.3，溫度對(duì)短寡核苷酸(例如10-50個(gè)核苷酸)是至少大約30℃。嚴(yán)格條件也可以添加去穩(wěn)定劑例如甲酰胺實(shí)現(xiàn)。

本文所用的"調(diào)節(jié)"意指增加(刺激)或降低(抑制)基因的表達(dá)。

術(shù)語(yǔ)"變體"，當(dāng)用于多核苷酸序列時(shí)，可以包含與野生型基因相關(guān)的多核苷酸序列。該定義也可以包括，例如"等位基因(的)"、"剪接(的)"、"種(的)"或"多態(tài)性(的)"變體。剪接變體可以和參比分子有顯著同一性，但是由于mrna加工中外顯子的可變剪接一般會(huì)含有更多或較少數(shù)量的多核苷酸。相應(yīng)的多肽可具有其它的功能性結(jié)構(gòu)域或缺失某些結(jié)構(gòu)域。種變體是種與種之間相異的多核苷酸序列。在本發(fā)明特別有用的是野生型基因產(chǎn)物的變體。變體可以由核酸序列中的至少一個(gè)突變所致，且可以導(dǎo)致改變的mrna或者結(jié)構(gòu)或功能可能有改變或沒(méi)有改變的多肽。任何給定的天然或重組基因可能沒(méi)有等位基因形式，也可能有一種或多種等位基因形式。導(dǎo)致變體的普通突變改變一般見(jiàn)于核苷酸的天然缺失、添加或置換。這些改變類(lèi)型的每一種都可以在給定序列中單獨(dú)地、或與其它聯(lián)合地出現(xiàn)一次或多次。

得到的多肽一般彼此具有顯著的氨基酸同一性。多態(tài)性變體是給定物種中不同個(gè)體之間具體基因的多核苷酸序列的變異。多態(tài)性變體也可以包括"單核苷酸多態(tài)性(snp)"，或是多核苷酸序列中一個(gè)堿基變化的單堿基突變。snp的存在可能說(shuō)明例如某一人群對(duì)某一疾病狀態(tài)的傾向性，即易感性/抵抗性。

衍生多核苷酸包含進(jìn)行了化學(xué)修飾的核酸，例如烷基、酰基或氨基基團(tuán)取代氫。衍生物，例如衍生寡核苷酸，可以包含非天然部分，例如改變的糖部分或糖間鍵合。其中的示例是硫代磷酸酯和本領(lǐng)域公知的其它含硫種類(lèi)。衍生核酸也可以包含標(biāo)記，包括放射性核苷酸、酶、熒光試劑、化學(xué)發(fā)光試劑、顯色劑、底物、輔因子、抑制劑、磁性顆粒等。

"衍生(的)"多肽或肽是被修飾的多肽或肽，例如糖基化、聚乙二醇化、磷酸化、硫酸化、還原/烷基化、酰化、化學(xué)耦合或溫和福爾馬林處理。衍生物也可以被修飾為直接或間接包含可檢測(cè)的標(biāo)記，包括但是不限于放射性同位素、熒光和酶標(biāo)記。

本文所用的術(shù)語(yǔ)"動(dòng)物"或"患者"包括，例如人、綿羊、麋鹿、鹿、長(zhǎng)耳鹿、水貂、哺乳動(dòng)物、猴、馬、牛、豬、山羊、狗、貓、大鼠、小鼠、鳥(niǎo)類(lèi)、雞、爬行動(dòng)物、魚(yú)、昆蟲(chóng)和蜘蛛類(lèi)。

"哺乳動(dòng)物"包括通常處于醫(yī)療護(hù)理下的溫血哺乳動(dòng)物(例如人和家畜)。實(shí)例包括貓科動(dòng)物、犬科動(dòng)物、馬科動(dòng)物、?？苿?dòng)物和人，以及只包括人。

"治療"覆蓋哺乳動(dòng)物疾病狀態(tài)的治療，包括：(a)預(yù)防疾病狀態(tài)在哺乳動(dòng)物出現(xiàn)，特別是當(dāng)這種哺乳動(dòng)物對(duì)這種疾病狀態(tài)易感但還沒(méi)有被診斷為患病時(shí)；(b)抑制疾病狀態(tài)，例如阻止其發(fā)展；和/或(c)減輕疾病狀態(tài)，例如促成疾病狀態(tài)的消退直至達(dá)到所需最終狀態(tài)。治療也包括疾病癥狀的改善(例如減輕疼痛或不適)，其中這種改善可以或不可以直接影響疾病(例如引起、傳播、表達(dá)等)。

本文所用的術(shù)語(yǔ)"癌癥"指任何惡性腫瘤，特別是源于肺、腎或甲狀腺的腫瘤。癌癥本身可表現(xiàn)為"腫瘤"或包含這種癌癥的惡性細(xì)胞的組織。腫瘤的實(shí)例包括各種肉瘤和癌，例如但不限于：纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤(ewing'stumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀上皮細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌、維爾姆斯氏腫瘤(wilms'tumor)、子宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽(tīng)神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、黑素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。如上所述，本發(fā)明特別允許肺、腎和甲狀腺瘤的鑒別診斷。

多核苷酸和寡核苷酸組合物和分子

靶/目標(biāo)：在一個(gè)實(shí)施方案中，靶包含腫瘤抑制基因的核酸序列，包括但不限于和腫瘤抑制基因相關(guān)的有義和/或反義非編碼和/或編碼序列。

腫瘤抑制基因是其產(chǎn)物的作用是控制細(xì)胞分裂的基因。它們和癌基因的區(qū)別在于如果沒(méi)有達(dá)到生長(zhǎng)的條件，腫瘤抑制基因產(chǎn)生抑制細(xì)胞分裂的產(chǎn)物。觸發(fā)細(xì)胞‘剎車(chē)’的條件包括dna損傷、缺乏生長(zhǎng)因子或分裂裝置的缺陷。當(dāng)腫瘤抑制基因突變而造成其功能喪失或降低時(shí)，通常組合其它遺傳改變，細(xì)胞可能發(fā)展為癌癥。這和以其突變形式獲得功能(或者喪失被控制的能力)的癌基因相反。腫瘤抑制基因的實(shí)例包括p53(tp53)：一種調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的轉(zhuǎn)錄因子；rb：改變轉(zhuǎn)錄因子的活性和因此控制細(xì)胞分裂；apc：控制轉(zhuǎn)錄因子的可用性；brca：參與dna修復(fù)。

p53腫瘤抑制基因在各種類(lèi)型的應(yīng)激作用下，發(fā)揮抗增殖作用，包括生長(zhǎng)停滯、凋亡和細(xì)胞衰老(levinea.j.,(1997)cell88:323-31；orenm.,(1999)j.biol.chem.274:36031-034)。p53可被認(rèn)為是監(jiān)控來(lái)自不同來(lái)源的信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)回路的中樞節(jié)點(diǎn)，包括dna損傷反應(yīng)(例如atm/atr激活)、異常致癌事件(例如myc或ras激活)和日常細(xì)胞活動(dòng)(例如生長(zhǎng)因子刺激)。盡管p53突變見(jiàn)于所有人類(lèi)腫瘤一半以上(hollstein等,(1999)mutatres.431:199-209)，但是保有野生型p53的腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)p53通路的其它組分(例如arf腫瘤抑制基因)的缺陷(sherr,c.j.,(2001)natrevmolcellbiol2:731-737；sharplessn.e.等,(2004)jclininvest113:160-8)。p53通路的激活看起來(lái)是人癌癥的常見(jiàn)(如果不是普遍的話)特征。

調(diào)節(jié)這些多核苷酸對(duì)治療其中異常細(xì)胞增殖起作用的癌癥和其它障礙有極大的好處。例如，p53是一種短命的蛋白，其活性在正常細(xì)胞中保持低水平。抑制腫瘤需要的p53的分子功能包括p53作為調(diào)節(jié)內(nèi)源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的能力。因此p53自身的調(diào)節(jié)在它對(duì)腫瘤發(fā)生的作用和維持正常細(xì)胞生長(zhǎng)都很重要。反義化合物是特異性可雜交的化合物是指：反義化合物結(jié)合靶dna或rna而引起功用喪失，并且具有足夠程度的互補(bǔ)性，以避免在特異性結(jié)合是理想的條件下時(shí)反義化合物非特異性地結(jié)合非靶核酸序列，所述條件即體內(nèi)測(cè)定或治療性處理情形下的生理?xiàng)l件和體外測(cè)定時(shí)進(jìn)行測(cè)定的條件。

表1列出了一些腫瘤抑制基因

應(yīng)該明白該列表是非限制性的。本發(fā)明包括使用本文未特別列出的其它腫瘤抑制基因。在腫瘤抑制基因領(lǐng)域工作的技術(shù)人員能鑒別例如描述于出版文獻(xiàn)中的其它腫瘤抑制基因。

應(yīng)該理解的是在上表1中，指明的基因意指基因和其所有目前已知的變體，包括基因和其變體能產(chǎn)生的不同mrna轉(zhuǎn)錄物，可被闡明的進(jìn)一步的基因變體和反義序列。該列表也包括非編碼rna分子或多核苷酸的部分。但是一般這種變體和上表1中的任何多核苷酸序列具有顯著的序列同一性，例如變體和上表1中的序列具有至少大約70％的序列同一性，通常和上表1中的序列具有至少大約75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性。變體序列同一性可以通過(guò)許多標(biāo)準(zhǔn)方法例如blast程序(ncbi.nclm.nih.gov/blast/)測(cè)定。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸對(duì)一種或多種抑制異常細(xì)胞生長(zhǎng)或腫瘤的分子是特異性的。這包括抑制分子活性的因子(例如轉(zhuǎn)化細(xì)胞)、參與前腫瘤時(shí)期的因子、惡變、前轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)移等。其它實(shí)例包括但不限于：發(fā)育基因產(chǎn)物(例如黏著分子、細(xì)胞周期激酶抑制子、wnt家族成員、pax家族成員、winged螺旋家族成員、hox家族成員、細(xì)胞因子/淋巴因子和它們的受體、生長(zhǎng)/分化因子和它們的受體、神經(jīng)遞質(zhì)和它們的受體)；癌基因產(chǎn)物(例如abl1、bcl1、bcl2、bcl6、cbfa2、cbl、csf1r、erba、erbb、erb2、ets1、etv6、fgr、fos、fyn、hcr、hras、jun、kras、lck、lyn、mdm2、mll、myb、myc、mycl1、mycn、nras、pim1、pml、ret、src、tal1、tcl3和yes)；腫瘤抑制基因產(chǎn)物(例如apc、brca1、brca2、madh4、mcc、nf1、nf2、rbi、tp53和wt1)和酶(例如acc合酶和氧化酶、acp去飽和酶和羥化酶、adp葡糖焦磷酸化酶、三磷酸腺苷酶、醇脫氫酶、淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、查耳酮合酶、幾丁質(zhì)酶、環(huán)加氧酶、脫羧酶、糊精酶、dna和rna聚合酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、顆粒結(jié)合淀粉合酶、鳥(niǎo)苷三磷酸酶、解螺旋酶、半纖維素酶、整合酶、復(fù)旋花粉酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、激酶、乳糖酶、脂肪酶、脂加氧酶、溶菌酶、胭脂氨酸合成酶、章魚(yú)堿合酶、果膠酯酶、過(guò)氧化物酶、磷酸酶、磷脂酶、磷酸化酶、肌醇六磷酸酶、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)子合成酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶和肽酶、支鏈淀粉酶(pullanases)、重組酶、反轉(zhuǎn)錄酶、rubiscos、拓?fù)洚悩?gòu)酶和木聚糖酶)。

可用反義化合物獲得的從干細(xì)胞再生的細(xì)胞/組織治療的示例性的腫瘤抑制基因介導(dǎo)的疾病和障礙包括凋亡減少或增加的相關(guān)性疾病、組織/細(xì)胞老化、癌癥(包括列示于表1的癌癥)、自身免疫性疾病、包括艾滋病的免疫缺陷病、衰老、神經(jīng)變性疾病或障礙(例如阿爾茨海默氏病、運(yùn)動(dòng)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、帕金森氏病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化(als)、亨廷頓氏病等)、增生疾病(例如瘢痕瘤)、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、冠心病、局部缺血性細(xì)胞死亡、淋巴增生性障礙、動(dòng)脈粥樣硬化、骨質(zhì)疏松癥、骨髓增生異常綜合征、毒素誘發(fā)性疾病和病毒感染、傷口愈合、考登氏病(cd)、lhermitte-duclos病(ldd)、bannayan-zonana綜合征(bzs，也稱為bannayan-riley-ruvalcaba綜合征、ruvalcaba-myhre-smith綜合征和riley-smith綜合征)、移植、凋亡相關(guān)性疾病或障礙、在急性病中調(diào)節(jié)凋亡的代謝疾病或病癥(例如糖尿病)、腎病或障礙、心肌梗塞/心力衰竭、局部缺血、膿毒癥、其中特別的造血炎癥細(xì)胞過(guò)量的炎性疾病、增殖性疾病、或者其中有治療范例通過(guò)增加凋亡治療炎癥性疾病的疾病或障礙。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸對(duì)腫瘤抑制基因多核苷酸是特異性的，腫瘤抑制基因多核苷酸包括但并不限于非編碼區(qū)域。腫瘤抑制基因靶包含腫瘤抑制基因的變體、腫瘤抑制基因的突變體(包括snp)、腫瘤抑制基因的非編碼序列、等位基因、片段等。優(yōu)選寡核苷酸是反義rna分子。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，靶核酸分子并不僅限于腫瘤抑制基因多核苷酸，還延伸到腫瘤抑制基因的任何同種型、受體、同系物、非編碼區(qū)域等。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸靶向腫瘤抑制基因靶的天然反義序列(編碼和非編碼區(qū)域的天然反義序列)，其包括但不限于它的變體、等位基因、同系物、突變體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。優(yōu)選寡核苷酸是反義rna或dna分子。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物也包括在化合物的一個(gè)或多個(gè)核苷酸位置上存在不同堿基的變體。例如，如果第一個(gè)核苷酸是腺嘌呤，那么可產(chǎn)生在此位置包含胸腺嘧啶核苷、鳥(niǎo)苷、胞苷或其它天然或非天然的核苷酸的變體。這可以在反義化合物的任何位置上進(jìn)行。然后通過(guò)本文描述的方法測(cè)試這些化合物，以確定它們抑制靶核酸表達(dá)的能力。

在一些實(shí)施方案中，反義化合物和靶之間的同源性、序列同一性或互補(bǔ)性大約50％到大約60％。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性大約60％到大約70％。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性大約70％到大約80％。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性大約80％到大約90％。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性是大約90％、大約92％、大約94％、大約95％、大約96％、大約97％、大約98％、大約99％或大約100％。

反義化合物是特異性雜交的是指：反義化合物結(jié)合靶核酸時(shí)，干擾靶核酸的正常功能而引起活性喪失，并且有足夠程度的互補(bǔ)性，以在期望特異性結(jié)合的條件下避免反義化合物非特異性地結(jié)合非靶核酸序列，所述條件包括在體內(nèi)測(cè)定或治療性處理情形下的生理?xiàng)l件和在體外測(cè)定情形下進(jìn)行測(cè)定的條件。

