本發(fā)明涉及免疫學領(lǐng)域，更具體地，涉及一種抗斑點叉尾鮰病毒核蛋白的單克隆抗體，雜交瘤細胞株及其建立一種檢測斑點叉尾鮰病毒的膠體金試紙條。
背景技術(shù)：
：斑點叉尾鮰(ictaluruspunctatus)也被稱為溝鯰，屬于鲇形目、鮰科。其具有生長速度比較快、肉質(zhì)細嫩、銷售價格較高的特點，受到了廣大消費者和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者的歡迎。隨著其養(yǎng)殖規(guī)模的逐步擴大，由于病毒感染引起的斑點叉尾鮰病毒病(channelcatfishvirusdisease，ccvd)的日益流行，給其養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。斑點叉尾鮰病毒病(ccvd)最早流行于北美。爆發(fā)流行的最適水溫為25-30℃。該病是由皰疹病毒(即斑點叉尾鮰病毒(channelcatfishvirus)，簡稱ccv)引起的疾病，該病毒導致斑點叉尾鮰幼魚群爆發(fā)急性傳染病，并導致很高的死亡率。其中剛孵化的魚苗其死亡率達100％。ccv是鮰魚皰疹病毒i型(ictaluridherpesvirusi)，常稱為斑點叉尾鮰病毒(channelcatfishvirus,ccv)，國際病毒分類委員會(ictv)第八次報告的最新病毒分類系統(tǒng)將其歸類為皰疹病毒科(herpesvirus)的鮰皰疹病毒屬(ictalurivirus)。它是fijan于1968年發(fā)現(xiàn)的一種線性雙鏈dna病毒。其也是魚類中最早發(fā)現(xiàn)皰疹病毒。病毒顆粒為20面體對稱，由囊膜、間層和核衣殼組成，核衣殼由162個殼粒組成，具有囊膜的完整病毒粒子直徑約為175nm。ccv的基因組大小約為134kb.整個基因組預測由76個開放閱讀框(openreadingframe，orf)組成。其中，囊膜蛋白有orf10、orf46和orf59；核衣殼蛋白有orf27、orf28、orf39和orf53等；間層蛋白有orfll、orfl2和orf65等。每種結(jié)構(gòu)蛋白在斑點叉尾鮰病毒擴增、感染過程中都起到重要作用，研究其對后期病毒感染機理以及疫苗都具有重要作用。目前國內(nèi)外檢測這種病毒的方法主要有中和試驗、斑點雜交檢測技術(shù)、pcr技術(shù)、實時定量熒光探針pcr技術(shù)、免疫熒光技術(shù)等。這些方法雖然準確可靠，但因具有操作繁瑣、檢測周期長等缺點，不能滿足快速確診病原、及時控制疫情的實際工作需求，因此，建立更靈敏快捷的檢測技術(shù)對該病的防治具有重要的現(xiàn)實意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個目的在于提供一種抗斑點叉尾鮰病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體及其分泌產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤細胞株。本發(fā)明的第二個目的在于提供一種檢測斑點叉尾鮰病毒的膠體金試紙條。本發(fā)明的第三個目的在于上述單克隆抗體、雜交瘤細胞株和膠體金試紙條制備檢測斑點叉尾鮰病毒的試劑或試劑盒中應用。為達到上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：本發(fā)明抗斑點叉尾鮰病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體，是由保藏編號為cgmccno.13843的小鼠雜交瘤細胞株ccv-8b6分泌產(chǎn)生。該小鼠雜交瘤細胞株ccv-8b6已于2017年5月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址是中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，其保藏編號為cgmccno.13843，分類命名為雜交瘤細胞株。