本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種金離子檢測及吸附系統(tǒng)及其宿主菌、金離子回收方法。

背景技術(shù)：

金是人類較早發(fā)現(xiàn)和利用的貴金屬，由于其資源稀少及特有的理化性質(zhì)，自古以來被視為五金之首，有“金屬之王”的稱號。金是重金屬中少有的化學(xué)、物理、電子性能優(yōu)異的金屬，具有較高的穩(wěn)定性，它的應(yīng)用領(lǐng)域非常廣泛。由于金具備非常穩(wěn)定的理化性質(zhì)，如抗腐蝕性、導(dǎo)電性、導(dǎo)熱性和穩(wěn)定性，使它能夠廣泛用到許多現(xiàn)代高新技術(shù)當(dāng)中去，金離子在免疫系統(tǒng)能夠作為白細胞等免疫細胞的抑制劑。此外，金在生物學(xué)及醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域同樣扮演重要的作用，如細菌抗性及抗癌藥物研發(fā)等。

當(dāng)今社會重金屬對土壤、水、環(huán)境的污染問題越來越受到重視。重金屬金的礦產(chǎn)資源被開發(fā)的同時，有一部分進入環(huán)境中，然后通過地大氣、地表水、地下水和生物鏈直至大氣圈等傳播途徑，對人民的生產(chǎn)生活以及生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生污染、破壞乃至威脅到人們的生存環(huán)境及生命健康。此外，在不合理的開采和黃金的冶煉及二次加工等生產(chǎn)過程中產(chǎn)生一些副產(chǎn)物，這些問題已經(jīng)嚴重影響到黃金產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。眾所周知，黃金的含量是十分有限的，屬于稀有的貴金屬資源，如果我們能夠合理地開發(fā)金礦產(chǎn)資源，減少資源的浪費，可以很大程度上提高金礦產(chǎn)資源的有效利用率。所以，能夠?qū)Νh(huán)境中的金離子的檢測，以及能夠合理的回收環(huán)境中的金離子十分重要。隨著金應(yīng)用范圍的不斷擴大，尤其是金在食品安全方面以及醫(yī)藥健康的使用，從而致使許多金離子通過食物鏈的富集作用進入到動植物體內(nèi)，能使蛋白質(zhì)變性引起環(huán)境以及人的健康危害。由于金離子在環(huán)境中不能被分解，還能夠在水中的其他的有毒物質(zhì)結(jié)合生成毒性更大的產(chǎn)物，這些有毒產(chǎn)物通過動植物吸收，對消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)造成嚴重破壞。金離子還能夠在人體內(nèi)與各種酶發(fā)生的結(jié)合形成復(fù)合物，使酶本身失去活性，進而使人的身體機能遭到破壞，危害人體的健康，嚴重時甚至威脅生命。特別三價金離子能夠與生物體內(nèi)發(fā)生作用，導(dǎo)致生物體中毒，影響生物體的健康。所以重金屬金離子的檢測和回收逐漸為社會所關(guān)注，尋找準確、靈敏、快速的金檢測方法在當(dāng)今科學(xué)界具有非常重要的意義，如何檢測和回收環(huán)境中的金離子成為當(dāng)今時代的熱點問題。

現(xiàn)有的重金屬離子回收方法主要是化學(xué)方法，通過加入化學(xué)試劑與重金屬離子形成沉淀或者懸浮達到回收重金屬的目的。但是化學(xué)方法有三個缺點：第一是化學(xué)方法有可能由于加入的化學(xué)試劑的量不合適而造成二次污染；第二是化學(xué)方法選擇性不夠高，尤其是處理性質(zhì)極相近的各種重金屬效果不好，即使回收得到了一定的目的金屬，純度也不高，還需要進一步處理；第三是化學(xué)方法回收工業(yè)廢水中的重金屬，所產(chǎn)生污水對于環(huán)境不友好，沉淀劑等化學(xué)試劑可能對于自然環(huán)境造成更大的破壞。因此，現(xiàn)有的方法很難實現(xiàn)對工業(yè)廢水中金離子的高效選擇性檢測及富集和回收。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種金離子檢測及吸附系統(tǒng)及其宿主菌、金離子回收方法，旨在解決現(xiàn)有金離子回收選擇性不強、純度低、效果不理想，以及污染環(huán)境的技術(shù)問題。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一方面，本發(fā)明提供一種金離子檢測及吸附系統(tǒng)，包括檢測單元和與所述檢測單元連接的吸附單元，所述檢測單元包括熒光蛋白dna序列，且所述熒光蛋白dna序列與第一啟動子連接；所述吸附單元包括互相連接的枯草芽孢桿菌芽孢衣蛋白cotcdna序列和金離子結(jié)合蛋白golbdna序列，且所述枯草芽孢桿菌芽孢衣蛋白cotcdna序列與第二啟動子連接；所述檢測單元位于所述吸附單元的上游。

