本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種構(gòu)建遺傳工程菌的方法及其在轉(zhuǎn)化l-天冬氨酸產(chǎn)β-丙氨酸上的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

一、β-丙氨酸的醫(yī)療價值及其生理功能

β-丙氨酸是自然界中唯一存在的β型氨基酸，作為一種重要的精細(xì)化工品和藥物中間體,其用途廣泛：工業(yè)上,是合成泛酸鈣和肌肽的重要原料,也是合成聚β-氨基丙酸的前體物質(zhì)；醫(yī)藥上,作為原料用于合成抑制惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移的帕米膦酸鈉和抗結(jié)腸炎藥物巴柳氮,還是復(fù)方氨基酸的一種重要成分；同時還可作為鉛中毒的解毒劑以及用于合成甜味劑等。由于β-丙氨酸及其衍生物在醫(yī)藥、美容、食品、飼料及化工等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用,市場需求量呈日漸上升趨勢。

目前工業(yè)上主要通過化學(xué)方法生產(chǎn)β-丙氨酸，如丙烯腈法、丙烯酸法、琥珀酰亞胺(丁二酰亞胺)降解法、β-氨基丙腈法等，存在成本高、工藝條件苛刻、副產(chǎn)物較多及生產(chǎn)環(huán)境不友好等缺點(diǎn)，新的生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)工藝被認(rèn)為是最有前景的替代方法。

生物轉(zhuǎn)化法是以l-天冬氨酸為生產(chǎn)原料，利用微生物細(xì)胞胞內(nèi)的l-天冬氨酸α-脫羧酶(l-aspartateα-decarboxylase)催化l-天冬氨酸脫α位羧基生產(chǎn)β-丙氨酸(見圖1)。采用基因工程手段構(gòu)建工程菌是實(shí)現(xiàn)酶高效表達(dá)的重要途徑，目前工程菌株外源表達(dá)l-天冬氨酸α-脫羧酶的基因多來源于大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌，酶活不高，專利cn104531796a中通過l-天冬氨酸α-脫羧酶工程菌全細(xì)胞催化生產(chǎn)β-丙氨酸，最高催化48g/l的l-天冬氨酸，β-丙氨酸濃度約為32g/l，距離工業(yè)化應(yīng)用尚有距離，且酶需要多次反復(fù)投放，操作較為復(fù)雜。文獻(xiàn)“枯草芽胞桿菌l-天冬氨酸α-脫羧酶的酶學(xué)性質(zhì)”(生物工程學(xué)報(bào),2015,31(8):1184–1193.)比較了枯草芽孢桿菌和其他菌屬來源的pand基因表達(dá)的l-天冬氨酸α-脫羧酶，揭示了芽孢桿菌屬酶學(xué)性質(zhì)，具有更好的熱穩(wěn)定性和比酶活，應(yīng)是實(shí)現(xiàn)l-天冬氨酸α-脫羧酶高效表達(dá)、高效率轉(zhuǎn)化生產(chǎn)β-丙氨酸的重要選擇。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明是為了克服目前現(xiàn)有工程菌異源表達(dá)酶活不高的缺點(diǎn)，提供一種篩選分離到的一株特基拉芽孢桿菌pand37(cgmccno.10506)的)l-天冬氨酸α-脫羧酶基因(pand基因)，并以此為模板構(gòu)建基因工程菌，以及這種高產(chǎn)工程菌的構(gòu)建、表達(dá)和純化，及其全細(xì)胞轉(zhuǎn)化和發(fā)酵液直接轉(zhuǎn)化合成β-丙氨酸的方法；所述的特基拉芽孢桿菌pand37(bacillustequilensispand37)，已于2015年2月2日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號：cgmccno.10506，保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一株特基拉芽孢桿菌pand37(cgmccno.10506)的pand基因，見seq.no.1。

一種產(chǎn)l-天冬氨酸α-脫羧酶工程菌，所述的工程菌包含seq.no.1。產(chǎn)l-天冬氨酸α-脫羧酶工程菌的構(gòu)建方法，通過分子生物學(xué)手段從微生物中克隆獲得l-天冬氨酸α-脫羧酶基因，構(gòu)建含l-天冬氨酸α-脫羧酶基因的表達(dá)載體，將構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入e.colibl21(de3)，通過氨芐青霉素抗性平板篩選獲得表達(dá)載體高拷貝重組的含l-天冬氨酸α-脫羧酶工程菌，并通過表達(dá)和分泌獲得的l-天冬氨酸α-脫羧酶轉(zhuǎn)化l-天冬氨酸生產(chǎn)β-丙氨酸。

