本發(fā)明是基于申請(qǐng)日為2012年2月6日，申請(qǐng)?zhí)枮椤?01280015257.3”(國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮閜ct/us2012/024020)，發(fā)明名稱(chēng)為“脂蛋白復(fù)合物及其制備和用途”的專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。1.相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)依據(jù)35u.s.c.§119(e)要求2011年2月7日提交的臨時(shí)申請(qǐng)61/440,371、2011年3月14日提交的臨時(shí)申請(qǐng)61/452,630以及2011年5月17日提交的臨時(shí)申請(qǐng)61/487,263的益處，將所有這些申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用的方式并入本申請(qǐng)。2.
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開(kāi)提供了脂蛋白復(fù)合物、包含所述復(fù)合物的藥物組合物、產(chǎn)生并純化用于所述復(fù)合物的載脂蛋白的方法、制備所述復(fù)合物的方法以及使用所述復(fù)合物治療或者預(yù)防心血管疾病、與其相關(guān)的障礙和/或者病癥的方法。3.
背景技術(shù)：
：3.1.綜述循環(huán)的膽固醇經(jīng)由血液中轉(zhuǎn)運(yùn)脂質(zhì)的、脂質(zhì)與蛋白質(zhì)組成的血漿脂蛋白復(fù)合物顆粒運(yùn)送。血漿中循環(huán)的脂蛋白顆粒具有以下四種主要類(lèi)別并且均包括在脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中：乳糜微粒、極低密度脂蛋白(vldl)、低密度脂蛋白(ldl)和高密度脂蛋白(hdl)。乳糜微粒構(gòu)成了腸內(nèi)脂肪吸收的短壽命產(chǎn)物。vldl尤其是ldl負(fù)責(zé)將膽固醇由肝(膽固醇在肝中合成或由飲食來(lái)源獲得)遞送至肝外的組織，包括動(dòng)脈壁。相反，hdl介導(dǎo)膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(yùn)(rct)，膽固醇脂質(zhì)的去除，具體地，由肝外組織至肝，膽固醇在肝中儲(chǔ)存、分解代謝、消除或再循環(huán)。hdl在炎癥、轉(zhuǎn)運(yùn)氧化的脂質(zhì)和白細(xì)胞介素中也起有益作用。脂蛋白顆粒具有包含膽固醇(通常為膽固醇酯的形式)和甘油三酯的疏水核。該核為包含磷脂、未酯化的膽固醇和載脂蛋白的表層所圍繞。載脂蛋白介導(dǎo)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，并且載脂蛋白中的一部分可與脂質(zhì)代謝中涉及的酶相互作用。已經(jīng)鑒別了至少十種載脂蛋白，其包括：apoa-i、apoa-ii、apoa-iv、apoa-v、apob、apoc-i、apoc-ii、apoc-iii、apod、apoe、apoj和apoh。還發(fā)現(xiàn)其它蛋白質(zhì)如lcat(卵磷脂：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶)、cetp(膽固醇脂轉(zhuǎn)移蛋白)、pltp(磷脂轉(zhuǎn)移蛋白)和pon(對(duì)氧磷酶)也與脂蛋白有關(guān)。心血管疾病，如冠心病、冠狀動(dòng)脈疾病和動(dòng)脈粥樣硬化在極大程度上與血清中升高的膽固醇濃度有關(guān)。例如，動(dòng)脈粥樣硬化是一種緩慢進(jìn)展型疾病，其經(jīng)由動(dòng)脈壁內(nèi)膽固醇的蓄積而表征。令人信服的證據(jù)支持以下理論：在動(dòng)脈粥樣硬化病變中沉積的脂質(zhì)主要來(lái)自于血漿ldl；因此，ldl已被普遍地認(rèn)為是“有害的”膽固醇，相反，hdl血清濃度與冠心病成反比。事實(shí)上，hdl的較高血清濃度被認(rèn)為是負(fù)向的風(fēng)險(xiǎn)因素。據(jù)假設(shè)，較高濃度的血漿hdl不僅保護(hù)性地對(duì)抗冠狀動(dòng)脈疾病，而且實(shí)際上可以誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的消退(參見(jiàn)，例如，badimonetal.,1992,circulation86(suppl.iii):86-94；danskyandfisher,1999,circulation100:1762-63；tangiralaetal.,1999,circulation100(17):1816-22；fanetal.,1999,atherosclerosis147(1):139-45；deckertetal.,1999,circulation100(11):1230-35；boisvertetal.,1999,arterioscler.thromb.vasc.biol.19(3):525-30；benoitetal.,1999,circulation99(1):105-10；holvoetetal.,1998,j.clin.invest.102(2):379-85；duvergeretal.,1996,circulation94(4):713-17；miyazakietal.,1995,arterioscler.thromb.vasc.biol.15(11):1882-88；mezdouretal.,1995,atherosclerosis113(2):237-46；liuetal.,1994,j.lipidres.35(12):2263-67；plumpetal.,1994,proc.nat.acad.sci.usa91(20):9607-11；pasztyetal.,1994,j.clin.invest.94(2):899-903；sheetal,1992,chin.med.j.(engl).105(5):369-73；rubinetal.,1991,nature353(6341):265-67；sheetal.,1990,ann.nyacad.sci.598:339-51；ran,1989,chunghuapinglihsuehtsachih(還翻譯為：zhonghuabinglixuezazhi)18(4):257-61；quezadoetal.,1995,j.pharmacol.exp.ther.272(2):604-11；duvergeretal.,1996,arterioscler.thromb.vasc.biol.16(12):1424-29；kopfleretal.,1994,circulation；90(3):1319-27；milleretal.,1985,nature314(6006):109-11；haetal.,1992,biochim.biophys.acta1125(2):223-29；beitzetal.,1992,prostaglandinsleukot.essent.fattyacids47(2)：149-52)。作為結(jié)論，hdl已被普遍認(rèn)為是“有利的”膽固醇(參見(jiàn)，例如，zhang,etal.,2003circulation108:661-663)。hdl的“保護(hù)性”作用在大量研究中得以證實(shí)(例如,milleretal.,1977,lancet1(8019):965-68；whayneetal.,1981,atherosclerosis39:411-19)。在這些研究中，ldl升高的濃度似乎與增加的心血管風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，而較高的hdl濃度好像具有心血管保護(hù)作用。體內(nèi)研究已經(jīng)進(jìn)一步證明了hdl的保護(hù)作用，其顯示注入兔中的hdl可以阻礙膽固醇誘發(fā)的動(dòng)脈病變的形成(badimonetal.,1989,lab.invest.60:455-61)和/或者可以誘導(dǎo)所述動(dòng)脈病變消退(badimonetal.,1990,j.clin.invest.85:1234-41)。3.2.膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)、hdl和載脂蛋白a-i膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)(rct)通路起消除來(lái)自肝外大部分組織的膽固醇的作用并且對(duì)于維持機(jī)體內(nèi)大部分細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要。rct主要由以下三個(gè)步驟組成：(a)膽固醇外流，即，膽固醇最初由不同的外周細(xì)胞池的去除；(b)經(jīng)由卵磷脂:膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(lcat)的作用進(jìn)行的膽固醇酯化，從而防止外流的膽固醇再次進(jìn)入細(xì)胞中；以及(c)將hdl-膽固醇和膽固醇酯攝取至肝細(xì)胞進(jìn)行水解，然后進(jìn)行再循環(huán)、貯存、在膽汁中分泌或代謝成膽酸。lcat(rct中的關(guān)鍵酶)由肝產(chǎn)生并在與hdl成分締合的血漿中進(jìn)行循環(huán)。lcat將源自細(xì)胞的膽固醇轉(zhuǎn)化為膽固醇酯，所述膽固醇酯在指定去除的hdl中被隔離(參見(jiàn)jonas2000,biochim.biophys.acta1529(1-3):245-56)。膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(cetp)與磷脂轉(zhuǎn)移蛋白(pltp)致力于循環(huán)的hdl群的進(jìn)一步改造。cetp將lcat生成的膽固醇酯運(yùn)至其它的脂蛋白，特別是包括apob的脂蛋白，如vldl和ldl。pltp向hdl供應(yīng)卵磷脂。hdl甘油三酯通過(guò)細(xì)胞外的肝甘油三酯脂肪酶進(jìn)行代謝，并且脂蛋白膽固醇通過(guò)肝經(jīng)由幾種機(jī)制而除去。hdl顆粒的功能特征主要通過(guò)它們的主要載脂蛋白組分如apoa-i和apoa-ii而確定。還觀察到與hdl締合的微量apoc-i、apoc-ii、apoc-iii、apod、apoa-iv、apoe、apoj。hdl根據(jù)rct代謝級(jí)聯(lián)或通路過(guò)程的重構(gòu)狀態(tài)而以多種不同的尺寸以及上述成分的不同混合物存在。每個(gè)hdl顆粒通常包含至少1個(gè)分子的，并且通常包括2至4個(gè)分子的apoa-i。如prof.gerdassmann所描述的，hdl顆粒也可以只包括apoe(γ-lpe顆粒)，其還被認(rèn)為負(fù)責(zé)膽固醇外流(參見(jiàn),例如,voneckardsteinetal.,1994,curropinlipidol.5(6):404-16)。apoa-i作為前原載脂蛋白a-i(preproapolipoproteina-i)由肝和小腸合成，并作為原載脂蛋白a-i(proapolipoproteina-i)(原apoa-i(proapoa-i))分泌且快速地發(fā)生裂解從而產(chǎn)生血漿形式的apoa-i，其是一種243個(gè)氨基酸的單多肽鏈(breweretal.,1978,biochem.biophys.res.commun.80:623-30)。在實(shí)驗(yàn)中直接注射入血流的前原apoa-i也可以裂解為血漿形式的apoa-i(klonetal.,2000,biophys.j.79(3):1679-85；segrestetal.,2000,curr.opin.lipidol.11(2):105-15；segrestetal.,1999,j.biol.chem.274(45):31755-58)。apoa-i包含由連接體部分(經(jīng)常為脯氨酸)間隔開(kāi)的6至8個(gè)不同的22個(gè)氨基酸的α-螺旋或者功能性重復(fù)。該重復(fù)單元以?xún)捎H的螺旋形構(gòu)型存在(segrestetal.,1974,febslett.38:247-53)并賦予apoa-i的主要生物學(xué)活性，即，脂質(zhì)結(jié)合和卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(lcat)活化。apoa-i與脂質(zhì)形成以下三種類(lèi)型的穩(wěn)定復(fù)合物：稱(chēng)為前-β-1hdl的、貧脂質(zhì)的小復(fù)合物；稱(chēng)為前-β-2hdl的、包含極性脂質(zhì)(磷脂和膽固醇)的平盤(pán)狀顆粒；以及稱(chēng)為球狀或成熟hdl(hdl3和hdl2)的、包含極性和非極性脂質(zhì)的球狀顆粒。循環(huán)群中的大部分hdl包含apoa-i和apoa-ii(“ai/aii-hdl成分”)。然而，只包含apoa-i的hdl成分(“ai-hdl成分”)在rct中表現(xiàn)更有效。一些流行病學(xué)研究證明了apo-ai-hdl成分抗動(dòng)脈粥樣硬化的假設(shè)(parraetal.,1992,arterioscler.thromb.12:701-07；decossinetal.,1997,eur.j.clin.invest.27:299-307)。hdl顆粒由幾種具有不同尺寸、脂質(zhì)組成和載脂蛋白組成的顆粒群制成?？梢愿鶕?jù)它們的性能而進(jìn)行分離，所述性能包括其水合密度、載脂蛋白組成和荷電特征。例如，前-β-hdl成分的特征為具有比成熟α-hdl少的表面電荷。由于這種電荷差異，而使得前-β-hdl和成熟α-hdl在瓊脂糖凝膠中具有不同的電泳遷移率(davidetal.,1994,j.biol.chem.269(12):8959-8965)。前-β-hdl與成熟α-hdl的代謝也不同。前-β-hdl具有以下兩種代謝歸宿：由血漿除去以及通過(guò)腎代謝或者是重構(gòu)成優(yōu)先通過(guò)肝降解的中等尺寸hdl(leeetal.,2004,j.lipidres.45(4):716-728)。盡管由細(xì)胞表面轉(zhuǎn)移膽固醇的機(jī)制(即，膽固醇外流)是未知的，但是仍認(rèn)為貧脂質(zhì)的復(fù)合物，前-β-1hdl是從rct中涉及的外周組織轉(zhuǎn)移的膽固醇的優(yōu)選受體(參見(jiàn)davidsonetal.,1994,j.biol.chem.269:22975-82；bielickietal.,1992,j.lipidres.33:1699-1709；rothblatetal.,1992,j.lipidres.33:1091-97；andkawanoetal.,1993,biochemistry32:5025-28；kawanoetal.,1997,biochemistry36:9816-25)。在膽固醇由細(xì)胞表面募集的這種過(guò)程中，前-β-1hdl快速地轉(zhuǎn)化為前-β-2hdl。pltp可以增加前-β-2hdl盤(pán)(disc)形成的速率，但缺少表明pltp在rct中的作用的數(shù)據(jù)。lcat優(yōu)先與盤(pán)狀的小(前-β)hdl和球狀的(即成熟)hdl反應(yīng)，而將卵磷脂或其它磷脂的2-?；D(zhuǎn)移至膽固醇的游離羥基殘基以形成膽固醇酯(保留在hdl中)和溶血卵磷脂。lcat反應(yīng)需要apoa-i作為活化劑；即，apoa-i是lcat的天然輔因子。在hdl中隔離的膽固醇至其酯的轉(zhuǎn)化防止了膽固醇重新進(jìn)入細(xì)胞中，且凈結(jié)果為膽固醇由細(xì)胞除去。apoai-hdl成分(即，包括apoa-i而無(wú)apoa-ii)中成熟hdl顆粒中的膽固醇酯經(jīng)由肝除去并比源自包含apoa-i和apoa-ii的hdl(a1/aii-hdl成分)的那些更有效地加工入膽汁中。這可部分地歸因于apoai-hdl與肝細(xì)胞膜的更有效的結(jié)合。已經(jīng)假定存在hdl受體，并且已將b類(lèi)i型清除劑受體(sr-bi)鑒別為hdl受體(actonetal.,1996,science271:518-20；xuetal.,1997,lipidres.38:1289-98)。sr-bi在生成類(lèi)固醇的組織(如，腎上腺)及肝中最大量表達(dá)(landschulzetal.,1996,j.clin.invest.98:984-95；rigottietal.,1996,j.biol.chem.271:33545-49)。對(duì)于hdl受體的綜述，參見(jiàn)broutinetal.,1988,anal.biol.chem.46:16-23。經(jīng)由atp-結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子ai的最初脂化對(duì)于血漿hdl的形成以及對(duì)于前-β-hdl顆粒的膽固醇外流能力而言是至關(guān)重要的(leeandparks,2005,curr.opin.lipidol.16(1):19-25)。根據(jù)這些作者，這種最初的脂化使得前-β-hdl更有效地起膽固醇受體的作用并且防止了apoa-i與預(yù)存在的血漿hdl顆?？焖倬喓?，從而得到前-β-hdl顆粒更強(qiáng)的膽固醇外流能力。cetp還可在rct中起重要作用。cetp活性或其受體vldl和ldl的變化在hdl群的“重構(gòu)”中起重要作用。例如，在cetp不存在下，hdl變成不可清除的大顆粒。(對(duì)于rct和hdl的綜述，參見(jiàn)fieldingandfielding,1995,j.lipidres.36:211-28；barransetal.,1996,biochem.biophys.acta1300:73-85；hiranoetal.,1997,arterioscler.thromb.vasc.biol.17(6):1053-59)。hdl也在其它脂質(zhì)和非極性分子的逆轉(zhuǎn)運(yùn)以及解毒作用中起重要作用，即，將脂質(zhì)由細(xì)胞、器官和組織轉(zhuǎn)運(yùn)至肝進(jìn)行分解代謝和排泄。此類(lèi)脂質(zhì)包括鞘磷脂(sm)、氧化的脂質(zhì)和溶血磷脂酰膽堿。例如，robins和fasulo(1997,j.clin.invest.99:380-84)已經(jīng)證明了hdl刺激植物甾醇經(jīng)由肝轉(zhuǎn)運(yùn)入膽汁分泌物中。hdl的主要組分apoa-i可以與sm于體外締合。當(dāng)使用牛腦sm(bbsm)對(duì)apoa-i進(jìn)行體外重構(gòu)(reconstituted)時(shí)，在臨近bbsm相變溫度的溫度28℃產(chǎn)生最大的重構(gòu)率(swaney,1983,j.biol.chem.258(2),1254-59)。在bbsm:apoa-i比值為7.5:1或更低(wt/wt)時(shí)，形成了一種重構(gòu)的均質(zhì)hdl顆粒，每個(gè)顆粒包含三分子apoa-i并且具有360:1的bbsm:apoa-i摩爾比。該hdl顆粒在電子顯微鏡下為盤(pán)狀的復(fù)合物，其類(lèi)似于通過(guò)在磷脂/蛋白質(zhì)升高的比值下將apoa-i與磷脂酰膽堿進(jìn)行重組而獲得的復(fù)合物。然而，bbsm:apoa-i比值為15:1(wt/wt)時(shí)，形成了具有較高磷脂:蛋白質(zhì)摩爾比(535:1)的、較大直徑的盤(pán)狀復(fù)合物。這些復(fù)合物與使用磷脂酰膽堿形成的apoa-i復(fù)合物相比，明顯更大、更穩(wěn)定并且對(duì)于變性更具抵抗力。初期膽固醇受體(前-β-hdl以及γ-遷移apoe包含脂蛋白)中鞘磷脂(sm)增多，表明sm可以增強(qiáng)這些顆粒促進(jìn)膽固醇外流的能力(dassandjessup,2000,j.pharm.pharmacol.52:731-61；huangetal.,1994,proc.natl.acad.sci.usa91:1834-38；fieldingandfielding1995,j.lipidres.36:211-28)。3.3.hdl和apoa-i的保護(hù)機(jī)制近來(lái)對(duì)于hdl保護(hù)機(jī)制的研究焦點(diǎn)在于載脂蛋白a-i(apoa-i)，即hdl的主要組分。較高血漿濃度的apoa-i與冠狀病變的缺失或減少有關(guān)(maciejkoetal.,1983,n.engl.j.med.309:385-89；sedlisetal.,1986,circulation73:978-84)。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中注入apoa-i或hdl可產(chǎn)生顯著的生物化學(xué)變化，以及降低動(dòng)脈粥樣硬化病變的程度及嚴(yán)重性。在maciejko和mao(1982,arteriosclerosis2:407a)、badimon等人(1989,lab.invest.60:455-61；1989,j.clin.invest.85:1234-41)的最初報(bào)告之后，發(fā)現(xiàn)通過(guò)注入hdl(d＝l.063-1.325g/ml)可顯著地降低喂食膽固醇的兔中動(dòng)脈粥樣硬化病變的程度(降低45％)以及降低其膽固醇酯含量(降低58.5％)。他們還發(fā)現(xiàn)注入hdl使確定的病變出現(xiàn)接近50％的消退。esper等人(1987,arteriosclerosis7:523a)已經(jīng)證明，注入hdl可以顯著地改變患有遺傳性高膽固醇血癥的、watanabe兔的血漿脂蛋白組成，所述遺傳性高膽固醇血癥可發(fā)展成早期的動(dòng)脈病變。在這些兔中，注入hdl可使保護(hù)性hdl與導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的ldl之間的比值超過(guò)兩倍。