另一方面，本發(fā)明提供一種金離子檢測及吸附蛋白表面展示系統(tǒng)，包括由上述金離子檢測及吸附系統(tǒng)表達的熒光蛋白、枯草芽孢桿菌芽孢衣蛋白cotc和金離子結(jié)合蛋白golb。

另一方面，本發(fā)明提供一種表達載體，包括上述金離子檢測及吸附系統(tǒng)。

又一方面，本發(fā)明提供一種宿主菌，所述宿主菌包括上述表達載體或所述宿主菌表達上述金離子檢測及吸附蛋白表面展示系統(tǒng)。

再一方面，本發(fā)明提供一種上述金離子檢測及吸附系統(tǒng)的制備方法，包括如下步驟：

從枯草芽孢桿菌基因組中擴增出枯草芽孢桿菌芽孢衣蛋白cotcdna序列，從鼠傷寒沙門氏菌基因組中擴增出金離子結(jié)合蛋白golbdna序列；

以所述枯草芽孢桿菌芽孢衣蛋白cotcdna序列和所述金離子結(jié)合蛋白golbdna序列為模板，擴增出cotc-golb融合蛋白dna序列；

從大腸桿菌表達載體基因組中擴增熒光蛋白dna序列；

將第一啟動子、所述熒光蛋白dna序列、第二啟動子、所述cotc-golb融合蛋白dna序列依次連接。

最后，本發(fā)明提供一種金離子回收方法，包括如下步驟：

提供含有金離子的液體；

將本發(fā)明的宿主菌培養(yǎng)后加入所述液體中，靜置處理；

待所述溶液中出現(xiàn)沉淀后，進行過濾處理得到吸附有金離子的所述宿主菌；

用酸處理吸附有金離子的所述宿主菌，分離后得到金離子。

本發(fā)明的金離子檢測及吸附系統(tǒng)基于鼠傷寒沙門氏菌中金離子的調(diào)控機制設(shè)計，其中包含了檢測單元和吸附單元，檢測單元包括報告熒光蛋白dna序列，其可以可視化檢測金離子，而吸附單元包括cotc-golb吸附部分，高效吸附金離子。將該系統(tǒng)連接到質(zhì)粒中后導(dǎo)入非致病性的枯草芽孢桿菌細胞體內(nèi)，在啟動子調(diào)控下可視化檢測和吸附金離子，因此該種經(jīng)過改造后的工程菌對金離子的檢測及吸附具有很好的效果；因報告熒光蛋白、枯草芽孢桿菌芽孢衣蛋白cotc和金離子結(jié)合蛋白golb的高效表達，其工程菌可以表達金離子檢測及吸附蛋白表面展示系統(tǒng)，因此金離子檢測及吸附系統(tǒng)容易制備、成本較低、操作方便。

本發(fā)明提供的金離子回收方法，可以集金離子檢測及吸附一體化，用本發(fā)明的工程菌對含金工業(yè)廢水的處理：將工程菌液加入到廢水中，菌體能夠在檢測到含金廢水的同時在細胞膜外大量表達golb蛋白，將廢水中的金離子結(jié)合。在完成金離子的結(jié)合吸附后，對菌體進行聚集和沉淀，菌體回收方便。通過對菌體的處理和二次使用，本發(fā)明最終能夠通過生物手段實現(xiàn)對工業(yè)廢水中重金屬金的檢測及可循環(huán)富集和回收；因此，本發(fā)明能夠克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點，不會造成二次污染，對環(huán)境友好。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例1金離子檢測系統(tǒng)質(zhì)粒構(gòu)建圖譜；

