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水稻深綠穗基因的應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):12900614閱讀:297來(lái)源:國(guó)知局
水稻深綠穗基因的應(yīng)用的制作方法與工藝

本發(fā)明涉及一個(gè)水稻穗色相關(guān)基因及其功能,屬于植物分子遺傳領(lǐng)域。



背景技術(shù):

光合作用是利用葉綠體中的葉綠素(chlorophyll),在可見(jiàn)光照射下,將二氧化碳和水轉(zhuǎn)化為有機(jī)物。葉綠素含量在一定范圍內(nèi)與光合速率成正相關(guān)。穗的光合作用對(duì)籽粒的生物量累積具有一定的作用,如麥穗光合作用對(duì)籽粒的貢獻(xiàn)可達(dá)10%~76%,而稻穗光合能力較弱,對(duì)籽粒的貢獻(xiàn)只有4%~23%,可見(jiàn)稻穗的光合能力還有很大的提升空間。因此,利用新優(yōu)異基因,提高稻穗中葉綠素的含量,增加穗光合作用對(duì)籽粒的貢獻(xiàn)率,將可能更有效促地促進(jìn)水稻高產(chǎn)。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種水稻深綠穗基因的用途。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題,本發(fā)明提供一種水稻深綠穗基因的用途,用于提高稻穗中光合色素(包括葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素)的含量;調(diào)控該水稻深綠穗的基因的核苷酸序列如seqidno:1所示。

作為本發(fā)明的水稻深綠穗基因的用途的改進(jìn),用于提高稻穗中光合作用的光能轉(zhuǎn)化效率。

本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下:

本發(fā)明利用人工輻射誘變粳稻品種中花11,在突變體庫(kù)中獲得了一個(gè)罕見(jiàn)的深綠穗突變體,迄今在水稻中還未曾報(bào)道。與中花11的黃綠穗色相比,該突變體的穗色深綠(圖1),穗的葉綠素與類(lèi)胡蘿卜素的含量顯著性增加(圖2),穗中光合作用的光系統(tǒng)ii原初光能轉(zhuǎn)換效率也顯著性提高(圖3),對(duì)水稻穗的光合機(jī)理研究及其育種應(yīng)用具有重要意義。

將水稻深綠穗突變體與野生型品種巴香占雜交,f1表型為野生型。在f1自交的f2代群體中,野生型與突變型的比例經(jīng)χ2檢驗(yàn)符合3:1,表明深綠穗突變表型受一個(gè)隱性基因控制。利用圖位克隆技術(shù),將目的基因定位水稻第1號(hào)染色體上物理距離為91kb的兩個(gè)分子標(biāo)記之間。根據(jù)水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋,將其中1個(gè)預(yù)測(cè)基因(登錄號(hào):loc_os01g62060)確定為候選基因,通過(guò)rt-pcr分析表明該基因在野生型中表達(dá),在深綠穗突變體中不表達(dá)(圖4)。為了驗(yàn)證該基因的功能,構(gòu)建loc_os01g62060基因的表達(dá)載體,遺傳轉(zhuǎn)化到水稻深綠穗突變體中,獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因水稻植株,該轉(zhuǎn)基因植株的穗色恢復(fù)為野生型的黃綠色(圖5),證明該基因調(diào)控穗色深綠的功能,克隆了該基因。生物信息學(xué)分析表明該基因編碼的蛋白功能未知,與已知的葉綠素代謝、葉綠體發(fā)育、光合作用等途徑的相關(guān)基因沒(méi)有任何同源性,是一個(gè)沒(méi)有報(bào)道過(guò)的新功能基因,具有重要的研究意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

圖1為水稻深綠穗突變體與對(duì)照中花11的穗色;

圖2為水稻深綠穗突變體與對(duì)照中花11穗的葉綠素a、葉綠素b、類(lèi)胡蘿卜素含量,**表示t檢驗(yàn)存在極顯著性(p<0.01)差異,下同;

圖3為水稻深綠穗突變體與對(duì)照中花11穗的凈光合速率;

圖4為基因loc_os01g62060的rt-pcr表達(dá)分析,以持家基因actin做為內(nèi)參;

圖5為基因loc_os01g62060遺傳轉(zhuǎn)化水稻深綠穗突變體后的植株穗色。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1、水稻深綠穗突變體的獲得與種植