保藏編號為cgmccno.13843的小鼠雜交瘤細胞株也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明進一步提供了一種檢測斑點叉尾鮰病毒的膠體金檢測試紙條，該膠體金試紙包括依次相連接的吸水墊、基膜、金標墊和樣品墊；所述基膜上設置有c線和t線，所述c線上包被有羊抗鼠igg的抗體，所述t線上包被有第一抗體，即兔抗斑點叉尾鮰病毒的多克隆抗體；所述金標墊上含有膠體金標記的第二抗體，即抗斑點叉尾鮰病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體，所述單克隆抗體由保藏編號為cgmccno.13843的雜交瘤細胞株分泌得到。其中，所述兔抗斑點叉尾鮰病毒的多克隆抗體的制備包括以下步驟：用純化的斑點叉尾鮰病毒作為抗原，多點注射免疫新西蘭大白兔，分別是每1周免疫一次，共免疫4次；取血清，經(jīng)過飽和硫酸銨純化法純化，即得兔抗斑點叉尾鮰病毒的多克隆抗體，作為檢測試紙條中的第一抗體。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，所述制備膠體金試紙條的方法為：用噴金點膜機將兔抗斑點叉尾鮰多克隆抗體和羊抗鼠igg噴于基膜上，形成相互平行的t線和c線，烘干；將膠體金標記的抗斑點叉尾鮰病毒的單克隆抗體用噴金點膜機均勻的噴在金標墊上；然后將樣品墊、金標墊、噴有t線和c線的基膜和吸水墊依次連接組裝，而后裁切包裝即可。本發(fā)明檢測斑點叉尾鮰病毒的膠體金檢測試紙條的檢測原理為：將待檢樣品滴入樣品墊中，若樣品中有斑點叉尾鮰病毒，待檢樣品中斑點叉尾鮰病毒先和膠體金標記的單克隆抗體結(jié)合，由于毛細管作用，斑點叉尾鮰病毒和膠體金標記的單克隆抗體形成的復合體沿基膜向前泳動，到達檢測線時遇到包被在硝酸纖維素基膜上的第一抗體(即兔抗斑點叉尾鮰病毒的多克隆抗體)，由于第二抗體(即抗斑點叉尾鮰病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體)和第一抗體分別能結(jié)合斑點叉尾鮰病毒的不同抗原表位結(jié)合，從而形成“膠體金標記的單克隆抗體-斑點叉尾鮰病毒-第一抗體”復合體，從而使得膠體金富集在檢測線上，形成特異性的紫紅色層析線；沒有和斑點叉尾鮰病毒結(jié)合的膠體金標記的單克隆抗體則會直接通過檢測t線，達到質(zhì)控c線后被質(zhì)控線上的羊抗鼠igg捕獲，從而使得膠體金富集在質(zhì)控c線上形成紫紅色層析線，即判為陽性結(jié)果；若樣品中無斑點叉尾鮰病毒，由于無法在檢測線上形成“膠體金標記的單克隆抗體-斑點叉尾鮰病毒-第一抗體”復合體，從而使得檢測t線上不會產(chǎn)生肉眼可見的顏色反應，沒有和斑點叉尾鮰病毒結(jié)合的膠體金標記的單克隆抗體則會直接通過檢測t線，達到質(zhì)控c線后被質(zhì)控線上的羊抗鼠igg捕獲，從而使得膠體金富集在質(zhì)控c線上形成紫紅色層析線，即判為陰性結(jié)果。本發(fā)明還提供了上述抗斑點叉尾鮰病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體、雜交瘤細胞株、膠體金試紙條在檢測斑點叉尾鮰病毒中的應用。進一步，所述應用為所述單克隆抗體、雜交瘤細胞株、膠體金試紙條在制備檢測斑點叉尾鮰病毒的試劑或試劑盒中應用。本發(fā)明的有益效果如下：1、本發(fā)明單克隆抗體為抗斑點叉尾鮰病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體，其具有特異性強、生物結(jié)合性高等特點，能準確的檢測出斑點叉尾鮰病毒。對比現(xiàn)有技術(shù)中存在的單克隆抗體具有明顯優(yōu)勢，其一，本發(fā)明中單克隆抗體針對的位點為斑點叉尾鮰病毒核衣殼蛋白，即為抗斑點叉尾鮰病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體，該抗體尚未見報道；其二，與其他病毒或者細胞系的反應中，本發(fā)明中單克隆抗體具有較高的特異性，已經(jīng)報道單克隆抗體未見這方面研究；其三，本發(fā)明中單克隆抗體能夠應用制備膠體金試紙條，該試紙條具有方便快捷等優(yōu)勢。