圖2是本發(fā)明實施例1金離子檢測系統(tǒng)質(zhì)粒的電泳鑒定圖；其中m是dna分子量標準，1是金離子檢測系統(tǒng)質(zhì)粒泳道；

圖3是本發(fā)明實施例2金離子吸附系統(tǒng)質(zhì)粒構(gòu)建圖譜；

圖4是本發(fā)明實施例2金離子吸附系統(tǒng)質(zhì)粒的電泳鑒定圖；其中m是dna分子量標準，1是融合蛋白表達cotc-golb質(zhì)粒泳道；

圖5是本發(fā)明實施例3金離子檢測及吸附系統(tǒng)質(zhì)粒構(gòu)建圖譜；

圖6是本發(fā)明實施例5水體中金離子選擇性檢測效果示意圖；

圖7是本發(fā)明實施例6金離子檢測及吸附系統(tǒng)對金離子吸附效果對比圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

一方面，本發(fā)明實施例提供了一種金離子檢測及吸附系統(tǒng)，包括檢測單元和與該檢測單元連接的吸附單元，檢測單元包括熒光蛋白dna序列，且該熒光蛋白dna序列與第一啟動子連接；吸附單元包括互相連接的枯草芽孢桿菌芽孢衣蛋白cotcdna序列和金離子結(jié)合蛋白golbdna序列，且枯草芽孢桿菌芽孢衣蛋白cotcdna序列與第二啟動子連接；該檢測單元位于吸附單元的上游。

在一實施例中，第一啟動子為pgols-gols-pgolb，其序列如seqidno:10所示；第二啟動子為pgolb，其序列如seqidno:19所示。大腸桿菌外膜蛋白ompa的dna序列如seqidno:3所示，金離子結(jié)合蛋白golb的dna序列如seqidno:6所示。

具體地，熒光蛋白是一種發(fā)光、可視化的蛋白，可為紅色熒光蛋白rfp或綠色熒光蛋白egfp，在本實施例中主要起對金離子可視化檢測報告作用，在本發(fā)明一優(yōu)選的實施例中，熒光蛋白為紅色熒光蛋白rfp，其dna序列如seqidno:13所示。

另一方面，本發(fā)明實施例提供一種金離子檢測及吸附蛋白表面展示系統(tǒng)，其包括由本發(fā)明實施例的金離子檢測及吸附系統(tǒng)表達的熒光蛋白、枯草芽孢桿菌芽孢衣蛋白cotc和金離子結(jié)合蛋白golb。

另一方面，本發(fā)明實施例提供了一種表達載體，該表達載體包括本實施例的金離子檢測及吸附系統(tǒng)。同時，本發(fā)明實施例提供了一種宿主菌，該宿主菌包括本實施例的表達載體；或表達本實施例的金離子檢測及吸附蛋白表面展示系統(tǒng)。

又一方面，本發(fā)明實施例提供一種上述金離子檢測及吸附系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

s011：從枯草芽孢桿菌基因組中擴增出枯草芽孢桿菌芽孢衣蛋白cotcdna序列，從鼠傷寒沙門氏菌基因組中擴增出金離子結(jié)合蛋白golbdna序列；

s012：以上述枯草芽孢桿菌芽孢衣蛋白cotcdna序列和金離子結(jié)合蛋白golbdna序列為模板，擴增出cotc-golb融合蛋白dna序列；

s013：從大腸桿菌表達載體基因組中擴增熒光蛋白dna序列；

s014：將第一啟動子、熒光蛋白dna序列、第二啟動子、cotc-golb融合蛋白dna序列依次連接。

在一實施例中，擴增枯草芽孢桿菌芽孢衣蛋白cotc的dna序列的引物如seqidno:1、seqidno:2所示；擴增金離子結(jié)合蛋白golb的dna序列的引物如seqidno:4、seqidno:5所示物。

而根據(jù)具體熒光蛋白不同，選擇的擴增引物也不同，本實施例的熒光蛋白dna序列為紅色熒光蛋白rfpdna序列，其可以從本實驗室的大腸桿菌表達載體基因組中擴增紅色熒光蛋白rfpdna序列，且擴增引物如seqidno:11、seqidno:12所示。而在一實施例中，第一啟動子為pgols-gols-pgolb，且其擴增引物如seqidno:8、seqidno:9所示，第二啟動子為pgolb，且其擴增引物如seqidno:17、seqidno:18所示，兩種啟動子都可以從從鼠傷寒沙門氏菌基因組擴增得到，而本實施例的pgolb優(yōu)選從本實驗室的大腸桿菌生物磚表達載體pzh2中擴增，效率更高。