采用60co的γ射線輻射,以300gy的照射劑量處理水稻粳稻品種中花11的種子500g。5月初,將輻射后的種子(m1)播種在水稻田的苗床上,6月初進(jìn)行移栽,成熟后單株收獲種子(m2)。第2年,在水稻田中每個(gè)m2株系分別種植30株,鑒定表型。其中,在一個(gè)m2株系中發(fā)現(xiàn)深綠穗突變表型的植株。收獲突變株的種子,連續(xù)種植2代,即m3與m4代都出現(xiàn)相同的深綠穗突變表型,表明該突變表型是可穩(wěn)定遺傳的。深綠穗突變體m4代收獲的種子(m5)代用于以下的實(shí)驗(yàn)研究。

實(shí)施例2、水稻穗的葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素含量測(cè)定

在水稻抽穗期,選取長(zhǎng)勢(shì)一致的9株深綠穗突變體與9株對(duì)照中花11,對(duì)其新抽的穗,參照l(shuí)ichtenthaler等方法(引自:methodenzymol,1987,148:350-382)測(cè)定葉綠素a、葉綠素b及類(lèi)胡蘿卜素的含量;每3株的葉片混合成1個(gè)樣品,共3個(gè)生物性重復(fù)樣品。測(cè)定時(shí),每份樣品重復(fù)測(cè)定3次,取平均值,對(duì)3份樣品的平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用t-test檢驗(yàn)突變體與野生型之間的顯著性差異。

所得結(jié)果為深綠穗突變體穗的葉綠素a、葉綠素b與類(lèi)胡蘿卜素含量都顯著性高于野生型對(duì)照中花11。

實(shí)施例3、水稻穗的凈光合速率測(cè)定

在水稻抽穗期,選取長(zhǎng)勢(shì)一致的9株深綠穗突變體與9株對(duì)照中花11,對(duì)其新抽的穗,按照向珣朝等方法(引自:中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2005,21(1):81-84),測(cè)定儀分穗中光合作用的光系統(tǒng)ii原初光能轉(zhuǎn)換效率,取樣方式和統(tǒng)計(jì)分析同實(shí)施例2。

所得結(jié)果為深綠穗突變體穗中光合作用的光系統(tǒng)ii原初光能轉(zhuǎn)換效率顯著性高于野生型對(duì)照中花11。

實(shí)施例4、水稻深綠穗基因的精細(xì)定位

用深綠穗突變體與野生型品種巴香占進(jìn)行雜交,其f1代植株均表現(xiàn)為野生型。f1代自交得到f2群體,f2代中出現(xiàn)野生型與突變型兩種表型,其比例經(jīng)χ2檢驗(yàn)符合3:1,表明水稻深綠穗突變體是由單個(gè)隱性基因控制。采用圖位克隆技術(shù),通過(guò)分析f2群體中的深綠穗突變株的染色體交換率,對(duì)目的基因進(jìn)行定位。

首先,分別提取f2群體中深綠穗突變型個(gè)體的基因組dna。提取方法:取水稻葉片0.1g,用液氮研磨后,加600μl提取液(0.1mol/ltris-clph8.0,500mmol/lnacl,1.25g/lsds),65℃溫育30min。加200μl5mol/lkac,混勻后,冰浴30min。再加500μl氯仿,混勻,10000r/min離心5min,取上清,加2/3上清體積的異丙醇,混勻,12000r/min離心5min。棄去上清,用70%乙醇洗滌沉淀,倒置晾干,加100μlte溶解dna。

接著,用已公布的覆蓋水稻12條染色的ssr分子標(biāo)記(引自:nature,2005,436(11):793-800)對(duì)f2群體中20個(gè)突變株的dna分別進(jìn)行pcr擴(kuò)增。pcr試劑采用南京博爾迪生物技術(shù)有限公司的2×pcrmix,20μl反應(yīng)體系,方法見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明。pcr擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性5分鐘;94℃變性30秒,55~60℃退火30秒,72℃延伸30秒,35個(gè)循環(huán);72℃延伸5分鐘。

然后,用1×tae電泳液制備濃度為3%的瓊脂糖凝膠,將20μlpcr產(chǎn)物與2μl10×loadingbuffer混合,加到凝膠的點(diǎn)樣孔中,在100v恒壓下電泳30min。用溴化乙錠對(duì)凝膠進(jìn)行染色,顯示dna條帶,染色方法按照《分子克隆》(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社,第三版)。在紫外透射儀上,用305nm波段觀察凝膠上的電泳條帶。通過(guò)分析每個(gè)標(biāo)記的電泳帶型,計(jì)算分子標(biāo)記與目的基因的遺傳距離,將目的基因初步定位在了水稻1號(hào)染色體的長(zhǎng)臂上rm8084和rm11860兩個(gè)標(biāo)記之間。