通過(guò)apoa-i在體外發(fā)揮溶纖維蛋白活性的觀察結(jié)果進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了hdl在動(dòng)物模型中預(yù)防動(dòng)脈疾病的潛力(sakuetal.,1985,thromb.res.39:1-8)。ronneberger(1987,xthint.congr.pharmacol.,sydney,990)證明apoa-i可以增加beagle犬與cynomologous猴的血纖蛋白溶解。發(fā)現(xiàn)在體外的人血漿中具有類(lèi)似的活性。ronneberger能夠證實(shí)在經(jīng)apoa-i治療的動(dòng)物中，脂質(zhì)沉積和動(dòng)脈斑塊形成的減少。體外研究表明，apoa-i與卵磷脂的復(fù)合物可以促進(jìn)游離的膽固醇由培養(yǎng)的動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞外流(steinetal.,1975,biochem.biophys.acta,380:106-18)。hdl通過(guò)這種機(jī)制還可以減少這些細(xì)胞的增殖(yoshidaetal.,1984,exp.molpathol.41:258-66)。也已證明使用包括apoa-i或apoa-ii模擬肽的hdl灌注療法通過(guò)abc1轉(zhuǎn)運(yùn)子而調(diào)節(jié)血漿hdl濃度，從而產(chǎn)生了治療心血管疾病的效力(參見(jiàn),例如,breweretal.,2004,arterioscler.thromb.vasc.biol.24:1755-1760)。已經(jīng)分離出apoa-i的兩種天然形成的人多態(tài)性，其中精氨酸殘基被半胱氨酸取代。在載脂蛋白a-i米蘭(apoa-im)中，這種取代出現(xiàn)在殘基173，而在載脂蛋白a-i巴黎(apoa-ip)中，這種取代出現(xiàn)在殘基151(franceschinietal.,1980,j.clin.invest.66:892-900；weisgraberetal.,1983,j.biol.chem.258:2508-13；bruckertetal.,1997,atherosclerosis128:121-28；daumetal.,1999,j.mol.med.77:614-22；klonetal.,2000,biophys.j.79(3):1679-85)。還已經(jīng)分離了另外的apoa-i的天然形成的人多態(tài)性，其中亮氨酸在144位被精氨酸取代。該多態(tài)性已經(jīng)稱(chēng)為載脂蛋白a-izaragoza(apoa-iz)且與嚴(yán)重的α低脂蛋白血癥和高密度脂蛋白(hdl)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的增強(qiáng)作用相關(guān)(recaldeetal.,2001,atherosclerosis154(3):613-623；fiddymentetal.,2011,proteinexpr.purif.80(1):110-116)。包含apoa-im或apoa-ip的二硫化物連接的同源二聚體的重構(gòu)hdl顆粒與包含野生型apoa-i的重構(gòu)hdl顆粒相比，其清除二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(dmpc)乳狀液的能力及其促進(jìn)膽固醇外流的能力相似(calabresietal.,1997b,biochemistry36:12428-33；franceschinietal.,1999,arterioscler.thromb.vasc.biol.19:1257-62；daumetal.,1999,j.mol.med.77:614-22)。在兩種突變體中，雜合的個(gè)體降低了hdl的濃度，但是自相矛盾地是，其也降低了動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)(franceschinietal.,1980,j.clin.invest.66:892-900；weisgraberetal.,1983,j.biol.chem.258:2508-13；bruckertetal.,1997,atherosclerosis128:121-28)。盡管包含任一變體的重構(gòu)hdl顆粒與包含野生型apoa-i的重構(gòu)hdl顆粒相比時(shí)具有降低的效力，但是其能夠活化lcat(calabresietal.,1997,biochem.biophys.res.commun.232:345-49；daumetal.,1999,j.mol.med.77:614-22)。apoa-im突變體作為常染色體顯性性狀遺傳；并且已經(jīng)鑒別了該家族內(nèi)的八代載體(gualandrietal.,1984,am.j.hum.genet.37:1083-97)。單個(gè)apoa-im載體狀態(tài)的特征為顯著降低的hdl-膽固醇濃度。盡管單個(gè)載體顯著降低hdl膽固醇濃度，但是其并未明顯地表現(xiàn)出任何增加的動(dòng)脈疾病風(fēng)險(xiǎn)。事實(shí)上，通過(guò)研究系譜檔案(genealogicalrecords)發(fā)現(xiàn)這些受試者受到“保護(hù)”而使其免于動(dòng)脈粥樣硬化(sirtorietal.,2001,circulation,103:1949-1954；romaetal.,1993,j.clin.invest.91(4):1445-520)。apoa-im在突變體載體中的、可能的保護(hù)作用機(jī)制似乎與apoa-im突變體的結(jié)構(gòu)修飾有關(guān)，而在該結(jié)構(gòu)中，缺失了一個(gè)α-螺旋并且增加了暴露的疏水性殘基(franceschinietal.,1985,j.biol.chem.260:1632-35)。多個(gè)α-螺旋緊密結(jié)構(gòu)的缺失使該分子的柔韌性增加，而所述分子與正常的apoa-i相比，更易于與脂質(zhì)締合。此外，脂蛋白復(fù)合物對(duì)變性更敏感，從而表明在突變體中，也可以改善脂質(zhì)的遞送。bielicki等人(1997,arterioscler.thromb.vasc.biol.17(9):1637-43)已經(jīng)證明apoa-im與野生型apoa-i相比，具有募集膜膽固醇的有限能力。此外，由apoa-im與膜脂質(zhì)締合而形成的初生hdl主要是7.4nm的顆粒，而不是由野生型apoa-i形成的、較大的9nm和11nm的復(fù)合物。這些觀察結(jié)果表明，在apoa-i基本序列中arg173→cys173的取代干擾了細(xì)胞膽固醇募集和初生hdl組裝的正常過(guò)程。該突變明顯與從細(xì)胞除去膽固醇的降低的效力有關(guān)。因此，其抗動(dòng)脈粥樣硬化的性質(zhì)可能與rct無(wú)關(guān)。歸因于arg173→cys173取代的、最顯著的結(jié)構(gòu)變化是apoa-im的二聚作用(bielickietal.,1997,arterioscler.thromb.vasc.biol.17(9):1637-43)。apoa-im可以與自身形成同源二聚體而與apoa-ii形成異源二聚體。對(duì)于包含載脂蛋白混合物的血液成分的研究表明，循環(huán)中二聚體和復(fù)合物的存在是造成載脂蛋白消除半衰期延長(zhǎng)的原因。已在突變體載體的臨床研究中觀察到此類(lèi)消除半衰期的延長(zhǎng)(greggetal.,1988,natoarwonhumanapolipoproteinmutants:fromgenestructuretophenotypicexpression,limonesg)。其它研究表明，apoa-im二聚體(apoa-im/apoa-im)在體外的hdl顆?；プ冎衅鹨种埔蜃拥淖饔?franceschinietal.,1990,j.biol.chem.265:12224-31)。3.4.目前用于血脂異常及相關(guān)病癥的治療血脂異常障礙是與升高的血清膽固醇和甘油三酯濃度以及較低的血清hdl:ldl比值相關(guān)的疾病，并且其包括高脂血癥(特別是高膽固醇血癥)、冠心病、冠狀動(dòng)脈疾病、血管和血管周?chē)膊?、以及諸如動(dòng)脈粥樣硬化的心血管疾病。也可以包括與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的綜合征，比如由動(dòng)脈機(jī)能不全引起的短暫性腦缺血發(fā)作或者間歇性跛行。目前具有大量可用于降低與血脂異常障礙相關(guān)的、高血清膽固醇和甘油三酯的治療。但是，鑒于療效、副作用和患病人群，而使得每種治療具有各自的缺點(diǎn)和限制。膽汁酸結(jié)合樹(shù)脂是一類(lèi)中斷膽汁酸由腸至肝的再循環(huán)的藥物，如消膽胺(questranbristol-myerssquibb)和鹽酸考來(lái)替泊(upjohn公司)以及鹽酸考來(lái)維侖(daiichi-sankyo公司)。當(dāng)口服時(shí)，這些帶正電荷的樹(shù)脂在腸中與帶負(fù)電荷的膽汁酸結(jié)合。由于所述樹(shù)脂不能由腸吸收，因此它們攜帶著膽汁酸一起排出。但是，此類(lèi)樹(shù)脂的使用充其量只能將血清膽固醇濃度降低約20％，而且其與以下的胃腸副作用有關(guān)，該副作用包括便秘和一些維生素缺乏癥。此外，由于所述樹(shù)脂也可以結(jié)合其它的藥物，因而必需在所述樹(shù)脂攝入前至少一個(gè)小時(shí)或者攝入之后四至六小時(shí)才能服用其它的口服藥物，從而使得心臟病患者的用藥方案復(fù)雜化。他汀類(lèi)藥物(statins)是降膽固醇藥物，其通過(guò)抑制膽固醇生物合成通路中所涉及的關(guān)鍵酶，即hmgcoa還原酶而阻斷膽固醇的合成。他汀類(lèi)藥物有時(shí)可結(jié)合膽汁酸結(jié)合樹(shù)脂使用，所述他汀類(lèi)藥物的例子如洛伐他汀辛伐他汀普伐他汀氟伐他汀和阿伐他汀他汀類(lèi)藥物顯著降低血清膽固醇和血清ldl的濃度，并且延緩冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。然而，血清hdl膽固醇的濃度僅中等地增加。ldl作用減弱的機(jī)制可能涉及vldl濃度的降低以及l(fā)dl受體細(xì)胞表達(dá)的誘導(dǎo)，而其造成了產(chǎn)量減少和/或ldl分解代謝增強(qiáng)。包括肝和腎功能障礙的副作用與這些藥物的使用有關(guān)(thephysiciansdeskreference,56thed.,2002,medicaleconomics)。煙酸(尼克酸)是一種水溶性的維生素b-復(fù)合物，其作為食物添加物和抗高血脂藥使用。煙酸減少了vldl的形成并且在降低ldl方面是有效的。在一些情況中，煙酸與膽汁酸結(jié)合樹(shù)脂結(jié)合使用。當(dāng)煙酸以足夠的劑量使用時(shí)，可以增加hdl，但是當(dāng)以這樣高的劑量使用時(shí)，其有效性受到嚴(yán)重副作用的限制。是一種延長(zhǎng)釋放的煙酸形式，其與純煙酸相比產(chǎn)生更少的副作用。煙酸/洛伐他汀是一種含有煙酸和洛伐他汀的制劑，其聯(lián)合了每種藥物的益處。貝特類(lèi)藥物(fibrates)是一類(lèi)降脂質(zhì)藥物，其用于治療各種形式的高脂血癥(即，血清甘油三酯升高)，所述高脂血癥也可以與高膽固醇血癥有關(guān)。貝特類(lèi)藥物似乎減少了vldl成分并且適當(dāng)?shù)卦黾恿薶dl，但是，這些藥物對(duì)于血清膽固醇的作用卻是可變的。在美國(guó)，貝特類(lèi)藥物如氯貝丁酯非諾貝特和苯扎貝特已被批準(zhǔn)作為降血脂藥使用，但仍未獲得批準(zhǔn)用作高膽固醇血癥藥物。例如，氯貝丁酯是一種降血脂藥，其(經(jīng)由未知的機(jī)制)通過(guò)減少vldl成分而起降低血清甘油三酯的作用。盡管在某些患者亞群中可以降低血清膽固醇，但是其對(duì)于藥物的生物化學(xué)反應(yīng)是可變的，并且不可能總是預(yù)知哪名患者將獲得有利的結(jié)果。未表現(xiàn)出預(yù)防冠心病的療效。化學(xué)和藥理學(xué)相關(guān)的藥物吉非貝齊是一種脂質(zhì)調(diào)節(jié)劑，其中等地降低血清甘油三酯和vldl膽固醇，并中等增加hdl膽固醇-hdl2和hdl3亞成分以及apoa-i和a-ii(即，ai/amt-hdl成分)。但是，該脂質(zhì)應(yīng)答是不均勻的(heterogeneous)，特別是在不同的患者群體中。此外，盡管在無(wú)冠心病史或無(wú)現(xiàn)存冠心病癥狀的、40-55歲之間的男性患者中觀察到了冠心病的預(yù)防作用，但是還不清楚將這些結(jié)果以何種程度外推至其它的患者群體(如，婦女、老年人和較年輕的男性)。事實(shí)上，在患有確定的冠心病的患者中并未觀察到療效。嚴(yán)重的副作用與貝特類(lèi)藥物的使用有關(guān)，而所述副作用包括毒性作用，如惡性腫瘤(特別是胃腸癌)、膽囊疾病以及非冠狀死亡發(fā)生幾率的增加。對(duì)于絕經(jīng)后婦女中的中度的高膽固醇血癥，可考慮口服雌激素替代療法。然而，hdl的增加可能伴有甘油三酯的升高。當(dāng)然，雌激素治療受限于具體的患者群體(絕經(jīng)后婦女)并且與嚴(yán)重的副作用有關(guān)，而所述副作用包括誘發(fā)惡性腫瘤、膽囊疾病、血栓栓塞性疾病、肝腺瘤、血壓升高、葡萄糖耐受不良以及高鈣血癥。其它可用于治療高脂血癥的藥物包括依澤替米貝(merck)，其阻斷或抑制膽固醇的吸收。但是，依澤替米貝的抑制劑已顯示出某種毒性。hdl以及與磷脂復(fù)合的、重組形式的apoa-i可用作非極性或兩親性分子的吸收劑/清除劑，所述非極性或兩親性分子如膽固醇及衍生物(氧甾醇、氧化的甾醇、植物甾醇等)、膽固醇酯、磷脂及衍生物(氧化的磷脂)、甘油三酯、氧化產(chǎn)物和脂多糖(lps)(參見(jiàn)，如，casasetal.,1995,j.surg.res.nov59(5):544-52)。hdl還可以用作tnf-α及其它淋巴因子的清除劑。hdl還可以用作人血清對(duì)氧磷酶的載體，所述人血清對(duì)氧磷酶如pon-1、-2、-3。對(duì)氧磷酶是一種與hdl締合的酯酶，其對(duì)于保護(hù)細(xì)胞組分對(duì)抗氧化是重要的。ldl的氧化在氧化應(yīng)激過(guò)程中產(chǎn)生，其似乎與動(dòng)脈粥樣硬化的形成有直接關(guān)聯(lián)(aviram,2000,freeradic.res.33suppl:s85-97)。對(duì)氧磷酶似乎在動(dòng)脈粥樣硬化和心血管疾病的易受性方面起重要作用(aviram,1999,mol.med.today5(9):381-86)。人血清對(duì)氧磷酶(pon-1)與高密度脂蛋白(hdl)結(jié)合。其活性與動(dòng)脈粥樣硬化呈負(fù)相關(guān)。pon-1水解有機(jī)磷酸酯并且可以通過(guò)抑制hdl和低密度脂蛋白(ldl)的氧化而保護(hù)免受動(dòng)脈粥樣硬化(aviram,1999,mol.med.today5(9):381-86)。實(shí)驗(yàn)研究表明，這種保護(hù)作用與pon-1水解氧化的脂蛋白中的特異性脂質(zhì)過(guò)氧化物的能力有關(guān)。保持或促進(jìn)pon-1活性的干預(yù)可有助于延緩動(dòng)脈粥樣硬化與冠心病的發(fā)作。hdl進(jìn)一步具有抗血栓藥和纖維蛋白原還原劑的作用以及作為失血性休克藥物的作用(cockerilletal.,wo01/13939,2001年3月1日公布)。hdl，特別是apoa-i，其已被證明促進(jìn)敗血癥產(chǎn)生的脂多糖交換為包含apoa-i的脂質(zhì)顆粒，從而功能性地中和所述脂多糖(wrightetal.,wo9534289,1995年12月21日公布；wrightetal.,1999年7月27日發(fā)行的美國(guó)專(zhuān)利5,928,624；1999年8月3日發(fā)行的美國(guó)專(zhuān)利5,932,536)。存在眾多可用于體外制備脂蛋白復(fù)合物的方法。美國(guó)專(zhuān)利6,287,590和6,455,088公開(kāi)了如下的方法：將載脂蛋白和脂質(zhì)溶液在有機(jī)溶劑(或者溶劑混合物)中共冷凍干燥并且在冷凍干燥粉末的水合過(guò)程中形成荷電的脂蛋白復(fù)合物。脂蛋白復(fù)合物也可通過(guò)洗滌劑透析法來(lái)形成；例如，將脂質(zhì)、脂蛋白和諸如膽酸鹽的洗滌劑的混合物進(jìn)行透析并重構(gòu)形成復(fù)合物(參見(jiàn)，例如jonasetal.,1986,methodsenzymol.128:553-82)。美國(guó)公布文本2004/0067873的實(shí)施例1公開(kāi)了膽酸鹽分散法，其中將脂質(zhì)分散體與膽酸鹽在用于形成為膠束的條件下混合，并且再將這些膠束與載脂蛋白溶液一起孵育以形成復(fù)合物。最終，例如通過(guò)透析、超濾或者在親和性珠子或者樹(shù)脂上吸附將有毒的膽酸鹽除去。美國(guó)專(zhuān)利6,306,433公開(kāi)了通過(guò)使得蛋白和脂質(zhì)的流體混合物進(jìn)行高壓勻漿化來(lái)形成脂蛋白復(fù)合物。然而，對(duì)于高剪切力敏感的蛋白可能在暴露至高壓勻漿時(shí)喪失活性。因此，目前可用的制備方法導(dǎo)致起始物質(zhì)的浪費(fèi)諸如蛋白降解，和/或者需要所得產(chǎn)物的純化諸如除去毒性劑，且因此是效率低且開(kāi)支大的。此外，脂蛋白復(fù)合物的制備可為不均一的，其含有尺寸和組成可變的復(fù)合物的混合物。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利5,876,968。因此，需要開(kāi)發(fā)用于產(chǎn)生脂蛋白復(fù)合物的有效且獲得更均質(zhì)的復(fù)合物(優(yōu)選具有高純度)的新的方法。所述方法可允許更經(jīng)濟(jì)的大規(guī)模生產(chǎn)，而產(chǎn)生具有較低的污染物所導(dǎo)致的副作用風(fēng)險(xiǎn)的更均質(zhì)的藥用產(chǎn)物。此外，然而考慮到產(chǎn)物的低的總產(chǎn)率以及在重組表達(dá)的蛋白培養(yǎng)中出現(xiàn)的蛋白降解，apoa-i、apoa-im、apoa-ip和其它變體以及重組的hdl目前受到大量的治療性給藥所需的載脂蛋白以及蛋白生產(chǎn)成本的限制(參見(jiàn)，例如malloryetal.,1987,j.biol.chem.262(9):4241-4247；schmidtetal.,1997,proteinexpression&purification10:226-236)。早期臨床試驗(yàn)已經(jīng)表明用于治療心血管疾病的每次輸注所給予的蛋白劑量范圍為1.5-4g。完全治療所需的輸注次數(shù)是未知的(參見(jiàn)，例如erikssonetal.,1999,circulation100(6):594-98；carlson,1995,nutr.metab.cardiovasc.dis.5:85-91；nanjeeetal.,2000,arterioscler.thromb.vasc.biol.20(9):2148-55；nanjeeetal.,1999,arterioscler.thromb.vasc.biol.19(4):979-89；nanjeeetal.,1996,arterioscler.thromb.vasc.biol.16(9):1203-14)。重組人apoa-i已經(jīng)在異源性宿主中表達(dá)，然而成熟蛋白的產(chǎn)率不足以用于大規(guī)模治療應(yīng)用，特別是當(dāng)與進(jìn)一步降低產(chǎn)率且產(chǎn)生不純產(chǎn)物的純化方法結(jié)合時(shí)。weinbergetal.,1988,j.lipidresearch29:819-824描述了通過(guò)反相高效液相色譜由人血漿純化的載脂蛋白a-i、a-ii和a-iv以及它們的亞型的分離。wo2009/025754描述了α-1-抗胰蛋白酶和apoa-i由人血漿的蛋白分離和純化。hunteretal.,2009,biotechnol.prog.25(2):446-453描述了大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá)的apoa-i米蘭突變體的大規(guī)模純化。caparonetal.,2009,biotechnol.andbioeng.105(2):239-249描述了apoa-i米蘭由大腸桿菌宿主的表達(dá)和純化，所述大腸桿菌宿主經(jīng)遺傳性工程化以刪除兩個(gè)宿主細(xì)胞蛋白以降低這些蛋白在純化的載脂蛋白產(chǎn)物中的水平。美國(guó)專(zhuān)利6,090,921描述了使用陰離子交換色譜法將apoa-i或者載脂蛋白e(apoe)由含有apoa-i和apoe的人血漿成分純化。breweretal.,1986,meth.enzymol.128:223-246描述了使用色譜技術(shù)進(jìn)行載脂蛋白由人血液的分離和表征。weisweileretal.,1987,clinicachimicaacta169:249-254描述了使用快速-蛋白液相色譜法進(jìn)行apoa-i和apoa-ii由人hdl的分離。desilvaetal.,1990,j.biol.chem.265(24):14292-14297描述了通過(guò)免疫親和色譜法和反相高效液相色譜法進(jìn)行載脂蛋白j的純化。目前正在開(kāi)發(fā)脂蛋白和脂蛋白復(fù)合物用于臨床應(yīng)用，其中臨床研究使用不同的基于脂蛋白的試劑，其確立了脂蛋白療法的可行性(tardif,2010,journalofclinicallipidology4:399–404)。一個(gè)研究評(píng)價(jià)了自體同源的去脂的hdl(waksmanetal.,2010,jam.coll.cardiol.55:2727-2735)。另外的研究評(píng)價(jià)了etc-216，其為重組apoa-im和棕櫚?；?油?；?pc(popc)的復(fù)合物(nissenetal.,2003,jama290:2292-2300)。csl-111為由與大豆磷脂酰膽堿(sbpc)絡(luò)合的血漿純化的重建的人apoa-i(tardifetal.,2007,jama297:1675-1682)。