本發(fā)明涉及一種新型生物活性多肽及其制備方法，具體涉及一種通過陽離子交換hplc以及兩步反相hplc分離獲得新型生物活性多肽的方法。

背景技術(shù)：

生物毒素是一種重要的生命現(xiàn)象，是生物界在億萬年進化過程中為了生存而形成的，是一個巨大的潛在發(fā)現(xiàn)新的生物活性分子的重要資源。目前國際上已經(jīng)成功篩選到一些生物毒素分子用于治療某些相關(guān)疾病或作為新型藥物的設(shè)計參考。蜘蛛產(chǎn)生各種作用于神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)毒素，其神經(jīng)毒素根據(jù)它們的化學結(jié)構(gòu)分為蛋白多肽類神經(jīng)毒素和多胺類神經(jīng)毒素。其中蜘蛛多肽神經(jīng)毒素最重要，蜘蛛多肽類神經(jīng)毒素根據(jù)它們的功能和分子特征可分為兩種類型:第一種是低分子量多肽類，它們能與興奮性細胞膜上的陽離子通道相互作用；第二種是高分子量多肽類，它們與突觸前膜的受體組分及增強神經(jīng)介質(zhì)的分泌作用密切相關(guān)。蜘蛛毒液已成為神經(jīng)毒素的一個重要新來源，而且蜘蛛毒液中特異性藥物和毒素分子也是我們尋找農(nóng)業(yè)殺蟲劑的較好模式分子。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的旨在于提供一種從廣西纓毛蛛粗毒中制備新型生物活性多肽的方法，所述的生物活性多肽為蜘蛛抑鉀肽-35（spkp-35），其氨基酸序列為：

nh2-aspcysargalaleutyrglyglycysthrlysaspgluaspcyscyslyshisleualacysargargthrleuprothrtyrcysalatrpaspleuthrphepro-oh,

所述的蜘蛛抑鉀肽-35的n端第2位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之間，n端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之間，n端第15位半胱氨酸和第29位半胱氨酸之間分別形成二硫鍵。

所述方法包括：（1）粗毒干粉用雙蒸水溶解配成5mg/ml的毒素溶液，12000rpm離心5min,上清用millipore公司一次性過濾器(0.22μm)過濾后，置于4°c保存。粗毒上樣陽離子交換hplc(ion-exchangehplc)進行第一步分離。采用waters650型hplc、美國pharmacia公司的hiprep^tm16/10cmff預(yù)裝柱進行分離。486檢測器檢測，檢測波長為215nm。流動相為四相洗脫系統(tǒng)，流速為1.5ml/min。洗脫液分別為a相0.1mnah2po4,b相0.1mna2hpo4,c相1mnacl,d相ddh2o。上述經(jīng)ion-exchangehplc分離后收集的各洗脫峰分別上樣反相hplc進行進一步純化。采用分析型vydacc18rp-hplc反相柱(218tp54,4.6×250mm)于分析型waters2690高效液相色譜儀上進行梯度洗脫，996檢測器檢測，檢測波長為215nm，流動相為含0.1%tfa的水（a）和乙腈（b），洗脫速度為1ml/min，柱溫為40℃。

（2）通過上述陽離子交換hplc以及兩步反相hplc共三步分離獲得的spkp-35，運用質(zhì)譜鑒定純度達到98%以上，其分子量約為4120.8da，經(jīng)序列測定，該多肽的一級結(jié)構(gòu)由36個氨基酸殘基組成，其中含6個半胱氨酸并形成三對二硫鍵，c-端未酰胺化。多肽spkp-35純化凍干粉的理化性狀為白色或類白色疏松體，無氣味，極易溶解于水，水溶液近于無色透明。

附圖說明

圖1是廣西纓毛蛛粗毒陽離子交換hplc圖譜?！?”表示目的峰，縱坐標表示洗脫峰在280nm的吸收值，橫坐標表示洗脫時間。

圖2是廣西纓毛蛛粗毒目的陽離子交換峰反相hplc圖譜。箭頭表示目的峰，縱坐標表示各個洗脫峰在280nm下的吸收值，橫坐標表示洗脫時間。

圖3是目的多肽spkp-35的反相hplc圖譜。

具體實施方式

1、實驗材料和方法

1.1粗毒的獲取

廣西纓毛蛛采集于海南省瓊中縣境內(nèi)的山區(qū)，粗毒毒液采于雌性蛛種。簡述如下：使蜘蛛張開螯爪伸入塑料杯中，然后用5～10v的脈沖電流刺激兩螯肢基部外側(cè)3～5s。蜘蛛感受電刺激后，即用觸肢緊緊抱住杯壁，同時將螯爪有力刺向杯內(nèi)壁并射出毒液。毒液收集后，放入-40℃冷凍干燥機中經(jīng)真空冷凍干燥成淺黃色或白色粉末即為粗毒。