2、本發(fā)明雜交瘤細胞增殖后可制備大量所需的特異抗體，雜交瘤細胞注射小鼠后，產(chǎn)生的腹水單抗elisa效價可達到1：1×106。3、本發(fā)明抗原制備簡單方便，斑點叉尾鮰病毒與其他病毒相比，免疫原性強，所以采用差速離心方法就可以獲得抗原。4、本發(fā)明直接用天然病毒作為抗原，比人工表達蛋白作為抗原具有明顯的優(yōu)勢，即保證制備的單克隆抗體確實是針對天然病毒反應，不會因為表達蛋白缺少修飾導致制備抗體與天然病毒不反應。5、本發(fā)明建立的檢測斑點叉尾鮰病毒的膠體金試紙條，能夠準確的檢測出細胞懸液中的病毒存在與否。該檢測方法，預防和診斷斑點叉尾鮰病毒病提供了有利的條件。附圖說明下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細的說明。圖1示出單克隆抗體的抗原位點分析：m：蛋白分子量、1：單抗與病毒反應結(jié)果、2：單抗與陰性對照細胞反應結(jié)果。圖2示出膠體金試紙條判定結(jié)果示意圖。圖3示出膠體金試紙條檢測斑點叉尾鮰病毒結(jié)果。具體實施方式為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實施例和附圖對本發(fā)明做進一步的說明。附圖中相似的部件以相同的附圖標記進行表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應當理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應以此限制本發(fā)明的保護范圍。實施例1抗斑點叉尾鮰病毒單克隆抗體的制備1.抗原的制備及純化采用差速離心純化的方法對斑點叉尾鮰病毒懸液進行純化，即將斑點叉尾鮰病毒懸液先經(jīng)過8000r/min，離心30min；取上清在經(jīng)過24000r/min，離心5h，沉淀是由200微升0.01mol/lpbs重懸。經(jīng)過分光光度計測濃度后，用于免疫小鼠。2.免疫小鼠免疫用的小鼠為spf級5周齡雌性balb/c小鼠。每只小鼠以上述純化后的斑點叉尾鮰病毒懸液作為抗原進行腹腔注射基礎(chǔ)免疫，病毒懸液與弗氏完全佐劑1：1混合，腹腔注射；2周后加強免疫，斑點叉尾鮰病毒(30微克)與弗氏不完全佐劑1：1混合，腹腔注射；之后每隔1周加強免疫1次，腹腔注射，病毒懸液注射120微克/只；第4次免疫后第3天，將小鼠脫頸椎處死，無菌取脾臟用于細胞融合。3.細胞融合常規(guī)的細胞融合技術(shù)：取免疫小鼠的脾臟和sp2/0骨髓瘤細胞進行融合后，加入小鼠的胸腺細胞與融合細胞在hat培養(yǎng)系中共培養(yǎng)。所述技術(shù)中應用的hat培養(yǎng)基的配制：將50倍濃縮的hat(2ml，gibco公司)及特級胎牛血清(20ml，杭州四季青生物工程材料有限公司)加入到改良型rpmi1640培養(yǎng)基(80ml，hyclone公司)中混勻。4.雜交瘤細胞的篩選與克隆融合后雜交瘤細胞培養(yǎng)10天后，收取細胞培養(yǎng)上清，以差速離心純化的斑點叉尾鮰病毒作為包被抗原對2000個細胞株用間接elisa進行檢測，篩選出陽性雜交瘤細胞株，經(jīng)3次有限稀釋法克隆獲得7株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞株，分別命名為ccv-1a1、ccv-2a3、ccv-2b3、ccv-8b6、ccv-2b7、ccv-3e6、ccv-3f5。5.腹水的誘生取6～8周齡雌性balb/c小鼠，腹腔內(nèi)注射無菌的液體石蠟0.5ml/只；1周后，腹腔內(nèi)注射上述陽性雜交瘤細胞；接種雜交瘤細胞后7～10天，見小鼠腹部明顯膨大，抽腹水，離心后收集上清，-80℃凍存?zhèn)溆?。采用間接elisa法對上述制備的7株抗斑點叉尾鮰病毒的腹水進行測定，結(jié)果見表1，從表中可以看出ccv-8b6的p/n值和腹水效價分別為11.21和1：1×106，要明顯高于其他細胞株ccv-1a1、ccv-2a3、ccv-2b3、ccv-2b7、ccv-3e6、ccv-3f5，因此將該小鼠雜交瘤細胞株進行了保存。