一種產(chǎn)l-天冬氨酸α-脫羧酶工程菌的構(gòu)建方法，具體實(shí)施步驟為：

1、根據(jù)特基拉芽孢桿菌全基因組中l(wèi)-天冬氨酸α-脫羧酶基因的序列信息設(shè)計(jì)含有限制性內(nèi)切酶bamhi酶切位點(diǎn)的上游引物f-pand：5′-aaggatccgaaggagatataccatgtatcg-3′；和含有xhoi酶切位點(diǎn)(黑體表示)的下游引物r-pand：5′-ttctcgagctacaaaattgtacgggcgggttc-3′；

通過細(xì)菌基因組dna提取試劑盒提取得到特基拉芽孢桿菌pand37(cgmccno.10506)基因組dna，并以該基因組dna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr反應(yīng)體系包括10×extaqbuffer(mg²⁺plus)4μl，dntpsmixture4.5μl，takaraextaq0.3μl，模板1.0μl，上下游引物各1.0μl，用ddh2o補(bǔ)足至50μl；pcr反應(yīng)參數(shù)為：94℃30s，60℃30s，72℃2min，30個循環(huán)后，72℃延伸10min；pcr擴(kuò)增產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠檢測，并用axyprepdna凝膠回收試劑盒純化目標(biāo)dna片段；用bamhi和xhoi分別酶切載體pet32a及pand片段，然后用dna連接酶將pand片段與載體連接并轉(zhuǎn)化e.colibl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆，獲得產(chǎn)l-天冬氨酸α-脫羧酶的工程菌；

2、將構(gòu)建的產(chǎn)l-天冬氨酸α-脫羧酶的工程菌接入lb斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)14-24h；

3、接1環(huán)斜面產(chǎn)l-天冬氨酸α-脫羧酶基因的工程菌種于lb液體種子培養(yǎng)基培養(yǎng)6-12h；

4、發(fā)酵罐中裝入培養(yǎng)基，種子液以5％(體積比)種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，初始轉(zhuǎn)速200r/min，初始通氣流量為2l/min，隨著菌體od600值增加調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速與通氣流量，以維持溶氧值在20％以上，用氨水調(diào)節(jié)ph值穩(wěn)定在7.0，37℃培養(yǎng)6-10h，然后降溫至24-30℃表達(dá)；發(fā)酵過程中采用do-stat、ph-stat方式流加補(bǔ)料培養(yǎng)基；發(fā)酵結(jié)束后8000r/min、4℃離心10min收集含有l(wèi)-天冬氨酸α-脫羧酶基因的工程菌菌體。

利用構(gòu)建的產(chǎn)l-天冬氨酸α-脫羧酶的工程菌轉(zhuǎn)化l-天冬氨酸生產(chǎn)β-丙氨酸，具體方法如下：

1、將產(chǎn)l-天冬氨酸α-脫羧酶的工程菌菌體投入轉(zhuǎn)化液中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其轉(zhuǎn)化液為：ph為7.0、100-200g/ll-天冬氨酸溶液，加入濕的l-天冬氨酸α-脫羧酶工程菌菌體20-80g，轉(zhuǎn)化過程中控制ph在7.0，溫度30-40℃，轉(zhuǎn)化10-20h。

進(jìn)一步，轉(zhuǎn)化液ph值用naoh調(diào)節(jié)。

進(jìn)一步，轉(zhuǎn)化過程中ph值用2mol/lhcl控制。

本發(fā)明所述的基因工程菌及其構(gòu)建應(yīng)用生產(chǎn)β-丙氨酸的有益效果：

1、本發(fā)明是國內(nèi)外第一次使用來源于特基拉芽孢桿菌內(nèi)的l-天冬氨酸α-脫羧酶轉(zhuǎn)化l-天冬氨酸生產(chǎn)β-丙氨酸，該酶在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)后，表現(xiàn)出很高的活力，可以滿足工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的需求。

2、建立起的新型生物法生產(chǎn)β-丙氨酸的工藝，可以避免目前主要采用的化學(xué)合成法成本高、條件及生產(chǎn)環(huán)境不友好等缺點(diǎn)，具有明顯的經(jīng)濟(jì)社會效益。

3、本發(fā)明所提供的l-天冬氨酸α-脫羧酶工程菌遺傳穩(wěn)定性好，培養(yǎng)基成分簡單原料成本低，產(chǎn)生的l-天冬氨酸α-脫羧酶酶活力高，發(fā)酵得到的菌體無需破碎，即可直接用于轉(zhuǎn)化，可直接利用該菌株細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化β-丙氨酸，最高可以轉(zhuǎn)化180g/l的l-天冬氨酸，β-丙氨酸產(chǎn)量達(dá)到119.8g/l，工業(yè)應(yīng)用具有優(yōu)勢。