1.2spkp-35的分離純化及質(zhì)譜分析

粗毒干粉用雙蒸水溶解配成5mg/ml的毒素溶液，12000rpm離心5min,上清用millipore公司一次性過濾器(0.22μm)過濾后，置于4°c保存。粗毒上樣陽離子交換hplc(ion-exchangehplc)進行第一步分離。采用waters650型hplc、美國pharmacia公司的hiprep^tm16/10cmff預(yù)裝柱進行分離。486檢測器檢測，檢測波長為215nm。流動相為四相洗脫系統(tǒng)，流速為1.5ml/min。洗脫液分別為a相0.1mnah2po4,b相0.1mna2hpo4,c相1mnacl,d相ddh2o。上述經(jīng)ion-exchangehplc分離后收集的各洗脫峰分別上樣反相hplc進行進一步純化。采用分析型vydacc18rp-hplc反相柱(218tp54,4.6×250mm)于分析型waters2690高效液相色譜儀上進行梯度洗脫，996檢測器檢測，檢測波長為215nm，流動相為含0.1%tfa的水（a）和乙腈（b），洗脫速度為1ml/min，柱溫為40℃。

利用maldi-tof質(zhì)譜（voyager-de?strbiospectromitry?workstation）測定分子量。線性陽離子模式；n2光源337nm；離子加速電壓為20000v?；|(zhì)為α-氰基-4-羥基-肉桂酸（cca），通過以下方式制備樣品：取1ml（約0.5mg）樣品液加入到9mlcca0.1%tfa/50%乙腈飽和溶液，混勻后取1ml點樣，室溫干燥后測定，并采用內(nèi)標法校正。

1.3spkp-35的氨基酸序列測定

spkp-35氨基酸序列測定采用n-端edman降解法在appliedbiosystems公司491a型氣相測序儀上完成。測30個循環(huán)，采用儀器配備的標準程序測序，在線hplc檢測，準確讀出spkp-35的氨基酸序列。

2、實驗結(jié)果與分析

2.1spkp-35的分離純化

由于廣西纓毛蛛成分非常復雜，通常采用二維色譜的方法分離純化毒素多肽：即首先經(jīng)過陽離子交換分離粗毒后，洗脫成分進一步采用反相hplc分離純化。二維色譜是一種非常有效的分離純化的方法，通過陽離子交換hplc以及反相hplc兩步分離，我們從廣西纓毛蛛粗毒中成功分離到spkp-35。圖1是廣西纓毛蛛粗毒的陽離子交換hplc圖譜，在280nm波長下檢測，可觀察到8個非常明顯的洗脫峰，其中第3個峰是目的峰。收集此峰后，在akta純化系統(tǒng)上進行脫鹽處理所得圖譜見圖2。收集目的峰并冷凍干燥后，在alliance系統(tǒng)上進行再次反相hplc（見圖3）。圖中顯示含spkp-35的洗脫峰為單一峰，通過質(zhì)譜鑒定它們的純度達到98%以上。

2.2質(zhì)譜分析

洗脫峰用maldi-tof質(zhì)譜分析表明所含組分單一。經(jīng)鑒定spkp-35的分子量為4120.8da，樣品純度達到98%以上，說明目的肽的分離純化是很成功的。

2.3氨基酸序列分析

spkp-35的序列測定在491-a測序儀上進行。測序之前對spkp-35進行碘乙酰胺烷基化修飾，結(jié)果表明，spkp-35是單鏈多肽分子，由36個氨基酸殘基組成，其中包括6個cys。spkp-35含有6個半胱氨酸，形成三對二硫鍵。蜘蛛抑鉀肽-35的n端第2位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之間，n端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之間，n端第15位半胱氨酸和第29位半胱氨酸之間分別形成二硫鍵。spkp-35是新發(fā)現(xiàn)的一個序列獨特的蜘蛛毒素分子，spkp-35與其它ick模體毒素半胱氨酸殘基位置非常保守，因此spkp-35也是一種ick模體多肽毒素。

sequencelisting

<110>長沙沁才生物科技有限公司

<120>一種天然活性多肽spkp-35

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<170>patentinversion3.3

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<213>廣西纓毛蛛（selenocosmiahuwena）

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