最后，本發(fā)明實施例還提供一種金離子回收方法，包括如下步驟：

s021：提供含有金離子的液體；

s022：將本發(fā)明實施例的宿主菌培養(yǎng)后加入到上述液體中，靜置處理；

s023：待溶液中出現(xiàn)沉淀后，進行過濾處理得到吸附有金離子的宿主菌；

s024：用酸處理吸附有金離子的宿主菌，分離后得到金離子。

在一選實施例中，上述步驟s021中，含有金離子的液體可以是各種工業(yè)廢水、礦業(yè)廢水等中含有金離子回收液，在該液體中金離子的濃度范圍優(yōu)選為0.1μm～20μm；上述步驟s022中，靜置處理的時間范圍為40h～48h，該范圍內(nèi)宿主菌對液體中金離子起到很好的吸附效果。

本發(fā)明先后進行過多次試驗，現(xiàn)舉一部分試驗結(jié)果作為參考對發(fā)明進行進一步詳細描述，下面結(jié)合具體實施例進行詳細說明。

實施例1金離子檢測系統(tǒng)表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

1.檢測系統(tǒng)中金離子誘導(dǎo)基因：啟動子pgols-gols-pgolb擴增

使用特異引物pgolts1(seqidno:8)和pgolts2(seqidno:9)從鼠傷寒沙門氏菌基因組dna(ncbi中的引用位置：nc_003197)中擴增出編碼金誘導(dǎo)基因的dna序列(seqidno:10)，反應(yīng)條件如下。本實施例的金離子誘導(dǎo)基因(goldinductivegene)即為啟動子pgols-gols-pgolbgols，其可以表達gols蛋白，gols蛋白平時起到阻遏作用，在有金離子存在時才會從啟動子pgolb的dna序列上脫落，引發(fā)下游基因表達。

pcr反應(yīng)體系(50μl)：

pcr反應(yīng)條件：

第一步：95℃，3分鐘

第二步：95℃，1分鐘

第三步：60℃，2分鐘

第四步：72℃，4分鐘

第五步：重復(fù)第二步至第四步，29個循環(huán)

第六步：72℃10分鐘

第七步：4℃保溫。

回收pcr產(chǎn)物，備用。

2.檢測系統(tǒng)中報告基因rfp-terminator片段的擴增

1)紅色熒光蛋白rfp片段基因的擴增

使用特異引物rfp1(seqidno:11)和rfp2(seqidno:12)從本實驗室的大腸桿菌表達載體基因組dna中擴增出編碼紅色熒光蛋白rfp的dna序列(seqidno:13)，反應(yīng)條件如下。

pcr反應(yīng)體系(50μl)：

pcr反應(yīng)條件：

第一步：94℃，2分鐘

第二步：94℃，0.5分鐘

第三步：60℃，0.5分鐘

第四步：72℃，1分鐘

第五步：重復(fù)第二步至第四步，29個循環(huán)

第六步：72℃。10分鐘

第七步：10℃保溫。

回收pcr產(chǎn)物，備用。

2)終止子terminator片段的基因擴增

根據(jù)所需擴增目的dna序列和堿基互配原理，設(shè)計特異引物term1(seqidno:14)和term2(seqidno:15)，從本實驗室所有的大腸桿菌表達載體基因組dna中擴增出終止子terminator的dna序列(seqidno:16)，反應(yīng)條件如下。

pcr反應(yīng)體系(50μl)：

pcr反應(yīng)條件：

第一步：94℃，2分鐘

第二步：94℃，0.5分鐘

第三步：60℃，0.5分鐘

第四步：72℃，0.5分鐘

第五步：重復(fù)第二步至第四步，29個循環(huán)

第六步：72℃，10分鐘

第七步：10℃保溫。

回收pcr產(chǎn)物，備用。

3)rfp-terminator片段的基因擴增

根據(jù)所需擴增目的dna序列和堿基互配原理，使用特異引物rfp1(seqidno:11)和term2(seqidno:15)，以rfp片段和terminator片段的擴增產(chǎn)物為模版，擴增出ompa-golb片段的dna序列，反應(yīng)條件如下。

pcr反應(yīng)體系(50μl)：

pcr反應(yīng)條件：

第一步：94℃，2分鐘

第二步：94℃，0.5分鐘

第三步：65℃，0.5分鐘

第四步：72℃，1分鐘

第五步：重復(fù)第二步至第四步，29個循環(huán)