該小鼠雜交瘤細胞株ccv-8b6已于2017年5月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址是中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，保藏編號為cgmccno.13843。表1制備腹水的測定結(jié)果實施例2抗斑點叉尾鮰病毒核衣殼蛋白單克隆抗體的特性鑒定1.單克隆抗體的亞型鑒定方法：應用美國的southernbiotech的分型試劑盒(sbaclonotypingtmsystem/hrp)，依照其說明書對本發(fā)明所述小鼠雜交瘤細胞株ccv-8b6分泌的單克隆抗體的ig亞型進行鑒定。結(jié)果：本發(fā)明所述小鼠雜交瘤細胞株ccv-8b6分泌的單克隆抗體的亞型為igg3型k鏈。2.單克隆抗體的抗原位點分析免疫印跡法(westernblotting)：以純化斑點叉尾鮰病毒單克隆抗體為檢測組，設正常的斑點叉尾鮰卵巢細胞系細胞裂解物為陰性對照，免疫小鼠血清為陽性對照，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)分離蛋白，用電轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白分別轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(nc膜，孔徑0.20μm)上，經(jīng)含質(zhì)量體積為10％的脫脂奶粉的0.01mpbs溶液中4℃封閉過夜；pbs-t(含體積百分比為0.05％的tween-20的pbs溶液中)洗滌后，加入小鼠的腹水(單克隆抗體1：1000稀釋于pbs)，37℃孵育1h；再次pbs-t(含體積百分比為0.05％的tween-20的pbs溶液中)洗滌后，以辣根過氧化物酶(hrp)標記的羊抗小鼠igg為二抗，37℃孵育1h；洗滌后，用底物混合液dab顯色觀察。結(jié)果見圖1，從圖中可以看出：本發(fā)明小鼠雜交瘤細胞株ccv-8b6分泌的抗斑點叉尾鮰病毒單克隆抗體，能特異的與病毒發(fā)生反應，反應處蛋白帶分子量為35kda。經(jīng)證實其為斑點叉尾鮰病毒核衣殼蛋白，說明本發(fā)明所述的單克隆抗體為抗斑點叉尾鮰病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體。3.單克隆抗體的特異性實驗方法：主要采用間接elisa方法。具體步驟為用用包被緩沖液(0.05mol/l碳酸鹽緩沖液，ph值9.6)將差速離心純化的各個病毒或者細胞抗原(具體見表2)稀釋至濃度3μg/ml，包被96孔elisa酶標板(美國corning公司)，100μl/孔。用0.01mol/lpbs稀釋1％的明膠封閉，每孔150μl，37℃封閉1h。取出后用pbst洗板3次，每次3min，甩干，加入本發(fā)明中單克隆抗體(1:1萬)，100μl/孔，37℃反應1h。取出后用pbst洗板3次，每次3min，甩干，加入商品化辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗(1:6萬)(sigma)，100μl/孔37℃反應1h。取出后用pbst洗板3次，每次3min，甩干，加入酶的底物反應液，100μl/孔，5min。加入反應終止液，150μl/孔后，酶標儀(termo)，450nm讀數(shù)。其中，相關(guān)試劑配制：10×pbst的配制：nacl：80g，na2hpo4·12h2o：29g，kh2po4：2g，kcl：2g，吐溫-20：5ml，蒸餾水加至1000ml，4℃保存。酶的底物反應液：是10％硫酸鹽(tmb，sigma，用二甲基甲酰胺配置)：150μl，h2o2：4μl，ph5.0檸檬酸-磷酸緩沖液：10ml。現(xiàn)用現(xiàn)配。洗滌液為：如前述pbst配制。反應終止液：用蒸餾水配制2mol/lh2so4。結(jié)果見表2，從表2中可以看出本發(fā)明所述的單克隆抗體只能與斑點叉尾鮰病毒反應，說明本發(fā)明所述的單克隆抗體具有較強的特異性。