反義化合物，不管是dna、rna、嵌合體、取代的化合物等，都是特異性雜交的，表現(xiàn)為：反義化合物結(jié)合靶dna或rna分子時(shí)，干擾靶dna或rna的正常功能，進(jìn)而引起功效喪失，并且有足夠程度的互補(bǔ)性，以在期望特異性結(jié)合的條件下避免反義化合物非特異性地結(jié)合非靶核酸序列，這種條件包括在體內(nèi)測(cè)定或治療性處理情形下的生理?xiàng)l件和在體外測(cè)定情形下進(jìn)行測(cè)定的條件。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶向腫瘤抑制基因(包括但不限于利用例如pcr、雜交等鑒定或擴(kuò)增的反義序列，seqidno.:4、5、6、6a、6b、7、8和9等中的一種或多種序列)調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因的表達(dá)或功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)或功能相對(duì)于對(duì)照是上調(diào)的。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)或功能相對(duì)于對(duì)照是下調(diào)的。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸包括seqidno:10-30所示的核酸序列，包括利用例如pcr、雜交等鑒定或擴(kuò)增的反義序列。這些寡核苷酸可以包含一種或多種修飾的核苷酸、較短或較長(zhǎng)的片段、修飾的鍵等。修飾的鍵或核苷酸間鍵合的實(shí)例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，核苷酸包含磷衍生物?？梢越Y(jié)合本發(fā)明修飾的寡核苷酸的糖或糖類(lèi)似物部分的磷衍生物(或修飾的磷酸基團(tuán))可以是一磷酸、二磷酸、三磷酸、烷基磷酸、鏈烷磷酸、硫代磷酸等。制備上述的磷酸類(lèi)似物并將它們摻入核苷酸、修飾的核苷酸和寡核苷酸本身也是公知的，不需要在此描述。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用反義的特異性和靈敏性用于治療用途。反義寡核苷酸已經(jīng)作為治療劑部分用于治療動(dòng)物和人的疾病。反義寡核苷酸已被安全和有效地給予人，并且無(wú)數(shù)臨床試驗(yàn)?zāi)壳耙苍谶M(jìn)行中。因此確定寡核苷酸是有益的治療形式，配置后可用于治療細(xì)胞、組織和動(dòng)物、尤其是人的治療方案。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，反義寡聚化合物、特別是寡核苷酸結(jié)合靶核酸分子，并調(diào)節(jié)靶基因編碼的分子的表達(dá)和/或功能?？筛蓴_的dna的功能包括例如復(fù)制和轉(zhuǎn)錄?？筛蓴_的rna的功能包括所有重要的功能，例如轉(zhuǎn)移rna至蛋白翻譯位點(diǎn)、由rna翻譯蛋白、剪接rna產(chǎn)生一種或多種mrna和由rna進(jìn)行或促進(jìn)的催化活性。根據(jù)所需的功能，這些功能可被上調(diào)或抑制。

反義化合物包括雜交至靶核酸至少一部分的反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部指導(dǎo)序列(egs)寡核苷酸、可變剪接子、引物、探針和其它寡聚化合物。同樣，這些化合物可以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環(huán)形寡聚化合物的形式導(dǎo)入。

在本發(fā)明中，反義化合物靶向具體核酸分子可以是多步驟的過(guò)程。該過(guò)程通常開(kāi)始是鑒定需要調(diào)節(jié)其功能的靶核酸。該靶核酸可以是例如其表達(dá)與具體病癥或疾病狀態(tài)相關(guān)的細(xì)胞基因(或自該基因轉(zhuǎn)錄的mrna)，或者來(lái)自傳染致病因子的核酸分子。本發(fā)明中，靶核酸編碼腫瘤抑制基因。

靶向過(guò)程通常還包括在靶核酸內(nèi)確定至少一個(gè)發(fā)生反義相互作用的靶區(qū)域、片段或位點(diǎn)，以便產(chǎn)生所需的效應(yīng)(例如調(diào)節(jié)表達(dá))。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"區(qū)/區(qū)域"被定義為具有至少一種可鑒定結(jié)構(gòu)、功能或特征的靶核酸部分。在靶核酸的區(qū)域內(nèi)是區(qū)段。"區(qū)段"被定義為靶核酸內(nèi)的區(qū)域中的較小部分或亞部分。本發(fā)明所用的"位點(diǎn)"被定義為靶核酸內(nèi)的位置。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合腫瘤抑制基因的天然反義序列并調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因(seqidno:1、2和3)的表達(dá)和/或功能。反義序列的實(shí)例包括seqidno:4-30。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合腫瘤抑制基因多核苷酸的一個(gè)或多個(gè)區(qū)段，并調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因的表達(dá)和/或功能。區(qū)段包含腫瘤抑制基因有義或反義多核苷酸的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，反義寡核苷酸對(duì)腫瘤抑制基因的天然反義序列是特異的，其中反義寡核苷酸與腫瘤抑制基因的天然反義序列結(jié)合調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因的表達(dá)和/或功能。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸化合物包括seqidno:10-30所示的序列，利用例如pcr、雜交等鑒定和擴(kuò)增的反義序列。這些寡核苷酸可以包含一個(gè)或多個(gè)修飾的核苷酸、較短或較長(zhǎng)的片段、修飾的鍵等。修飾的鍵或核苷酸間鍵合的實(shí)例包含硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，核苷酸包含磷衍生物。可以結(jié)合本發(fā)明修飾的寡核苷酸的糖或糖類(lèi)似物部分的磷衍生物(或修飾的磷酸基團(tuán))可以是一磷酸、二磷酸、三磷酸、烷基磷酸、鏈烷磷酸、硫代磷酸等。制備上述磷酸類(lèi)似物和將它們摻入核苷酸、修飾的核苷酸和寡核苷酸本身同樣是公知的，不需要在此描述。

如本領(lǐng)域公知的，由于翻譯起始密碼子通常是5'-aug(在轉(zhuǎn)錄的mrna分子中；而對(duì)應(yīng)的dna分子中是5'-atg)，所以翻譯起始密碼子也稱作"aug密碼子"、"起始密碼子"或"aug起始密碼子"。少數(shù)基因具有rna序列為5'-gug、5'-uug或5'-cug的翻譯起始密碼子；已顯示5'-aua、5'-acg和5'-cug在體內(nèi)具有功能。因此術(shù)語(yǔ)"翻譯起始密碼子"和"起始密碼子"可包含許多密碼子序列，但是每種情況下的起始氨基酸通常都是甲硫氨酸(在真核生物中)或甲酰甲硫氨酸(在原核生物中)。真核和原核基因可以有兩個(gè)或更多個(gè)可選起始密碼子，在具體細(xì)胞類(lèi)型或組織中或在具體條件組下，其中一種起始密碼子可被優(yōu)選用于翻譯起始。在本發(fā)明中，"起始密碼子"和"翻譯起始密碼子"指不管密碼子序列如何，體內(nèi)用于啟動(dòng)從編碼腫瘤抑制基因的基因轉(zhuǎn)錄的mrna的翻譯的密碼子。基因的翻譯終止密碼子(或"終止密碼子")可具有以下三個(gè)序列中的一種，即5'-uaa、5'-uag和5'-uga(它們對(duì)應(yīng)的dna序列分別是5'-taa、5'-tag和5'-tga)。

術(shù)語(yǔ)"起始密碼子區(qū)域"和"翻譯起始密碼子區(qū)域"指從翻譯起始密碼子的任一方向(即5'或3')包含大約25個(gè)到大約50個(gè)連續(xù)核苷酸的mrna或基因的部分。類(lèi)似地，術(shù)語(yǔ)"終止密碼子區(qū)域"和"翻譯終止密碼子區(qū)域"指從翻譯終止密碼子的任一方向(即5'或3')包含大約25個(gè)到大約50個(gè)連續(xù)核苷酸的mrna或基因的部分。因此，"起始密碼子區(qū)域"(或"翻譯起始密碼子區(qū)域")和"終止密碼子區(qū)域"(或"翻譯終止密碼子區(qū)域")是可以被本發(fā)明的反義化合物有效靶中的所有區(qū)域。

開(kāi)放閱讀框(orf)或"編碼區(qū)"，本領(lǐng)域公知指翻譯起始密碼子和翻譯終止密碼子之間的區(qū)域，它也是可以有效靶中的區(qū)域。在本發(fā)明上下文中，中靶區(qū)域是包含基因開(kāi)放閱讀框(orf)的翻譯起始密碼子或終止密碼子的基因內(nèi)區(qū)域。

另一個(gè)靶區(qū)域包括5'非翻譯區(qū)域(5'utr)，本領(lǐng)域公知指始自翻譯起始密碼子的mrna5'方向的部分，因此包含mrna5'帽位點(diǎn)和翻譯起始密碼子之間的核苷酸(或基因上對(duì)應(yīng)的核苷酸)。再一個(gè)靶區(qū)域包含3'非翻譯區(qū)域(3'utr)，本領(lǐng)域公知指始自翻譯終止密碼子的mrna3'方向的部分，因此包含翻譯終止密碼子和mrna3'末端之間的核苷酸(或基因上對(duì)應(yīng)的核苷酸)。mrna的5'帽位點(diǎn)包含n7甲基化的鳥(niǎo)苷殘基，其通過(guò)5'-5'三磷酸酯鍵合與mrna5'末端殘基結(jié)合。mrna的5'帽區(qū)域被認(rèn)為包含5'帽結(jié)構(gòu)本身和與該帽位點(diǎn)相鄰的前50個(gè)核苷酸。本發(fā)明的另一個(gè)靶區(qū)域是5'帽區(qū)域。

雖然一些真核mrna轉(zhuǎn)錄物可被直接翻譯，但是許多mrna轉(zhuǎn)錄物包含一個(gè)或多個(gè)在其翻譯之前從轉(zhuǎn)錄物切除掉的稱為"內(nèi)含子"的區(qū)域。余下的(并因此翻譯的)區(qū)域稱為"外顯子"，被拼接在一起形成連續(xù)的mrna序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶向剪接位點(diǎn)(即內(nèi)含子-外顯子接點(diǎn)或外顯子-內(nèi)含子接點(diǎn))尤其有益于下列情形：疾病涉及異常剪接，或疾病涉及過(guò)度產(chǎn)生特殊的剪接產(chǎn)物。靶位點(diǎn)的另一個(gè)實(shí)施方案是由于重排或缺失而帶來(lái)的異常融合連接。通過(guò)剪接加工兩種(或更多種)從不同基因來(lái)源的mrna而產(chǎn)生的mrna轉(zhuǎn)錄物稱為"融合轉(zhuǎn)錄物"。利用靶向例如dna或pre-mrna的反義化合物可以有效地靶中內(nèi)含子。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合靶多核苷酸的編碼和/或非編碼區(qū)域，并調(diào)節(jié)靶分子的表達(dá)和/或功能。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合天然反義多核苷酸，并調(diào)節(jié)靶分子的表達(dá)和/或功能。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合有義多核苷酸，并調(diào)節(jié)靶分子的表達(dá)和/或功能。

選擇性(alternative)rna轉(zhuǎn)錄物可以從dna的相同基因組區(qū)域產(chǎn)生。這些選擇性轉(zhuǎn)錄物一般稱為"變體"。更具體地，"premrna變體"是由相同基因組dna產(chǎn)生的、與在起始位置或終止位置不同的相同基因組dna產(chǎn)生的其它轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄物，并且包含內(nèi)含子和外顯子序列。

在剪接時(shí)剪切掉一個(gè)或多個(gè)外顯子或內(nèi)含子區(qū)域、或它們的部分，premrna變體產(chǎn)生較小"mrna變體"。因此，mrna變體是剪接后的premrna變體，每個(gè)獨(dú)特的premrna變體必定總是產(chǎn)生作為剪接結(jié)果的獨(dú)特mrna變體。這些mrna變體也稱為"選擇性剪接變體"。如果沒(méi)有對(duì)premrna變體的剪接，則premrna變體與mrna變體相同。

變體可通過(guò)利用起始或終止轉(zhuǎn)錄的選擇性信號(hào)產(chǎn)生。premrna和mrna可以具有不止一個(gè)起始密碼子或終止密碼子。源自使用選擇性起始密碼子的premrna或mrna的變體稱為premrna或mrna的"選擇性起始變體"。使用選擇性終止密碼子的那些轉(zhuǎn)錄物稱為premrna或mrna的"選擇性終止變體"。一種選擇性終止變體的具體類(lèi)型是"多聚a變體"，其中產(chǎn)生的多種轉(zhuǎn)錄物因?yàn)檗D(zhuǎn)錄裝置選擇性選擇"多聚a終止信號(hào)"的一種而來(lái)，因此產(chǎn)生終止在獨(dú)特多聚a位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄物。在本發(fā)明中，本文描述的各種類(lèi)型變體也是靶核酸的實(shí)施方案。

靶核酸上反義化合物雜交的位置定義為活性反義化合物靶向的靶區(qū)域的至少5個(gè)核苷酸長(zhǎng)度部分。

雖然本文給出了某些示例性靶區(qū)段的具體序列，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到這些是作為舉例說(shuō)明和描述的本發(fā)明范圍內(nèi)的具體的實(shí)施方案。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本申請(qǐng)公開(kāi)內(nèi)容可容易地鑒定其它靶區(qū)段。

包含一段至少5個(gè)連續(xù)核苷酸的、選自舉例說(shuō)明性優(yōu)選靶區(qū)段的5-100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的靶區(qū)段被認(rèn)為是合適的靶。

靶區(qū)段可以包括dna或rna序列，其包含舉例說(shuō)明性的優(yōu)選靶區(qū)段之一的自5'末端的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸(余下的核苷酸是同一dna或rna的連續(xù)核苷酸段，從靶區(qū)段的5'末端上游開(kāi)始到dna或rna包含大約5個(gè)到大約100個(gè)核苷酸)。類(lèi)似的是，優(yōu)選的靶區(qū)段由dna或rna序列代表，其包含舉例說(shuō)明性的優(yōu)選靶區(qū)段之一的自3'末端的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸(余下的核苷酸是同一dna或rna的連續(xù)核苷酸段，從靶區(qū)段的3'末端下游開(kāi)始直到dna或rna包含大約5個(gè)到大約100個(gè)核苷酸)。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文舉例說(shuō)明的靶區(qū)段能鑒定(無(wú)需過(guò)度試驗(yàn))進(jìn)一步優(yōu)選的靶區(qū)段。

鑒定一個(gè)或多個(gè)靶區(qū)域、區(qū)段或位點(diǎn)后，選擇將與靶有足夠互補(bǔ)程度的反義化合物(即充分雜交和足夠特異性)，從而產(chǎn)生所需效果。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，寡核苷酸結(jié)合具體靶的反義鏈。寡核苷酸長(zhǎng)度為至少5個(gè)核苷酸，它們可以合成，這樣每個(gè)寡核苷酸靶向重疊序列，以便合成的多個(gè)寡核苷酸覆蓋靶多核苷酸的全長(zhǎng)。靶也包括編碼和非編碼區(qū)域。

在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選由反義寡核苷酸靶向具體的核酸。使反義化合物靶向具體核酸是多步驟過(guò)程。該過(guò)程通常開(kāi)始是鑒定需要調(diào)節(jié)其功能的核酸序列。這可以是例如其表達(dá)與具體病癥或疾病狀態(tài)相關(guān)的細(xì)胞基因(或該基因轉(zhuǎn)錄的mrna)，或者非編碼多核苷酸，例如非編碼rna(ncrna)。

rna可分類(lèi)成(1)翻譯為蛋白的信使rna(mrna)，和(2)非蛋白編碼rna(ncrna)。ncrna包含微小rna、反義轉(zhuǎn)錄物和包含高密度的終止密碼子和缺乏任何延展性"開(kāi)放閱讀框"的其它轉(zhuǎn)錄單位(tu)。許多ncrna看起來(lái)是從蛋白編碼基因座的3'非翻譯區(qū)域(3'utr)的起始位點(diǎn)開(kāi)始。ncrna通常罕見(jiàn)，fantom組織(thefantomconsortium)測(cè)序的至少半數(shù)的ncrna似乎沒(méi)有多腺苷酸化。大多數(shù)研究人員因?yàn)轱@而易見(jiàn)的原因集中研究加工多腺苷酸化mrna和輸送至細(xì)胞質(zhì)。最近表明非多腺苷酸化核rna的集合可能非常大，許多這種轉(zhuǎn)錄物源自所謂的基因間區(qū)域(cheng,j.等(2005)science308(5725),1149-1154；kapranov,p.等(2005).genomeres15(7),987-997)。ncrna可以調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制是通過(guò)與靶轉(zhuǎn)錄物的堿基配對(duì)。通過(guò)堿基配對(duì)起作用的rna可分組為(1)順式編碼rna：其在相同遺傳位點(diǎn)被編碼，但是它們作用于rna的相反鏈，因此展現(xiàn)出與它們的靶完美的互補(bǔ)性，和(2)反式編碼rna：它們?cè)谂c它們作用的rna不同的染色體位點(diǎn)上編碼，一般不具有與它們的靶完美的堿基配對(duì)潛力。