最后,根據(jù)水稻基因組的序列(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/),在標(biāo)記rm8084與rm11860之間的dna序列上,設(shè)計(jì)了分子標(biāo)記id21、id26與caps1的pcr引物,id21:5’-gtggatgtggaatggaggaagt-3’與5’-aggcagcagctggagaagaat-3’,id26:5’-gataatgccacatgattctga-3’與5’-taacacgattggtgcctacat-3’,caps1:5’-tgctcatgaattccgttgca-3’與5’-aatgtccacacctgagaagg-3’。對(duì)f2群體中1000個(gè)突變株的dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增,方法同上。caps1標(biāo)記的pcr產(chǎn)物還要用限制性內(nèi)切酶taqi(takara,japan)進(jìn)行酶切,方法見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明。電泳分析與ssr標(biāo)記的方法相同。通過(guò)分析每個(gè)標(biāo)記的電泳帶型,計(jì)算分子標(biāo)記與目的基因的遺傳距離,最終將目的基因精選定位在標(biāo)記id26與caps1之間,物理距離為91kb。

實(shí)施例5、水稻深綠穗候選基因的確定

根據(jù)水稻基因組的基因注釋數(shù)據(jù)庫(kù)(http://rice.plantbiology.msu.edu/),對(duì)標(biāo)記id26與caps1之間的序列進(jìn)行基因預(yù)測(cè)分析,確定了1個(gè)可能的候選基因loc_os01g62060。取水稻葉片組織,在液氮中研磨后,用trizol試劑(invitrogen,usa)提取總rna,用m-mlv反轉(zhuǎn)錄酶(promega,usa)合成cdna第一鏈,方法見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明。設(shè)計(jì)loc_os01g62060基因的pcr引物5’-acatcagattggtgcagcatc-3’與5’-atctcttggaaccagcagct-3’;以水稻持家基因β-actin為標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參,引物序列為5’-ggaactggtatggtcaaggc-3’與5’-agtctcatggatacccgcag-3’。pcr試劑采用南京博爾迪生物技術(shù)有限公司的2×pcrmix,20μl反應(yīng)體系,方法見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明。pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min;94℃30s,60℃復(fù)性30s,72℃延伸1min,25個(gè)循環(huán);72℃延伸5min。pcr產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙啶染色后,在紫外透射儀上,用305nm波段觀察凝膠上的電泳條帶,分析loc_os01g62060基因的表達(dá)水平。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該基因在野生型中花11有表達(dá),而在深綠穗突變體不表達(dá),因此,確定loc_os01g62060基因?yàn)楹蜻x基因。

loc_os01g62060基因的序列如seqidno:1所示。

實(shí)施例6、水稻loc_os01g62060基因的轉(zhuǎn)基因功能互補(bǔ)試驗(yàn)

為驗(yàn)證侯選基因loc_os01g62060的功能,設(shè)計(jì)帶有限制性內(nèi)切酶序列的pcr引物:5’-ggggtaccatggacgacggcggcggc-3’與5’-cgcggatccctagtcgtcgtctccgcc-3’,采用高保真酶premixprimestarhs(takara,japan),pcr擴(kuò)增該基因的cdna序列(為seqidno:2),pcr擴(kuò)增體系與程序方法見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明。pcr產(chǎn)物與表達(dá)載體pcambia1300s分別用限制內(nèi)切酶kpni與bamhi(takara,japan)進(jìn)行酶切,方法見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明。采用t4dna連接酶(promega,usa)將酶切完的pcr產(chǎn)物與pcambia1300s載體進(jìn)行dna連接,方法見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明,構(gòu)建了loc_os01g62060基因表達(dá)載體。并根據(jù)文獻(xiàn)《aprotocolforagrobacterium-mediatedtransformationinrice》(引自:natprotoc,2006,1(6):2796-2802.)的方法,將構(gòu)建好的loc_os01g62060基因表達(dá)載體遺傳轉(zhuǎn)化到水稻深綠穗突變體中,獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因水稻,其穗色恢復(fù)到了野生型的黃綠色,驗(yàn)證了loc_os01g62060基因的功能,克隆了該水稻深綠穗基因。即,loc_os01g62060基因?qū)μ岣叩舅胫腥~綠素的含量具有負(fù)調(diào)控的作用。

最后,還需要注意的是,以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然,本發(fā)明不限于以上實(shí)施例,還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形,均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。

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