第六步：72℃，10分鐘

第七步：10℃保溫。

回收pcr產(chǎn)物，備用。

3.檢測系統(tǒng)中金離子誘導(dǎo)基因和報告基因融合蛋白表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

1)使用dna限制性內(nèi)切酶ecori和psti酶切上述金離子誘導(dǎo)基因：啟動子pgols-gols-pgolb擴增得到的dna片段(seqidno:10)，然后使用t4dna連接酶插入到本實驗室所有的大腸桿菌生物磚表達載體pzh2中。

酶切反應(yīng)體系(20μl)：

反應(yīng)條件：37℃，水浴10小時。

dna連接反應(yīng)體系(10μl，100ngdna)：

反應(yīng)條件：16℃，水浴16小時。

2)使用dna限制性內(nèi)切酶xbai和psti酶切上述rfp-terminator的擴增dna片段，然后使用t4dna連接酶插入1)步驟構(gòu)建完成的大腸桿菌生物磚表達載體pzh2中。

酶切反應(yīng)體系(20μl)：

反應(yīng)條件：37℃，水浴10小時。

dna連接反應(yīng)體系(10μl，100ngdna)：

反應(yīng)條件：16℃，水浴16小時。

3)檢測系統(tǒng)中金離子誘導(dǎo)基因和報告基因融合蛋白表達質(zhì)粒的提取結(jié)果請見圖1(圖中g(shù)olb啟動子即為啟動子pgols-gols-pgolb)，電泳鑒定結(jié)果請見圖2。

實施例2金離子吸附系統(tǒng)表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

1.吸附系統(tǒng)中啟動子pgolb片段的擴增

根據(jù)所需擴增目的dna序列和堿基互配原理，設(shè)計特異引物pgolb1(seqidno:17)和pgolb2(seqidno:18)，從本實驗室所有的大腸桿菌生物磚表達載體pzh2中擴增出金離子調(diào)控基因的啟動子pgolb的序列(seqidno:19)，反應(yīng)條件如下。

pcr反應(yīng)體系(50μl)：

pcr反應(yīng)條件：

第一步：95℃，2分鐘

第二步：95℃，0.5分鐘

第三步：63℃，0.5分鐘

第四步：72℃，0.5分鐘

第五步：重復(fù)第二步至第四步，29個循環(huán)

第六步：72℃，10分鐘

第七步：4℃保溫。

回收pcr產(chǎn)物，備用。

2.吸附系統(tǒng)中金離子吸附基因片段的擴增

1)枯草芽孢桿菌芽孢衣蛋白cotc片段的基因擴增

根據(jù)所需擴增目的dna序列和堿基互配原理，設(shè)計特異引物cotc1(seqidno:1)和cotc2(seqidno:2)，從枯草芽孢桿菌基因組dna(ncbi中的引用位置：nc_000964)中擴增出編碼枯草芽孢桿菌芽孢衣蛋白cotc第1位至第159位氨基酸的dna序列(seqidno:3)，反應(yīng)條件如下。

pcr反應(yīng)體系(50μl)：

pcr條件：

第一步：95℃，2分鐘

第二步：95℃，0.5分鐘

第三步：63℃，0.5分鐘

第四步：72℃，0.5分鐘

第五步：重復(fù)第二步至第四步，29個循環(huán)

第六步：72℃10分鐘

第七步：4℃保溫。

回收pcr產(chǎn)物，備用。

2)金離子結(jié)合蛋白golb片段的基因擴增

根據(jù)所需擴增目的dna序列和堿基互配原理，設(shè)計特異引物golb1(seqidno:4)和golb2(seqidno:5)從鼠傷寒沙門氏菌基因組dna(ncbi中的引用位置：nc_003197)中擴增出編碼金離子結(jié)合蛋白golb的dna序列(seqidno:6)，并在其c端加上編碼flag-tag的序列(flag分子量為1012da，是一段由8個氨基酸殘基組成的標記標簽，可以被抗體識別，用于后續(xù)western蛋白印記實驗，從而產(chǎn)生條帶證明蛋白被表達)，反應(yīng)條件如下。

pcr反應(yīng)體系(50μl)：

pcr條件：

第一步：95℃，2分鐘

第二步：95℃，0.5分鐘

第三步：60℃，0.5分鐘

第四步：72℃，0.5分鐘

第五步：重復(fù)第二步至第四步，29個循環(huán)