不希望被任何理論所束縛，通過(guò)本文描述的反義寡核苷酸干擾反義多核苷酸能改變相應(yīng)的有義mrna的表達(dá)。但是，這種調(diào)節(jié)可以是不協(xié)調(diào)的(反義敲低(knockdown)導(dǎo)致mrna升高)或協(xié)調(diào)的(反義敲低導(dǎo)致伴隨的mrna減少)。在這些情況下，反義寡核苷酸可靶向反義轉(zhuǎn)錄物的重疊或非重疊部分，導(dǎo)致其敲低或隔絕。編碼和非編碼反義序列能以相同的方式靶向，任一種類(lèi)都能以協(xié)調(diào)或不協(xié)調(diào)的方式調(diào)節(jié)對(duì)應(yīng)的有義轉(zhuǎn)錄物。用于鑒定對(duì)抗靶使用的新寡核苷酸的策略可以根據(jù)反義寡核苷酸敲低反義rna轉(zhuǎn)錄物或任何其它調(diào)節(jié)所需靶的方式。

策略1：在不協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)的情形下，敲低反義轉(zhuǎn)錄物增加常規(guī)(有義)基因的表達(dá)。如果后面的基因編碼已知或推定的藥物靶，那么敲低其反義對(duì)應(yīng)物能令人信服地模擬受體激動(dòng)劑或酶刺激劑的作用。

策略2：在協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)的情形下，人們可同時(shí)敲低反義和有義轉(zhuǎn)錄物，因此實(shí)現(xiàn)常規(guī)(有義)基因表達(dá)的協(xié)同減少。例如，如果反義寡核苷酸用于實(shí)現(xiàn)敲低，那么這種策略可用于使一個(gè)反義寡核苷酸靶向有義轉(zhuǎn)錄物，且另一個(gè)反義寡核苷酸靶向?qū)?yīng)的反義轉(zhuǎn)錄物，或者單一有力的對(duì)稱反義寡核苷酸同時(shí)靶向重疊的有義和反義轉(zhuǎn)錄物。

根據(jù)本發(fā)明，反義化合物包括雜交至靶核酸至少一部分并調(diào)節(jié)其功能的反義寡核苷酸、核酶、外部指導(dǎo)序列(egs)寡核苷酸、sirna化合物、單鏈或雙鏈rna干擾(rnai)化合物(例如sirna化合物)和其它寡聚化合物。因此，它們可以是dna、rna、dna樣、rna樣或它們的組合，或可以是這些中的一種或多種的模擬物。這些化合物可以是單鏈、雙鏈、環(huán)狀或發(fā)夾寡聚化合物，可以包含結(jié)構(gòu)元素(例如內(nèi)部或末端膨脹、錯(cuò)配或環(huán))。反義化合物可以按常規(guī)制備成為線性的，但是也可以結(jié)合或制備成環(huán)狀和/或分枝狀。反義化合物可以包括各種構(gòu)建體，例如兩條鏈雜交形成全部或部分雙鏈化合物或具有足夠自身互補(bǔ)性的單鏈雜交和形成全部或部分雙鏈的化合物。兩條鏈可以內(nèi)部連接而留下游離3'或5'末端，或可以連接而形成連續(xù)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)或環(huán)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以在5'或3'末端包含產(chǎn)生單鏈性狀延伸的突出端。雙鏈化合物任選在末端包含突出端。進(jìn)一步的修飾可以包括連接到一個(gè)末端、選定的核苷酸位置、糖位置或一個(gè)核苷間鍵合的綴合基團(tuán)?；蛘?，兩條鏈可以通過(guò)非核酸部分或連接基團(tuán)連接。當(dāng)僅由一條鏈形成時(shí)，dsrna可以形成自身對(duì)折形成雙鏈體的自身互補(bǔ)的發(fā)夾型分子。因此，dsrna可以是完整或部分的雙鏈?？赏ㄟ^(guò)在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)dsrna發(fā)夾實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的特異性調(diào)節(jié)，但是在一些實(shí)施方案中，基因表達(dá)或功能是上調(diào)的。當(dāng)由兩條鏈形成或自身互補(bǔ)單鏈對(duì)折形成雙鏈體的發(fā)夾型分子時(shí)，兩條鏈(或單鏈的雙鏈體形成區(qū)域)是華生-克里克形式堿基配對(duì)的互補(bǔ)rna鏈。

一旦導(dǎo)入系統(tǒng)，本發(fā)明的化合物可以引發(fā)一種或多種酶或結(jié)構(gòu)蛋白的作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶核酸的切割或其它修飾，或者可以通過(guò)占領(lǐng)型(occupancy-based)機(jī)制而發(fā)揮作用。通常，核酸(包括寡核苷酸)可以描述為"dna樣"(即一般具有一個(gè)或多個(gè)2'脫氧糖，和一般為t而非u堿基)或"rna樣"(即一般具有一個(gè)或多個(gè)2'羥基或2'修飾糖，和一般為u而非t堿基)。核酸螺旋可以采用不止一種結(jié)構(gòu)類(lèi)型，最常見(jiàn)的是a和b型。據(jù)信，一般具有b型樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸是"dna樣"的，而那些具有a型樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸則是"rna樣"的。在一些(嵌合)實(shí)施方案中，反義化合物可以包含a型和b型區(qū)域。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所需的寡核苷酸或反義化合物包含至少一種以下物質(zhì)：反義rna、反義dna、嵌合反義寡核苷酸、包含修飾鍵的反義寡核苷酸、干擾rna(rnai)、短干擾rna(sirna)、微小干擾rna(mirna)、小時(shí)序rna(strna)、或短發(fā)夾rna(shrna)、小rna誘導(dǎo)的基因激活(rnaa)、小激活rnas(sarnas)或它們的組合。

dsrna也可以激活基因表達(dá)，其是被稱為"小rna誘導(dǎo)的基因激活"或rnaa的機(jī)制。dsrna靶向基因啟動(dòng)子誘導(dǎo)相關(guān)基因有效的轉(zhuǎn)錄激活。rnaa利用合成dsrna已在人細(xì)胞得到了證實(shí)，稱為"小激活rnas"(sarna)。目前不知道rnaa是否在其它生物中保守存在。

小雙鏈rna(dsrna)，例如小干擾rna(sirna)和微小rna(mirna)，已被發(fā)現(xiàn)觸發(fā)進(jìn)化保守的稱為rna干擾(rnai)的機(jī)制。rnai通過(guò)重塑染色質(zhì)總是導(dǎo)致基因沉默，從而抑制轉(zhuǎn)錄、降解互補(bǔ)mrna或阻斷蛋白翻譯。但是，在隨后實(shí)施例部分詳細(xì)描述的情況中，顯示寡核苷酸增強(qiáng)腫瘤抑制基因多核苷酸和其編碼產(chǎn)物的表達(dá)和/或功能。dsrna也可以充當(dāng)小激活rna(sarna)的角色。不希望被理論所束縛，通過(guò)靶向基因啟動(dòng)子的序列，sarna誘導(dǎo)靶基因表達(dá)的現(xiàn)象稱為dsrna誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活(rnaa)。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本文鑒定的"優(yōu)選靶區(qū)段"可以用于篩選調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因多核苷酸表達(dá)的其它化合物。"調(diào)節(jié)劑"是降低或增加編碼腫瘤抑制基因的核酸分子的表達(dá)的那些化合物，其至少包含與優(yōu)選靶區(qū)段互補(bǔ)的5個(gè)核苷酸部分。篩選方法包括的步驟是：使編碼腫瘤抑制基因的有義或天然反義多核苷酸的核酸分子的優(yōu)選靶區(qū)段與一種或多種候選調(diào)節(jié)劑接觸，和選擇降低或增加編碼腫瘤抑制基因多核苷酸的核酸分子表達(dá)的一種或多種候選調(diào)節(jié)劑(例如seqidno:10-30)。一旦顯示候選調(diào)節(jié)劑或調(diào)節(jié)劑能調(diào)節(jié)(例如降低或增加)編碼腫瘤抑制基因多核苷酸的核酸分子的表達(dá)，則該調(diào)節(jié)劑可以進(jìn)一步用于研究腫瘤抑制基因多核苷酸的功能，或用作本發(fā)明的研究、診斷或治療制劑。

靶向天然反義序列優(yōu)選調(diào)節(jié)靶基因的功能，例如p73基因(ncbi注冊(cè)號(hào):nm_005427.2)、p53基因(ncbi注冊(cè)號(hào)：nm_000546.4)和pten基因(ncbi注冊(cè)號(hào)：nm_000314)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶是腫瘤抑制基因的反義多核苷酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，反義寡核苷酸靶向腫瘤抑制基因多核苷酸的有義和/或天然反義序列(p73：ncbi注冊(cè)號(hào)：nm_005427.2；p53：ncbi注冊(cè)號(hào)：nm_000546.4；pten：ncbi注冊(cè)號(hào)：nm_000314)、它們的變體、等位基因、同種型、同系物、突變體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。優(yōu)選寡核苷酸是反義分子，靶包括反義和/或有義腫瘤抑制基因多核苷酸的編碼和非編碼區(qū)域。

本發(fā)明優(yōu)選的靶區(qū)段也可以和本發(fā)明它們各自的互補(bǔ)反義化合物結(jié)合，從而形成穩(wěn)定的雙鏈(雙鏈體)寡核苷酸。

這種雙鏈寡核苷酸部分已經(jīng)在本領(lǐng)域顯示通過(guò)反義機(jī)制調(diào)節(jié)靶表達(dá)和調(diào)節(jié)翻譯以及rna剪接。另外，雙鏈部分可以進(jìn)行化學(xué)修飾(fire等,(1998)nature,391,806-811；timmonsandfire,(1998)nature,395,854；timmons等,(2001)gene,263,103-112；tabara等,(1998)science,282,430-431；montgomery等,(1998)proc.natl.acad.sci.usa,95,15502-15507；tuschl等,(1999)genesdev.,13,3191-3197；elbashir等,(2001)nature,411,494-498；elbashir等,(2001)genesdev.15,188-200)。例如，這種雙鏈部分已經(jīng)顯示通過(guò)雙鏈體反義鏈與靶的經(jīng)典雜交抑制靶，從而觸發(fā)靶的酶促降解(tijsterman等,(2002)science,295,694-697)。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，反義寡核苷酸靶向腫瘤抑制基因多核苷酸(p73：ncbi注冊(cè)號(hào)：nm_005427.2；p53：ncbi注冊(cè)號(hào)：nm_000546.4；pten：ncbi注冊(cè)號(hào)：nm_000314)和它們的變體、等位基因、同種型、同系物、突變體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。優(yōu)選寡核苷酸是反義分子。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，靶核酸分子并不僅限于腫瘤抑制基因，還擴(kuò)展至腫瘤抑制基因分子的任何同種型、受體、同系物等。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸靶向腫瘤抑制基因多核苷酸的天然反義序列，例如seqidno:4、5、6、6a、6b、7、8和9所示的多核苷酸，和它們的變體、等位基因、同系物、突變體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。反義寡核苷酸的實(shí)例例如seqidno:10-30。

在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸互補(bǔ)于或結(jié)合至腫瘤抑制基因反義的核酸序列，包括但不限于與腫瘤抑制基因多核苷酸有關(guān)的非編碼有義和/或反義序列，和調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因分子的表達(dá)和/或功能。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸互補(bǔ)于或結(jié)合腫瘤抑制基因天然反義的核酸序列(如seqidno:4、5、6、6a、6b、7、8和9所示)，并調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因分子的表達(dá)和/或功能。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸包含seqidno:10-30的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸的序列，和調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因分子的表達(dá)和/或功能。

多核苷酸靶包括腫瘤抑制基因(包含其家族成員)、腫瘤抑制基因的變體、腫瘤抑制基因的突變體(包含snp)、腫瘤抑制基因的非編碼序列、腫瘤抑制基因的等位基因、種變體、片段等。優(yōu)選寡核苷酸是反義分子。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸靶向腫瘤抑制基因多核苷酸，包括：反義rna、干擾rna(rnai)、短干擾rna(sirna)、微小干擾rna(mirna)、小時(shí)序rna(strna)、或短發(fā)夾rna(shrna)、小rna誘導(dǎo)基因激活(rnaa)或小激活rna(sarna)。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，打靶腫瘤抑制基因多核苷酸，例如seqidno:4、5、6、6a、6b、7、8和9，可以調(diào)節(jié)這些靶的表達(dá)或功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于對(duì)照表達(dá)或功能被上調(diào)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于對(duì)照表達(dá)或功能被下調(diào)。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，反義化合物包括seqidno:10-30的序列。這些寡核苷酸可包含一種或多種修飾的核苷酸、較短或較長(zhǎng)片段、修飾的鍵等。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，seqidno:10-30包含一種或多種lna核苷酸。

調(diào)節(jié)期望靶核酸可用本領(lǐng)域公知的幾種方式進(jìn)行。例如反義寡核苷酸、sirna等。酶促核酸分子(例如核酶)是能催化一種或多種反應(yīng)的核酸分子，包括以核苷酸堿基序列特異性方式的反復(fù)切割其它獨(dú)立核酸分子的能力。這種酶促核酸分子可用于，例如靶向幾乎任何rna轉(zhuǎn)錄物(zaug等,324,nature4291986；cech,260jama3030,1988；和jefferies等,17nucleicacidsresearch1371,1989)。

因?yàn)樗鼈兊男蛄刑禺愋?，反式切割酶促核酸分子顯示作為人疾病治療藥物的希望(usman&mcswiggen,(1995)ann.rep.med.chem.30,285-294；christoffersenandmarr,(1995)j.med.chem.38,2023-2037)?？蓪⒚复俸怂岱肿釉O(shè)計(jì)為在細(xì)胞rna的背景下切割具體rna靶。這種切割事件致使mrna無(wú)功能和廢除從rna的蛋白表達(dá)。以這種方式，可選擇性地抑制與疾病狀態(tài)相關(guān)的蛋白的合成。

總體上，具有rna切割活性的酶促核酸通過(guò)首先結(jié)合到靶rna起作用。這種結(jié)合通過(guò)酶促核酸的靶結(jié)合部分發(fā)生，該酶促核酸分子靶結(jié)合部分與作用為切割靶rna分子的酶促部分緊密相鄰。因此，酶促核酸首先通過(guò)互補(bǔ)性堿基配對(duì)識(shí)別并結(jié)合靶rna，一旦結(jié)合到正確的位點(diǎn)，就酶促切割靶rna。這種靶rna的關(guān)鍵性切割將破壞其直接合成編碼蛋白的能力。在酶促核酸結(jié)合和切割其rna靶后，酶促核酸從該rna釋放出來(lái)再尋找其它靶，重復(fù)結(jié)合并切割新靶。

幾種方法例如體外選擇(進(jìn)化)策略(orgel,(1979)proc.r.soc.london,b205,435)已被用于進(jìn)化新的能催化各種反應(yīng)(例如切割和連接磷酸二酯鍵和酰胺鍵)的核酸催化劑(joyce,(1989)gene,82,83-87；beaudry等,(1992)science257,635-641；joyce,(1992)scientificamerican267,90-97；breaker等,(1994)tibtech12,268；bartel等,(1993)science261:1411-1418；szostak,(1993)tibs17,89-93；kumar等,(1995)fasebj.,9,1183；breaker,(1996)curr.op.biotech.,7,442)。