目前的探索藥物已經(jīng)顯示出降低動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的效能，但是該作用伴隨有次級(jí)效應(yīng)，諸如轉(zhuǎn)氨酶增加以及apoa-i抗體的形成(nanjeeetal.,1999,arterioscler.vasc.throm.biol.19:979-89；nissenetal.,2003,jama290:2292-2300；spiekeretal.,2002,circulation105:1399-1402；nieuwdorpetal.,2004,diabetologia51:1081-4；drewetal.,2009,circulation119,2103-11；shawetal.,2008,circ.res.103:1084-91；tardiffetal.,2007,jama297:1675-1682；waksman,2008,circulation118:s371；cho,美國(guó)專(zhuān)利7,273,849b2,2007年9月25日出版)。例如，erase臨床試驗(yàn)(tardiffetal.,2007,jama297:1675-1682)采用兩個(gè)劑量的csl-111：40mg/kg和80mg/kg的apoa-i。80mg/kg劑量組由于肝毒性(已知為嚴(yán)重的轉(zhuǎn)氨酶升高)而需要終止。甚至在40mg/kg劑量組中，若干患者經(jīng)歷了轉(zhuǎn)氨酶升高。因此，存在對(duì)于更有效地降低血清膽固醇、增加hdl血清水平、預(yù)防和/或者治療血脂異常和/或者與血脂異常相關(guān)的疾病、病癥和/或者障礙的更安全的藥物的需要。本領(lǐng)域存在對(duì)于不與肝毒性相關(guān)且優(yōu)選僅誘導(dǎo)甘油三酯、ldl-甘油三酯或者vldl-甘油三酯的最少量(或者無(wú))的增加的脂蛋白制劑，以及對(duì)于可用于可靠地制備這些脂蛋白的商業(yè)規(guī)模的制劑的穩(wěn)固生產(chǎn)方法的需要。4.技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本公開(kāi)提供了特別適用于治療和/或者預(yù)防血脂異常和與血脂異常相關(guān)的疾病、障礙和/或者病癥的包含蛋白部分(例如載脂蛋白部分)和脂質(zhì)部分的脂蛋白復(fù)合物和脂蛋白復(fù)合物群體。本公開(kāi)還發(fā)現(xiàn)了本申請(qǐng)所述的具有更高純度和/或者均質(zhì)性和/或者包含特定比例的脂質(zhì)和蛋白的復(fù)合物群體具有增強(qiáng)的動(dòng)員膽固醇以及降低副作用風(fēng)險(xiǎn)的能力。所述脂蛋白復(fù)合物包含蛋白部分(例如載脂蛋白部分)和脂質(zhì)部分(例如磷脂部分)。所述蛋白部分包含一種或者多種當(dāng)存在于脂蛋白復(fù)合物中時(shí)能夠動(dòng)員膽固醇的脂質(zhì)-結(jié)合蛋白，諸如載脂蛋白、肽或者載脂蛋白肽類(lèi)似物或者模擬物。所述載脂蛋白和載脂蛋白肽的非限制性實(shí)例包括前原載脂蛋白、前原apoai、原apoa-i、apoa-i、前原apoa-ii、原apoa-ii、apoa-ii、前原apoa-iv、原apoa-iv、apoa-iv、apoa-v、前原apoe、原apoe(proapoe)、apoe、前原apoa-im、原apoa-im、apoa-im、前原apoa-ip、原apoa-ip、apoa-ip、前原apoa-iz、原apoa-iz和apoa-iz。所述一種或者多種載脂蛋白可為單體、二聚體或者三聚體或者它們的混合物的形式。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述載脂蛋白部分基本上由apoa-i構(gòu)成，最優(yōu)選地為單一同等型。脂蛋白復(fù)合物中的apoa-i可具有與相應(yīng)于seqidno:1的氨基酸25-267的蛋白至少90％或者至少95％的序列同一性。任選地，apoa-i進(jìn)一步包含在相應(yīng)于seqidno:1的全長(zhǎng)apoa-i氨基酸25的位置(以及成熟蛋白的位置1)上的門(mén)冬氨酸。優(yōu)選地，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或者至少95％的apoa-i為經(jīng)恰當(dāng)工程化的成熟蛋白(即，缺失信號(hào)和前肽序列)且為未被氧化、被脫去酰胺和/或者被截短的。本公開(kāi)還提供了經(jīng)工程化以表達(dá)apoa-i的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞、包含apoa-i的細(xì)胞培養(yǎng)物以及產(chǎn)生成熟的生物學(xué)活性apoa-i的方法。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，工程化哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞以表達(dá)大量的成熟apoa-i是可能的，所述成熟apoa-i基本上不含不成熟的apoa-i(原apoa-i)以及經(jīng)蛋白酶降解所產(chǎn)生的截短形式的apoa-i。這些結(jié)果是令人意料不到的。首先，預(yù)期的是，用于蛋白加工的宿主細(xì)胞機(jī)制(machinery)被異源性蛋白如apoa-i的過(guò)表達(dá)所壓制，這導(dǎo)致未加工的不成熟蛋白的產(chǎn)生。第二，使得分泌至培養(yǎng)基中的apoa-i被蛋白酶降解，而僅在培養(yǎng)基中觀察到低水平的截短的apoa-i。哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物和產(chǎn)生apoa-i的方法特別適于以商業(yè)上相關(guān)的數(shù)量產(chǎn)生用于治療應(yīng)用中的成熟蛋白。將本申請(qǐng)?zhí)峁┑牟溉閯?dòng)物宿主細(xì)胞工程化以表達(dá)優(yōu)選包含氨基酸序列(或者由氨基酸序列組成)的蛋白，所述氨基酸序列具有與seqidno:1的位置25-267至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或者100％的同一性。所述蛋白優(yōu)選在相應(yīng)于seqidno:1的位置25的位置上具有門(mén)冬氨酸殘基。所述哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞可任選地進(jìn)一步分泌所述蛋白。在一些情況下，由哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表達(dá)和/或者分泌的蛋白可進(jìn)一步包含18個(gè)氨基酸的信號(hào)序列(mkaavltlavlfltgsqa，seqidno:2)和/或者6個(gè)氨基酸的前肽序列(rhfwqq，seqidno:3)。在一些情況下，將所述宿主細(xì)胞工程化以表達(dá)包含氨基酸序列的蛋白，所述氨基酸序列具有與seqidno:1至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或者100％的同一性。所述宿主細(xì)胞可來(lái)自任何哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，包括但不限于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(例如cho-k1或者cho-s)、vero、bhk、bhk570、hela、cos-1、cos-7、mdck、293、3t3、pc12和w138，或者來(lái)自骨髓瘤細(xì)胞或者細(xì)胞系(例如鼠類(lèi)骨髓瘤細(xì)胞或者細(xì)胞系)。所述哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞可進(jìn)一步含有編碼apoa-i蛋白的核酸的多個(gè)副本，所述apoa-i蛋白為例如包含seqidno:1的位置25-267或者由seqidno:1的位置25-267組成的蛋白。例如，所述哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞可含有至少約5、6、7、8或者更多的核酸副本，且至多約10、11、12、13或者14個(gè)核酸副本。所述核酸可進(jìn)一步可操作地連接至啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子能夠在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中高水平地表達(dá)所述蛋白，例如，猿猴巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子或者更具體為早期猿猴巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子。所述哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞優(yōu)選能夠在培養(yǎng)物中產(chǎn)生至少約0.5、1、2或者3g/lapoa-i和/或者至多約20g/lapoa-i，例如至多4、5、6、7、8、9、10、12或者15g/lapoa-i。所述培養(yǎng)物可為任意規(guī)格的，范圍為約150ml至約500l、1000l、2000l、5000l、10,000l、25,000l或者50,000l或者更大。在不同的實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)物體積的范圍可為10l至50l、50l至100l、100l至150l、150l至200l、200l至300l、300l至500l、500l至1000l、1000l至1500l、1500l至2000l、2000l至3000l、3000l至5000l、5000l至7500l、7500l至10,000l、10,000l至20,000l、20,000l至40,000l、30,000l至50,000l。在一些情況下，所述培養(yǎng)物為大規(guī)格培養(yǎng)物，諸如15l、20l、25l、30l、50l、100l、200l、300l、500l、1000l、5000l、10,000l、15,000l、20,000l、25,000l、至多50,000l或者更大。本公開(kāi)的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞可在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)。因此，本公開(kāi)進(jìn)一步提供了哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物，其包含如上所述或者在如下段落6.1.2中所述的多個(gè)哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。所述細(xì)胞培養(yǎng)物可包括一種或者多種以下特征：(a)所述培養(yǎng)物(其任選地為至少10升、至少20升、至少30升、至少50升、至少100升、300l、500l、1000l、5000l、10,000l、15,000l、20,000l、25,000l、至多50,000l的大規(guī)格分批培養(yǎng)物，或者為至少10升、至少20升、至少30升、至少50升、至少100升、300l、500l、1000l、5000l或者至多10,000l的連續(xù)培養(yǎng)物)包含至少約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0g/l或者更多的成熟apoa-i蛋白，該apoa-i蛋白包含相應(yīng)于seqidno:1的氨基酸25-267的氨基酸序列或者由該氨基酸序列組成；(b)在所述培養(yǎng)基中的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或者至少99％的蛋白為缺失信號(hào)序列的apoa-i蛋白；(c)在所述培養(yǎng)基中的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或者至少99％的蛋白為缺失信號(hào)序列和前肽序列的成熟apoa-i蛋白；以及(d)至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的成熟apoa-i未被截短、氧化或者被脫去酰胺。本公開(kāi)還提供了產(chǎn)生成熟的生物學(xué)活性apoa-i的方法。一般而言，所述方法包括在表達(dá)和分泌apoa-i的條件下培養(yǎng)如上所述或者在如下段落6.1.2中所述的任意哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。所述方法可進(jìn)一步包括以下步驟：由培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的上清液回收，并任選地純化所述成熟的生物學(xué)活性apoa-i(諸如通過(guò)在如下段落6.1.3和段落6.1.4公開(kāi)的方法)。通過(guò)如上所述的方法獲得的或者可獲得的apoa-i可進(jìn)一步與脂質(zhì)復(fù)合以形成本申請(qǐng)所述的脂蛋白復(fù)合物，和/或者可以治療有效量摻入至藥物組合物中。所述藥物組合物優(yōu)選為磷酸鹽緩沖溶液，其也含有蔗糖和/或者甘露醇作為賦形劑。已經(jīng)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使用色譜法和濾過(guò)步驟的新的組合來(lái)純化apoa-i，可產(chǎn)生大量的純的apoa-i，其含有如下水平的宿主細(xì)胞蛋白、宿主細(xì)胞dna、內(nèi)毒素和截短形式的所述蛋白，所述水平足夠低以至于產(chǎn)生一種或者多種屬性，包括降低的副作用風(fēng)險(xiǎn)以及低毒性或者無(wú)毒性，這使得所述蛋白特別適用于治療用途。優(yōu)選地，由本申請(qǐng)所述的方法純化的apoa-i在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中重組性產(chǎn)生且分泌至生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。因此，本公開(kāi)涉及純化apoa-i的方法，其包括以下步驟：(a)使含有apoa-i的溶液與陰離子交換基質(zhì)在使得apoa-i不能與所述基質(zhì)結(jié)合的條件下接觸；(b)經(jīng)具有足以除去病毒或者病毒顆粒的孔徑的膜將步驟(a)獲得的含有apoa-i的溶液濾過(guò)；(c)在使得apoa-i與基質(zhì)結(jié)合的條件下使得步驟(b)獲得的濾液經(jīng)過(guò)第一反相色譜柱；(d)使用增加濃度的有機(jī)溶劑梯度由所述第一反相色譜基質(zhì)洗脫出第一含有apoa-i的反相洗脫液；(e)在使得apoa-i與基質(zhì)結(jié)合的條件下使得步驟(d)的第一apoa-i的反相洗脫液經(jīng)過(guò)第二反相色譜柱；以及(f)使用增加濃度的有機(jī)溶劑梯度由所述第二反相色譜基質(zhì)洗脫出第二含有apoa-i的反相洗脫液。所進(jìn)行的步驟的順序不是關(guān)鍵的，例如，在示例性實(shí)施方案中，經(jīng)膜濾過(guò)以除去病毒或者病毒顆粒的步驟在上述步驟(f)之后進(jìn)行，而不是在步驟(a)之后進(jìn)行。本申請(qǐng)還提供了由本申請(qǐng)所述的純化方法獲得的或者可獲得的基本純的apoa-i產(chǎn)物，其中apoa-i的濃度為至少10g/l。所述由本申請(qǐng)所述的純化方法產(chǎn)生的基本純的apoa-i產(chǎn)物優(yōu)選包含小于約10pg的宿主細(xì)胞dna/mgapoa-i、小于約100ng的宿主細(xì)胞蛋白/mgapoa-i和/或者小于0.1eu的內(nèi)毒素/mgapoa-i。所述apoa-i產(chǎn)物可為至少95％純的、至少96％純的、至少97％純的、至少98％純的或者至少99％純的。此外，所述基本純的apoa-i產(chǎn)物可摻入至本申請(qǐng)所述的包含apoa-i的任何藥物組合物和/或者脂蛋白復(fù)合物。所述脂質(zhì)部分通常包含一種或者多種磷脂，所述磷脂可為中性的、荷負(fù)電的、荷正電的或者它們的組合。所述磷脂上的脂肪酸鏈在長(zhǎng)度上優(yōu)選含有12-26或者16-26個(gè)碳且可在飽和程度上為飽和至單不飽和。示例性磷脂包括小烷基鏈磷脂、蛋磷脂酰膽堿、大豆磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、1-肉豆蔻酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿、1-棕櫚酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、1-棕櫚酰-2-硬脂酰磷脂酰膽堿、1-硬脂酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰甘油磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油諸如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕櫚酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰絲氨酸、二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸、腦磷脂酰絲氨酸、腦鞘磷脂、蛋鞘磷脂、乳鞘磷脂、棕櫚酰鞘磷脂、植物鞘磷脂、二棕櫚酰鞘磷脂、二硬脂酰鞘磷脂、二棕櫚酰磷脂酰甘油鹽、磷脂酸、半乳糖腦苷脂、神經(jīng)節(jié)苷酯、腦苷脂、二月桂基磷脂酰膽堿、(1,3)-d-甘露糖基-(1,3)甘油二酯、氨基苯基糖苷、3-膽固醇基-6'-(糖基硫基)己基醚糖脂以及膽固醇及其衍生物。包含sm和棕櫚酰鞘磷脂的磷脂部分可任選地包含少量的任意類(lèi)型的脂質(zhì)，包括但不限于溶血磷脂質(zhì)、除了棕櫚酰鞘磷脂之外的鞘磷脂、半乳糖腦苷脂、神經(jīng)節(jié)苷酯、腦苷脂、甘油酯、甘油三酯以及膽固醇及其衍生物。最優(yōu)選地，所述脂質(zhì)部分含有至少一種中性磷脂以及任選地一種或者多種負(fù)電荷磷脂。在包含中性和負(fù)電荷磷脂的脂蛋白復(fù)合物中，所述中性和負(fù)電荷磷脂可含有具有相同或者不同數(shù)目的碳以及相同或者不同程度的飽和度的脂肪酸鏈。在一些情況下，所述中性和負(fù)電荷磷脂將具有相同的酰基末端，例如c16:0，或者棕櫚酰、酰基鏈。當(dāng)所述復(fù)合物的脂質(zhì)成分包含中性和負(fù)電荷磷脂或者由中性和負(fù)電荷磷脂組成時(shí)，所述中性與負(fù)電荷磷脂的重量-重量(wt:wt)比優(yōu)選為范圍為約99:1至約90:10、更優(yōu)選約99:1至約95:5且最優(yōu)選約98:2至約96:4的wt:wt比。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或多種中性磷脂和一種或多種負(fù)電荷磷脂以約97:3的一種或多種中性磷脂與一種或多種負(fù)電荷磷脂的重量-重量(wt:wt)比存在。所述中性磷脂可為天然的或者合成的。優(yōu)選地，所述磷脂為鞘磷脂(“sm”)，諸如棕櫚酰鞘磷脂、植物鞘磷脂、二植物鞘磷脂、磷酸鞘脂或者糖鞘脂，其任選地含有具有16-26個(gè)碳原子的鏈長(zhǎng)的飽和或者單-不飽和的脂肪酸。sm可來(lái)自任何來(lái)源。例如，所述sm可由乳、蛋、腦獲得或者合成性制備。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述sm由雞蛋獲得(“蛋sm”)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述sm為棕櫚酰鞘磷脂。在生理學(xué)ph帶有至少部分負(fù)電荷的任何磷脂可用作負(fù)電荷磷脂。非限制性實(shí)例包括荷負(fù)電的形式，例如磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油和磷脂酸的鹽。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述負(fù)電荷磷脂為1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-[-磷酸-外消旋-(1-甘油)]或者dppg、磷脂酰甘油。優(yōu)選的鹽包括鉀鹽和鈉鹽。用于制備本公開(kāi)復(fù)合物的磷脂優(yōu)選為至少95％純的且更優(yōu)選為至少99％純的，和/或者具有在4meqo/kg、更優(yōu)選在3meqo/kg(例如在2meqo/kg)的氧化水平。氧和脂肪酸的主要初始反應(yīng)產(chǎn)物為過(guò)氧化氫。使用碘量滴定法，可以通過(guò)測(cè)定過(guò)氧化物在樣品中的存在來(lái)測(cè)量氧化水平。本公開(kāi)的脂蛋白復(fù)合物優(yōu)選具有載脂蛋白與脂質(zhì)的比，該比導(dǎo)致更完全和更均質(zhì)的復(fù)合物形成，如下在實(shí)施例中顯示。所述脂蛋白復(fù)合物的特征在于范圍為1:80-1:120、1:100-1:115或者1:105-1:110的載脂蛋白部分:脂質(zhì)部分摩爾比，其中所述載脂蛋白在apoa-i等價(jià)物中表達(dá)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述載脂蛋白部分:脂質(zhì)部分的摩爾比為1:80-1:90(例如1:82、1:85或者1:87)、1:90-1:100(例如1:95或者1:98)、1:100-1:110(例如1:105或者1:108)。在一些具體的實(shí)施方案中，特別是蛋sm用作中性脂質(zhì)的那些，所述載脂蛋白部分:脂質(zhì)部分的重量比的范圍為約1:2.7至約1:3(例如1:2.7)。