附圖說明

圖1：l-天冬氨酸α-脫羧酶催化反應(yīng)機(jī)制；

圖2：重組質(zhì)粒pet32a-pand的構(gòu)建；

圖3：β-丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品液相譜圖(6.8min)；

圖4：基因工程菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)物液相譜圖(6.8min)。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例結(jié)合附圖來對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步解釋，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受實(shí)施例任何形式上的限制。

實(shí)施例1

含l-天冬氨酸α-脫羧酶基因工程菌的構(gòu)建

以特基拉芽孢桿菌pand37(cgmccno.10506)全基因組為模板，設(shè)計(jì)一對引物pcr擴(kuò)增l-天冬氨酸α-脫羧酶基因pand，構(gòu)建重組質(zhì)粒pet-32a-pand(如圖2所示)，轉(zhuǎn)化e.colibl21(de3)得到產(chǎn)l-天冬氨酸α-脫羧酶的工程菌。

根據(jù)特基拉芽孢桿菌全基因組(lgrw01000001)中l(wèi)-天冬氨酸α-脫羧酶基因的序列信息設(shè)計(jì)含有限制性內(nèi)切酶bamhi酶切位點(diǎn)的上游引物f-pand：5′-aaggatccgaaggagatataccatgtatcg-3′；和含有xhoi酶切位點(diǎn)(黑體表示)的下游引物r-pand：5′-ttctcgagctacaaaattgtacgggcgggttc-3′。通過細(xì)菌基因組dna提取試劑盒提取得到bacillustequilensispand37(cgmccno.10506)基因組dna，并以該基因組dna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr反應(yīng)體系包括10×extaqbuffer(mg²⁺plus)4μl，dntpsmixture4.5μl，takaraextaq0.3μl，模板1.0μl，上下游引物各1.0μl，用ddh2o補(bǔ)足至50μl。pcr反應(yīng)參數(shù)為：94℃30s，60℃30s，72℃2min，30個循環(huán)后，72℃延伸10min。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠檢測，并用axyprepdna凝膠回收試劑盒純化目標(biāo)dna片段。用bamhi和xhoi分別酶切載體pet32a及pand片段，然后用dna連接酶將pand片段與載體連接并轉(zhuǎn)化e.colibl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆，獲得l-天冬氨酸α-脫羧酶基因工程菌。

實(shí)施例2

通過表達(dá)和分泌獲得l-天冬氨酸α-脫羧酶轉(zhuǎn)化l-天冬氨酸生產(chǎn)β-丙氨酸

(1)將構(gòu)建的l-天冬氨酸α-脫羧酶基因工程菌接入lb斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)24h；

(2)接1環(huán)斜面l-天冬氨酸α-脫羧酶基因工程菌菌種于lb液體種子培養(yǎng)基培養(yǎng)12h；

(3)5l發(fā)酵罐中裝入3.0l培養(yǎng)基，種子液以5％(體積比)種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，初始轉(zhuǎn)速200r/min，初始通氣流量為2l/min，隨著菌體od600值增加調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速與通氣流量，以維持溶氧值在20％(溶氧電極測定)以上，用25％(g/100ml)氨水調(diào)節(jié)ph值穩(wěn)定在7.0，37℃培養(yǎng)6h，然后降溫至30℃表達(dá)。發(fā)酵過程中采用do-stat方式流加補(bǔ)培養(yǎng)基。發(fā)酵結(jié)束后8000r/min、4℃離心10min收集菌體，無菌生理鹽水洗滌l-天冬氨酸α-脫羧酶基因工程菌菌體兩次。

(4)將步驟(3)收集的l-天冬氨酸α-脫羧酶基因工程菌菌體投入轉(zhuǎn)化液中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化液的配制方法為：100g/ll-天冬氨酸溶液2l，naoh調(diào)節(jié)ph為7.0；加入濕l-天冬氨酸α-脫羧酶基因工程菌菌體20g，轉(zhuǎn)化過程中自動流加2mol/lhcl控制ph在7.0，溫度32℃，在5l自控發(fā)酵罐上轉(zhuǎn)化10h,β-丙氨酸濃度為66.3g/l，摩爾轉(zhuǎn)化率99.1％。

轉(zhuǎn)化液中β-丙氨酸含量按以下方法來測定取轉(zhuǎn)化液10000rpm離心10min，收集上清液，并以β-丙氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，配制標(biāo)準(zhǔn)溶液；將適度稀釋后的上清液和標(biāo)準(zhǔn)溶液分別與2，4-二硝基氟苯衍生，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后，用高效液相色譜法測定β-丙氨酸的含量。β-丙氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)品的液相譜圖(6.8min)如圖3所示；基因工程菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)物液相譜圖(6.8min)如圖4所示。