開(kāi)發(fā)催化活性最佳的核酶將顯著有助于采用rna切割核酶從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)的任何策略。錘頭核酶例如在mg²⁺輔助因子的飽和濃度(10mm)存在下催化率(kcat)大約是1分鐘^-1。人工"rna連接酶"核酶顯示以比率大約是100分鐘^-1催化對(duì)應(yīng)的自修飾反應(yīng)。另外，已知某些修飾的具有由dna構(gòu)成的底物結(jié)合臂的錘頭核酶催化性rna切割，其具有接近100分鐘^-1的復(fù)式轉(zhuǎn)化率(multipleturn-overrate)。最后，用特定核苷酸類(lèi)似物置換錘頭內(nèi)催化核心的具體殘基產(chǎn)生催化率增加大約10倍的修飾的核酶。這些發(fā)現(xiàn)表明核酶可以催化率顯著大于絕大多數(shù)天然自切割核酶體外催化率促進(jìn)化學(xué)轉(zhuǎn)化。因此可以優(yōu)化某些自切割核酶的結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生最大催化活性，或可制備對(duì)rna磷酸二酯鍵的切割效率顯著更快的全新rna基序。

1987年首次證實(shí)了通過(guò)擬合"錘頭"模型的rna催化劑的rna底物的分子間切割(uhlenbeck,o.c.(1987)nature,328:596-600)?；厥誶na催化劑與多rna分子反應(yīng)，表明其真實(shí)的催化性。

通過(guò)改變催化性rna的合適的堿基而保持必需的與靶序列的堿基配對(duì)，根據(jù)"錘頭"基序設(shè)計(jì)的催化性rna已經(jīng)被用于切割具體靶序列(haseloffandgerlach,(1988)nature,334,585；walbotandbruening,(1988)nature,334,196；uhlenbeck,o.c.(1987)nature,328:596-600；koizumi,m.等,(1988)febslett.,228:228-230)。這允許利用催化性rna切割具體靶序列，表明根據(jù)"錘頭"模型設(shè)計(jì)的催化性rna可能可以體內(nèi)切割具體的底物rna(參見(jiàn)haseloffandgerlach,(1988)nature,334,585；walbotandbruening,(1988)nature,334,196；uhlenbeck,o.c.(1987)nature,328:596-600)。

rna干擾(rnai)已經(jīng)成為調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因表達(dá)的強(qiáng)有力工具。該方法需要利用表達(dá)質(zhì)?；虿《疽约凹庸こ蓅irna的小發(fā)夾rna的編碼序列遞送作為rna自身或作為dna的小干擾rna(sirna)。該系統(tǒng)能有效運(yùn)輸前sirna進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，在此它們有活性并允許利用用于基因表達(dá)的調(diào)節(jié)和組織特異性啟動(dòng)子。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸或反義化合物包括核糖核酸(rna)和/或脫氧核糖核酸(dna)寡聚體或多聚體，或它們的模擬物、嵌合體、類(lèi)似物或同系物。該術(shù)語(yǔ)包括由天然核苷酸、糖和共價(jià)核苷間(骨架)鍵合組成的寡核苷酸，以及具有類(lèi)似功能的、具有非天然部分的寡核苷酸。由于所需的特征(例如增高的細(xì)胞攝取、增高對(duì)靶核酸的親和力、增高在核酸酶存在下的穩(wěn)定性)常常需要相對(duì)于天然形式的這種修飾或置換的寡核苷酸。

根據(jù)本發(fā)明，寡核苷酸或"反義化合物"包括雜交至靶核酸的至少一部分并調(diào)節(jié)靶核酸功能的反義寡核苷酸(例如它們的rna、dna、模擬物、嵌合體、類(lèi)似物或同系物)、核酶、外部指導(dǎo)序列(egs)寡核苷酸、sirna化合物、單鏈或雙鏈rna干擾(rnai)化合物(例如sirna化合物、sarna、arna)和其它寡聚化合物。因此，它們可以是dna、rna、dna樣、rna樣、或它們的混合物，或可以是這些中一種或多種的模擬物。這些化合物可以是單鏈、雙鏈、環(huán)狀或發(fā)夾寡聚化合物，并可以包含結(jié)構(gòu)因素例如內(nèi)部或末端膨脹、錯(cuò)配或環(huán)。反義化合物可以按常規(guī)制備成為線性的，但是也可以結(jié)合或制備成環(huán)狀和/或分枝狀。反義化合物可以包括構(gòu)建體，例如兩條鏈雜交形成完整或部分雙鏈化合物或具有足夠自身互補(bǔ)性的單鏈允許雜交和形成完整或部分雙鏈的化合物。兩條鏈可以內(nèi)部連接而留下游離3'或5'末端，或可以連接而形成連續(xù)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)或環(huán)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以在5'或3'末端包含產(chǎn)生單鏈性狀延伸的突出端。雙鏈化合物任選在末端包含突出端。進(jìn)一步的修飾可以包含連接到一個(gè)末端、選定的核苷酸位置、糖位置或一個(gè)核苷間鍵合的綴合基團(tuán)?；蛘撸瑑蓷l鏈可以通過(guò)非核酸部分或連接基團(tuán)連接。當(dāng)僅由一條鏈形成時(shí)，dsrna可以形成自身對(duì)折形成雙鏈體的自身互補(bǔ)的發(fā)夾型分子。因此，dsrna可以是完整或部分的雙鏈?？赏ㄟ^(guò)在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)dsrna發(fā)夾實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的特異性調(diào)節(jié)(hammond等,(1991)nat.rev.genet.,2,110-119；matzke等,(2001)curr.opin.genet.dev.,11,221-227；sharp,(2001)genesdev.,15,485-490)。當(dāng)由兩條鏈形成或單鏈自身對(duì)折形成雙鏈體的自身互補(bǔ)的發(fā)夾型分子時(shí)，兩條鏈(或單鏈的雙鏈體形成區(qū)域)是華生-克里克形式堿基配對(duì)的互補(bǔ)rna鏈。

導(dǎo)入系統(tǒng)后，本發(fā)明的化合物可以引發(fā)一種或多種酶或結(jié)構(gòu)蛋白的作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶核酸的切割或其它修飾，或者可以通過(guò)占領(lǐng)型(occupancy-based)機(jī)制而發(fā)揮作用。通常，核酸(包括寡核苷酸)可以描述為"dna樣"(即一般具有一個(gè)或多個(gè)2'脫氧糖，和一般為t而非u堿基)或"rna樣"(即一般具有一個(gè)或多個(gè)2'羥基或2'修飾糖，和一般為u而非t堿基)。核酸螺旋可以采用不止一種結(jié)構(gòu)類(lèi)型，最常見(jiàn)的是a和b型。據(jù)信，一般具有b型樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸是"dna樣"的，而那些具有a型樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸則是"rna樣"的。在一些(嵌合)實(shí)施方案中，反義化合物可以包含a型和b型區(qū)域。

根據(jù)本發(fā)明，反義化合物可包含長(zhǎng)度大約5個(gè)到大約80個(gè)核苷酸的反義部分(即大約5個(gè)到大約80個(gè)連接的核苷)。這指的是反義化合物的反義鏈或部分的長(zhǎng)度。換句話說(shuō)，本發(fā)明的單鏈反義化合物包含5個(gè)到大約80個(gè)核苷酸，而本發(fā)明的雙鏈反義化合物(例如dsrna)包含長(zhǎng)度是5個(gè)到大約80個(gè)核苷酸的有義和反義鏈或部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解的是，這包含下列核苷酸長(zhǎng)度或其任何核苷酸長(zhǎng)度范圍的反義部分：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80個(gè)核苷酸。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義化合物具有核苷酸長(zhǎng)度是10個(gè)到50個(gè)的反義部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解的是，本發(fā)明寡核苷酸具有下列核苷酸長(zhǎng)度或其中任何核苷酸長(zhǎng)度范圍的反義部分：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸長(zhǎng)度是15個(gè)核苷酸。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義或寡核苷酸化合物具有核苷酸長(zhǎng)度是12個(gè)或13個(gè)到30個(gè)核苷酸的反義部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明的反義化合物具有下列核苷酸長(zhǎng)度或其中任何核苷酸長(zhǎng)度范圍的反義部分：12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)核苷酸。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物也包含變體，其中化合物內(nèi)一個(gè)或多個(gè)核苷酸位置上存在不同的堿基。例如，如果第一個(gè)核苷酸是腺苷，則可產(chǎn)生在此位置包含胸苷、鳥(niǎo)苷或胞苷的變體。這種變化可以在反義或dsrna化合物的任何位置進(jìn)行。然后通過(guò)本文描述的方法測(cè)試這些化合物，進(jìn)而確定它們抑制靶核酸表達(dá)的能力。

在一些實(shí)施方案中，反義化合物和靶之間的同源性、序列同一性或互補(bǔ)性是大約40％到大約60％。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性是大約60％到大約70％。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性是大約70％到大約80％。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性是大約80％到大約90％。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性是大約90％、大約92％、大約94％、大約95％、大約96％、大約97％、大約98％、大約99％或大約100％。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，反義寡核苷酸(例如seqidno:10-30所示的核酸分子)包含一種或多種置換或修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸被鎖定核酸(lna)置換。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸靶向與腫瘤抑制基因相關(guān)的編碼和/或非編碼序列的核酸分子有義和/或反義的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域，所述寡核苷酸序列示于seqidno:1、1a、1b、2、2a、2b、3、3a、4、5、6、6a、6b、7、8和9。寡核苷酸也靶向seqidno:1、1a、1b、2、2a、2b、3、3a、4、5、6、6a、6b、7、8和9的重疊區(qū)域。

本發(fā)明某些優(yōu)選的寡核苷酸是嵌合寡核苷酸。本發(fā)明中，"嵌合寡核苷酸"或"嵌合體"是包含兩個(gè)或更多個(gè)化學(xué)上不同的區(qū)域的寡核苷酸，每個(gè)區(qū)域至少由一種核苷酸構(gòu)成。這些寡核苷酸通常包含至少一個(gè)賦予一種或更多有益特征(例如增加的核酸酶抗性、增加攝取入細(xì)胞、增加對(duì)靶的結(jié)合親和力)的修飾核苷酸的區(qū)域，和能切割rna:dna或rna:rna雜交體的酶的底物的區(qū)域。舉例來(lái)說(shuō)，rna酶h是切割rna:dna雙鏈體的rna鏈的細(xì)胞內(nèi)切核酸酶。激活rna酶h因此導(dǎo)致切割rna靶，從而極大增加基因表達(dá)反義調(diào)節(jié)的效率。因此，與雜交至相同靶區(qū)域的硫代磷酸脫氧寡核苷酸相比，用嵌合寡核苷酸時(shí)，用較短的寡核苷酸常?？梢缘玫较喈?dāng)?shù)慕Y(jié)果。rna靶的切割可由凝膠電泳和必要時(shí)聯(lián)合本領(lǐng)域公知的相關(guān)核酸雜交方法常規(guī)進(jìn)行檢測(cè)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，嵌合寡核苷酸包含至少一個(gè)修飾的增加靶結(jié)合親和力的區(qū)域和通常作為rna酶h底物的區(qū)域。寡核苷酸與其靶的親和力(在這種情況下為編碼ras的核酸)由檢測(cè)寡核苷酸/靶配對(duì)的tm常規(guī)決定，tm是寡核苷酸和靶解離時(shí)的溫度。解離由分光光度計(jì)檢測(cè)。tm越高，寡核苷酸與靶的親和力越大。

本發(fā)明的嵌合反義化合物可由上述兩種或更多種寡核苷酸、修飾的寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸模擬物形成復(fù)合結(jié)構(gòu)。這種化合物在本領(lǐng)域被稱為雜合物或雜合體或gapmer。教導(dǎo)制備這種雜合物結(jié)構(gòu)的代表性美國(guó)專利包括但不限于美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)5,013,830、5,149,797、5,220,007、5,256,775、5,366,878、5,403,711、5,491,133、5,565,350、5,623,065、5,652,355、5,652,356和5,700,922，上述每一個(gè)都通過(guò)引用結(jié)合到本申請(qǐng)中。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，修飾的寡核苷酸區(qū)域包含至少一個(gè)在糖的2'位置修飾的核苷酸，最優(yōu)選2'-o烷基、2'-o-烷基-o-烷基或2'-氟代修飾的核苷酸。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，rna修飾包括在嘧啶的核糖上的2'-氟代、2'-氨基和2'o-甲基，脫堿基殘基，或在rna3'末端的或倒置堿基。這樣的修飾常規(guī)摻入寡核苷酸中，這些寡核苷酸已經(jīng)顯示出比2'-脫氧寡核苷酸對(duì)給定靶具有更高的tm(即更高的靶結(jié)合親和力)。這種增加的親和力效果極大地增強(qiáng)了rnai寡核苷酸對(duì)基因表達(dá)的抑制。rna酶h是切割rna:dna雙鏈體rna鏈的細(xì)胞內(nèi)切核酸酶。激活該酶從而導(dǎo)致rna靶的切割，并因此能極大地增加rnai抑制的效率。rna靶的切割常規(guī)可由凝膠電泳證實(shí)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，嵌合寡核苷酸也被修飾以提高核酸酶抗性。細(xì)胞包含各種可以降解核酸的外切和內(nèi)切核酸酶。已經(jīng)證實(shí)其中摻入了一定量修飾的核苷酸和核苷的寡核苷酸比天然寡脫氧核苷酸對(duì)核酸酶消化具有更大的抗性。核酸酶抗性通常如下檢測(cè)：通過(guò)溫育寡核苷酸與細(xì)胞提取物或分離的核酸酶溶液，然后通常由凝膠電泳檢測(cè)隨時(shí)間變化完整寡核苷酸的保持量。已被修飾提高了其核酸酶抗性的寡核苷酸比未修飾的寡核苷酸完整存在更長(zhǎng)的時(shí)間。已經(jīng)證明各種寡核苷酸修飾增加或賦予核酸酶抗性。目前更優(yōu)選包含至少一種硫代磷酸酯修飾的寡核苷酸。在一些情況下，提高靶結(jié)合親和力的寡核苷酸修飾也能獨(dú)立地增強(qiáng)核酸酶抗性。一些所需的修飾可參見(jiàn)demesmaeker等(1995)acc.chem.res.,28:366-374。

本發(fā)明設(shè)想的一些優(yōu)選寡核苷酸的具體實(shí)例包括那些包含修飾的骨架的寡核苷酸，例如硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短鏈烷基或環(huán)烷基糖間鍵合或短鏈雜原子或雜環(huán)糖間鍵合。最優(yōu)選有硫代磷酸骨架的寡核苷酸和那些有雜原子骨架的寡核苷酸，特別是ch2--nh--o--ch2、ch,--n(ch3)--o--ch2[稱為亞甲基(甲基亞氨基)或mmi骨架]、ch2--o--n(ch3)--ch2、ch2–n(ch3)--n(ch3)--ch2和o--n(ch3)--ch2--ch2骨架，其中天然磷酸二酯鍵骨架表示為o--p--o--ch)。也優(yōu)選demesmaeker等(1995)acc.chem.res.28:366-374所公開(kāi)的酰胺骨架。還優(yōu)選具有嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)的寡核苷酸(summertonandweller,美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)5,034,506)。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，例如肽核酸(pna)骨架，寡核苷酸的磷酸二酯鍵骨架被聚酰胺骨架取代，核苷酸直接或間接地結(jié)合于聚酰胺骨架上的氮雜氮原子(nielsen等(1991)science254,1497)。寡核苷酸也可以包含一種或多種取代的糖部分。優(yōu)選的寡核苷酸在2'位置包含一種下列基團(tuán)：oh、sh、sch3、f、ocn、och3och3、och3o(ch2)nch3、o(ch2)nnh2或o(ch2)nch3(其中n是從1到大約10)；c1-c10低級(jí)烷基、烷氧基烷氧基、取代的低級(jí)烷基、烷芳基或芳烷基；cl；br；cn；cf3；ocf3；o--、s--或n-烷基；o--、s--或n-烯基；soch3；so2ch3；ono2；no2；n3；nh2；雜環(huán)烷基；雜環(huán)烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；取代的甲硅烷基；rna切割基團(tuán)；腫瘤抑制基因報(bào)告基團(tuán)(rtumorsuppressorgenertergroup)、嵌入劑；增加寡核苷酸藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征的基團(tuán)；或增加寡核苷酸藥效學(xué)特征的基團(tuán)和其它具有類(lèi)似特征的取代基。優(yōu)選的修飾包括2'-甲氧乙氧基[2'-o-ch2ch2och3，也稱為2'-o-(2-甲氧乙基)](martin等,(1995)helv.chim.acta,78,486)。其它優(yōu)選的修飾包括2'-甲氧基(2'-o--ch3)、2'-丙氧基(2'-och2ch2ch3)和2'-氟代(2'-f)。類(lèi)似的修飾也可以在寡核苷酸的其它位置上進(jìn)行，特別是在3'末端核苷酸上糖的3'位置和5'末端核苷酸上的5'位置。寡核苷酸也可以有糖模擬物，例如環(huán)丁基替代戊呋喃糖(pentofuranosyl)基團(tuán)。