本公開(kāi)的脂蛋白復(fù)合物也可用作遞送疏水性、親脂性或者非極性活性劑的載體。對(duì)于所述應(yīng)用，所述脂質(zhì)部分可進(jìn)一步包含一種或者多種疏水性、親脂性或者非極性活性劑，或者所述脂蛋白復(fù)合物可載入有一種或者多種疏水性、親脂性或者非極性活性劑，所述活性劑包括但不限于脂肪酸、藥物、核酸、維生素和/或者營(yíng)養(yǎng)素?；钚詣┑木唧w實(shí)例描述于段落6.2中。本公開(kāi)還提供了脂蛋白復(fù)合物群體。典型地：·所述群體含有多個(gè)脂蛋白復(fù)合物，其各自包含蛋白部分和脂質(zhì)部分；·所述蛋白部分含有如上所述和在段落6.1或者6.5.3中所述的脂蛋白或者脂蛋白類(lèi)似物；最優(yōu)選地，蛋白部分包含脂蛋白(例如apoa-i蛋白)或者基本上由脂蛋白(例如apoa-i蛋白)構(gòu)成，所述脂蛋白由段落6.1.2所述的方法獲得或者可獲得，和/或者由段落6.1.4所述的方法純化；·所述脂質(zhì)部分含有如上所述和在段落6.2或者6.5.2中所述的脂質(zhì)；·所述脂蛋白復(fù)合物優(yōu)選由在段落6.5.4中所述的熱循環(huán)方法產(chǎn)生。申請(qǐng)人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了若干特征，這些特征被認(rèn)為在單獨(dú)或者組合時(shí)有助于脂蛋白復(fù)合物群體的效能和安全性特性。這些特征包括：·群體中的復(fù)合物大小的均一性，其主要范圍為4nm至15nm(例如5nm至12nm、6nm至15nm或者8nm至10nm)；·用于制備復(fù)合物的載脂蛋白的純度(例如，缺乏被氧化的、被脫去酰胺的、被截短的和/或者不成熟形式的載脂蛋白和/或者缺乏內(nèi)毒素和/或者缺乏除了一種或者多種載脂蛋白之外的蛋白(諸如宿主細(xì)胞蛋白)，和/或者通常存在于重組生產(chǎn)中的宿主細(xì)胞dna)；·群體中復(fù)合物本身的純度(特征在于缺乏污染物，諸如用于制備復(fù)合物的溶劑或者洗滌劑；缺乏氧化的脂質(zhì)；缺乏被脫去酰胺的、氧化的或者截短的蛋白；和/或者降低量的或者缺乏非復(fù)合的載脂蛋白和/或者脂質(zhì))。在這些特征中，認(rèn)為復(fù)合物的均一性以及復(fù)合物中成熟的、未修飾的載脂蛋白的普及能夠增加效能。載脂蛋白、脂質(zhì)和復(fù)合物的純度降低了副作用的風(fēng)險(xiǎn)，所述副作用諸如由肝酶(例如轉(zhuǎn)氨酶)增加所表現(xiàn)出的肝損傷。此外，發(fā)明人已經(jīng)可以通過(guò)導(dǎo)致大部分載脂蛋白摻入復(fù)合物中的方法制備脂蛋白復(fù)合物群體，并且非復(fù)合的載脂蛋白的量的降低也是有益的，這是因?yàn)槠浣档土丝捎山o予異源性蛋白所引起的受試者中免疫源應(yīng)答的風(fēng)險(xiǎn)。因此，本公開(kāi)提供了脂蛋白復(fù)合物群體，其特征在于以下特征中的一種或者多種或者全部：(a)所述群體中至少75wt％、至少80wt％、至少85wt％、至少90wt％或者至少95wt％的脂蛋白(通常為apoa-i)為成熟形式；(b)所述群體中不超過(guò)25wt％、不超過(guò)20wt％、不超過(guò)15wt％、不超過(guò)10wt％或者不超過(guò)5wt％的脂蛋白(通常為apoa-i)為不成熟形式；(c)所述群體含有不超過(guò)100皮克宿主細(xì)胞dna/毫克脂蛋白(通常為apoa-i)、不超過(guò)50皮克宿主細(xì)胞dna/毫克脂蛋白(通常為apoa-i)、不超過(guò)25皮克宿主細(xì)胞dna/毫克脂蛋白(通常為apoa-i)、不超過(guò)10皮克宿主細(xì)胞dna/毫克脂蛋白(通常為apoa-i)或者不超過(guò)5皮克宿主細(xì)胞dna/毫克脂蛋白(通常為apoa-i)；(d)所述群體含有不超過(guò)500納克宿主細(xì)胞蛋白/毫克脂蛋白(通常為apoa-i)、不超過(guò)200納克宿主細(xì)胞蛋白/毫克脂蛋白(通常為apoa-i)、不超過(guò)100納克宿主細(xì)胞蛋白/毫克脂蛋白(通常為apoa-i)、不超過(guò)50納克宿主細(xì)胞蛋白/毫克脂蛋白(通常為apoa-i)或者不超過(guò)20納克宿主細(xì)胞蛋白/毫克脂蛋白(通常為apoa-i)；(e)所述群體中不超過(guò)25wt％、不超過(guò)20wt％、不超過(guò)15wt％、不超過(guò)10wt％或者不超過(guò)5wt％的脂蛋白(通常為apoa-i)為截短形式；(f)所述脂蛋白成分包含成熟apoa-i或者由成熟apoa-i構(gòu)成，且所述群體中的所述apoa-i中的不超過(guò)20％、不超過(guò)15％、不超過(guò)10％、不超過(guò)5％、不超過(guò)3％、不超過(guò)2％或者不超過(guò)1％的蛋氨酸112和蛋氨酸148各自被氧化；(g)如經(jīng)凝膠滲透色譜法(“gpc”)或者動(dòng)態(tài)光散射(“dls”)所測(cè)量，至少80％、至少85％、至少90％或者至少95％的脂蛋白復(fù)合物為具有以下粒度的顆粒形式：4nm至15nm，例如6nm至15nm或者8nm至12nm，更優(yōu)選5nm至12nm；(i)所述群體含有不超過(guò)1eu內(nèi)毒素/毫克脂蛋白(通常為apoa-i)、不超過(guò)0.5eu內(nèi)毒素/毫克脂蛋白(通常為apoa-i)、不超過(guò)0.3eu內(nèi)毒素/毫克脂蛋白(通常為apoa-i)或者不超過(guò)0.1eu內(nèi)毒素/毫克脂蛋白(通常為apoa-i)；(j)所述群體中的脂蛋白(通常為apoa-i)中的不超過(guò)15％、不超過(guò)10％、不超過(guò)5％、不超過(guò)4％、不超過(guò)3％、不超過(guò)2％或者不超過(guò)1％的氨基酸被脫去酰胺；(k)所述復(fù)合物中的脂質(zhì)部分中的不超過(guò)15wt％、不超過(guò)10wt％、不超過(guò)5wt％、不超過(guò)2wt％或者0wt％的脂質(zhì)為膽固醇；(l)所述群體含有不超過(guò)200ppm、100ppm、50ppm的非水溶劑；(m)所述群體不含有任何洗滌劑(例如膽酸鹽)；(n)如經(jīng)凝膠滲透色譜法中群體在單峰中的百分?jǐn)?shù)所測(cè)量，所述群體可為至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或者至少99％均質(zhì)的；(o)所述群體在組合物中，在所述組合物中，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或者至少97％的蛋白為復(fù)合形式；(p)所述群體中不超過(guò)5％、不超過(guò)4％、不超過(guò)3％、不超過(guò)2％或者不超過(guò)1％的脂質(zhì)被氧化；以及(q)所述群體中不超過(guò)15％、不超過(guò)10％、不超過(guò)5％、不超過(guò)4％、不超過(guò)3％、不超過(guò)2％或者不超過(guò)1％的蛋氨酸和/或者色氨酸殘基被氧化。在一些具體的實(shí)施方案中，所述群體具有選自以下各組的特征：組i：上述特征(a)、(b)和(e)；組ii：上述特征(c)、(d)和(i)；組iii：上述特征(f)、(j)、(e)、(p)和(q)；組iv：上述特征(g)、(n)和(o)；組v：上述特征(l)和(m)；和組vi：上述特征(k)。在某些方面，所述群體的特征在于獨(dú)立選自組i和組iv各自的一種或者兩種特征；任選地，所述群體的特征在于獨(dú)立選自組i和組iv各自的三種特征。所述群體的另外的特征在于獨(dú)立選自組ii和/或者組iii各自的一種、兩種或者三種特征。所述群體的進(jìn)一步特征在于獨(dú)立選自組v的一種或者兩種特征和/或者獨(dú)立選自組vi的一種特征。某些脂質(zhì)和蛋白成分可形成多種不同的但均質(zhì)的脂蛋白復(fù)合物。因此，本公開(kāi)還提供了包含兩種、三種或者四種脂蛋白復(fù)合物群體的組合物，所述脂蛋白復(fù)合物包含不同量的載脂蛋白分子(例如兩個(gè)、三個(gè)或者四個(gè)apoa-i分子或者apoa-i等價(jià)物)。在示例性實(shí)施方案中，組合物包含兩種脂蛋白復(fù)合物群體，其分別為包含每個(gè)脂蛋白復(fù)合物具有2個(gè)apoa-i分子或者apoa-i等價(jià)物的脂蛋白復(fù)合物的第一群體，包含每個(gè)脂蛋白復(fù)合物具有3或者4個(gè)apoa-i分子或者apoa-i等價(jià)物的脂蛋白復(fù)合物的第二群體，以及任選地包含每個(gè)脂蛋白復(fù)合物具有4或者3個(gè)apoa-i分子或者apoa-i等價(jià)物的脂蛋白復(fù)合物的第三群體。包含兩種或者更多種脂蛋白復(fù)合物群體的組合物優(yōu)選具有低水平的非復(fù)合的脂蛋白和/或者脂質(zhì)。因此，組合物中優(yōu)選不超過(guò)15％、不超過(guò)12％、不超過(guò)10％、不超過(guò)9％、不超過(guò)8％、不超過(guò)7％、不超過(guò)6％、不超過(guò)5％、不超過(guò)4％、不超過(guò)3％、不超過(guò)2％或者不超過(guò)1％的脂質(zhì)為非復(fù)合形式和/或者組合物中不超過(guò)15％、不超過(guò)12％、不超過(guò)10％、不超過(guò)9％、不超過(guò)8％、不超過(guò)7％、不超過(guò)6％、不超過(guò)5％、不超過(guò)4％、不超過(guò)3％、不超過(guò)2％或者不超過(guò)1％的脂蛋白為非復(fù)合形式。本公開(kāi)提供了用于制備脂蛋白復(fù)合物的方法。所述方法特別基于這樣的發(fā)現(xiàn)：使得含有非復(fù)合的脂質(zhì)以及脂質(zhì)-結(jié)合蛋白或者肽的混懸液經(jīng)歷熱循環(huán)條件會(huì)導(dǎo)致脂蛋白復(fù)合物的形成，其具有相對(duì)于其它方法有利的結(jié)果，在所述其它方法中通過(guò)將成分在固定溫度孵育來(lái)產(chǎn)生脂蛋白復(fù)合物。本公開(kāi)提供了用于制備脂蛋白復(fù)合物的熱循環(huán)方法，諸如在段落6.5.1至6.5.4中所述。典型地，所述方法包括使得包含脂質(zhì)顆粒(“脂質(zhì)成分”)和脂質(zhì)-結(jié)合蛋白或者肽(“蛋白成分”)的混懸液進(jìn)行多個(gè)熱循環(huán)，直到大部分蛋白成分摻入至脂蛋白復(fù)合物中。所述方法通常使得所述混懸液在第一較高溫度范圍內(nèi)的溫度以及第二較低溫度范圍內(nèi)的溫度之間的溫度進(jìn)行循環(huán)，直到形成脂蛋白復(fù)合物。所述熱循環(huán)方法的所述高和低溫度范圍是基于脂蛋白復(fù)合物的脂質(zhì)和蛋白成分的相轉(zhuǎn)變溫度?？蛇x擇地，當(dāng)所述脂質(zhì)成分不顯示確定的或者離散的相轉(zhuǎn)變時(shí)(這可在使用具有不飽和的脂肪酸鏈的磷脂或者磷脂混合物時(shí)發(fā)生)，所述熱循環(huán)的高和低溫度范圍的差別為至少約20℃，至多約40℃或者更大。例如，在一些實(shí)施方案中，所述低和高溫度范圍的差別為20℃-30℃、20℃-40℃、20℃-50℃、30℃-40℃、30℃-50℃、25℃-45℃、35℃-55℃。對(duì)于脂質(zhì)，所述相轉(zhuǎn)變包括由已知為凝膠狀態(tài)的緊密填充的有序的結(jié)構(gòu)變化為已知為流體狀態(tài)的松散填充的較無(wú)序的結(jié)構(gòu)。脂蛋白復(fù)合物通常在本領(lǐng)域中通過(guò)以下方法來(lái)形成：將脂質(zhì)顆粒和載脂蛋白在接近使用的具體脂質(zhì)或者脂質(zhì)混合物的轉(zhuǎn)變溫度進(jìn)行孵育。所述脂質(zhì)成分的相轉(zhuǎn)變溫度(其可由量熱法確定)+/-12℃，更優(yōu)選地+/-10℃表示本公開(kāi)方法中的“低”溫度范圍。在某些實(shí)施方案中，所述低溫度范圍為所述脂質(zhì)成分的相轉(zhuǎn)變溫度的+/-3℃、+/-5℃或者+/-8℃。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述低溫度范圍為所述脂質(zhì)成分的相轉(zhuǎn)變溫度的不小于-5℃或者不小于-10℃至+5℃。對(duì)于蛋白，所述相轉(zhuǎn)變溫度涉及由三級(jí)結(jié)構(gòu)變化為二級(jí)結(jié)構(gòu)。所述蛋白成分的相轉(zhuǎn)變溫度+/-12℃，更優(yōu)選+/-10℃表示本公開(kāi)的方法中的“高”溫度范圍。在一些具體的實(shí)施方案中，所述高溫度范圍為所述蛋白成分的相轉(zhuǎn)變溫度的+/-3℃、+/-5℃或者+/-8℃。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述低溫度范圍為所述蛋白成分的相轉(zhuǎn)變溫度的-10℃至不超過(guò)+5℃、不超過(guò)+10℃或者不超過(guò)+15℃。所述起始混懸液(即并未進(jìn)行熱循環(huán)的混懸液)的脂質(zhì)成分優(yōu)選包含脂質(zhì)顆粒，例如主要包含不與脂質(zhì)-結(jié)合蛋白復(fù)合的脂質(zhì)。所述脂質(zhì)成分的組成通常描述于如下段落6.5.2。所述起始混懸液的蛋白成分優(yōu)選含有這樣的脂質(zhì)-結(jié)合肽和/或者蛋白，所述脂質(zhì)-結(jié)合肽和/或者蛋白不與脂質(zhì)復(fù)合，或者以與在預(yù)期復(fù)合物中的蛋白/肽與脂質(zhì)的比相比大至少5-倍(例如至少5-倍、至少10-倍或者至少20-倍)的蛋白/肽與脂質(zhì)的比與脂質(zhì)組合。所述蛋白成分的組成通常描述于如下段落6.1和段落6.5.3。優(yōu)選根據(jù)在段落6.1.2中所述的方法制備所述蛋白成分和/或者根據(jù)在段落6.1.3或者6.1.4中所述的方法純化所述蛋白成分。在本公開(kāi)的方法中，將含有所述蛋白成分和脂質(zhì)成分的混懸液通常在高溫度范圍和低溫度范圍之間(優(yōu)選起始于在高溫度范圍中的溫度)進(jìn)行熱循環(huán)，直到形成脂蛋白復(fù)合物。使用適當(dāng)量的脂質(zhì)和蛋白成分(例如如在美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)2006-0217312a1中所述，將其內(nèi)容通過(guò)引用的方式并入本申請(qǐng))，在若干循環(huán)之后可實(shí)現(xiàn)所述脂質(zhì)和蛋白成分的基本完全復(fù)合。適于熱循環(huán)方法的對(duì)于蛋白和脂質(zhì)化學(xué)計(jì)量的進(jìn)一步詳述描述于段落6.5.4中。由所述方法產(chǎn)生的復(fù)合物通常為超分子集合體，其形態(tài)為膠束、小泡、球狀或者盤(pán)狀顆粒，其中所述蛋白成分與所述脂質(zhì)成分在具體的化學(xué)計(jì)量范圍進(jìn)行物理結(jié)合，其具有均勻的粒度分布。本公開(kāi)的方法有利地導(dǎo)致所述在起始混懸液中的脂質(zhì)和/或者蛋白基本上完全復(fù)合，這獲得基本上不含游離脂質(zhì)和/或者游離蛋白的組合物，如通過(guò)分離方法諸如色譜法所觀察。因此，本公開(kāi)的方法可在不存在純化步驟的情況下進(jìn)行。在起始混懸液中的脂質(zhì)成分通常為顆粒形式。優(yōu)選的是所述顆粒的粒度主要為至少45nm、至少50nm、至少55nm或者至少60nm，其粒度范圍為至多65nm、至多70nm、至多75nm、至多80nm、至多100nm、至多120nm、至多150nm、至多200nm、至多250nm、至多300nm、至多500nm，例如，45nm至100nm或者45nm至250nm，更優(yōu)選50nm至90nm，且最優(yōu)選55nm至75nm。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)顆粒主要包含蛋-鞘磷脂且粒度為55nm至75nm。在另外優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)顆粒主要包含一種或者多種合成鞘磷脂(例如棕櫚酰鞘磷脂或者植物鞘磷脂)且粒度為175nm至250nm。在另外優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)顆粒主要包含一種或者多種合成脂質(zhì)(例如棕櫚酰鞘磷脂或者植物鞘磷脂)且粒度為250nm至1000nm。在另外優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)顆粒主要包含一種或者多種合成脂質(zhì)(例如棕櫚酰鞘磷脂或者植物鞘磷脂)且粒度為1000nm至4000nm。本申請(qǐng)所指的粒度為經(jīng)動(dòng)態(tài)光散射確定的ζ(z)平均粒度。高壓勻漿例如微流化(microfluidization)有利地產(chǎn)生具有適當(dāng)粒度的脂質(zhì)顆粒。用于形成顆粒的其它方法披露于如下段落6.5.2中，且可用作勻漿化的替代方法。如果所述方法產(chǎn)生不在優(yōu)選的粒度范圍內(nèi)的顆粒，則所述顆?？蛇M(jìn)行粒度濾過(guò)以獲得具有適當(dāng)粒度的顆粒。本申請(qǐng)所述的制備脂蛋白復(fù)合物的方法有利地產(chǎn)生其粒度分布為均勻的復(fù)合物，這避免了對(duì)于粒度分級(jí)的需要。此外，本公開(kāi)的方法導(dǎo)致將起始的蛋白基本上完全摻入(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％)至脂蛋白顆粒中。因此，本公開(kāi)提供了包含脂蛋白復(fù)合物的組合物，且其中在所述組合物中的至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％的脂質(zhì)-結(jié)合蛋白與脂質(zhì)復(fù)合，例如使用凝膠滲透色譜法所確定。在一些具體的實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供了包含脂蛋白復(fù)合物的組合物，所述脂蛋白復(fù)合物具有以下的ζ平均粒度：4nm至20nm，例如4nm至20nm、4nm至15nm、4nm至12nm、5nm至15nm、5nm至12nm、5nm至10nm、5nm至20nm、6nm至15nm或者8nm至12nm，且其中所述組合物中的至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％的脂質(zhì)-結(jié)合蛋白與脂質(zhì)復(fù)合，例如使用凝膠滲透色譜法所確定。根據(jù)本申請(qǐng)所述的方法使脂質(zhì)顆粒與脂蛋白進(jìn)行熱循環(huán)通常導(dǎo)致具有以下粒度的脂蛋白顆粒群體：4nm至15nm，例如6nm至15nm、5nm至12nm或者8nm至12nm。進(jìn)行熱循環(huán)的所述脂質(zhì)顆粒的粒度的范圍可為50nm至250nm。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)顆粒主要包含蛋-鞘磷脂且粒度為55至75nm。在另外優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)顆粒主要包含一種或者多種合成鞘磷脂(例如植物鞘磷脂)且粒度為175nm至250nm。在制備脂蛋白復(fù)合物的方法中的一個(gè)或者多個(gè)步驟可在惰性氣體下進(jìn)行。實(shí)施該步驟可降低或者防止載脂蛋白和/或者脂質(zhì)的氧化，由此降低副作用諸如肝損傷的風(fēng)險(xiǎn)。適當(dāng)?shù)亩栊詺怏w包括氮?dú)?、氦氣和氬氣。通過(guò)如上所述的方法獲得的或者可獲得的脂蛋白復(fù)合物特別適于治療用途，這是因?yàn)樵谛纬蓮?fù)合物后不需要進(jìn)一步的純化步驟。本公開(kāi)還提供了脂蛋白復(fù)合物群體和藥物組合物，所述藥物組合物包含本申請(qǐng)所述的脂蛋白復(fù)合物或者其群體，且可任選地包含一種或者多種藥用載體、賦形劑和/或者稀釋劑。在一些實(shí)施方案中，將所述藥物組合物以適于給藥的單位劑量進(jìn)行包裝。例如，在一些實(shí)施方案中，所述組合物包含在密封瓶中包裝的單位劑量的干燥(例如低壓凍干)的脂蛋白復(fù)合物。所述組合物適于用水、生理溶液(諸如鹽水)或者緩沖劑重建，且經(jīng)注射給藥。所述組合物可任選地包含一種或者多種抗結(jié)塊劑和/或者抗團(tuán)聚劑以便于所述荷電復(fù)合物的重建，或者可包含設(shè)計(jì)用于調(diào)節(jié)所述重建混懸液的ph、滲透度和/或者鹽度的一種或者多種緩沖劑、等滲劑(例如蔗糖和/或者甘露醇)、糖或者鹽(例如氯化鈉)。如上所述的脂蛋白復(fù)合物群體和/或者藥物組合物可在使得氧化最小化的條件下制備，由此降低由氧化產(chǎn)物所引起的副作用諸如肝損傷的風(fēng)險(xiǎn)。例如，藥物組合物可在惰性氣體諸如氮?dú)狻⒑饣蛘邭鍤庀轮苽?。?duì)于商業(yè)應(yīng)用，有用的是進(jìn)行脂蛋白復(fù)合物和藥物組合物的大規(guī)格的制備。因此，本公開(kāi)還提供了包含脂蛋白復(fù)合物的至少1l、2l、5l或者10l且至多15l、20l、30l、50l或者更大的制劑(例如5l至30l、10l至15l或者30l至50l的制劑)，其量足以實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)-結(jié)合蛋白的以下濃度：至少約3mg/ml、至少約4mg/ml或者至少約5mg/ml，且至多約10mg/ml、約15mg/ml或者約20mg/ml，優(yōu)選范圍為約8mg/ml至約12mg/ml，最優(yōu)選約8mg/ml。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述制劑具有15l至25l的體積且含有約100g至約250g的apoa-i。在另外的具體實(shí)施方案中，所述制劑具有30l至50l的體積且含有約240g至約780g的apoa-i。本申請(qǐng)所述的脂蛋白復(fù)合物用于治療動(dòng)物最優(yōu)選人類(lèi)中的血脂異常障礙。