第六步：72℃，10分鐘

第七步：4℃保溫。

回收pcr產(chǎn)物，備用。

3)終止子terminator片段的基因擴增

根據(jù)所需擴增目的dna序列和堿基互配原理，設(shè)計特異引物term1(seqidno:14)和term2(seqidno:15)，從本實驗室所有的大腸桿菌表達載體基因組dna中擴增出終止子terminator的dna序列(seqidno:16)，反應(yīng)條件如下。

pcr反應(yīng)體系(50μl)：

pcr條件：

第一步：94℃，2分鐘

第二步：94℃0.5分鐘

第三步：60℃0.5分鐘

第四步：72℃0.5分鐘

第五步：重復(fù)第二步至第四步，29個循環(huán)

第六步：72℃10分鐘

第七步：10℃保溫。

回收pcr產(chǎn)物，備用。

3.cotc-golb融合蛋白表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

1)使用dna限制性內(nèi)切酶xbai和psti酶解上述pgolb片段、cotc片段、golb片段以及terminator片段的擴增產(chǎn)物，然后使用t4dna連接酶插入大腸桿菌生物磚表達載體pzh2中，cotc-golb融合蛋白表達質(zhì)粒構(gòu)建圖譜請詳見圖3，其中cotc-golb融合蛋白的dna序列為：seqidno:7。

酶切反應(yīng)體系(20μl)：

反應(yīng)條件：37℃水浴10小時。

dna連接反應(yīng)體系(10μl，100ngdna)：

反應(yīng)條件：16℃水浴16小時。

2)cotc-golb融合蛋白表達質(zhì)粒的提取與鑒定，結(jié)果請見圖4。

實施例3金離子檢測及吸附系統(tǒng)表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

1.使用dna限制性內(nèi)切酶psti和spei酶解上述實施例1中得到的pgols-gols-pgolb-rfp-terminator酶解片段，使其具有粘性末端，使用dna限制性內(nèi)切酶psti和xbai酶解上述實施例2中得到的pgolb-cotc-golb-terminator酶解片段，使其具有粘性末端，然后使用t4dna連接酶插入到大腸桿菌生物磚質(zhì)粒骨架pzh2中，將大腸桿菌生物磚表達載體pzh2中的目的片段使用dna限制性內(nèi)切酶psti和ecori酶酶切下來整合到pdg1730枯草芽孢桿菌表達載體，同源重組到枯草芽孢桿菌的基因組上進行表達，即獲得金離子檢測及吸附一體化系統(tǒng)。

酶切反應(yīng)體系(20μl)：

反應(yīng)條件：37℃水浴10小時。

dna連接反應(yīng)體系(10μl，100ngdna)：

反應(yīng)條件：16℃水浴16小時。

2.金離子檢測及吸附一體化表達質(zhì)粒的提取結(jié)果請見圖5。

實施例4金離子檢測及吸附系統(tǒng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌

1)將上述同源重組所得的表達型質(zhì)粒載體，采用cacl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，酶切鑒定重組整合載體。

2)枯草芽胞桿菌的轉(zhuǎn)化，活化枯草芽胞桿菌轉(zhuǎn)接到spⅰ培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間，然后轉(zhuǎn)到spⅱ培養(yǎng)基中培養(yǎng)形成感受態(tài)，將重組pdg1730質(zhì)粒切成線狀轉(zhuǎn)化枯草芽胞桿菌，具體方法參照zeigler(2002)。

3)重組菌的篩選和鑒定

采用常規(guī)菌落pcr法和抽提陽性克隆的質(zhì)粒后酶切鑒定法，具體可參見《takara限制性內(nèi)切酶采購目錄和技術(shù)指南》。測序由上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司完成，金離子檢測及吸附系統(tǒng)質(zhì)粒的提取與鑒定。

實施例5金離子檢測及吸附系統(tǒng)對金離子選擇性能力的檢測

1.將用于檢測金離子的枯草芽孢桿菌菌種接入適量含有壯觀霉素(50μgml^-1)的lb液體培養(yǎng)基中于37℃中培養(yǎng)過夜；將過夜培養(yǎng)菌液1:100稀釋入適量含有壯觀霉素(50μgml^-1)dsm液體培養(yǎng)基中于37℃中培養(yǎng)至培養(yǎng)液od600＝0.6，向培養(yǎng)液中分別加入終濃度為20μm的銀、鎳、鋅、銅、鎘、鉻、鉛離子，培養(yǎng)液在37℃中繼續(xù)培養(yǎng)48h；