寡核苷酸也可另外或選擇性地包括核酸堿基(本領(lǐng)域經(jīng)常簡(jiǎn)稱為"堿基")修飾或取代。本文所用的"未修飾(的)"或"天然(的)"核苷酸包括腺嘌呤(a)、鳥(niǎo)嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u)。修飾的核苷酸包括在天然核酸中不常或暫時(shí)發(fā)現(xiàn)的核苷酸，例如次黃嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-甲基嘧啶，特別是5-甲基胞嘧啶(也稱為5-甲基-2'脫氧胞嘧啶，在本領(lǐng)域中常稱為5-me-c)、5-羥甲基胞嘧啶(hmc)、糖基hmc和龍膽二糖基(gentobiosyl)hmc；和合成核苷酸例如2-氨基腺嘌呤、2-(甲氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、2-(氨基烷基氨基)腺嘌呤或其它雜取代的烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羥甲基尿嘧啶、8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤、7-脫氮鳥(niǎo)嘌呤、n6(6-氨基己基)腺嘌呤和2,6-二氨基嘌呤(kornberg,a.,dnareplication,w.h.freeman&co.,sanfrancisco,1980,pp75-77；gebeyehu,g.,(1987)等nucl.acidsres.15:4513)?？砂ū绢I(lǐng)域公知的"通用"堿基，例如肌苷。已經(jīng)證實(shí)5-me-c取代增加核酸雙鏈體的穩(wěn)定性0.6-1.2℃(sanghvi,y.s.,incrooke,s.t.andlebleu,b.主編,antisenseresearchandapplications,crcpress,bocaraton,1993,pp.276-278)，并且是目前優(yōu)選的堿基取代。

本發(fā)明寡核苷酸的另一修飾包括化學(xué)連接一種或多種提高寡核苷酸活性或者細(xì)胞攝取的部分或綴合物到所述寡核苷酸。這類(lèi)部分包括但不限于脂部分例如膽固醇部分、膽甾烯基部分(letsinger等,(1989)proc.natl.acad.sci.usa86,6553)、膽酸(manoharan等(1994)bioorg.med.chem.let.4,1053)、硫醚例如己基-s-三苯甲硫醇(manoharan等(1992)ann.n.y.acad.sci.660,306；manoharan等(1993)bioorg.med.chem.let.3,2765)、硫代膽固醇(oberhauser等,(1992)nucl.acidsres.20,533)、脂肪族鏈例如十二烷雙醇或十一烷基殘基(saison-behmoaras等emboj.1991,10,111；kabanov等(1990)febslett.259,327；svinarchuk等(1993)biochimie75,49)、磷脂例如二-十六烷基-rac-甘油或三乙基銨1,2-二-o-十六烷基-rac-甘油基-3-h-膦酸酯(manoharan等(1995)tetrahedronlett.36,3651；shea等(1990)nucl.acidsres.18,3777)、多胺或聚乙二醇鏈(manoharan等(1995)nucleosides&nucleotides,14,969)或金剛烷乙酸(manoharan等(1995)tetrahedronlett.36,3651)。本領(lǐng)域公知包含親脂部分的寡核苷酸和制備這類(lèi)寡核苷酸的方法，例如美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)5,138,045、5,218,105和5,459,255。

對(duì)給定寡核苷酸的所有位點(diǎn)進(jìn)行一致的修飾是不必要的，實(shí)際上可以將上述修飾中2種以上修改摻入單一寡核苷酸內(nèi)甚至寡核苷酸的單一核苷內(nèi)。本發(fā)明也包括如上定義的嵌合寡核苷酸的寡核苷酸。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子綴合了另一部分，其包括但不限于脫堿基核苷酸、聚醚、多胺、聚酰胺、肽、糖、脂或聚烴化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，可將這些分子連接到一個(gè)或多個(gè)構(gòu)成所述核酸分子的任何核苷酸的糖、堿基或磷酸基團(tuán)上的若干位點(diǎn)上。

根據(jù)本發(fā)明所用的寡核苷酸可以通過(guò)公知的固相合成技術(shù)方便地常規(guī)制備。若干公司包括appliedbiosystems出售這種合成設(shè)備。也可采用這類(lèi)合成的任何其它方法。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知寡核苷酸的實(shí)際合成。還已知利用相似方法制備其它寡核苷酸例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。同樣已知利用類(lèi)似的方法和商業(yè)有售的修飾的amidites和孔徑控制的玻璃(cpg)產(chǎn)物例如生物素、熒光素、吖啶或補(bǔ)骨脂素修飾的amidites和/或cpg(glenresearch，sterlingva有售)合成熒光標(biāo)記的、生物素化的或其它修飾的寡核苷酸，例如膽固醇修飾的寡核苷酸。

根據(jù)本發(fā)明，利用修飾(例如利用lna單體增高作用的潛能、特異性和持續(xù)時(shí)間以及擴(kuò)大寡核苷酸的給藥途徑)包括當(dāng)前的化學(xué)物例如moe、ana、fana、ps等(uhlman，等(2000)currentopinionsindrugdiscovery&developmentvol.3no2)。這可通過(guò)用lna單體置換當(dāng)前寡核苷酸中的某些單體實(shí)現(xiàn)。lna修飾的寡核苷酸的大小與母體化合物相似或大一些或優(yōu)選小一些。優(yōu)選這種lna修飾的寡核苷酸包含小于大約70％、更優(yōu)選小于大約60％，最優(yōu)選小于大約50％的lna單體，并且它們的大小在大約5-25個(gè)核苷酸之間，優(yōu)選在大約12-20個(gè)核苷酸之間。

優(yōu)選修飾的寡核苷酸骨架包括但不限于硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包括3'亞烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、包含3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯的氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯和包含正常3'-5'鍵合的磷酸硼酯、這些中的2'-5'連接類(lèi)似物、和那些包含倒置極性寡核苷酸骨架，其中相鄰核苷單位對(duì)由3'-5'到5'-3'或2'-5'到5'-2'連接。也包括各種鹽、混合鹽和游離酸形式。

教導(dǎo)制備上述含磷鍵合的代表性美國(guó)專利包括但不限于美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361和5,625,050，上述每一個(gè)都通過(guò)引用結(jié)合到本申請(qǐng)中。

優(yōu)選其中不包含磷原子的修飾寡核苷酸骨架具有由以下部分形成的骨架：短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間鍵合、混合雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間鍵合、或一種或多種短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間鍵合。這些包括那些具有嗎啉代鍵合(部分由核苷的糖部分形成)的骨架、硅氧烷骨架、(硫化物、亞砜和砜)骨架、甲乙?；?formacetyl)和硫代甲乙?；?thioformacetyl)骨架、亞甲基甲乙?；土虼滓阴；羌?、含烯骨架、氨基磺酸酯骨架、亞甲基亞氨基和亞甲基肼基骨架、磺酸酯和磺酰胺骨架、酰胺骨架和其它具有混合n、o、s和ch2組分部分的骨架。

教導(dǎo)制備上述寡核苷的代表性美國(guó)專利包括但不限于美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,264,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,610,289、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437和5,677,439，上述每一個(gè)都通過(guò)引用結(jié)合到本申請(qǐng)中。

在其它優(yōu)選的寡核苷酸模擬物中，核苷酸單位的糖和核苷間鍵合(即骨架)被新穎基團(tuán)取代。堿基單位被保留用于與合適的核酸靶化合物雜交。一種這樣的寡聚化合物即顯示具有優(yōu)秀的雜交特性的寡核苷酸模擬物被稱為肽核酸(pna)。在pna化合物中，寡核苷酸的糖骨架被含酰胺的骨架取代，尤其是氨基乙基甘氨酸骨架。核酸堿基被保留，并且其直接或間接地結(jié)合到骨架酰胺部分的氮雜氮原子。教導(dǎo)制備pna化合物的代表性美國(guó)專利包括但不限于美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)5,539,082、5,714,331和5,719,262，其中每一個(gè)都通過(guò)引用結(jié)合到本申請(qǐng)中。pna化合物進(jìn)一步的教導(dǎo)可參見(jiàn)nielsen等(1991)science254,1497-1500。

在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸具有硫代磷酸酯骨架和寡核苷具有雜原子骨架，尤其是ch2-nh-o-ch2-、稱為亞甲基(甲基亞氨基)或mmi骨架的-ch2-n(ch3)-o-ch2-、-ch2-o-n(ch3)-ch2-、-ch2n(ch3)-n(ch3)ch2-和-o-n(ch3)-ch2-ch2-，其中天然磷酸二酯骨架表示為-o-p-o-ch2-，參見(jiàn)上面提及的美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)5,489,677，以及酰胺骨架，參見(jiàn)上面提及的美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)5,602,240。還優(yōu)選上面提及的美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)5,034,506的具有嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。

修飾的寡核苷酸也可以包括一種或多種取代的糖部分。優(yōu)選寡核苷酸的2'位置包含以下基團(tuán)中的一種：oh；f；o-、s-、或n-烷基；o-、s-、或n-烯基；o-、s-或n-炔基；或o烷基-o-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的c到co烷基或c2到co烯基和炔基。尤其優(yōu)選的是o(ch2)nomch3、o(ch2)n、och3、o(ch2)nnh2、o(ch2)nch3、o(ch2)nonh2和o(ch2non(ch2)nch3)2，其中n和m可以是1到大約10。其它優(yōu)選的寡核苷酸在2'位置包含以下基團(tuán)中的一種：c到co、低級(jí)烷基、取代的低級(jí)烷基、烷芳基、芳烷基、o-烷芳基或o-芳烷基、sh、sch3、ocn、cl、br、cn、cf3、ocf3、soch3、so2ch3、ono2、no2、n3、nh2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、rna切割基團(tuán)、腫瘤抑制基因報(bào)告基團(tuán)、嵌入劑、增加寡核苷酸藥代動(dòng)力學(xué)特征的基團(tuán)或增加寡核苷酸藥效學(xué)特征的基團(tuán)和其它具有相似特性的取代基。優(yōu)選的修飾包括2'-甲氧乙氧基(2'-o-ch2ch2och3，也稱為2'-o-(2-甲氧乙基)或2'-moe)(martin等,(1995)helv.chim.acta,78,486-504)，即烷氧基烷氧基基團(tuán)。進(jìn)一步優(yōu)選的修飾包括描述于以下實(shí)施例的2'-二甲基氨基氧乙氧基，即o(ch2)2on(ch3)2基團(tuán)，也稱為2'-dmaoe，和2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基(本領(lǐng)域也稱為2'-o-二甲基氨基乙氧基乙基或2'-dmaeoe)，即2'-o-ch2-o-ch2-n(ch2)2。

其它優(yōu)選的修飾包括2'-甲氧基(2'-och3)、2'-氨基丙氧基(2'-och2ch2ch2nh2)和2’-氟代(2'-f)。在寡核苷酸的其它位置也可進(jìn)行類(lèi)似的修飾，尤其在3'末端核苷酸或2'-5'連接的寡核苷酸的糖的3'位置和5'末端核苷酸的5'位置。寡核苷酸也可以具有糖模擬物例如環(huán)丁基部分取代戊呋喃糖基糖。教導(dǎo)制備這種修飾的糖結(jié)構(gòu)的美國(guó)專利包括但不限于4,981,957、5,118,800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5,591,722、5,597,909、5,610,300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5,658,873、5,670,633和5,700,920，上述每一個(gè)專利都通過(guò)引用結(jié)合到本申請(qǐng)中。

寡核苷酸也可以包括核酸堿基(本領(lǐng)域經(jīng)常簡(jiǎn)稱為"堿基")修飾或取代。本文所用的"未修飾(的)"或"天然(的)"核苷酸包含嘌呤堿基腺嘌呤(a)和鳥(niǎo)嘌呤(g)，和嘧啶堿基胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u)。修飾的核苷酸包括其它合成和天然核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-c)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-鹵素尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-氮雜尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-鹵素、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基和其它8-取代的腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤、5-鹵素尤其是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基奎寧和7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮鳥(niǎo)嘌呤和7-脫氮腺嘌呤以及3-脫氮鳥(niǎo)嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。

另外，核苷酸包括那些公開(kāi)于美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)3,687,808、公開(kāi)于'theconciseencyclopediaofpolymerscienceandengineering'，858-859頁(yè)，kroschwitz,j.i.,主編johnwiley&sons,1990、公開(kāi)于englisch等,'angewandlechemie,internationaledition',1991,30,613頁(yè)和公開(kāi)于sanghvi,y.s.,chapter15,'antisenseresearchandapplications',289-302頁(yè)，crooke,s.t.andlebleu,b.ea.,crcpress,1993中的核苷酸。這些核苷酸中的某些對(duì)增加本發(fā)明的寡聚化合物的結(jié)合親和力特別有用。這些核苷酸包括5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶和n-2、n-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代顯示增加0.6-1.2℃的核酸雙鏈體穩(wěn)定性(sanghvi,y.s.,crooke,s.t.andlebleu,b.主編'antisenseresearchandapplications',crcpress,bocaraton,1993,pp.276-278)，并且為目前優(yōu)選的堿基取代，在結(jié)合2'-o甲氧乙基糖修飾時(shí)甚至更優(yōu)選。

教導(dǎo)制備上述的修飾核苷酸和其它修飾的核苷酸的代表性美國(guó)專利包括但不限于美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)3,687,808和4,845,205、5,130,302、5,134,066、5,175,273、5,367,066、5,432,272、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,596,091、5,614,617、5,750,692和5,681,941，上述每一個(gè)專利都通過(guò)引用結(jié)合到本申請(qǐng)中。

本發(fā)明寡核苷酸的另一種修飾包括化學(xué)連接一種或多種部分或綴合物到寡核苷酸，所述部分或綴合物增加寡核苷酸的活性、細(xì)胞分布或細(xì)胞攝取。

這類(lèi)部分包括但不限于脂部分，例如膽固醇部分(letsinger等,(1989)proc.natl.acad.sci.usa86,6553-6556)、膽酸(manoharan等,(1994)bioorg.med.chem.let.4,1053-1060)、硫醚例如己基-s-三苯甲硫醇(manoharan等,(1992)ann.n.y.acad.sci.660,306-309；manoharan等,(1993)bioorg.med.chem.let.3,2765-2770)、硫代膽固醇(oberhauser等,(1992)nucl.acidsres.,20,533-538)、脂肪族鏈例如十二烷雙醇或十一烷基殘基(kabanov等,(1990)febslett.,259,327-330；svinarchuk等(1993)biochimie75,49-54)、磷脂例如二-十六烷基-rac-甘油或三乙基銨1,2-二-o-十六烷基-rac-甘油基-3-h-磷酸酯(manoharan等,(1995)tetrahedronlett.,36,3651-3654；shea等,(1990)nucl.acidsres.,18,3777-3783)、多胺或聚乙二醇鏈(manoharan等,(1995)nucleosides&nucleotides,14,969-973)或金剛烷乙酸(manoharan等,(1995)tetrahedronlett.,36,3651-3654)、棕櫚基部分(mishra等,(1995)biochim.biophys.acta,1264,229-237)、或十八胺或己基氨基-羰基-t羥膽固醇部分(crooke等,(1996)j.pharmacol.exp.ther.,277,923-937)。