所述病癥包括但不限于高脂血癥且特別是高膽固醇血癥(包括雜合的和純合的家族性高膽固醇血癥)，以及心血管疾病諸如動(dòng)脈粥樣硬化(包括治療和預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化)和動(dòng)脈粥樣硬化的眾多臨床表現(xiàn)諸如中風(fēng)、缺血性中風(fēng)(ischemicstroke)、短暫性缺血發(fā)作、心肌梗塞、急性冠脈綜合征(acutecoronarysyndrome)、心絞痛、間歇性跛行、嚴(yán)重肢體缺血(criticallimbischemia)、心瓣狹窄(valvestenosis)和房脈瓣硬化(atrialvalvesclerosis)；再狹窄(例如預(yù)防或者治療動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，其作為醫(yī)學(xué)操作諸如氣囊血管成形術(shù)的結(jié)果發(fā)展)；以及其它病癥諸如內(nèi)毒素血癥，其通常導(dǎo)致感染性休克。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本申請(qǐng)所述的脂蛋白復(fù)合物和組合物當(dāng)以低于迄今為止所研究的其它脂蛋白復(fù)合物所使用的劑量的劑量給藥時(shí)影響和/或者促進(jìn)膽固醇外流。參見(jiàn)例如spiekeretal.,2002,circulation105:1399-1402(使用80mg/kg的劑量)；nissenetal.,2003,jama290:2292-2300(使用15mg/kg或者40mg/kg的劑量)；tardifetal.,2007jama297:1675-1682(使用40mg/kg至80mg/kg的劑量)，使用范圍為15mg/kg至80mg/kg的劑量。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本申請(qǐng)所述的脂蛋白復(fù)合物具有減少的副作用。如下在實(shí)施例中所顯示，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本公開(kāi)的脂蛋白復(fù)合物在低至2mg/kg的劑量有效地動(dòng)員膽固醇，相反地先前給予人類(lèi)患者的脂蛋白復(fù)合物不顯著地提升甘油三酯、vldl和肝酶諸如轉(zhuǎn)氨酶的水平(c.f.,nanjeeetal.,1999,arterioscler.vasc.throm.biol.19:979-89)。此外，在具有正常肝和/或者腎功能的正常受試者中，即使當(dāng)劑量增至約15mg/kg(缺乏甘油三酯升高)或者高達(dá)45mg/kg(缺乏轉(zhuǎn)氨酶增加)時(shí)也觀察到減少的副作用。因此，本公開(kāi)復(fù)合物的在給藥時(shí)不產(chǎn)生副作用的能力優(yōu)選在具有正常肝功能、正常腎功能或者正常肝功能和正常腎功能的個(gè)體中進(jìn)行評(píng)估。在不被理論所束縛的情況下，發(fā)明人將本公開(kāi)脂蛋白復(fù)合物的益處歸因于相比于先前治療而言復(fù)合物的更均勻的粒度分布以及損傷的蛋白和/或者脂質(zhì)(例如氧化的蛋白、被脫去酰胺的蛋白以及氧化的脂質(zhì))的降低的量。進(jìn)一步認(rèn)為包含負(fù)電荷磷脂的所述脂質(zhì)部分將使得本申請(qǐng)所述的復(fù)合物和組合物相比于常規(guī)脂蛋白復(fù)合物而言具有改善的治療性質(zhì)。在小盤(pán)狀前-βhdl顆粒(其在腎中降解)和大盤(pán)狀和/或者球狀hdl(其被肝識(shí)別，在所述肝中，它們的膽固醇被儲(chǔ)存、再循環(huán)、代謝(作為膽汁酸)或者清除(在膽汁中))之間的關(guān)鍵差異中的一種是顆粒的電荷。相比于荷負(fù)電的大盤(pán)狀和/或者球狀hdl顆粒而言，所述小盤(pán)狀前-βhdl顆粒具有較小的表面負(fù)電荷。認(rèn)為較大的負(fù)電荷是引起所述顆粒被肝識(shí)別且因此避免所述顆粒被腎分解代謝的因素中的一種。此外，已經(jīng)顯示腎不能容易地吸收荷電顆粒(參見(jiàn)hackeretal.,2009,pharmacology:principlesandpractice,183)。因此，部分由于存在荷電磷脂，認(rèn)為本申請(qǐng)所述的荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物和組合物相比于常規(guī)脂蛋白復(fù)合物而言在循環(huán)中停留更長(zhǎng)，或者電荷將以電荷依賴(lài)性方式影響所述脂蛋白的半衰期。預(yù)期的是，它們的較長(zhǎng)的循環(huán)(停留)時(shí)間以及所述復(fù)合物與存在的hdl的凝聚和融合的比率和/或者程度的降低(作為荷負(fù)電的結(jié)果)的結(jié)合將促進(jìn)膽固醇動(dòng)員(通過(guò)給予所述復(fù)合物更多的蓄積膽固醇的時(shí)間)和酯化(通過(guò)提供更多的lcat催化酯化反應(yīng)的時(shí)間)。所述電荷也可增加膽固醇捕獲和/或者除去的比率，由此促進(jìn)更大量的膽固醇的除去。因此，預(yù)期的是本申請(qǐng)所述的荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物和組合物將提供優(yōu)于常規(guī)脂蛋白療法的治療益處，這是因?yàn)樾枰o予的復(fù)合物和/或者組合物較少，且通常在較少地給予時(shí)，副作用降低。因此，本申請(qǐng)?zhí)峁┑姆椒ㄍǔ０ㄏ蚴茉囌呓o予治療有效量的本申請(qǐng)所述的脂蛋白復(fù)合物、脂蛋白復(fù)合物的群體或者藥物組合物以治療或者預(yù)防血脂異常障礙。所述脂蛋白復(fù)合物每次注射可以以下劑量來(lái)給予：范圍為約0.25mg/kgapoa-i等價(jià)物至約45mg/kg，例如約0.5mg/kg至約30mg/kg或者約1mg/kgapoa-i等價(jià)物至最多約15mg/kgapoa-i等價(jià)物。通過(guò)選擇使得甘油三酯、vldl-膽固醇和/或者vldl-甘油三酯水平增加最小化的劑量，所述劑量可進(jìn)一步針對(duì)待治療的個(gè)體來(lái)制定。在一些具體的實(shí)施方案中，所述劑量為約3mg/kg、約6mg/kg或者約12mg/kg。所述方法進(jìn)一步包括以如下間隔來(lái)給予所述脂蛋白復(fù)合物：間隔范圍為5至14天，或者6至12天，諸如一周或者兩周。所述方法可進(jìn)一步包括以如上所述的任意間隔且優(yōu)選為一周的間隔給予所述脂蛋白復(fù)合物4、5、6、7、8、9、10、11、12或者至多52次。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，給予所述脂蛋白復(fù)合物六次，在每次給藥之間的間隔為1周。對(duì)于慢性病癥，可進(jìn)行多于52次給藥。任選地，所述方法可由初始誘導(dǎo)期來(lái)開(kāi)始，其中更頻繁地給予所述脂蛋白復(fù)合物。復(fù)合物和/或者其藥物組合物可經(jīng)腸胃外給藥，例如靜脈內(nèi)給藥。靜脈內(nèi)給藥可作為歷時(shí)范圍為約1至約24小時(shí)或者約1至4小時(shí)、約0.5至2小時(shí)或者約1小時(shí)的時(shí)間的輸注來(lái)完成。如下實(shí)施例顯示在以30mg/kg和45mg/kg的劑量給藥后甘油三酯水平少量增加，這可解釋為由高程度的膽固醇動(dòng)員所導(dǎo)致的vldl和ldl的增加?？稍谥委熯^(guò)程中控制這些參數(shù)，這是因?yàn)樗鼈兛稍卺t(yī)院實(shí)驗(yàn)室中使用標(biāo)準(zhǔn)脂質(zhì)表盤(pán)來(lái)進(jìn)行常規(guī)測(cè)量?；谌缦聦?shí)施例，可實(shí)現(xiàn)劑量選擇以使得甘油三酯和vldl-膽固醇和vldl-甘油三酯水平的增加最小化，這取決于患者對(duì)藥物的反應(yīng)，其允許個(gè)體化類(lèi)型藥物。所述復(fù)合物和/或者組合物可單獨(dú)給藥(作為單一療法)，或者可選擇地，它們可與用于治療和/或者預(yù)防血脂異常和/或者與其相關(guān)的病癥、疾病和/或者障礙的其它治療劑一起給藥。可與本申請(qǐng)所述的荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物和組合物一起給藥的所述治療劑的非限制性實(shí)例包括膽汁酸結(jié)合樹(shù)脂、hmgcoa還原酶抑制劑(他汀類(lèi)藥物)、煙酸、樹(shù)脂、膽固醇吸收抑制劑、血小板聚集抑制劑、貝特類(lèi)藥物、抗凝血?jiǎng)etp抑制劑(例如安塞曲匹和達(dá)塞曲匹)和/或者pcskg抗體或者配體。5.附圖說(shuō)明圖1：人前原-載脂蛋白a-i的氨基酸序列(seqidno:1；genbank登記號(hào)aab59514.1)。粗體字體的氨基酸1-18相應(yīng)于apoa-i的信號(hào)序列，且下劃線標(biāo)記的氨基酸19-24相應(yīng)于前肽序列。信號(hào)序列和前肽序列均在細(xì)胞中斷開(kāi)以產(chǎn)生全長(zhǎng)成熟人apoa-i(氨基酸25-267)。圖2：在表達(dá)apoa-i的重組s-cho細(xì)胞的12天加料分批培養(yǎng)物中的apoa-i滴定。通過(guò)由第0代向第43代的連續(xù)傳代將細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)。在第4、8、14、19、25、21、36和43代通過(guò)反相hplc來(lái)監(jiān)測(cè)apoa-i產(chǎn)生。apoa-i在培養(yǎng)基中的量在1259mg/l至1400mg/l變化。圖3a-3b：圖3a顯示在表達(dá)apoa-i的重組s-cho細(xì)胞的200l13天培養(yǎng)物中的存活細(xì)胞密度。在第9天觀察到存活細(xì)胞密度的最大值33.20x105個(gè)細(xì)胞/ml，存活率為92.5％。圖3b顯示在13天培養(yǎng)中apoa-i在培養(yǎng)基中的濃度。在第12天觀察到apoa-i在培養(yǎng)基中的濃度的最大值，約為2mg/ml。圖4：通過(guò)本申請(qǐng)所述的方法純化的apoa-i的sds聚丙烯酰胺凝膠。左側(cè)泳道顯示分子量標(biāo)記。右側(cè)泳道顯示具有約28kd的分子量的純化的apoa-i。圖5a-5d：蛋白:脂質(zhì)重量比為1:2.5(式a；圖5a)、1:2.7(式b；圖5b)、1:3.1(式c；圖5c)的原apoa-i/sm復(fù)合物的hplc色譜圖以及蛋白:脂質(zhì)重量比為1:2.7(式d；圖5d)的原apoa-i/sm/dppc復(fù)合物的hplc色譜圖。圖6a-6d：分別在10、20、30和60分鐘的式d的脂蛋白復(fù)合物的hplc色譜圖。圖7a-7d：分別在10、20、30和50分鐘的式b的脂蛋白復(fù)合物的hplc色譜圖。圖8a-8d：分別在20、40、60和120分鐘的式f的脂蛋白復(fù)合物的hplc色譜圖。圖9：隨時(shí)間推移前-βhdl復(fù)合物的形成的圖表，其示例說(shuō)明了具有1:2.7的脂蛋白:總磷脂的wt:wt比的脂蛋白復(fù)合物的形成，包括原apoa-i和sm(式b)；原apoa-i、sm、dppc和dppg，其中sm:dppc:dppgwt:wt比為48:48:4(式f)；以及原apoa-i、sm、dppc和dppg，其中sm:dppc:dppgwt:wt比為73:23:4(式g)。圖10a-10d：式e、h、i和j各自的hplc色譜圖。圖11：制備脂蛋白復(fù)合物的示例性方法的示意圖。圖12：針對(duì)非商業(yè)規(guī)格熱循環(huán)運(yùn)行所使用的示例性熱循環(huán)裝置。圖13a-13e：具有增加數(shù)目的熱循環(huán)的sm/dppg/apoa-i蛋白復(fù)合物的凝膠滲透色譜。使所述成分在57℃和37℃之間進(jìn)行熱循環(huán)，在每個(gè)溫度進(jìn)行5分鐘，總計(jì)30分鐘(圖13a)、60分鐘(圖13b)、120分鐘(圖13c)、180分鐘(圖13d)或者210分鐘(圖13e)。圖14：sm/apoa-i復(fù)合物的凝膠滲透色譜。圖15：n-棕櫚酰-4-羥基二氫鞘氨醇-1-磷酸膽堿(植物sm或者植物鞘磷脂的一種形式)/dppg/apoa-i復(fù)合物的凝膠滲透色譜。圖16：合成棕櫚酰sm/dppg/apoa-i復(fù)合物的凝膠滲透色譜。圖17：植物鞘磷脂/dppg/apoa-i復(fù)合物的凝膠滲透色譜。圖18：sm/dppc/dppg/apoa-i肽復(fù)合物的凝膠滲透色譜。圖19a-19d：使用malverninstrumentszetasizer(malverninstrumentsinc.)通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射系統(tǒng)表征脂質(zhì)顆粒。在圖19a中，所述z平均值為84.49nm(“84nm顆?！?；在圖19b中，所述z平均值為76.76nm(“77nm顆?！?；在圖19c中，所述z平均值為66.21nm(“66nm顆粒”)；以及在圖19d中，所述z平均值為59.50nm(“60nm顆?！?。圖20a-20d：具有84nm(圖20a)、77nm(圖20b)、66nm(圖20c)和60nm(圖20d)的脂質(zhì)顆粒的復(fù)合物在五次熱循環(huán)后的凝膠滲透色譜圖。圖21a-21b：用450nm(圖21a)和40nm(圖21b)的脂質(zhì)顆粒開(kāi)始的復(fù)合物在六次熱循環(huán)后的凝膠滲透色譜圖。圖22：用65nm的脂質(zhì)顆粒開(kāi)始的復(fù)合物在六次熱循環(huán)后的凝膠滲透色譜，其中第一循環(huán)起始于37℃的“低溫度”。圖23：制備包含脂蛋白復(fù)合物的藥物組合物的示例性實(shí)施方案的示意圖，其包括將經(jīng)本公開(kāi)方法產(chǎn)生的脂蛋白復(fù)合物配制為商業(yè)上有效的藥物組合物。圖24：在輸注式b和式h的脂蛋白復(fù)合物后血漿vldl-總膽固醇水平的增加。以5mg/kg的劑量將式h(■)和式b(▼)的脂蛋白復(fù)合物輸注至禁食的兔子。減去三組的范圍為0.03至0.3g/l的基線值以確定血漿vldl-總膽固醇水平的增加。圖25：在輸注式b和式h的脂蛋白復(fù)合物后血漿甘油三酯水平的增加。以5mg/kg的劑量將式h(■)和式b(▲)的脂蛋白復(fù)合物輸注至禁食的兔子。減去三組的范圍為0.31至0.71g/l的基線值以確定血漿甘油三酯水平的增加。圖26a-26d：相比于稀釋劑(■)，在兔子中輸注5mg/kg或者20mg/kg以及20mg/kg的apoa-i/蛋sm復(fù)合物(●,▲)或者apoa-i/合成sm復(fù)合物(◆,▼)后血漿總膽固醇(圖26a)、甘油三酯(圖26b)、磷脂(圖26c)和apoa-i(圖26d)的增加。對(duì)于不同血漿脂質(zhì)所測(cè)量的基線值的范圍如下：對(duì)于血漿膽固醇，0.28至0.4g/l；對(duì)于血漿甘油三酯，0.23至0.29g/l；且對(duì)于血漿磷脂，0.45至0.61g/l。圖27a-27c：相比于稀釋劑(■)，在兔子中輸注5mg/kgapoa-i/蛋sm復(fù)合物(●)以及apoa-i/合成sm復(fù)合物(◆)后血漿hdl-總膽固醇(圖27a)、ldl-總膽固醇(圖27b)和vldl-總膽固醇(圖27c)的增加?；€值的范圍如下：對(duì)于血漿hdl–總膽固醇，0.20至0.31g/l；對(duì)于血漿ldl-總膽固醇，0.06至0.09g/l；以及對(duì)于血漿vldl-總膽固醇，0.007至0.011g/l。6.具體實(shí)施方式本公開(kāi)提供了脂蛋白復(fù)合物、其群體以及制備所述脂蛋白復(fù)合物的方法。所述復(fù)合物以及其群體和組合物(例如藥物組合物)用于治療和/或者預(yù)防血脂異常和/或者與血脂異常相關(guān)的疾病、障礙和/或者病癥。如在
發(fā)明內(nèi)容章節(jié)中所討論的，所述脂蛋白復(fù)合物包含優(yōu)選已確定重量或者摩爾比的兩個(gè)主要部分，即載脂蛋白部分和磷脂部分，且優(yōu)選包含特定量的中性磷脂以及任選的一種或者多種負(fù)電荷磷脂。6.1.蛋白部分本公開(kāi)提供了包含蛋白部分的脂蛋白復(fù)合物。本公開(kāi)進(jìn)一步提供了制備脂蛋白復(fù)合物的方法。所述脂蛋白復(fù)合物的蛋白成分對(duì)于本發(fā)明方法的成功而言不是關(guān)鍵的。事實(shí)上，任何提供治療和/或預(yù)防益處的脂質(zhì)-結(jié)合蛋白諸如載脂蛋白和/或其衍生物或類(lèi)似物均可包括在該復(fù)合物中。此外，由于在與脂質(zhì)締合時(shí)可活化lcat或者形成盤(pán)狀顆粒而“模擬”載脂蛋白(例如apoa-i)活性的任何α-螺旋肽或肽類(lèi)似物或任何其它類(lèi)型的分子可包含在脂蛋白復(fù)合物中，并且涵蓋在術(shù)語(yǔ)“脂質(zhì)-結(jié)合蛋白”內(nèi)。6.1.1.脂質(zhì)結(jié)合蛋白本公開(kāi)進(jìn)一步提供了純化重組產(chǎn)生的蛋白的方法，所述重組產(chǎn)生的蛋白例如用于制備脂蛋白復(fù)合物。所述重組產(chǎn)生的蛋白最適當(dāng)?shù)貫檩d脂蛋白。適當(dāng)?shù)牡鞍装ㄝd脂蛋白apoa-i、apoa-ii、apoa-iv、apoa-v和apoe；優(yōu)選為成熟形式。脂質(zhì)-結(jié)合蛋白也包括前述載脂蛋白的活性多晶型、同等型、變體和突變體以及截短形式，其中最常見(jiàn)的為載脂蛋白a-i米蘭(apoa-im)、載脂蛋白a-i巴黎(apoa-ip)和載脂蛋白a-i薩拉戈薩(apoa-iz)。含有半胱氨酸殘基的載脂蛋白突變體也是已知的，且也可使用(參見(jiàn)例如美國(guó)公開(kāi)2003/0181372)。載脂蛋白可以是單體或二聚體形式，而所述二聚體可以為同源二聚體或異源二聚體。例如，可使用apoa-i(duvergeretal.,1996,arterioscler.thromb.vasc.biol.16(12):1424-29)、apoa-im(franceschinietal.,1985,j.biol.chem.260:1632-35)、apoa-ip(daumetal.,1999,j.mol.med.77:614-22)、apoa-ii(shelnessetal.,1985,j.biol.chem.260(14):8637-46；shelnessetal.,1984,j.biol.chem.259(15):9929-35)、apoa-iv(duvergeretal.,1991,euro.j.biochem.201(2):373-83)、apoe(mcleanetal.,1983,j.biol.chem.258(14):8993-9000)、apoj和apoh的同源二聚體和異源二聚體(在可行的情況下)。所述載脂蛋白可以包括與促進(jìn)其分離的元件(比如his標(biāo)簽)或經(jīng)設(shè)計(jì)用于其它目的的其它元件相應(yīng)的殘基，只要當(dāng)該載脂蛋白包含在復(fù)合物中時(shí)能夠保留一些生物活性即可。如本領(lǐng)域所公知的，所述載脂蛋白可以由動(dòng)物來(lái)源進(jìn)行純化(特別是由人類(lèi)來(lái)源)或者進(jìn)行重組生產(chǎn)，參見(jiàn)例如chungetal.,1980,j.lipidres.21(3):284-91；cheungetal.,1987,j.lipidres.28(8):913-29。也參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,059,528、5,128,318、6,617,134；美國(guó)公開(kāi)20002/0156007、2004/0067873、2004/0077541和2004/0266660；以及pct公開(kāi)wo/2008/104890和wo/2007/023476。純化的其它方法也是可能的，例如如下在章節(jié)6.1.3和6.1.4中所述。適合作為載脂蛋白用于本申請(qǐng)所述的復(fù)合物及組合物中的、與載脂蛋白相應(yīng)的肽和肽類(lèi)似物以及模擬apoa-i、apoa-im、apoa-ii、apoa-iv和apo-e活性的激動(dòng)劑的非限制性實(shí)例在以下文獻(xiàn)中公開(kāi)：美國(guó)專(zhuān)利6,004,925、6,037,323和6,046,166(授予dasseuxetal.)、美國(guó)專(zhuān)利5,840,688(授予tso)、美國(guó)公開(kāi)2004/0266671、2004/0254120、2003/0171277和2003/0045460(fogelman的)、美國(guó)公開(kāi)2003/0087819(bielicki的)以及pct公開(kāi)wo/2010/093918(dasseuxetal.的)，將它們的內(nèi)容通過(guò)引用的方式并入本申請(qǐng)。這些肽和肽類(lèi)似物可包括l-氨基酸或者d-氨基酸或者l-和d-氨基酸的混合物。它們也可包括一種或者多種非肽或酰胺鍵，諸如一種或多種公知的肽/酰胺等排物?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何肽合成技術(shù)來(lái)合成或制備所述“肽和/或肽模擬物”載脂蛋白，所述肽合成技術(shù)包括，如美國(guó)專(zhuān)利6,004,925、6,037,323和6,046,166中描述的技術(shù)。所述復(fù)合物可包括單一類(lèi)型的脂質(zhì)-結(jié)合蛋白，或者兩種或者更多種不同的脂質(zhì)-結(jié)合蛋白的混合物，其可以源自相同或不同的物種。盡管不必需，但是所述脂蛋白復(fù)合物仍?xún)?yōu)選包含源自受治療動(dòng)物物種的脂質(zhì)-結(jié)合蛋白或者氨基酸序列與受治療動(dòng)物物種相對(duì)應(yīng)的脂質(zhì)-結(jié)合蛋白，以避免誘導(dǎo)對(duì)治療的免疫應(yīng)答。因此，對(duì)于人類(lèi)患者的治療，人源的脂質(zhì)-結(jié)合蛋白優(yōu)選用于本公開(kāi)的復(fù)合物中。