表2單克隆抗體特異性試驗結(jié)果樣品p/n值結(jié)果判定草魚呼腸孤病毒1.56不反應鯉春血癥病毒1.23不反應斑點叉尾鮰病毒3.78反應草魚性腺細胞系1.13不反應斑點叉尾鮰卵巢細胞系1.12不反應實施例3檢測斑點叉尾鮰病毒的膠體金試紙條的組成檢測斑點叉尾鮰病毒的膠體金試紙條，該膠體金試紙包括依次相連接的吸水墊、基膜(硝酸纖維素膜)、金標墊和樣品墊；所述基膜上設置有檢測t線和質(zhì)控c線，所述質(zhì)控c線上包被有羊抗鼠igg的抗體(商品化購買所得)，所述檢測t線上包被有第一抗體(即兔抗斑點叉尾鮰病毒的多克隆抗體)；所述金標墊上含有膠體金標記的第二抗體(即保藏編號cgmccno.13843的雜交瘤細胞株ccv-8b6分泌得到的抗斑點叉尾鮰病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體)。其中，兔抗斑點叉尾鮰病毒的多克隆抗體的制備和包埋elisa條板：用純化的斑點叉尾鮰病毒作為抗原，多點注射免疫新西蘭大白兔，分別是每1周免疫一次，共免疫4次；取血清純化，即采用飽和硫酸銨沉淀方法，沉淀2次，飽和硫酸銨濃度分別為50％和33％，最終的沉淀用pbs溶解，裝入透析袋，于4℃下透析72h，期間換液至少4次/天，收集純化多克隆抗體，即兔抗斑點叉尾鮰病毒的多克隆抗體，分裝-80℃保存保存?zhèn)溆?。膠體金的制備方法包括：將0.01重量％的haucl4溶液加熱煮沸后加入1重量％的檸檬酸三鈉溶液直至溶液的顏色完全變?yōu)橥该鞯募t色時，繼續(xù)回流10min后停止加熱，冷卻至室溫，即得到膠體金。將單克隆抗體進行膠體金標記的方法包括：取1ml制取好的膠體金，用1重量％的k2co3調(diào)節(jié)ph值到8.0，加入8μg單克隆抗體，混合均勻，室溫反應40min；加入5重量％的bsa至終濃度為0.1重量％，靜置30min；先用低速(1500r/min)離心15分鐘，棄去由凝聚的金膠粒形成的沉淀；然后用10000r/min離心30分鐘；仔細吸出上清，沉淀物用0.1ml含1％bsa的0.1mpbs(ph7.4)復溶，加入5％疊氮鈉至終濃度為0.05％，4℃保存。制備膠體金試紙條的方法：用噴金點膜機將兔抗斑點叉尾鮰病毒的多克隆抗體和羊抗鼠igg噴于基膜上，形成相互平行的檢測t線和質(zhì)控c線，烘干；將膠體金標記的抗斑點叉尾鮰病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體用噴金點膜機均勻的噴在金標墊上；然后將樣品墊、金標墊、噴有t線和c線的基膜和吸水墊依次連接組裝，而后裁切包裝備用。實施例4檢測斑點叉尾鮰病毒的膠體金試紙條的使用本實施例用于說明本發(fā)明檢測斑點叉尾鮰病毒的膠體金試紙條(即實施例3)檢測斑點叉尾鮰病毒。具體步驟為：(1)樣品制備：分別取約200μl斑點叉尾鮰病毒懸液和魚類細胞系懸液到樣品管中。(2)檢測：取出實施例3制備得到的膠體金試紙條，室溫平衡20分鐘，打開包裝取出試紙條，將試紙條按照箭頭方向插入樣品管中，靜置10-15分鐘，判定結(jié)果。(3)結(jié)果判定：當時紙條出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色質(zhì)控c線，沒有出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色檢測t線，判為陰性；當試紙條出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色質(zhì)控c線，同時出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色檢測t線，判為陽性；檢測線顏色深度與待檢抗原量成正比，顏色越深說明待檢抗原含量越高，質(zhì)控線無條帶則判為試紙條失效。判定結(jié)果示意圖見圖2。檢測結(jié)果見圖3，從圖中可以看出本發(fā)明所述的膠體金試紙條能準確的檢測出斑點叉尾鮰病毒。顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定，對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動，這里無法對所有的實施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之列。當前第1頁12