教導(dǎo)制備這類(lèi)寡核苷酸綴合物的代表性美國(guó)專利包括但不限于美國(guó)專利號(hào)4,828,979、4,948,882、5,218,105、5,525,465、5,541,313、5,545,730、5,552,538、5,578,717,5,580,731、5,580,731、5,591,584、5,109,124、5,118,802、5,138,045、5,414,077、5,486,603、5,512,439、5,578,718、5,608,046、4,587,044、4,605,735、4,667,025、4,762,779、4,789,737、4,824,941、4,835,263、4,876,335、4,904,582、4,958,013、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,245,022、5,254,469、5,258,506、5,262,536、5,272,250、5,292,873、5,317,098、5,371,241、5,391,723、5,416,203、5,451,463、5,510,475、5,512,667、5,514,785、5,565,552、5,567,810、5,574,142、5,585,481、5,587,371、5,595,726、5,597,696、5,599,923、5,599,928和5,688,941，上述每一個(gè)專利文獻(xiàn)都通過(guò)引用結(jié)合到本申請(qǐng)中。

藥物發(fā)現(xiàn)：本發(fā)明的化合物也可用于藥物發(fā)現(xiàn)和靶確認(rèn)的領(lǐng)域。本發(fā)明包括在藥物發(fā)現(xiàn)工作中使用本文鑒定的化合物和優(yōu)選靶區(qū)段，進(jìn)而闡明存在于腫瘤抑制基因多核苷酸和疾病狀態(tài)、表型或癥狀之間的關(guān)系。這些方法包括檢測(cè)或調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因多核苷酸，包括使樣品、組織、細(xì)胞或生物接觸本發(fā)明的化合物；檢測(cè)處理后某時(shí)間時(shí)的腫瘤抑制基因多核苷酸的核酸或蛋白水平和/或相關(guān)表型或化學(xué)終點(diǎn)；以及任選比較未處理樣品或用本發(fā)明進(jìn)一步的化合物處理的樣品的檢測(cè)值。這些方法也可以平行進(jìn)行或與其它試驗(yàn)組合進(jìn)行，從而確定標(biāo)靶確認(rèn)過(guò)程中的未知基因的功能或者確定具體基因產(chǎn)物作為治療或預(yù)防具體疾病、癥狀或表型的標(biāo)靶的有效性。

評(píng)價(jià)基因表達(dá)的上調(diào)或抑制：

傳送外源核酸進(jìn)入宿主細(xì)胞或生物體可以直接通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞或生物體中該核酸的存在來(lái)評(píng)價(jià)。這種檢測(cè)可用本領(lǐng)域已知的幾種方法實(shí)現(xiàn)。例如，例如外源核酸的存在可用dna印跡法(southernblot)或用特異性擴(kuò)增與核酸相關(guān)的核苷酸序列的引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)方法檢測(cè)。外源核酸的表達(dá)也可以利用包括基因表達(dá)分析的常規(guī)方法來(lái)檢測(cè)。例如，從外源核酸產(chǎn)生的mrna的檢測(cè)和定量可以通過(guò)rna印跡法和反轉(zhuǎn)錄pcr(rt-pcr)。

外源核酸的表達(dá)rna也可以通過(guò)檢測(cè)酶活性或報(bào)道蛋白活性來(lái)檢測(cè)。例如，反義調(diào)節(jié)活性可間接地通過(guò)靶核酸表達(dá)的減少或增加來(lái)檢測(cè)，說(shuō)明外源核酸在產(chǎn)生效應(yīng)子rna。根據(jù)序列保守性，可設(shè)計(jì)引物并用于擴(kuò)增靶基因的編碼區(qū)域。最初，每個(gè)基因的最高表達(dá)的編碼區(qū)可用來(lái)建立模型對(duì)照基因，但也可以使用任何編碼或非編碼區(qū)。通過(guò)在報(bào)告編碼區(qū)和其多聚(a)信號(hào)之間插入各個(gè)編碼區(qū)裝配每個(gè)對(duì)照基因。這些質(zhì)粒將產(chǎn)生在該基因的上游部分具有腫瘤抑制基因報(bào)告基因(artumorsuppressorgenertergene)和在3'非編碼區(qū)具有潛在rnai靶的mrna。通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因報(bào)告基因分析單個(gè)反義寡核苷酸的有效性。在本發(fā)明方法中有用的腫瘤抑制基因報(bào)告基因包括乙酰羥酸合酶(ahas)、堿性磷酸酶(ap)、β半乳糖苷酶(lacz)、β-葡萄糖醛酸苷酶(gus)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(cat)、綠色熒光蛋白(gfp)、紅色熒光蛋白(rfp)、黃色熒光蛋白(yfp)、青色熒光蛋白(cfp)、辣根過(guò)氧化物酶(hrp)、螢光素酶(luc)、胭脂氨酸合成酶(nos)、章魚(yú)堿合酶(ocs)和它們的衍生物。已有多種賦予抗以下抗生素的選擇性標(biāo)記：氨芐青霉素、博來(lái)霉素、氯霉素、慶大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、氨甲喋呤、膦絲菌素、嘌呤霉素和四環(huán)素。本領(lǐng)域公知測(cè)定腫瘤抑制基因報(bào)告基因的調(diào)節(jié)的方法，包括但不限于使用熒光計(jì)的方法(例如熒光光譜、熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(facs)、熒光顯微鏡術(shù))、抗生素抗性測(cè)定。

試劑盒、研究試劑、診斷和治療

本發(fā)明的化合物可以用于診斷、治療和預(yù)防，以及作為研究試劑和試劑盒組分。另外，可以極好的特異性抑制基因表達(dá)的反義寡核苷酸經(jīng)常被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員用于闡明具體基因的功能或區(qū)分生物通路中不同成員之間的功能。

對(duì)于用于試劑盒和診斷以及各種生物系統(tǒng)，單獨(dú)或聯(lián)合其它化合物或治療劑的本發(fā)明的化合物是有用的工具，其用于差別和/或組合分析中闡明在細(xì)胞或組織內(nèi)表達(dá)基因的一部分或全部的表達(dá)模式。

本文所用的術(shù)語(yǔ)"生物系統(tǒng)"或"系統(tǒng)"定義為表達(dá)或被賦予能力表達(dá)腫瘤抑制基因產(chǎn)物的任何生物體、細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或組織。這些包括但不限于人、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織、異種移植物、移植物和它們的組合。

作為一個(gè)非限制性的實(shí)例，比較用一種或多種反義化合物處理的細(xì)胞或組織和未用反義化合物處理的對(duì)照細(xì)胞或組織的表達(dá)模式，所產(chǎn)生的模式用于分析基因表達(dá)的差別水平，因?yàn)樗鼈兩婕八鶛z測(cè)基因的例如疾病關(guān)聯(lián)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞定位、表達(dá)水平、大小、結(jié)構(gòu)或功能。這些分析可以在刺激或未刺激細(xì)胞和影響表達(dá)模式的其它化合物存在或不存在情況下進(jìn)行。

本領(lǐng)域公知的基因表達(dá)分析方法實(shí)例包括dna陣列或微陣列(brazmaandvilo,(2000)febslett.,480,17-24；celis等,(2000)febslett.,480,2-16)、sage(基因表達(dá)系列分析)(madden等,(2000)drugdiscov.today,5,415-425)、reads(消化cdna的限制性酶擴(kuò)增)(prasharandweissman,(1999)methodsenzymol.,303,258-72)、toga(全基因表達(dá)分析)(sutcliffe等,(2000)proc.natl.acad.sci.u.s.a.,97,1976-81)、蛋白質(zhì)陣列和蛋白組學(xué)(celis等,(2000)febslett.,480,2-16；jungblut等,electrophoresis,1999,20,2100-10)、表達(dá)性序列標(biāo)簽(est)測(cè)序(celis等,febslett.,2000,480,2-16；larsson等,j.biotechnol.,2000,80,143-57)、消減式rna指紋法(surf)(fuchs等,(2000)anal.biochem.286,91-98；larson等,(2000)cytometry41,203-208)、消減克隆、差異展示(dd)(jurecicandbelmont,(2000)curr.opin.microbiol.3,316-21)、比較基因組雜交(carulli等,(1998)j.cellbiochem.suppl.,31,286-96)、fish(熒光原位雜交)法(goingandgusterson,(1999)eur.j.cancer,35,1895-904)和質(zhì)譜分析法(to,comb.(2000)chem.highthroughputscreen,3,235-41)。

本發(fā)明的化合物對(duì)于研究和診斷有用，因?yàn)檫@些化合物雜交至編碼腫瘤抑制基因的核酸。例如，以本文公開(kāi)的這種效率和這種條件下雜交的作為有效的腫瘤抑制基因調(diào)節(jié)劑的寡核苷酸，分別是在基因擴(kuò)增或檢測(cè)有利條件下的有效引物或探針。這些引物和探針可用于需要特異性檢測(cè)編碼腫瘤抑制基因的核酸分子的方法，以及可用于擴(kuò)增所述核酸分子以用于進(jìn)行檢測(cè)或者用于腫瘤抑制基因的進(jìn)一步研究。本發(fā)明的反義寡核苷酸(特別是引物和探針)和編碼腫瘤抑制基因的核酸的雜交可用本領(lǐng)域公知的方法檢測(cè)。這類(lèi)方法可以包括綴合酶到寡核苷酸、放射標(biāo)記寡核苷酸或任何其它適合的檢測(cè)手段。也可以制備利用這類(lèi)檢測(cè)手段檢測(cè)樣品中腫瘤抑制基因水平的試劑盒。

本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以利用反義的特異性和靈敏性用于治療用途。反義化合物已被用于治療包括人的動(dòng)物疾病狀態(tài)的治療劑部分。反義寡核苷酸藥物已經(jīng)安全有效地給予人，并且無(wú)數(shù)臨床試驗(yàn)?zāi)壳罢谶M(jìn)行中。因此確立了反義化合物是有用的治療形式，其可以配制用于治療細(xì)胞、組織和動(dòng)物、特別是人的治療方案中。

對(duì)于治療學(xué)，對(duì)懷疑患有可通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因多核苷酸的表達(dá)來(lái)治療的疾病或障礙的動(dòng)物(優(yōu)選人)可以給予根據(jù)本發(fā)明的反義化合物來(lái)治療。例如，在一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，所述方法包括給予需要治療的動(dòng)物治療有效劑量的腫瘤抑制基因調(diào)節(jié)劑的步驟。本發(fā)明的腫瘤抑制基因調(diào)節(jié)劑有效地調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因的活性或調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因蛋白的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于對(duì)照，動(dòng)物中腫瘤抑制基因的活性或表達(dá)被抑制大約10％。優(yōu)選動(dòng)物中腫瘤抑制基因的活性或表達(dá)被抑制大約30％，更優(yōu)選動(dòng)物中腫瘤抑制基因的活性或表達(dá)被抑制50％以上。因此，相對(duì)于對(duì)照，所述寡聚化合物調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因mrna的表達(dá)至少10％、至少50％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％。

在一個(gè)實(shí)施方案中，與對(duì)照相比，動(dòng)物中腫瘤抑制基因的活性或表達(dá)增加了大約10％。優(yōu)選動(dòng)物中腫瘤抑制基因的活性或表達(dá)增加大約30％。更優(yōu)選動(dòng)物中腫瘤抑制基因的活性或表達(dá)增加50％以上。因此，相對(duì)于對(duì)照，寡聚化合物調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因mrna的表達(dá)至少10％、至少50％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％。

例如，腫瘤抑制基因表達(dá)的減少可以在動(dòng)物的血清、血液、脂肪組織、肝臟或任何其它體液、組織或器官中檢測(cè)。優(yōu)選包含在被分析的所述液體、組織或器官的細(xì)胞包含編碼腫瘤抑制基因肽的核酸分子和/或腫瘤抑制基因蛋白本身。

通過(guò)添加有效量的化合物到適合的藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體中，本發(fā)明的化合物可以藥學(xué)組合物使用。本發(fā)明的化合物的用途和本發(fā)明的方法在預(yù)防疾病上同樣有用。

綴合物

本發(fā)明寡核苷酸的另一種修飾涉及化學(xué)連接一種或多種提高寡核苷酸活性、細(xì)胞分布或細(xì)胞攝取的部分或綴合物到所述寡核苷酸。這些部分或綴合物可以包括共價(jià)連接到官能團(tuán)(例如伯羥基或仲羥基)的綴合物基團(tuán)。本發(fā)明的綴合物基團(tuán)包括嵌入劑、腫瘤抑制基因報(bào)告分子、多胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、提高寡聚體藥效特征的基團(tuán)和提高寡聚體藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征的基團(tuán)。典型的綴合物基團(tuán)包括膽固醇、脂質(zhì)、磷脂、生物素、吩嗪、葉酸酯、菲啶、蒽醌、吖啶、熒光素、羅丹明、香豆素類(lèi)和染料。本發(fā)明中提高藥效學(xué)特征的基團(tuán)包括促進(jìn)攝取、提高降解抗性和/或增強(qiáng)和靶核酸的序列特異性雜交的基團(tuán)。本發(fā)明中提高藥物代謝動(dòng)力學(xué)的基團(tuán)包括促進(jìn)本發(fā)明化合物的攝取、分布、代謝或排泄的基團(tuán)。代表性的綴合物基團(tuán)公開(kāi)于1992年10月23日申請(qǐng)的國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)杙ct/us92/09196和美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)6,287,860中，它們通過(guò)引用結(jié)合到本文中。綴合物部分包括但不限于脂質(zhì)部分例如膽固醇部分、膽酸、硫醚(例如己基-5-三苯甲硫醇、硫代膽固醇)、脂肪族鏈(例如十二烷雙醇或十一烷基殘基)、磷脂例如二-十六烷基-rac-甘油或三乙基銨1,2-二-o-十六烷基-rac-甘油基-3-h膦酸酯、多胺或聚乙二醇鏈、或金剛烷乙酸、棕櫚基部分、或十八胺或己基氨基-羰基-羥膽固醇部分。本發(fā)明的寡核苷酸也可以綴合到活性藥物，例如阿司匹林、華法林、保泰松、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮洛芬、(s)-(+)-普拉洛芬、卡洛芬、丹磺酰肌氨酸、2,3,5-三碘苯甲酸、氟芬那酸、亞葉酸、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮雜卓(diazepine)、吲哚美辛、巴比妥酸鹽、頭孢菌素、磺胺藥、抗糖尿病藥、抗菌藥或抗生素。

教導(dǎo)制備這類(lèi)寡核苷酸綴合物的代表性美國(guó)專利包括但不限于：4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717；5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941。

制劑

本發(fā)明的化合物可以和其它分子、分子結(jié)構(gòu)或化合物的混合物混合、囊化、綴合或其它方式締合以有利于攝取、分布和/或吸收，例如脂質(zhì)體、靶向受體的分子、口服、直腸、局部或其它制劑，。教導(dǎo)制備這類(lèi)有助于攝取、分布和/或吸收制劑的代表性美國(guó)專利包括但不限于美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；5,543,165；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619；5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295；5,527,528；5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575，上述每一個(gè)專利都通過(guò)引用結(jié)合到本文中。

雖然，為了調(diào)節(jié)靶的表達(dá)和/或功能，本發(fā)明反義寡核苷酸不需要以載體形式給藥，但是本發(fā)明的實(shí)施方案涉及用于表達(dá)反義寡核苷酸的表達(dá)載體構(gòu)建體，其包含啟動(dòng)子、雜合啟動(dòng)子基因序列并具有強(qiáng)組成型啟動(dòng)子活性，或在所需的情形下能被誘導(dǎo)的啟動(dòng)子活性。