肽模擬物載脂蛋白的使用也可降低或避免產(chǎn)生免疫應(yīng)答。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)-結(jié)合蛋白為具有與成熟人apoa-i蛋白至少95％序列同一性的氨基酸序列的蛋白，例如具有相應(yīng)于seqidno:1的位置25-267的氨基酸序列的蛋白。在某些實(shí)施方案中，所述成熟人apoa-i蛋白具有與seqidno:1的位置25-267至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述成熟人apoa-i蛋白具有在位置1(即相應(yīng)于seqidno:1的位置25的位置)上具有門(mén)冬氨酸的氨基酸序列。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述成熟人apoa-i蛋白具有相應(yīng)于seqidno:1的位置25-267的氨基酸序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述apoa-i蛋白在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞最優(yōu)選為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(“cho”)細(xì)胞中重組產(chǎn)生，如在下述小章節(jié)中所述。6.1.2.載脂蛋白的重組表達(dá)本公開(kāi)提供了用于產(chǎn)生脂質(zhì)結(jié)合蛋白諸如apoa-i的重組表達(dá)方法，以及相關(guān)的核酸、哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物。如本申請(qǐng)所述，可將所得的重組脂質(zhì)結(jié)合蛋白純化和/或者摻入脂蛋白復(fù)合物。一般而言，對(duì)于重組產(chǎn)生，將編碼脂質(zhì)-結(jié)合蛋白或者肽的多核苷酸序列插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)媒介物中，所述媒介物即為含有所插入的編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需元件的載體，或者在rna病毒載體的情況下，其為復(fù)制和翻譯所必需的元件。所述表達(dá)載體可衍生自病毒諸如腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或者慢病毒。然后將表達(dá)媒介物轉(zhuǎn)染至適當(dāng)靶標(biāo)細(xì)胞，該細(xì)胞表達(dá)蛋白或者肽。適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞包括但不限于細(xì)菌類(lèi)、哺乳動(dòng)物或者昆蟲(chóng)宿主細(xì)胞系統(tǒng)，包括桿狀病毒系統(tǒng)(參見(jiàn)例如luckowetal.,bio/technology,6,47(1988))以及確立的細(xì)胞系諸如293、cos-7、c127、3t3、cho、hela、bhk等。取決于所使用的表達(dá)系統(tǒng)，然后將所表達(dá)的肽通過(guò)本領(lǐng)域熟知的操作分離。重組蛋白和肽產(chǎn)生的方法為本領(lǐng)域熟知的(參見(jiàn)，例如sambrooketal.,1989,molecularcloningalaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,n.y.；以及ausubeletal.,1989,currentprotocolsinmolecularbiology,greenepublishingassociatesandwileyinterscience,n.y.，將其各自的內(nèi)容通過(guò)引用的方式并入本申請(qǐng))。當(dāng)apoa-i為脂質(zhì)結(jié)合蛋白時(shí)，apoa-i蛋白由編碼apoa-i的重組核苷酸序列表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，編碼apoa-i的核苷酸序列來(lái)自人類(lèi)。人apoa-i核苷酸序列的非限制性實(shí)例披露于美國(guó)專(zhuān)利5,876,968；5,643,757；和5,990,081以及wo96/37608；將其各自的內(nèi)容通過(guò)引用的方式并入本申請(qǐng)。在某些實(shí)施方案中，所述核苷酸序列編碼成熟apoa-i蛋白的氨基酸序列，其優(yōu)選可操作地連接至用于從宿主細(xì)胞分泌apoa-i的信號(hào)序列(例如seqidno:1的氨基酸1-18)和/或者前蛋白序列(例如seqidno:1的氨基酸19-25)。適用于定向分泌apoa-i的其它信號(hào)序列可對(duì)于apoa-i例如人白蛋白信號(hào)肽或者人il-2信號(hào)肽是異源性的，或者對(duì)于apoa-i是同源性的。優(yōu)選地，所述核苷酸序列編碼成熟人apoa-i多肽，例如具有與相應(yīng)于seqidno:1的位置25-267的氨基酸序列至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％相同的氨基酸序列的多肽，任選地其中所述氨基酸序列在位置25包含門(mén)冬氨酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核苷酸序列編碼具有seqidno:1的氨基酸序列的多肽。所述核苷酸序列也可編碼具有與人apoa-i蛋白的氨基酸序列至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％相同的氨基酸序列的多肽，所述人apoa-i蛋白的氨基酸序列闡述于genbank登記號(hào)np_000030、aab59514、p02647、caa30377、aaa51746或者aah05380.1中的一種，其任選地在相應(yīng)于成熟人apoa-i蛋白的第一氨基酸的位置包含門(mén)冬氨酸。所述apoa-i編碼多核苷酸可為針對(duì)在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)所優(yōu)化的密碼子。優(yōu)選的宿主細(xì)胞為哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，包括但不限于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(例如cho-k1；atccno.ccl61；cho-s(gibcolifetechnologiesinc.,rockville,md,目錄#11619012))、vero細(xì)胞、bhk(atccno.crl1632)、bhk570(atccno.crl10314)、hela細(xì)胞、cos-1(atccno.crl1650)、cos-7(atccno.crl1651)、mdck細(xì)胞、293細(xì)胞(atccno.crl1573；grahametal.,j.gen.virol.36:59-72,1977)、3t3細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞(特別是鼠類(lèi))、pc12細(xì)胞和w138細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞諸如cho-s細(xì)胞(invitrogentm,carlsbadca)適于在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。另外適當(dāng)?shù)募?xì)胞系為本領(lǐng)域已知的且獲自公共儲(chǔ)藏室諸如americantypeculturecollection,manassas,va。對(duì)于apoa-i的重組表達(dá)，編碼apoa-i的多核苷酸可操作地連接至一個(gè)或者多個(gè)控制序列例如啟動(dòng)子或者終止子，其調(diào)節(jié)apoa-i在感興趣的宿主細(xì)胞中的表達(dá)。所述一個(gè)或者多個(gè)控制序列可對(duì)于apoa-i-編碼序列而言是天然的或者外源的，且也對(duì)于其中表達(dá)apoa-i的宿主細(xì)胞而言是天然的或者外源的?？刂菩蛄邪ǖ幌抻趩?dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、先導(dǎo)序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信號(hào)肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。在一些實(shí)施方案中，所述控制序列包括啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。所述控制序列也可包括用于引入特定限制位點(diǎn)的目的的一種或者多種銜接物，這促進(jìn)所述控制序列與編碼apoa-i的核苷酸序列的編碼區(qū)的連接。驅(qū)動(dòng)apoa-i的重組表達(dá)的啟動(dòng)子可為構(gòu)成性啟動(dòng)子、調(diào)節(jié)性啟動(dòng)子或者誘導(dǎo)性啟動(dòng)子。適當(dāng)?shù)膯?dòng)子序列可獲自編碼細(xì)胞外或者細(xì)胞內(nèi)多肽的基因，其對(duì)于宿主細(xì)胞而言是內(nèi)源性或者異源性的。用于具有可變長(zhǎng)度的啟動(dòng)子的分離、鑒別和處理的方法可在本領(lǐng)域中獲得或者可從本領(lǐng)域容易地修改。參見(jiàn)例如nevoigtetal.(2006)appl.environ.microbiol.72:5266-5273，將其內(nèi)容通過(guò)引用的方式并入本申請(qǐng)。一種或者多種控制序列可衍生自病毒來(lái)源。例如，在某些方面，啟動(dòng)子衍生自多瘤或者腺病毒主要后期啟動(dòng)子。在其它方面，所述啟動(dòng)子衍生自猿猴病毒40(sv40)，其可作為還含有sv40病毒復(fù)制起始區(qū)的片段來(lái)獲得(fiersetal.,1978,nature,273:113-120)或者來(lái)自巨細(xì)胞病毒例如猿猴巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,956,288)。其它適當(dāng)?shù)膯?dòng)子包括來(lái)自金屬硫蛋白基因的那些(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,579,821和4,601,978)。本申請(qǐng)還提供了重組apoa-i表達(dá)載體。重組表達(dá)載體可為可通過(guò)重組dna技術(shù)來(lái)處理以便于異源性apoa-i在重組宿主細(xì)胞中的表達(dá)的任何載體，例如質(zhì)?；蛘卟《?。可將所述表達(dá)載體整合至重組宿主細(xì)胞的染色體中且其包含一種或者多種可操作地連接至一種或者多種用于產(chǎn)生apoa-i的控制序列的異源性基因。在其它實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體為染色體外復(fù)制的dna分子，例如線性或者閉合的環(huán)狀質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)其具有低拷貝數(shù)(例如約1至約10個(gè)拷貝/基因組當(dāng)量)或者高拷貝數(shù)(例如多于約10個(gè)拷貝/基因組當(dāng)量)。在多個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括可選標(biāo)記，諸如使得包含所述載體的重組宿主有機(jī)體具有抗菌素抗性(例如氨芐西林、卡那霉素、氯霉素或者四環(huán)素抗藥性)的基因。在具體的方面，所述dna構(gòu)成物、載體和多核苷酸適于apoa-i在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。用于apoa-i在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)的載體可包含與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容的復(fù)制起始區(qū)、啟動(dòng)子以及任何必需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、rna剪接位點(diǎn)、多腺苷酸化位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子序列。在某些方面，所述復(fù)制起始區(qū)對(duì)于宿主細(xì)胞是異源性的，例如其為病毒來(lái)源(例如sv40、polyoma、adeno、vsv、bpv)。在其它方面，復(fù)制起始區(qū)通過(guò)宿主細(xì)胞染色體復(fù)制機(jī)制來(lái)提供。用于將外源dna引入至哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中的方法、試劑和工具為本領(lǐng)域已知的且包括但不限于磷酸鈣-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(wigleretal.,1978,cell14:725；corsaroetal.,1981,somaticcellgenetics7:603；grahametal.,1973,virology52:456)、電穿孔(neumannetal.,1982,emboj.1:841-5)、deae-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(ausubeletal.(eds.),shortprotocolsinmolecularbiology,3rdedition(johnwiley&sons1995))和脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(hawley-nelsonetal.,1993,focus15:73；ciccaroneetal.,1993,focus15:80)。對(duì)于高產(chǎn)率的生產(chǎn)，apoa-i的穩(wěn)定表達(dá)是優(yōu)選的。例如，在將外源dna引入至宿主細(xì)胞之后，所述宿主細(xì)胞可在富集培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1-2天，然后將其更換至選擇性培養(yǎng)基中。并非使用含有病毒復(fù)制起始區(qū)的表達(dá)載體，宿主細(xì)胞可使用具有包含apoa-i-編碼序列的核苷酸序列的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其通過(guò)適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制元件和可選標(biāo)記來(lái)控制。所述載體中的可選標(biāo)記賦予對(duì)選擇的抗性且允許細(xì)胞穩(wěn)定地將載體整合至它們的染色體中且生長(zhǎng)以形成集落(foci)，所述集落繼而可被克隆且擴(kuò)大至細(xì)胞系中?？墒褂帽姸噙x擇系統(tǒng)，包括但不限于可分別在tk-、hgprt-或者aprt-細(xì)胞中采用的單純皰疹病毒胸苷激酶(wigleretal.,1977,cell11:223)、次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(szybalska&szybalski,1962,proc.natl.acad.sci.usa48:2026)和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(lowyetal.,1980,cell22:817)基因。同樣地，抗代謝藥物抗性可用作選擇基礎(chǔ)，其通過(guò)使用例如，dhfr，其賦予對(duì)甲氨蝶呤的抗性(wigleretal.,1980,natl.acad.sci.usa77:3567；o’hareetal.,1981,proc.natl.acad.sci.usa78:1527)；gpt，其賦予對(duì)麥考酚酸的抗性(mulligan&berg,1981,proc.natl.acad.sci.usa78:2072)；neo，其賦予對(duì)氨基糖苷g-418的抗性(colberre-garapinetal.,1981,j.mol.biol.150:1)；和/或者h(yuǎn)yg，其賦予對(duì)潮霉素的抗性(santerreetal.,1984,gene30:147)。穩(wěn)定的高產(chǎn)率的表達(dá)也可通過(guò)使用整合至宿主細(xì)胞基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體來(lái)實(shí)現(xiàn)(參見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)2008/0286779和2004/0235173)?？蛇x擇地，apoa-i的穩(wěn)定的高產(chǎn)率的表達(dá)可通過(guò)基因激活方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，其引起在所選的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組dna中的內(nèi)源性apoa-i基因的激活表達(dá)且將其擴(kuò)增，例如在wo1994/012650中所述。增加apoa-i基因(含有apoa-i編碼序列和一種或者多種控制元件)的拷貝數(shù)可促進(jìn)apoa-i的高產(chǎn)率表達(dá)。優(yōu)選地，其中表達(dá)apoa-i的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞具有至少2、至少3、至少4或者至少5的apoa-i基因拷貝指數(shù)。在一些具體的實(shí)施方案中，其中表達(dá)apoa-i的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞具有至少6、至少7、至少8、至少9或者至少10的apoa-i基因拷貝指數(shù)。在某些實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞適于產(chǎn)生至少0.5g/l、至少1g/l、至少1.5g/l、至少2g/l、至少2.5g/l、至少3g/l、至少3.5g/l且任選地至多4g/l、至多4.5g/l、至多5g/l、至多5.5g/l或者至多6g/l的量的apoa-i。所述哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞優(yōu)選能夠在培養(yǎng)物中產(chǎn)生至少約0.5、1、2或者3g/l的apoa-i和/或者在培養(yǎng)物中產(chǎn)生至多約20g/l的apoa-i，例如在培養(yǎng)物中產(chǎn)生至多4、5、6、7、8、9、10、12或者15g/l的apoa-i。在某些實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞適于在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。在這些實(shí)施方案中，所述apoa-i由所述細(xì)胞分泌。在其它實(shí)施方案中，所述apoa-i不由所述細(xì)胞分泌。本申請(qǐng)?zhí)峁┑牟溉閯?dòng)物宿主細(xì)胞可用于產(chǎn)生apoa-i。一般而言，所述方法包括在表達(dá)apoa-i的條件下培養(yǎng)本申請(qǐng)所述的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。此外，所述方法可包括由所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液回收且任選純化成熟apoa-i。所述培養(yǎng)條件(包括培養(yǎng)基、溫度、ph)可適合待培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞以及所選的培養(yǎng)方式(搖瓶、生物反應(yīng)器、滾瓶等)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以在大規(guī)模分批培養(yǎng)物、連續(xù)培養(yǎng)物或者半連續(xù)培養(yǎng)物中生長(zhǎng)。本申請(qǐng)還提供了哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物，其包含多個(gè)本申請(qǐng)所述的apoa-i-產(chǎn)生的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物包括至少0.5g/l、至少1g/l、至少1.5g/l、至少2g/l、至少2.5g/l、至少3g/l、至少3.5g/l且任選地至多4g/l、至多4.5g/l、至多5g/l、至多5.5g/l或者至多6g/l的apoa-i。所述培養(yǎng)物可為任何規(guī)模，其范圍為約150ml至約500ml、1l、10l、15l、50l、100l、200l、250l、300l、350l、400l、500l、750l、1000l、1500l、2000l、2500l、3000l、5000l、7500l、10000l、15000l、20000l、25000l、50000l或者更大。在一些情況下，所述培養(yǎng)物為大規(guī)模培養(yǎng)物，諸如15l、20l、25l、30l、50l、100l、200l、300l、500l、1000l、5000l、10000l、15000l、20000l、25000l、至多50000l或者更大。