2.培養(yǎng)48h的細菌培養(yǎng)液通過離心(8000轉(zhuǎn)/分鐘，2min)收集后，用去離子水清洗1次；

3.清洗后的菌體使用1×pbs緩沖液重懸；

4.使用酶標儀檢測重懸后的菌液。

具體檢測結(jié)果請見圖6，從圖可知，經(jīng)改造的工程菌對金離子有較好的選擇性。

實施例6cotc-golb、wt168金離子吸附能力的檢測

工程菌cotc-golb、wt168(枯草芽孢桿菌常用品系，對照組)進行吸附實驗，檢測cotc-golb對金離子的吸附能力。實驗前兩種菌均劃線培養(yǎng)于lb固體培養(yǎng)基中(壯觀霉素抗性)。

①從兩個培養(yǎng)皿中分別挑取單菌落接種于5mllb(含5ul壯觀霉素)培養(yǎng)基中，37℃、220rpm培養(yǎng)過夜。

②將細菌培養(yǎng)液以1：100重新接種于100mldsm(含100ul氨芐青霉素)培養(yǎng)基中，37℃、220rpm培養(yǎng)至od600＝0.6，加入au³⁺至終濃度分別為1μmol，5μmol，20μmol。37℃、220rpm繼續(xù)培養(yǎng)48h。每個實驗組設(shè)置3個重復(fù)。

③收集細菌，棄上清液。ddh2o清洗3次。-80℃凍存6h后用凍干機凍干細菌沉淀。

④稱重后用1ml濃硝酸消解至完全，用雙蒸水定容至10ml，最后使用電感耦合等離子發(fā)射光譜(icp-aes)檢測，具體檢測結(jié)果請見圖7，圖7為列舉金離子濃度為20μmol時的吸附效果，從圖可知cotc-golb工程菌對金離子具有很好的吸附能力。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>深圳勁宇生物科技有限公司

<120>金離子檢測及吸附系統(tǒng)及其宿主菌、金離子回收方法

<160>19

<210>1

<211>46

<212>dna

<213>擴增編碼枯草芽孢桿菌芽孢衣蛋白cotc的基因的引物

<400>1

ctttcttcgaattcgcggccgcttctagagatgggttattacaaaa46

<210>2

<211>41

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<213>擴增編碼枯草芽孢桿菌芽孢衣蛋白cotc的基因的引物

<400>2

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<210>3

<211>201

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<213>枯草芽孢桿菌芽孢衣蛋白cotc的dna序列

<400>3

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<210>4

<211>45

<212>dna

<213>擴增編碼金離子結(jié)合蛋白golb片段的基因的引物

<400>4

ctttcttcgaattcgcggcccttctagagaatgcagttccatatt45

<210>5

<211>63

<212>dna

<213>擴增編碼金離子結(jié)合蛋白golb片段的基因的引物

<400>5

gtttcttcctgcagcggccgtactagtataaaggatgacgacgataagatctgaaagctt60

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<210>6

<211>228

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<213>金離子結(jié)合蛋白golb的dna序列

<400>6

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<210>7

<211>429

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<213>cotc-golb融合蛋白的dna序列

<400>7

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<210>8

<211>43

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<213>擴增啟動子pgols-gols-pgolb的引物

<400>8

ctttcttcgaattcgcggccgcttctagagaaggaaaggtcaa43

<210>9

<211>43

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<213>擴增啟動子pgols-gols-pgolb的引物

<400>9

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<210>10

<211>3231

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<213>啟動子pgols-gols-pgolb的序列

<400>10

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<213>擴增編碼紅色熒光蛋白rfp的基因的引物

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<210>12

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<213>擴增編碼紅色熒光蛋白rfp的基因的引物

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<210>13

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<213>紅色熒光蛋白rfp的dna序列

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<213>擴增終止子terminator的引物

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<213>擴增終止子terminator的引物

<400>15

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<213>終止子terminator的序列

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<213>擴增啟動子pgolb的引物

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<213>擴增啟動子pgolb的引物

<400>18

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<213>啟動子pgolb的序列

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