在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明實(shí)踐包括給予至少一種具有合適的核酸遞送系統(tǒng)的前述反義寡核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，該系統(tǒng)包含可操作連接到多核苷酸的非病毒載體。這種非病毒載體的實(shí)例包括單獨(dú)的寡核苷酸(例如seqidno:10-30中的任一種或多種)或者聯(lián)合合適的蛋白、多糖或脂質(zhì)制劑。

其它合適的核酸遞送系統(tǒng)包括病毒載體，通常為來(lái)自至少一種以下病毒的序列：腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒(aav)、依賴輔助病毒的腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或日本血凝病毒(hvj)脂質(zhì)體復(fù)合體。優(yōu)選病毒載體包含可操作連接到多核苷酸的強(qiáng)真核啟動(dòng)子，例如巨細(xì)胞病毒(cmv)啟動(dòng)子。

其它優(yōu)選的載體包括病毒載體、融合蛋白和化學(xué)綴合物。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括莫洛尼鼠白血病病毒和hiv型病毒。一個(gè)優(yōu)選的hiv型病毒載體包含至少兩種載體，其中g(shù)ag和pol基因來(lái)自hiv基因組，env基因來(lái)自另一種病毒。優(yōu)選dna病毒載體。這些載體包括痘病毒載體，例如正痘病毒(orthopox)或禽痘病毒(avipox)載體；皰疹病毒載體，例如單純皰疹病毒i(hsv)載體[geller,a.i.等,(1995)j.neurochem,64:487；lim,f.等,dnacloning:mammaliansystems,d.glover,ed.(oxforduniv.press,oxfordengland)(1995)；geller,a.i.等,(1993)procnatl.acad.sci.:u.s.a.:907603；geller,a.i.等,(1990)procnatl.acad.sciusa:87:1149]；腺病毒載體(legallasalle等,science,259:988(1993)；davidson等,(1993)nat.genet.3:219；yang等,(1995)j.virol.69:2004)和腺伴隨病毒載體(kaplitt,m.g.等,(1994)nat.genet.8:148)。

本發(fā)明的反義化合物包括任何藥學(xué)上可接受的鹽、酯、或這類(lèi)酯的鹽、或任何其它化合物，其一旦給予包括人的動(dòng)物能提供(直接或間接)生物活性代謝物或其殘基。

術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的鹽"指本發(fā)明化合物的生理學(xué)和藥學(xué)上可接受的鹽，即保留母體化合物的所需生物活性且沒(méi)有不需要的毒性作用的鹽。對(duì)于寡核苷酸，優(yōu)選的藥學(xué)上可接受的鹽的實(shí)例和它們的用途詳見(jiàn)美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)6,287,860，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。

本發(fā)明也包括包含本發(fā)明的反義化合物的藥學(xué)組合物和制劑。本發(fā)明的藥學(xué)組合物可根據(jù)需要局部治療還是全身治療以及待治療的部位以多種方式給藥。給藥可以是局部給藥(包括眼部給藥和粘膜(包括陰道和直腸遞送)給藥)；肺部給藥(例如吸入或吹入粉末或氣霧劑(包括通過(guò)噴霧器)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、表皮和透皮的方式)；口服或胃腸外給藥。胃腸外給藥包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)注射或輸注、或顱內(nèi)例如鞘膜內(nèi)或心室內(nèi)給藥。人們認(rèn)為具有至少一個(gè)2'-o-甲氧乙基修飾的寡核苷酸尤其有益于口服給藥。局部給藥的藥學(xué)組合物和制劑可以包括透皮貼劑、藥膏、洗劑、乳劑、凝膠劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體劑和粉末劑。常規(guī)藥學(xué)載體、水性、粉末或油基、增稠劑等可能是需要的或理想的。涂覆的避孕套、手套等也可能是有用的。

本發(fā)明藥學(xué)制劑可以方便地采取單位劑型，其可通過(guò)藥學(xué)工業(yè)上公知的常規(guī)方法制備。這類(lèi)方法包括使所述活性成分和藥學(xué)載體或賦形劑混合的步驟。通常，制備制劑通過(guò)使活性成分和液體載體或精細(xì)固體載體或兩者均勻充分混合，然后如果需要，使產(chǎn)品成型。

本發(fā)明的組合物可以制備成許多可能劑型中的任一種，例如但不限于片劑、膠囊劑、凝膠膠囊劑、液體糖漿劑、軟凝膠劑、栓劑和灌腸劑。本發(fā)明的組合物也可以制備成水性、非水性或混合性介質(zhì)的混懸劑。水性混懸劑可以進(jìn)一步包含增加懸浮粘度的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇和/或葡聚糖。混懸劑也可以包含穩(wěn)定劑。

本發(fā)明的藥學(xué)組合物包括但不限于溶液、乳劑、泡沫和含脂質(zhì)體的制劑。本發(fā)明的藥學(xué)組合物和制劑可以包含一種或多種穿透促進(jìn)劑、載體、賦形劑或其它活性或非活性成分。

乳劑通常是一種液體分散在另一種流體中的非均相系統(tǒng)，乳劑液滴直徑通常超過(guò)0.1μm。除了分散相，乳劑還可以包含其它成分，活性藥物可以為水相、油相或其自身為獨(dú)立相的溶液。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括微乳劑。本領(lǐng)域公知乳劑和它們的用途，詳見(jiàn)美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)6,287,860。

本發(fā)明的制劑包括脂質(zhì)體制劑。本文所用的術(shù)語(yǔ)"脂質(zhì)體"意指由排列成球形雙層或多雙層的兩親的脂質(zhì)組成的小泡。脂質(zhì)體是單層或多層小泡，其具有親脂物質(zhì)形成的膜和包含待遞送組合物的水性內(nèi)含物。陽(yáng)離子脂質(zhì)體是帶正電的脂質(zhì)體，人們認(rèn)為其與帶負(fù)電的dna分子互相作用形成穩(wěn)定的復(fù)合體。ph敏感性或帶負(fù)電的脂質(zhì)體被認(rèn)為是捕獲dna而不是與它復(fù)合。陽(yáng)離子和非陽(yáng)離子脂質(zhì)體均已用于遞送dna到細(xì)胞。

脂質(zhì)體也包括"立體穩(wěn)定的"脂質(zhì)體，本文所用的該術(shù)語(yǔ)指包含一種或多種特殊化脂質(zhì)的脂質(zhì)體。當(dāng)摻入脂質(zhì)體中時(shí)，這些特殊化的脂質(zhì)導(dǎo)致脂質(zhì)體相對(duì)于無(wú)這種特殊化脂質(zhì)的脂質(zhì)體具有更長(zhǎng)的循環(huán)壽命。立體穩(wěn)定的脂質(zhì)體的實(shí)例是：脂質(zhì)體中形成小泡的脂質(zhì)部分包含一種或多種糖脂，或者其衍生自一種或多種親水聚合物，例如聚乙二醇(peg)部分。脂質(zhì)體和它們的用途詳見(jiàn)美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)6,287,860。

本發(fā)明的藥學(xué)制劑和組合物還可以包括表面活性劑。表面活性劑在藥品、制劑和乳劑中的用途是本領(lǐng)域公知的。表面活性劑和它們的用途進(jìn)一步描述于美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)6,287,860，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明采用各種穿透促進(jìn)劑影響核酸(尤其是寡核苷酸)的有效遞送。除了幫助非親脂性藥物擴(kuò)散穿過(guò)細(xì)胞膜，穿透促進(jìn)劑也提高親脂藥物的滲透性。穿透促進(jìn)劑可以歸類(lèi)到屬于五大類(lèi)的其中一種，即表面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑和非螯合性非表面活性劑。穿透促進(jìn)劑和它們的用途進(jìn)一步描述于美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)6,287,860，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，根據(jù)制劑的預(yù)定用途，即給藥途徑，常規(guī)設(shè)計(jì)制劑。

優(yōu)選的用于局部給藥的制劑包括本發(fā)明的寡核苷酸與局部遞送劑混合的制劑，局部遞送劑例如脂質(zhì)、脂質(zhì)體、脂肪酸、脂肪酸酯、類(lèi)固醇、螯合劑和表明活性劑。優(yōu)選的脂質(zhì)和脂質(zhì)體包括中性的(例如二油?；?磷脂?；掖及穌ope、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿dmpc、二硬脂酰磷脂酰膽堿)、陰性的(例如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油dmpg)和陽(yáng)離子的(例如二油?；募谆被鵧otap和二油?；?磷脂?；掖及穌otma)。

對(duì)于局部或其它給藥，本發(fā)明寡核苷酸可包囊在脂質(zhì)體中或可與其形成其復(fù)合物，特別是陽(yáng)離子脂質(zhì)體?；蛘?，寡核苷酸可以復(fù)合脂質(zhì)，特別是陽(yáng)離子脂質(zhì)。優(yōu)選的脂肪酸和酯、它們藥學(xué)上可接受的鹽和它們的用途詳見(jiàn)美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)6,287,860。

用于口服給藥的組合物和制劑包括粉末或顆粒、微粒、納米微粒、在水或非水性介質(zhì)中的混懸劑或溶液劑、膠囊、凝膠膠囊、小囊劑、片劑或小片劑。增稠劑、矯味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑可能是需要的。優(yōu)選的口服制劑是：其中本發(fā)明的寡核苷酸與一種或多種穿透促進(jìn)劑、表面活性劑和螯合劑聯(lián)合給予的制劑。優(yōu)選的表面活性劑包括脂肪酸和/或其酯或其鹽、膽酸和/或其鹽。優(yōu)選的膽酸/鹽和脂肪酸以及它們的用途描述于美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)6,287,860，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。還優(yōu)選穿透促進(jìn)劑(例如脂肪酸/鹽)聯(lián)合膽酸/鹽的組合。特別優(yōu)選的組合是月桂酸的鈉鹽、癸酸和udca。進(jìn)一步的穿透促進(jìn)劑包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-十六烷基醚。本發(fā)明的寡核苷酸可以顆粒形式口服遞送，包括噴霧干顆?；驈?fù)合形成微米或納米顆粒。寡核苷酸復(fù)合劑和它們的用途進(jìn)一步描述于美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)6,287,860，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。

用于腸胃外、鞘內(nèi)或腔室內(nèi)給予的組合物和制劑可以包括無(wú)菌水溶液，該無(wú)菌水溶液也可以包含緩沖劑、稀釋劑和其它合適的添加劑，例如但不限于穿透促進(jìn)劑、載體化合物和其它藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。

本發(fā)明某些實(shí)施方案提供包含一種或多種寡聚化合物和一種或多種通過(guò)非反義機(jī)制起作用的其它化學(xué)治療劑的藥學(xué)組合物。這類(lèi)化學(xué)治療劑的實(shí)施包括但不限于癌癥化學(xué)治療藥物例如柔紅霉素、道諾霉素、放線菌素、多柔比星、表柔比星、伊達(dá)比星、依索比星、博來(lái)霉素、馬磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、二氯乙基-亞硝基脲(bischloroethyl-nitrosurea)、白消安、絲裂霉素c、放線菌素d、普卡霉素、潑尼松、羥孕酮、睪酮、他莫昔芬、達(dá)卡巴嗪、丙卡巴肼、六甲蜜胺、五甲蜜胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基環(huán)己基亞硝基脲(methylcyclohexylnitrosurea)、氮芥、美法侖、環(huán)磷酰胺、6-巰嘌呤、6-硫代鳥(niǎo)嘌呤、阿糖胞苷、5-氮雜胞苷、羥基脲、脫氧柯福霉素(deoxycoformycin)、4-羥基過(guò)氧環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-fu)、5-氟脫氧尿苷(5-fudr)、甲氨蝶呤(mtx)、秋水仙堿、泰素、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、依托泊苷(vp-16)、三甲曲沙、伊立替康、托泊替康、吉西他濱、替尼泊苷、順鉑和己烯雌酚(des)。當(dāng)與本發(fā)明的化合物聯(lián)用時(shí)，這些化學(xué)治療劑可單獨(dú)使用(例如5-fu和寡核苷酸)、序貫使用(例如5-fu和寡核苷酸用藥一段時(shí)間，接著使用mtx和寡核苷酸)，或與一種或多種其它這樣的化學(xué)治療劑聯(lián)用(例如5-fu、mtx和寡核苷酸聯(lián)用，或5-fu、放射療法和寡核苷酸聯(lián)用)。消炎藥(包括但不限于非類(lèi)固醇消炎藥和皮質(zhì)激素)和抗病毒藥物(包括但不限于利巴韋林(ribivirin)、阿糖腺苷、阿昔洛韋和更昔洛韋)也可以結(jié)合到本發(fā)明的組合物。反義化合物和其它非反義藥物的組合也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。兩種或更多種結(jié)合型化合物可以一起使用或序貫使用。

在另一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可以包含一種或多種靶向第一核酸的反義化合物(尤其是寡核苷酸)，和一種或多種靶向第二核酸靶的其它反義化合物。例如，第一個(gè)靶可以是腫瘤抑制基因的特定反義序列，而第二個(gè)靶可以是另一核苷酸序列的一個(gè)區(qū)域?；蛘?，本發(fā)明的組合物可以包含兩種或更多種靶向相同腫瘤抑制基因核酸目標(biāo)的不同區(qū)域的反義化合物。本文舉例說(shuō)明了很多反義化合物的實(shí)例，可從本領(lǐng)域已知的適合化合物中選擇其它反義化合物。兩種或更多種結(jié)合型化合物可以一起使用或序貫使用。

定量給藥：

治療性組合物的制劑和其隨后的給藥(定量給藥)在本領(lǐng)域技術(shù)人員技術(shù)知識(shí)范圍內(nèi)。定量給藥根據(jù)待治疾病的嚴(yán)重性和反應(yīng)性來(lái)決定，治療過(guò)程持續(xù)幾天到幾個(gè)月，或直到治愈或達(dá)到減輕疾病的狀態(tài)。最佳給藥方案可從檢測(cè)患者體內(nèi)藥物累積來(lái)計(jì)算。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易地決定最佳劑量、給藥方法和重復(fù)率。最佳劑量可以根據(jù)各個(gè)寡核苷酸的相對(duì)功效來(lái)改變，以及一般可以根據(jù)體外和體內(nèi)動(dòng)物模型中獲得的有效的ec50來(lái)估算。總體而言，劑量是0.01μg-100g/kg體重，可以每天、每周、每月或每年給藥一次或多次，甚至每4到30年給藥一次。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能根據(jù)檢測(cè)到的藥物在體液或組織中的停留時(shí)間和濃度容易地估算重復(fù)給藥率。成功治療后，理想的是讓患者進(jìn)行維持療法以預(yù)防疾病狀態(tài)的復(fù)發(fā)，其中寡核苷酸以維持劑量給藥：0.01μg-100g/kg體重，每天一次或多次到每20年一次。

盡管上面已經(jīng)描述了本發(fā)明的各種實(shí)施方案，但是應(yīng)當(dāng)理解的是它們僅以實(shí)施例的方式來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，而非限制性的。根據(jù)本文的公開(kāi)內(nèi)容在不脫離本發(fā)明宗旨或范圍內(nèi)可對(duì)公開(kāi)的實(shí)施方案進(jìn)行許多改變。因此，本發(fā)明的寬度和范圍不應(yīng)該受上述任何實(shí)施方案的限制。

本文提到的所有文獻(xiàn)都通過(guò)引用結(jié)合到本文中。出于所有目的，本申請(qǐng)中引用的所有出版物和專利文獻(xiàn)都通過(guò)引用結(jié)合到本文中，引用的程度就好像每一出版物或?qū)＠墨I(xiàn)單獨(dú)指明一樣。在本文中引用各種參考文獻(xiàn)，申請(qǐng)人并不承認(rèn)任何具體的參考文獻(xiàn)對(duì)于他們的發(fā)明是“先有技術(shù)”。發(fā)明性組合物和方法的實(shí)施方案用下列實(shí)施例予以說(shuō)明。