6.1.3.載脂蛋白的純化本公開(kāi)涉及獲得高度純化的載脂蛋白的方法，其用于制備本申請(qǐng)所述的脂蛋白復(fù)合物及其組合物。所述方法可應(yīng)用于任何載脂蛋白，包括但不限于apoa-i、-ii、-iii或者–iv；apob48和apob100；apoc-i、-ii、-iii或者–iv；apod；apoe、apoh；apoj。更具體地，本公開(kāi)涉及獲得高度純化的apoa-i的方法。在一些實(shí)施方案中，所述apoa-i為具有選自(但不限于)下述序列的人蛋白：在genbank登記號(hào)np_000030、aab59514、p02647、caa30377、aaa51746和aah05380.1中闡述的序列。在某些實(shí)施方案中，所述apoa-i為如上在段落6.1.2中所述的人蛋白。在其它實(shí)施方案中，本公開(kāi)的方法可用于純化由非人動(dòng)物(參見(jiàn)，例如美國(guó)公開(kāi)2004/0077541)例如，牛、馬、羊、猴、狒狒、山羊、兔、狗、刺猬、獾、小鼠、大鼠、貓、豚鼠、侖鼠、鴨、雞、鮭魚(yú)和鰻魚(yú)獲得的apoa-i(brouilletteetal.,2001,biochim.biophys.acta.1531:4-46；yuetal.,1991,cellstruct.funct.16(4):347-55；chenandalbers,1983,biochimbiophysacta.753(1):40-6；luoetal.,1989,jlipidres.30(11):1735-46；blatonetal.,1977,biochemistry16:2157-63；sparrowetal.,1995,jlipidres.36(3):485-95；beaubatieetal.,1986,j.lipidres.27:140-49；januzzietal.,1992,genomics14(4):1081-8；goulinetandchapman,1993,j.lipidres.34(6):943-59；colletetal.,1997,jlipidres.38(4):634-44；以及frankandmarcel,2000,j.lipidres.41(6):853-72)。可通過(guò)本申請(qǐng)披露的方法純化的apoa-i蛋白的實(shí)例包括但不限于前原載脂蛋白形式的apoa-i、原形式和成熟形式的apoa-i，以及活化的多晶型、同等型、變體和突變體以及截短形式，例如apoa-im、apoa-iz和apoa-ip。apoa-im為apoa-i的r173c分子變體(參見(jiàn)，例如parolinietal.,2003,jbiolchem.278(7):4740-6；calabresietal.,1999,biochemistry38:16307-14；以及calabresietal.,1997,biochemistry36:12428-33)。apoa-ip為apoa-i的r151c分子變體(參見(jiàn)，例如daumetal.,1999,jmolmed.77(8):614-22)。apoa-iz為apoa-i的l144r分子變體(參見(jiàn)recaldeetal.,2001,atherosclerosis154(3):613-623；fiddymentetal.,2011,proteinexpr.purif.80(1):110-116)。含有半胱氨酸殘基的載脂蛋白a-i突變體也是已知的，并且也可通過(guò)本申請(qǐng)所述的方法純化(參見(jiàn)，例如美國(guó)公開(kāi)2003/0181372)。用于本申請(qǐng)所述的方法的apoa-i可為單體、同源二聚體或異源二聚體。例如，可制備的原-apoa-i和成熟apoa-i的同源二聚體和異源二聚體包括apoa-i(duvergeretal.,1996,arteriosclerthrombvascbiol.16(12):1424-29)、apoa-im(franceschinietal.,1985,jbiolchem.260:1632-35)和apoa-ip(daumetal.,1999,jmolmed.77:614-22)等。本申請(qǐng)所述的純化方法可以適于本領(lǐng)域從業(yè)者的任何規(guī)模來(lái)進(jìn)行。在某些方面，可通過(guò)本申請(qǐng)所述的方法純化的apoa-i蛋白具有與seqidno:1的氨基酸25-267至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或者至少100％相同的氨基酸序列。載脂蛋白可來(lái)自任何來(lái)源，包括血液血漿或者原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞的重組表達(dá)。在一些具體的實(shí)施方案中，所述載脂蛋白為apoa-i，例如人apoa-i。在某些方面，所述apoa-i在原核或者真核宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或者周質(zhì)中表達(dá)。在這些實(shí)施方案中，在純化apoa-i前，將所述細(xì)胞破裂以將apoa-i釋放至上清液。細(xì)胞破裂方法為本領(lǐng)域熟知的。使細(xì)胞破裂的示例性方法包括但不限于酶方法、聲裂法、洗滌劑方法和機(jī)械法。在某些優(yōu)選的方面，apoa-i在哺乳動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)選cho細(xì)胞中表達(dá)，且分泌至生長(zhǎng)培養(yǎng)基。在這些實(shí)施方案中，apoa-i由澄清的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基純化。應(yīng)該理解的是，盡管所述純化方法在本申請(qǐng)中與人apoa-i結(jié)合來(lái)更詳細(xì)地描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使得所述純化條件適于其它載脂蛋白以及非人apoa-i；apoa-i或者其它載脂蛋白的多晶型、同等型、變體和突變體以及截短形式，這取決于可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易確定的特定蛋白特征(例如分子量、等電點(diǎn)、斯托克斯半徑、疏水性、多聚體狀態(tài)等)。當(dāng)apoa-i由血漿制備時(shí)，其可通過(guò)任何已知的方法包括但不限于冷分級(jí)分離方法由血漿分離，諸如描述于cohnetal.,1946,j.am.chem.soc.68:459-475(“cohn方法”)或者oncleyetal.,1949,j.am.chem.soc.71:541-550(“cohn-oncley方法”)。用于由血漿分離載脂蛋白的其它方法包括cohn和cohn-oncley方法的變化形式，諸如kistler-nitschmann方法(參見(jiàn)nitschmannetal.,1954,helv.chim.acta37:866-873；kistleretal.,1962,voxsang.7:414-424)。在這些實(shí)施方案中，載脂蛋白通過(guò)由血漿用冷的醇例如乙醇進(jìn)行沉淀來(lái)獲得。用于血漿的冷分級(jí)分離的其它醇包括c1-c6直鏈或者支鏈醇，諸如甲醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、仲丁醇、異丁醇和叔丁醇。在多個(gè)實(shí)施方案中，除了醇之外的降低蛋白溶解性的試劑可用于由血漿來(lái)沉淀載脂蛋白。所述試劑包括但不限于乙醚(ether)、硫酸銨、7-乙氧基吖啶-3,9-二胺(雷佛奴爾)和聚乙二醇。沉淀的蛋白可通過(guò)本領(lǐng)域任何已知的方法由上清液分離，所述方法包括但不限于沉積、離心和濾過(guò)。apoa-i可由含有蛋白的血漿的任何部分回收。在一些實(shí)施方案中，apoa-i由人血漿的血清部分回收，其中纖維蛋白原的量通過(guò)用約8％(w/w)的乙醇沉淀而降低。在其它實(shí)施方案中，載脂蛋白由人血漿的血清部分回收，其中其它血清蛋白(例如β-球蛋白和γ-球蛋白)的濃度已經(jīng)通過(guò)用約25％(w/w)的乙醇沉淀而降低。在其它實(shí)施方案中，載脂蛋白作為由人血清的沉淀物來(lái)回收，其通過(guò)將乙醇濃度增加至約38％至約42％(w/w)而獲得。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，載脂蛋白作為由人血清的沉淀物來(lái)回收，其通過(guò)將乙醇濃度增加至約40％(w/w)而獲得(cohn部分iv)。沉淀的apoa-i可通過(guò)本領(lǐng)域任何已知的方法包括但不限于離心和濾過(guò)由血清部分回收。在一些實(shí)施方案中，血漿部分(載脂蛋白由該部分回收)的溫度足夠低以防止蛋白變性。在這些實(shí)施方案中，apoa-i部分的溫度的范圍為約-10℃至約0℃，諸如約-8℃至約-2℃。在多個(gè)實(shí)施方案中，血漿部分(apoa-i由該部分回收)的ph的范圍防止蛋白變性。在這些實(shí)施方案中，含有apoa-i的部分的ph范圍為約5至約7，諸如約5.5至約6.5。6.1.4.改善的脂蛋白純化方法申請(qǐng)人已經(jīng)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生成熟、完整且基本上不含污染物的脂蛋白的改善的純化方法，其如下描述且在實(shí)施例中示例說(shuō)明。本申請(qǐng)所述的純化方法可以適于本領(lǐng)域從業(yè)者的任何規(guī)模來(lái)進(jìn)行。所述方法可應(yīng)用于任何載脂蛋白，包括但不限于apoa-i、-ii、-iii或者–iv；apob48和apob100；apoc-i、-ii、-iii或者–iv；apod；apoe、apoh；apoj。更具體地，本公開(kāi)涉及獲得高度純化的apoa-i的方法。在一些實(shí)施方案中，所述apoa-i為具有選自(但不限于)下述序列的人蛋白：在genbank登記號(hào)np_000030、aab59514、p02647、caa30377、aaa51746和aah05380.1中闡述的序列。在某些實(shí)施方案中，所述apoa-i為如上在段落6.1.2中所述的人蛋白。在其它實(shí)施方案中，本公開(kāi)的方法可用于純化由非人動(dòng)物(參見(jiàn)，例如美國(guó)公開(kāi)2004/0077541)例如，牛、馬、羊、猴、狒狒、山羊、兔、狗、刺猬、獾、小鼠、大鼠、貓、豚鼠、侖鼠、鴨、雞、鮭魚(yú)和鰻魚(yú)獲得的apoa-i(brouilletteetal.,2001,biochimbiophysacta.1531:4-46；yuetal.,1991,cellstructfunct.16(4):347-55；chenandalbers,1983,biochimbiophysacta.753(1):40-6；luoetal.,1989,jlipidres.30(11):1735-46；blatonetal.,1977,biochemistry16:2157-63；sparrowetal.,1995,jlipidres.36(3):485-95；beaubatieetal.,1986,jlipidres.27:140-49；januzzietal.,1992,genomics14(4):1081-8；goulinetandchapman,1993,jlipidres.34(6):943-59；colletetal.,1997,jlipidres.38(4):634-44；以及frankandmarcel,2000,jlipidres.41(6):853-72)。可通過(guò)本申請(qǐng)披露的方法純化的apoa-i蛋白的實(shí)例包括但不限于前原載脂蛋白形式的apoa-i、原形式和成熟形式的apoa-i，以及活化的多晶型、同等型、變體和突變體以及截短形式，例如apoa-im、apoa-iz和apoa-ip。含有半胱氨酸殘基的載脂蛋白a-i突變體也是已知的，并且也可通過(guò)本申請(qǐng)所述的方法純化(參見(jiàn)，例如美國(guó)公開(kāi)2003/0181372)。用于本申請(qǐng)所述的方法的apoa-i可為單體、同源二聚體或異源二聚體。例如，可制備的原-apoa-i和成熟apoa-i的同源二聚體和異源二聚體包括apoa-i(duvergeretal.,1996,arteriosclerthrombvascbiol.16(12):1424-29)、apoa-im(franceschinietal.,1985,jbiolchem.260:1632-35)和apoa-ip(daumetal.,1999,jmolmed.77:614-22)等。在某些方面，可通過(guò)本申請(qǐng)所述的方法純化的apoa-i蛋白具有與seqidno:1的氨基酸25-267至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或者至少100％相同的氨基酸序列。載脂蛋白可來(lái)自任何來(lái)源，包括血液血漿或者原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞的重組表達(dá)。在一些具體的實(shí)施方案中，所述載脂蛋白為apoa-i，例如人apoa-i。在某些方面，所述apoa-i在原核或者真核宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或者周質(zhì)中表達(dá)。在這些實(shí)施方案中，在純化apoa-i前，將所述細(xì)胞破裂以將apoa-i釋放至上清液。細(xì)胞破裂方法為本領(lǐng)域熟知的。使細(xì)胞破裂的示例性方法包括但不限于酶方法、聲裂法、洗滌劑方法和機(jī)械法。在某些優(yōu)選的方面，apoa-i在哺乳動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)選cho細(xì)胞中表達(dá)，且分泌至生長(zhǎng)培養(yǎng)基。在這些實(shí)施方案中，apoa-i由澄清的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基純化。應(yīng)該理解的是，盡管所述純化方法在本申請(qǐng)中與人apoa-i結(jié)合來(lái)更詳細(xì)地描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使得所述純化條件適于其它載脂蛋白以及非人apoa-i；apoa-i或者其它載脂蛋白的多晶型、同等型、變體和突變體以及截短形式，這取決于可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易確定的特定蛋白特征(例如分子量、等電點(diǎn)、斯托克斯半徑、疏水性、多聚體狀態(tài)等)。一般而言，所述純化方法包括以下步驟：(a)在使得apoa-i不與基質(zhì)結(jié)合的條件下使得含有apoa-i的溶液與陰離子交換基質(zhì)接觸；(b)經(jīng)具有足以除去病毒或者病毒顆粒的孔徑的膜將步驟(a)獲得的含有apoa-i的溶液濾過(guò)；(c)在使得apoa-i與基質(zhì)結(jié)合的條件下使得步驟(b)獲得的濾液經(jīng)過(guò)第一反相色譜柱；(d)使用增加濃度的有機(jī)溶劑梯度由第一反相色譜基質(zhì)洗脫出第一含有apoa-i的反相洗脫液；(e)在使得apoa-i與基質(zhì)結(jié)合的條件下使得步驟(d)獲得的第一apoa-i的反相洗脫液經(jīng)過(guò)第二反相色譜柱；以及(f)使用增加濃度的有機(jī)溶劑梯度由第二反相色譜基質(zhì)洗脫出第二含有apoa-i的反相洗脫液。所述步驟所進(jìn)行的順序不是關(guān)鍵的。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，所述步驟的順序的眾多排列是可能的，其中一些如下描述。在某些方面，調(diào)整所述含有apoa-i的溶液，之后使其與步驟(a)的陰離子交換基質(zhì)接觸。進(jìn)行調(diào)整以調(diào)節(jié)所述蛋白溶液的ph，以使得其處于其中apoa-i不與步驟(a)的陰離子交換基質(zhì)結(jié)合的范圍內(nèi)(即所述蛋白不具有凈負(fù)電荷且步驟(a)以陰性方式進(jìn)行)。在這些方面，含有apoa-i的溶液的ph為約5至約7，優(yōu)選約5.0至約5.6。在具體的方面，所述ph為約5.1至約5.5。在其它方面，所述ph為約5.3?？赏ㄟ^(guò)加入適當(dāng)?shù)乃?例如鹽酸)或者堿(例如氫氧化鈉)來(lái)進(jìn)行ph的調(diào)節(jié)，直到獲得預(yù)期范圍內(nèi)的ph。在一些實(shí)施方案中，將含有apoa-i的溶液濾過(guò)以移去細(xì)胞和細(xì)胞碎片，之后進(jìn)行調(diào)整步驟。在其它實(shí)施方案中，當(dāng)不存在調(diào)整步驟時(shí)，在進(jìn)行步驟(a)之前，任選地將含有apoa-i的溶液濾過(guò)，以移去細(xì)胞和細(xì)胞碎片。在一些實(shí)施方案中，使得含有apoa-i的溶液與陰離子交換基質(zhì)接觸的步驟(a)通過(guò)使蛋白溶液經(jīng)過(guò)色譜柱來(lái)進(jìn)行。在這些實(shí)施方案中，所述柱裝填的底料高度為約10cm至約50cm，優(yōu)選約10cm至約30cm，且更優(yōu)選約20cm。在某些方面，所述柱裝載有包含約10g至約50g諸如約10g至約30g、諸如約25g至約35g的apoa-i/l的蛋白溶液。在一些具體的實(shí)施方案中，所述柱裝載有包含至多約32g的apoa-i/l的蛋白溶液。在其它實(shí)施方案中，步驟(a)以分批方式進(jìn)行，即，將陰離子交換基質(zhì)加入至燒瓶中的蛋白溶液中，混合充足的時(shí)間以將污染物與基質(zhì)結(jié)合，然后例如通過(guò)濾過(guò)或者離心將基質(zhì)物質(zhì)由蛋白溶液分離。在某些實(shí)施方案中，將所述蛋白溶液濾過(guò)以除去溶液中的顆粒，之后使其與陰離子交換基質(zhì)接觸。本申請(qǐng)所述的方法的步驟(a)中所用的陰離子交換基質(zhì)可為本領(lǐng)域已知的任何陰離子交換基質(zhì)。適當(dāng)?shù)年庪x子交換基質(zhì)包括但不限于q-sepharoseff、q-spherosil、deae-sepharoseff、q-cellulose、deae-cellulose和q-spherodex。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述陰離子交換基質(zhì)為q-sepharoseff(gehealthcare)。在某些方面，在使得步驟(a)的蛋白溶液與陰離子交換基質(zhì)接觸之前，將所述基質(zhì)在具有如上討論的使得apoa-i不與所述基質(zhì)結(jié)合的優(yōu)選的范圍內(nèi)ph的緩沖劑中平衡。用于在步驟(a)之前平衡陰離子交換基質(zhì)且用于進(jìn)行步驟(a)的緩沖劑對(duì)于技術(shù)人員是已知的。在一些具體的實(shí)施方案中，所述緩沖劑為tampa(20mm磷酸鈉,ph5.3)。在多個(gè)實(shí)施方案中，步驟(a)用于針對(duì)除了apoa-i之外的蛋白(例如宿主細(xì)胞蛋白)、宿主細(xì)胞dna和內(nèi)毒素純化apoa-i，所述除了apoa-i之外的蛋白(例如宿主細(xì)胞蛋白)、宿主細(xì)胞dna和內(nèi)毒素結(jié)合至陰離子交換基質(zhì)且由此與apoa-i分離，apoa-i在如上所述的ph和鹽條件下不與基質(zhì)結(jié)合。在某些方面，由陰離子交換步驟回收在起始溶液中的至少75％、至少80％、至少85％或者至少90％或者更大的量的apoa-i。在多個(gè)實(shí)施方案中，所述純化方法包括步驟(b)，其中使用濾器將步驟(a)的apoa-i溶液濾過(guò)，所述濾器具有足以捕獲病毒和病毒顆粒的孔徑。任選地，經(jīng)膜濾過(guò)以除去病毒或者病毒顆粒的步驟(b)在如上步驟(f)后進(jìn)行，而不是在步驟(a)后進(jìn)行。在某些方面，在病毒濾過(guò)步驟(b)之前通過(guò)加入氫氧化鈉或者其它適當(dāng)?shù)膲A來(lái)調(diào)節(jié)來(lái)自陰離子交換基質(zhì)的洗脫液的ph。將步驟(a)的含有apoa-i的溶液調(diào)節(jié)為約7.8至約8.2的ph。在具體的方面，將含有apoa-i的溶液調(diào)節(jié)為約8.0的ph。步驟(b)中使用的濾器可為具有用于捕獲病毒的適當(dāng)孔徑例如約15nm至約75nm的孔徑的任何濾器。在一些具體的實(shí)施方案中，所述濾器的孔徑為約20nm(例如planova20n,asahikaseimedical)。技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到蛋白溶液經(jīng)過(guò)病毒濾器的流速由所述溶液的性質(zhì)(例如其粘性、顆粒的濃度等)來(lái)確定。對(duì)于病毒濾過(guò)的典型流速為約12.5l/h/m2，然而，所述流速可被調(diào)節(jié)更高或者更低以保持1巴或者更低的濾器壓力。步驟(b)的濾液含有apoa-i。在某些方面，apoa-i由病毒濾過(guò)步驟的回收率為步驟(a)的陰離子交換洗脫液中的apoa-i量的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或者至少98％或者更大。在一些具體的實(shí)施方案中，本申請(qǐng)所述的純化方法包括步驟(b)之后的步驟(c)，其中在允許載脂蛋白a-i與基質(zhì)結(jié)合的緩沖劑和鹽條件下使得步驟(b)的濾液經(jīng)過(guò)第一反相色譜柱。在這些實(shí)施方案中，使用增加濃度的有機(jī)溶劑的梯度將所述apoa-i針對(duì)宿主細(xì)胞dna、宿主細(xì)胞蛋白、內(nèi)毒素和截短形式進(jìn)行純化。反相色譜法可使用本領(lǐng)域已知的多種基質(zhì)進(jìn)行，所述基質(zhì)包括但不限于硅膠、聚苯乙烯或者交聯(lián)瓊脂糖基培養(yǎng)基(在所述培養(yǎng)基上接枝c4-c18疏水性配體)。