高效液相色譜條件：

液相色譜條件為氨基酸專用ods-c18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm)，柱溫：33℃；檢測波長：360nm；流動相a：50％乙腈，流動相b：0.45％乙酸鈉緩沖液(ph6.4)，按表1梯度洗脫，流動相總流量：1ml/min，2,4-二硝基氟苯柱前衍生測定。

表1流動相洗脫方式

實(shí)施例3

通過表達(dá)和分泌獲得l-天冬氨酸α-脫羧酶轉(zhuǎn)化l-天冬氨酸生產(chǎn)β-丙氨酸

(1)將構(gòu)建的l-天冬氨酸α-脫羧酶基因工程菌接入lb斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)18h；

(2)接1環(huán)斜面l-天冬氨酸α-脫羧酶基因工程菌菌種于lb液體種子培養(yǎng)基培養(yǎng)8h；

(3)5l發(fā)酵罐中裝入3.0l培養(yǎng)基，種子液以7％(體積比)種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，初始轉(zhuǎn)速200r/min，初始通氣流量為2l/min，隨著菌體od600值增加調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速與通氣流量，以維持溶氧值在25％以上，用25％氨水調(diào)節(jié)ph值穩(wěn)定在7.0，37℃培養(yǎng)9h降溫至26℃表達(dá)。發(fā)酵過程中采用ph-stat方式流加補(bǔ)培養(yǎng)基。發(fā)酵結(jié)束后8000r/min、4℃離心10min收集菌體，無菌生理鹽水洗滌l-天冬氨酸α-脫羧酶基因工程菌菌體兩次。

(4)將步驟(3)收集的l-天冬氨酸α-脫羧酶基因工程菌菌體投入轉(zhuǎn)化液中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化液的配制方法為：150g/ll-天冬氨酸溶液2l，naoh調(diào)節(jié)ph為7.0；加入濕l-天冬氨酸α-脫羧酶基因工程菌菌體30g，轉(zhuǎn)化過程中自動流加2mol/lhcl控制ph在7.0，溫度37℃，在5l自控發(fā)酵罐上轉(zhuǎn)化13h,β-丙氨酸濃度為99.9g/l，摩爾轉(zhuǎn)化率99.5％。

實(shí)施例4

通過表達(dá)和分泌獲得l-天冬氨酸α-脫羧酶轉(zhuǎn)化l-天冬氨酸生產(chǎn)β-丙氨酸

(1)將構(gòu)建的l-天冬氨酸α-脫羧酶基因工程菌接入lb斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)14h；

(2)接1環(huán)斜面l-天冬氨酸α-脫羧酶基因工程菌菌種于lb液體種子培養(yǎng)基培養(yǎng)6h；

(3)5l發(fā)酵罐中裝入3.0l培養(yǎng)基，種子液以5％(體積比)種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，初始轉(zhuǎn)速200r/min，初始通氣流量為2l/min，隨著菌體od600值增加調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速與通氣流量，以維持溶氧值在20％以上，用25％氨水調(diào)節(jié)ph值穩(wěn)定在7.0，37℃培養(yǎng)7h降溫至25℃表達(dá)。發(fā)酵過程中采用do-stat方式流加補(bǔ)培養(yǎng)基。發(fā)酵結(jié)束后8000r/min、4℃離心10min收集菌體，無菌生理鹽水洗滌l-天冬氨酸α-脫羧酶基因工程菌菌體兩次。

(4)將步驟(3)收集的l-天冬氨酸α-脫羧酶基因工程菌菌體投入轉(zhuǎn)化液中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化液的配制方法為：180g/ll-天冬氨酸溶液2l，naoh調(diào)節(jié)ph為7.0；加入濕l-天冬氨酸α-脫羧酶基因工程菌菌體20g，轉(zhuǎn)化過程中自動流加2mol/lhcl控制ph在7.0，溫度40℃，在5l自控發(fā)酵罐上轉(zhuǎn)化18h,β-丙氨酸濃度為119.8g/l，摩爾轉(zhuǎn)化率99.4％。

sequencelisting

<110>魯東大學(xué)

<120>生產(chǎn)β-丙氨酸的工程菌構(gòu)建及其生產(chǎn)β-丙氨酸的方法

<130>無

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>383

<212>dna

<213>bacillussp.

<400>1

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<213>artificial

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<223>下游引物r-pand

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