實(shí)施例

以下非限制性實(shí)施例用來(lái)舉例說(shuō)明本發(fā)明的選定實(shí)施方案。應(yīng)理解的是，顯示的組分的比例變化和元件替代對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的并屬于本發(fā)明實(shí)施方案的范圍內(nèi)。

實(shí)施例1：設(shè)計(jì)對(duì)腫瘤抑制基因多核苷酸的反義鏈和/或有義鏈核酸分子特異性的反義寡核苷酸

如上所述，術(shù)語(yǔ)"對(duì)…特異性的寡核苷酸"或"寡核苷酸靶"指具有以下特征序列的寡核苷酸：(i)能與靶基因的一部分形成穩(wěn)定的復(fù)合物，或(ii)能與靶基因的mrna轉(zhuǎn)錄物的一部分形成穩(wěn)定的雙鏈體。

利用自動(dòng)比對(duì)核酸序列并且指示同一性或同源性區(qū)域的計(jì)算機(jī)程序輔助選擇適當(dāng)?shù)墓押塑账?。這種程序用于比較例如通過(guò)搜索數(shù)據(jù)庫(kù)(例如genbank)或通過(guò)測(cè)序pcr產(chǎn)物得到的核酸序列。比較一定范圍內(nèi)物種的核酸序列允許選擇在物種之間展示出合適同一性程度的核酸序列。在基因還沒(méi)有測(cè)序的情況下，可進(jìn)行dna印跡從而測(cè)定目標(biāo)物種和其它物種基因之間的同一性程度。本領(lǐng)域公知通過(guò)在不同嚴(yán)格程度下進(jìn)行dna印跡，可能獲得同一性的近似值。這些程序允許選擇與需要控制的個(gè)體中的靶核酸序列顯示高度互補(bǔ)性，而和其它物種的相應(yīng)核酸序列互補(bǔ)性程度較低的寡核苷酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)知道，用于本發(fā)明的基因的合適區(qū)域的選擇空間相當(dāng)大。

反義化合物是"可特異性雜交"是指：當(dāng)所述化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能而引起功能和/或活性的調(diào)節(jié)，并且有足夠程度的互補(bǔ)性以避免在理想的特異性結(jié)合的條件下(即體內(nèi)測(cè)定或治療性處理情形下的生理?xiàng)l件下，和在體外測(cè)定時(shí)進(jìn)行測(cè)定的條件下)反義化合物非特異性地結(jié)合非靶核酸序列。

本文描述的寡核苷酸的雜交特性可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的一種或多種體外試驗(yàn)測(cè)定。例如，本文描述的寡核苷酸的特性可以如下獲得：利用解鏈曲線分析測(cè)定靶天然反義序列和潛在藥物分子之間的結(jié)合強(qiáng)度。

靶天然反義序列和潛在藥物分子(分子)之間的結(jié)合強(qiáng)度可以利用任何已經(jīng)建立的檢測(cè)分子間相互作用強(qiáng)度的方法來(lái)估算，例如解鏈曲線分析。

解鏈曲線分析確定天然反義/分子雙鏈體發(fā)生雙鏈到單鏈構(gòu)象快速轉(zhuǎn)化時(shí)的溫度。廣泛認(rèn)為該溫度是兩個(gè)分子間相互作用強(qiáng)度的可靠測(cè)量指標(biāo)。

解鏈曲線測(cè)定可利用對(duì)應(yīng)于所述分子結(jié)合位點(diǎn)的實(shí)際天然反義rna分子的cdna拷貝或合成dna或rna核苷酸進(jìn)行。已有包含進(jìn)行該測(cè)定所有必需試劑的多種試劑盒(例如appliedbiosystemsinc.meltdoctor試劑盒)。這些試劑盒包含合適的緩沖溶液，緩沖溶液包含一種雙鏈dna(dsdna)結(jié)合染料(例如abihrm染料、sybrgreen、syto等)。dsdna染料的特征是他們?cè)谧杂蔂顟B(tài)下幾乎不發(fā)熒光，但是在結(jié)合dsdna時(shí)是高熒光性的。

為了進(jìn)行測(cè)定，將cdna或?qū)?yīng)的寡核苷酸和分子以具體制造商方案規(guī)定的濃度混合。將混合物加熱到95℃以便所有預(yù)先形成的dsdna復(fù)合體解離，然后緩慢冷卻至室溫或試劑盒制造商規(guī)定的其它較低的溫度以允許dna分子退火。然后慢慢加熱新形成的復(fù)合體到95℃，同時(shí)連續(xù)收集由所述反應(yīng)產(chǎn)生的熒光量數(shù)據(jù)。熒光強(qiáng)度與反應(yīng)中存在的dsdna的量成反比。數(shù)據(jù)可用與試劑盒兼容的實(shí)時(shí)pcr儀器收集(例如abi’sstumorsuppressorgeneneplusrealtimepcrsystem或lighttyper儀器,rochediagnostics,lewes,uk)。

用適當(dāng)?shù)能浖?例如lighttyper(roche)或sdsdissociationcurve，abi)對(duì)溫度(-d(熒光)/dt)，y軸)相對(duì)于溫度(x軸)作負(fù)導(dǎo)數(shù)熒光圖從而構(gòu)建解鏈峰。分析數(shù)據(jù)，鑒定從dsdna復(fù)合體到單鏈分子之間的快速轉(zhuǎn)變的溫度。該溫度稱為tm并且與兩個(gè)分子之間的相互作用強(qiáng)度成正比例。通常tm超過(guò)40℃。

實(shí)施例2：調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因寡核苷酸基因表達(dá)

用反義寡核苷酸處理hepg2細(xì)胞

得自atcc的hepg2細(xì)胞(cat#hb-8065)于37℃和5％co2條件下生長(zhǎng)于生長(zhǎng)培養(yǎng)基(mem/ebss(hyclonecat#sh30024，或mediatechcat#mt-10-010-cv)+10％fbs(mediatechcat#mt35-011-cv)+青霉素/鏈霉素(mediatechcat#mt30-002-ci))。試驗(yàn)的前一天，將細(xì)胞以1.5×10⁵/ml的密度重新接種于6孔板中，于37℃和5％co2條件下溫育。試驗(yàn)當(dāng)天將6孔板中的培養(yǎng)基換為新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。稀釋所有的反義寡核苷酸到濃度20μm。2μl該溶液與400μl的opti-mem培養(yǎng)基(gibcocat#31985-070)和4μl的lipofectamine2000(invitrogencat#11668019)室溫下溫育20分鐘，然后加入有hepg2細(xì)胞的6孔板的每個(gè)孔中。包含2μl水代替寡核苷酸溶液的類(lèi)似混合物用于模擬轉(zhuǎn)染對(duì)照。在37℃和5％co2條件下溫育3-18小時(shí)后，培養(yǎng)基換為新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。在加入反義寡核苷酸48小時(shí)后，去掉培養(yǎng)基，根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，用svtotalrnaisolationsystem(promega,cat#z3105)或rneasytotalrnaisolationkit(qiagen,cat#74181)從細(xì)胞中提取rna。利用versocdna試劑盒(thermoscientific,cat#ab1453b)或highcapacitycdnareversetranscriptionkit(cat#4368813)，根據(jù)制造商的方案，在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中加入600ngrna。利用abitaqmangeneexpressionmix(cat#4369510)和abi設(shè)計(jì)的引物/探針，由實(shí)時(shí)pcr利用反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中得到的cdna監(jiān)測(cè)基因表達(dá)。采用的pcr循環(huán)如下：50℃2分鐘，95℃10分鐘，40次循環(huán)(95℃15秒，60℃1分鐘)，采用steponeplusrealtimepcrmachine(appliedbiosystemsinc.)或mx4000熱循環(huán)儀(stratagene)。

根據(jù)處理和模擬轉(zhuǎn)染樣品之間18s標(biāo)準(zhǔn)化的dct值的差異，計(jì)算反義寡核苷酸處理之后基因表達(dá)的倍數(shù)變化。

p73表達(dá)測(cè)定使用(abicat#s)，所有探針mgb

p73:hs00232088_ml(靶序列acctctggagctctctggaac，外顯子2seqidno.:35)

p73as:hs00215135_ml(靶序列tatgatggaaaggtgcgcatcctta，外顯子7seqidno.:36)和hs00892470_g1

結(jié)果:

實(shí)時(shí)pcr結(jié)果顯示，用針對(duì)腫瘤抑制基因設(shè)計(jì)的sirna中的兩種處理hepg2細(xì)胞48小時(shí)后，腫瘤抑制基因mrna的水平顯著增加(腫瘤抑制基因_1，p＝0.02，和腫瘤抑制基因_2，p＝0.04，圖1a)。用針對(duì)腫瘤抑制基因的sirna處理同樣的樣品后，腫瘤抑制基因rna的水平可能減少(圖1b)。

在圖1c中，實(shí)時(shí)pcr結(jié)果顯示，用針對(duì)腫瘤抑制基因反義hs.668503設(shè)計(jì)的寡聚體中的兩種和針對(duì)腫瘤抑制基因反義hs.674463設(shè)計(jì)的寡聚體中的一種處理hepg2細(xì)胞48小時(shí)后，腫瘤抑制基因mrna的水平顯著增加。

實(shí)時(shí)pcr結(jié)果顯示，用針對(duì)pten反義hs.624903設(shè)計(jì)的寡核苷酸中的一種處理hepg2細(xì)胞48小時(shí)后，ptenmrna的水平顯著增加(圖3)。(檢測(cè)探針:appliedbiosystemstaqmangeneexpressionassay:hs02621230_s1)

用反義寡核苷酸處理tm4細(xì)胞

得自atcc的tm4細(xì)胞(cat#crl-1715)于37℃和5％co2條件下生長(zhǎng)于生長(zhǎng)培養(yǎng)基(mem/ebss(hyclonecat#sh30024，或mediatechcat#mt-10-010-cv)+10％fbs(mediatechcat#mt35-011-cv)+青霉素/鏈霉素(mediatechcat#mt30-002-ci))。試驗(yàn)的前一天，將細(xì)胞以1.5×10⁵/ml的密度重新接種于6孔板中，于37℃和5％co2條件下溫育。試驗(yàn)當(dāng)天將6孔板中的培養(yǎng)基換為新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。稀釋所有的反義寡核苷酸到濃度20μm。2μl該溶液與400μl的opti-mem培養(yǎng)基(gibcocat#31985-070)和4μl的lipofectamine2000(invitrogencat#11668019)于室溫下溫育20分鐘，然后加入有tm4細(xì)胞的6孔板的每個(gè)孔中。包含2μl水代替寡核苷酸溶液的類(lèi)似混合物用于模擬轉(zhuǎn)染對(duì)照。在于37℃和5％co2條件下溫育3-18小時(shí)后，培養(yǎng)基換為新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。加入反義寡核苷酸48小時(shí)后，去掉培養(yǎng)基，根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，用svtotalrnaisolationsystem(promega,cat#z3105)或rneasytotalrnaisolationkit(qiagen,cat#74181)從細(xì)胞中提取rna。利用versocdna試劑盒(thermoscientific,cat#ab1453b)或highcapacitycdnareversetranscriptionkit(cat#4368813)，根據(jù)制造商的方案，在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中加入600ng的rna。通過(guò)abitaqmangeneexpressionmix(cat#4369510)和abi設(shè)計(jì)的引物/探針(appliedbiosystemstaqmangeneexpressionassay:mm00660220_m1，由appliedbiosystemsinc.,fostercityca設(shè)計(jì))，由實(shí)時(shí)pcr利用該反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中得到的cdna監(jiān)測(cè)基因表達(dá)。采用的pcr循環(huán)如下：50℃2分鐘，95℃10分鐘，40圈(95℃15秒，60℃1分鐘)，采用steponeplusrealtimepcrmachine(appliedbiosystems)。

根據(jù)處理和模擬轉(zhuǎn)染樣品之間18s標(biāo)準(zhǔn)化的dct值的差異，計(jì)算反義寡核苷酸處理之后基因表達(dá)的倍數(shù)變化。

結(jié)果：

實(shí)時(shí)pcr結(jié)果顯示，各用一種針對(duì)腫瘤抑制基因反義hs.668503設(shè)計(jì)的寡聚體中的一種和腫瘤抑制基因反義wdr8設(shè)計(jì)的寡聚體中的一種處理小鼠tm4細(xì)胞48小時(shí)后，腫瘤抑制基因mrna的水平顯著增加(圖1d)。

用反義寡核苷酸處理huvec細(xì)胞

得自atcc的huvec細(xì)胞(promocellcat#c-12253)于37℃和5％co2條件下生長(zhǎng)于上皮生長(zhǎng)培養(yǎng)基(promocellcat#c-22010)。試驗(yàn)的前一天，用promocelldetachkit(cat#c-41200)將細(xì)胞以1.5×10⁵/ml的密度重新接種于6孔板中，于37℃和5％co2條件下溫育。試驗(yàn)當(dāng)天將6孔板中的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)變?yōu)樾迈r的上皮生長(zhǎng)培養(yǎng)基。稀釋所有反義寡核苷酸到濃度20μm。2μl該溶液與400μl的opti-mem培養(yǎng)基(gibcocat#31985-070)和4μl的lipofectamine2000(invitrogencat#11668019)于室溫下溫育20分鐘，然后加入有huvec細(xì)胞的6孔板的每個(gè)孔中。包含2μl水代替寡核苷酸溶液的類(lèi)似混合物用于模擬轉(zhuǎn)染對(duì)照。在于37℃和5％co2條件下溫育3-18小時(shí)后，培養(yǎng)基換為新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。加入反義寡核苷酸48小時(shí)后，去掉培養(yǎng)基；根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，用svtotalrnaisolationsystem(promega,cat#z3105)或rneasytotalrnaisolationkit(qiagen,cat#74181)從細(xì)胞中提取rna。利用versocdna試劑盒(thermoscientific,cat#ab1453b)，根據(jù)制造商的方案，在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中加入600ng的rna。通過(guò)abitaqmangeneexpressionmix(cat#4369510)和abi設(shè)計(jì)的引物/探針(appliedbiosystemstaqmangeneexpressionassays:hs00153340_m1和hs00216360_m1，由appliedbiosystemsinc.,fostercityca設(shè)計(jì))，由實(shí)時(shí)pcr利用該反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中得到的cdna監(jiān)測(cè)基因表達(dá)。所用的pcr循環(huán)如下：50℃2分鐘，95℃10分鐘，40次循環(huán)(95℃15秒，60℃1分鐘)，采用steponeplusrealtimepcrmachine(appliedbiosystems)或mx4000熱循環(huán)儀(stratagene)。

根據(jù)處理和模擬轉(zhuǎn)染樣品之間18s標(biāo)準(zhǔn)化的dct值的差異，計(jì)算反義寡核苷酸處理之后基因表達(dá)的倍數(shù)變化。

p53表達(dá)測(cè)定使用(abicat#s)，所有的探針fam/mgb:18s:4319413e

p53:hs00153340_m1(靶序列cttccctggattggcagccagactg，seqidno.:37)

p53as:hs00216360_m1(靶序列atatgcagaaatggtccctgtcctt，seqidno.:38)

結(jié)果：

實(shí)時(shí)pcr結(jié)果顯示，用針對(duì)p53as設(shè)計(jì)的所有sirna處理huvec細(xì)胞48小時(shí)后，p53mrna的水平顯著增加(圖2)。

雖然針對(duì)一種或多種實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了舉例性說(shuō)明和描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀和理解本說(shuō)明書(shū)和附圖后，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行等同性修改和修飾。另外，雖然本發(fā)明的具體特征可能僅就若干實(shí)施方式中的一種進(jìn)行了公開(kāi)，但是當(dāng)對(duì)任何給定的或具體的應(yīng)用可能是理想的和有利時(shí)，這種特征可以和其它實(shí)施方式中的一種或幾種特征結(jié)合。

本公開(kāi)的摘要使讀者可以快速確定本技術(shù)公開(kāi)的性質(zhì)。應(yīng)當(dāng)理解的是其不能被用為解釋或限制權(quán)利要求的范圍或意義。