用于本申請(qǐng)所述的方法中的可商購(gòu)得到的疏水性基質(zhì)包括但不限于butylsepharose-ff、octylsepharose-ff、dianonhp20ss、c18hypersil和source30rpc。在一些具體的實(shí)施方案中，步驟(c)中使用的基質(zhì)為source30rpc(gehealthcare)。在某些方面，所述反相色譜柱具有約10cm至約50cm諸如約10cm至約30cm的底料高度。在具體的方面，所述反相色譜柱具有約25cm的底料高度。在一些實(shí)施方案中，將病毒濾過(guò)步驟(b)的apoa-i濾液以每升約1至約20gapoa-i諸如約1.5g至約5gapoa-i且更優(yōu)選約2.5g至約3.5gapoa-i的濃度載入至反相柱上。在具體的方面，將步驟(b)的apoa-i濾液以約3.4gapoa-i/l的濃度載入至反相柱上。可用于在載入apoa-i之前平衡所述反相柱且保證所述蛋白在載入后將結(jié)合至所述柱上的緩沖條件將對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是可容易確定的。優(yōu)選地，所述柱平衡緩沖劑為強(qiáng)的緩沖劑，其可將柱ph降低至約9.5。在某些實(shí)施方案中，所述平衡緩沖劑為tampd(20mm碳酸銨)。優(yōu)選地，在平衡后，將步驟(b)的含有apoa-i的濾液(ph為約8.0)以約0.5cm至約5.0cm/分鐘諸如約2.0cm至約4.0cm/分鐘的流速載入至柱上。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，將含有apoa-i濾液以約2.8cm/分鐘的流速載入至柱上。在步驟(c)中將apoa-i結(jié)合至反相基質(zhì)后，通過(guò)暴露于增加濃度的有機(jī)溶劑在緩沖劑中的梯度諸如約35％至約50％乙腈在tampd緩沖劑中的梯度將蛋白在步驟(d)中洗脫出。在某些方面，歷時(shí)約60至約90分鐘諸如約70分鐘或者更優(yōu)選約80分鐘的時(shí)間內(nèi)約35％至約50％乙腈的線性梯度可用于將apoa-i由所述柱洗脫出。在某些方面，在線性梯度之后進(jìn)行使用50％乙腈的約10分鐘的等度洗脫。用于將apoa-i由所述反相柱洗脫出的確切條件將對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是可容易確定的。在多個(gè)實(shí)施方案中，柱負(fù)載中的約60％諸如約65％、約70％、約75％或者約80％或者更多的apoa-i存在于步驟(d)的柱洗脫液中。在某些方面，本申請(qǐng)所述的純化方法進(jìn)一步包括在步驟(d)后的步驟(e)，其中使得步驟(d)的載脂蛋白a-i反相洗脫液經(jīng)過(guò)第二反相色譜柱以進(jìn)一步由全長(zhǎng)蛋白中除去dna、宿主細(xì)胞蛋白和截短形式的apoa-i。優(yōu)選地，在允許所述載脂蛋白a-i結(jié)合至基質(zhì)的條件下將步驟(d)的反相洗脫液載入至第二反相柱上。用于步驟(e)的反相基質(zhì)可為與步驟(d)所用的相同類(lèi)型的基質(zhì)或者不同類(lèi)型的基質(zhì)。在一些具體的實(shí)施方案中，步驟(e)中所用的反相基質(zhì)為c18硅膠基質(zhì)諸如daisogelsp-300-bioc18基質(zhì)(10μm；daisoco.,ltd.)?？捎糜谠谳d入apoa-i之前平衡所述c18柱且保證所述蛋白在載入后將結(jié)合至所述柱上的緩沖條件將對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是可容易確定的。優(yōu)選地，所述柱平衡緩沖劑為強(qiáng)緩沖劑，其可將柱ph降低至約9.5。在某些實(shí)施方案中，所述平衡緩沖劑為tampe(100mm碳酸銨)。在多個(gè)實(shí)施方案中，在本申請(qǐng)所述的純化方法的步驟(e)中所用的反相柱具有約10cm至約50cm諸如約10cm至約30cm的底料高度。在一些具體的實(shí)施方案中，步驟(e)中所用的反相柱具有約25cm的底料高度。在多個(gè)實(shí)施方案中，將步驟(d)的apoa-i洗脫液以每升約0.5g至約30gapoa-i諸如約1g至約10gapoa-i且更優(yōu)選約4g至約5gapoa-i的濃度載入至c18反相柱上。在一些具體的實(shí)施方案中，將步驟(d)的apoa-i洗脫液以約4.7gapoa-i/l的濃度載入至c18柱上。優(yōu)選地，在平衡后，將步驟(d)的含有apoa-i的洗脫液以約0.5cm至約5.0cm/分鐘諸如約1.0cm至約3.0cm/分鐘的流速載入至柱上。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，將含有apoa-i的濾液以約2.1cm/分鐘的流速載入至柱上。在apoa-i結(jié)合至步驟(e)的反相基質(zhì)中后，使用增加濃度的有機(jī)溶劑在緩沖劑中的梯度諸如約40％至約50％乙腈在tampe緩沖劑中的梯度將蛋白在步驟(f)洗脫出。在某些方面，歷時(shí)約40至約80分鐘諸如約50分鐘、約60分鐘或者約70分鐘的時(shí)間內(nèi)約40％至約50％乙腈的線性梯度用于將apoa-i由所述柱洗脫出。在一些具體的實(shí)施方案中，歷時(shí)約60分鐘的時(shí)間內(nèi)約40％至約50％乙腈在tampe緩沖劑中的線性梯度用于將apoa-i由所述反相基質(zhì)洗脫出。在某些方面，線性梯度之后進(jìn)行使用50％乙腈的約15分鐘的等度洗脫。用于將apoa-i由所述反相柱洗脫出的確切條件將對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是容易確定的。在多個(gè)實(shí)施方案中，在柱負(fù)載中的約60％諸如約65％、約70％、約75％或者約80％或者更多的apoa-i在步驟(f)的柱洗脫液中回收。在某些實(shí)施方案中，將有機(jī)溶劑由本申請(qǐng)所述方法的步驟(f)獲得的含有apoa-i的洗脫液除去。溶劑除去可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)完成，包括但不限于將步驟(f)獲得的含有apoa-i的洗脫液濃縮并將所述濃縮液滲濾至含水緩沖劑中。在某些實(shí)施方案中，將步驟(f)的洗脫液濃縮約2-倍、約2.5-倍、約3-倍、約3.5-倍、約4-倍、約4.5-倍或者約5-倍(相比于步驟(f)的反相柱中洗脫液的體積)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，將洗脫液濃縮約2.5-倍，然后經(jīng)約10、15或者20體積，優(yōu)選15體積的適當(dāng)含水緩沖劑滲濾。適當(dāng)?shù)暮彌_劑為本領(lǐng)域已知的。特別優(yōu)選的緩沖劑為tampc(3mm磷酸鈉,ph8.0)。在一些實(shí)施方案中，色譜柱的順序是可顛倒的。任選地，在濃縮和緩沖劑交換后，將含水a(chǎn)poa-i溶液進(jìn)一步經(jīng)陰離子交換色譜法以陰性模式(即在其中apoa-i不結(jié)合至陰離子交換基質(zhì)的條件下)純化，以除去殘留的dna和其它荷負(fù)電的污染物諸如宿主細(xì)胞蛋白(步驟(g))。在一些實(shí)施方案中，所述陰離子交換步驟以分批模式進(jìn)行。在其它實(shí)施方案中，所述陰離子交換步驟經(jīng)柱色譜法進(jìn)行。用于分批模式或者柱色譜法中的適當(dāng)?shù)年庪x子交換基質(zhì)包括但不限于qsepharose-ff或者如上在步驟(a)中所討論的任何陰離子交換基質(zhì)。在具體的方面，所述陰離子交換步驟通過(guò)以下方法實(shí)施：使得apoa-i溶液經(jīng)過(guò)陰離子交換膜諸如具有大的表面積和強(qiáng)的陽(yáng)離子電荷的膜，例如sartobindq或者mustangq。優(yōu)選地，使用mustangq陰離子交換膜(palllifesciences)來(lái)進(jìn)行所述陰離子交換步驟。在某些方面，將所述含水a(chǎn)poa-i溶液的ph降低至約5.5、約6.0或者約6.5，之后使用任何適當(dāng)?shù)乃徇M(jìn)行該陰離子交換步驟。在具體的方面，使用稀磷酸將所述含水a(chǎn)poa-i溶液的ph降低至約6.0。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使得所述apoa-i溶液以約12.5l/m2/h經(jīng)過(guò)mustangq柱。在一些實(shí)施方案中，將所述陰離子交換膜濾液濃縮并任選地滲濾，以將溶劑變換為適于儲(chǔ)存或者進(jìn)一步加工所述apoa-i的溶劑，所述加工諸如與在如下段落6.5.1中所述的脂質(zhì)復(fù)合和/或者如以下段落6.6中所述配制在藥物組合物中。用于儲(chǔ)存或者進(jìn)一步加工apoa-i的適當(dāng)?shù)木彌_劑對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是容易確定的。在一些具體的實(shí)施方案中，將所述純化的apoa-i交換至tampc緩沖劑中。任何超濾膜可用于該步驟中，條件是所述膜具有低于全長(zhǎng)成熟apoa-i的分子量的分子量截止值以使得其允許緩沖劑經(jīng)過(guò)而不允許蛋白經(jīng)過(guò)。在一些具體的實(shí)施方案中，使用10,000額定分子量截止值的聚醚砜膜(例如filtronomega系列)。優(yōu)選地，在超濾后所述溶液中的apoa-i濃度為至少10g/l、至少12g/l、至少15g/l、至少20g/l、至少25g/l、至少30g/l、至少35g/l、至少40g/l、至少45g/l或者至少50g/l。6.1.5.載脂蛋白產(chǎn)物本公開(kāi)還提供了基本純的成熟全長(zhǎng)載脂蛋白。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“基本純的”是指至少95％純的蛋白。在某些實(shí)施方案中，所述基本純的蛋白為至少96％純的、至少97％純的、至少98％純的、至少99％純的、至少99.5％純的、至少99.9％純的或者100％純的。在某些方面，使用光源對(duì)照白色背景進(jìn)行視覺(jué)觀察時(shí)，由本申請(qǐng)所述的純化方法產(chǎn)生的基本純的載脂蛋白產(chǎn)物為不含可見(jiàn)顆粒的澄清至略微乳色溶液。在多個(gè)實(shí)施方案中，由如上在段落6.1.4中所述的方法獲得或者可獲得的基本純的載脂蛋白包括少量或者檢測(cè)不到的量的一種或者多種宿主細(xì)胞dna、除了載脂蛋白之外的蛋白(例如宿主細(xì)胞蛋白)、內(nèi)毒素、殘留的溶劑以及低生物負(fù)載(即在樣品上或者樣品中的少量的微生物)，如下進(jìn)一步詳述。載脂蛋白產(chǎn)物的純度可由本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)確定，包括但不限于n-末端edman序列測(cè)定、maldi-ms、凝膠電泳、hplc和/或者免疫測(cè)定。在多個(gè)實(shí)施方案中，由本申請(qǐng)所述的方法獲得的基本純的載脂蛋白為具有約28.1千道爾頓的質(zhì)量的全長(zhǎng)成熟人apoa-i。該產(chǎn)物中的apoa-i的質(zhì)量可由本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)確定，包括但不限于maldi-ms。在多個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)物中至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％的apoa-i蛋白為成熟全長(zhǎng)apoa-i(例如包含seqidno:1的氨基酸25-267的apoa-i)。在某些方面，所述基本純的apoa-i產(chǎn)物含有約15wt％或者更低、約10wt％或者更低、約5wt％或者更低、約4wt％或者更低、約3wt％或者更低、約2wt％或者更低或者約1wt％或者更低的n-末端延長(zhǎng)的apoa-i同等型(例如原apoa-i)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，產(chǎn)物中任何n-末端延長(zhǎng)的apoa-i將在給藥后在血液中快速地轉(zhuǎn)化為成熟apoa-i。在多個(gè)實(shí)施方案中，所述apoa-i產(chǎn)物含有約25wt％或者更低、約20wt％或者更低、約15wt％或者更低、約10wt％或者更低、約5wt％或者更低、約4wt％或者更低、約3wt％或者更低、約2wt％或者更低、約1wt％或者更低、約0.75wt％或者更低、約0.5wt％或者更低、約0.25wt％或者更低或者約0.1wt％或者更低的截短形式的apoa-i。截短的或者延長(zhǎng)的apoa-i的量可通過(guò)例如n-末端edman序列測(cè)定和/或者maldi-ms和/或者運(yùn)行和掃描sds-page凝膠來(lái)確定，以確定純化的apoa-i譜帶面積(如果存在)的強(qiáng)度與所有譜帶的總強(qiáng)度的比例。在多個(gè)實(shí)施方案中，所述apoa-i產(chǎn)物含有約20wt％或者更低、約10wt％或者更低、約5wt％或者更低、約4wt％或者更低、約3wt％或者更低、約2wt％或者更低、約1wt％或者更低、約0.75wt％或者更低、約0.5wt％或者更低、約0.25wt％或者更低或者約0.1wt％或者更低的氧化形式的apoa-i，特別是在位置met112和/或者met148氧化的apoa-i。在某些實(shí)施方案中，由本申請(qǐng)所述的方法產(chǎn)生的基本純的載脂蛋白包含以小于約100ppm(例如ng/mg)諸如小于約75ppm、小于約50ppm、小于約40ppm、小于約30ppm、小于約20ppm或者小于約10ppm的量存在的宿主細(xì)胞蛋白。在一些具體的實(shí)施方案中，所述基本純的載脂蛋白產(chǎn)物包含小于約20ppm的宿主細(xì)胞蛋白。更優(yōu)選地，所述載脂蛋白產(chǎn)物包含小于約10ppm的宿主細(xì)胞蛋白。載脂蛋白樣品中的宿主細(xì)胞蛋白的存在和量可由本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)確定。當(dāng)載脂蛋白在例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞中重組產(chǎn)生時(shí)，可商購(gòu)得到的elisa試劑盒(例如kitf015，來(lái)自cygnustechnologies)可用于檢測(cè)和定量宿主細(xì)胞蛋白水平。在某些方面，如本申請(qǐng)所述純化的基本純的載脂蛋白產(chǎn)物包含以小于約50pg/mg的載脂蛋白諸如小于約40pg/mg、小于約30pg/mg、小于約20pg/mg、小于約10pg/mg或者小于約5pg/mg的載脂蛋白的量存在的宿主細(xì)胞dna。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，基本純的載脂蛋白產(chǎn)物包含小于約10pg的宿主細(xì)胞蛋白/mg的載脂蛋白。宿主細(xì)胞dna在載脂蛋白樣品中的存在和量可由本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)確定，包括實(shí)時(shí)-pcr或者使用抗-ssb抗體(glycotypebiotechnology)的具有單鏈結(jié)合蛋白的復(fù)合物的檢測(cè)，優(yōu)選通過(guò)定量pcr。在某些實(shí)施方案中，由本申請(qǐng)所述的方法產(chǎn)生的基本純的載脂蛋白產(chǎn)物包含小于約0.5eu/mg的載脂蛋白諸如小于約0.4eu/mg、小于約0.3eu/mg、小于約0.2eu/mg或者小于約0.1eu/mg的載脂蛋白的量的內(nèi)毒素。優(yōu)選地，本申請(qǐng)所述的基本純的載脂蛋白產(chǎn)物包含小于約0.1eu的內(nèi)毒素/mg的載脂蛋白。內(nèi)毒素的檢測(cè)和定量可由本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如使用針對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素(cambrex；敏感性0.125eu/ml)的鱟阿米巴樣細(xì)胞溶解物(limulusamebocytelysate,lal)定性測(cè)試。本申請(qǐng)所述的基本純的載脂蛋白產(chǎn)物具有低生物負(fù)載。術(shù)語(yǔ)“生物負(fù)載”是指產(chǎn)物中的需氧菌、厭氧菌、酵母以及霉菌的水平。在多個(gè)實(shí)施方案中，如本申請(qǐng)所述純化的基本純的載脂蛋白產(chǎn)物的生物負(fù)載為小于約1cfu/ml。生物負(fù)載測(cè)試可根據(jù)任何已知方法來(lái)進(jìn)行，例如根據(jù)europeanpharmacopoeiachapter2.6.12.b,2.6.1以及usbchapter61統(tǒng)一方法。本申請(qǐng)所述的基本純的載脂蛋白產(chǎn)物包含少量的殘留溶劑。在一些具體的實(shí)施方案中，殘留溶劑以針對(duì)10mg/l的載脂蛋白而言小于約50ppm、小于約45ppm、小于約40ppm、小于約35ppm、小于約30ppm、小于約25ppm、小于約20ppm、小于約15ppm或者小于約10ppm的量存在。優(yōu)選地，殘留溶劑以針對(duì)10mg/l的載脂蛋白而言小于約41ppm的量存在。殘留溶劑的量可由本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)測(cè)定，包括但不限于gc-ms和hplc。優(yōu)選地，所述載脂蛋白為apoa-i(例如包含seqidno:1的氨基酸25-267的apoa-i)。在一些實(shí)施方案中，所述成熟人apoa-i蛋白具有在位置1(即，相應(yīng)于seqidno:1的位置25的位置)具有門(mén)冬氨酸的氨基酸序列。6.2.脂質(zhì)部分本公開(kāi)的脂蛋白復(fù)合物和組合物包含脂質(zhì)部分。所述脂質(zhì)部分包含一種或者多種脂質(zhì)。在多個(gè)實(shí)施方案中，一種或者多種脂質(zhì)可為飽和和/或者不飽和的，以及天然或者合成的脂質(zhì)。所述脂質(zhì)部分優(yōu)選包含至少一種磷脂。可存在于脂質(zhì)部分中的適當(dāng)?shù)闹|(zhì)包括但不限于小烷基鏈磷脂、蛋磷脂酰膽堿、大豆磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、1-肉豆蔻酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿、1-棕櫚酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、1-棕櫚酰-2-硬脂酰磷脂酰膽堿、1-硬脂酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰甘油磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油諸如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕櫚酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰絲氨酸、二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸、腦磷脂酰絲氨酸、腦鞘磷脂、棕櫚酰鞘磷脂、二棕櫚酰鞘磷脂、蛋鞘磷脂、乳鞘磷脂、植物鞘磷脂、二硬脂酰鞘磷脂、二棕櫚酰磷脂酰甘油鹽、磷脂酸、半乳糖腦苷脂、神經(jīng)節(jié)苷酯、腦苷脂、二月桂基磷脂酰膽堿、(1,3)-d-甘露糖基-(1,3)甘油二酯、氨基苯基糖苷、3-膽固醇基-6'-(糖基硫基)己基醚糖脂以及膽固醇及其衍生物。合成的脂質(zhì)諸如合成的棕櫚酰鞘磷脂或者n-棕櫚酰-4-羥基二氫鞘氨醇-1-磷酸膽堿(植物鞘磷脂形式)可用于使得脂質(zhì)氧化最小化。包含棕櫚酰鞘磷脂的磷脂部分可任選地包括少量的任何類(lèi)型的脂質(zhì)，包括但不限于溶血磷脂質(zhì)、除了棕櫚酰鞘磷脂之外的鞘磷脂、半乳糖腦苷脂、神經(jīng)節(jié)苷酯、腦苷脂、甘油酯、甘油三酯和膽固醇及其衍生物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)部分包含兩種類(lèi)型的磷脂：鞘磷脂(sm)和負(fù)電荷磷脂。sm為“中性”磷脂，是在生理ph條件下凈電荷約為零的磷脂。使用的sm的特性并不是成功的關(guān)鍵所在。因此，如本申請(qǐng)所用，“sm”的表達(dá)不僅包括衍生自或者源自天然來(lái)源的鞘磷脂，而且包括與天然形成的sm一樣的、不受lcat水解影響的天然形成的sm的類(lèi)似物和衍生物。sm是一種結(jié)構(gòu)極類(lèi)似于卵磷脂的磷脂，但是其與卵磷脂不一致之處在于其不具有甘油骨架，并由此而不具有結(jié)合?；湹孽ユI。相反，sm具有神經(jīng)酰胺骨架，在該骨架中酰胺鍵與酰基鏈連接。sm并不是lcat的底物，并且其通常不能被lcat水解。但是，sm可以起lcat抑制劑的作用或者可以通過(guò)稀釋底物磷脂的濃度而降低lcat的活性。由于sm不被水解，因此其在循環(huán)中可滯留更長(zhǎng)的時(shí)間。預(yù)期這種特征可使本申請(qǐng)所述的荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物具有更長(zhǎng)的藥理作用(膽固醇的流動(dòng))持續(xù)時(shí)間，并且其與不包括sm的載脂蛋白復(fù)合物相比，能夠獲取更多的脂質(zhì)，尤其是膽固醇。這種作用可以使包括sm的脂蛋白復(fù)合物與不包括sm的脂蛋白復(fù)合物相比，治療所需的次數(shù)更少或者劑量更低。事實(shí)上，sm可以源自任何來(lái)源。例如，sm可以由牛奶、蛋或腦獲得。還可以使用sm類(lèi)似物或衍生物。有用的sm類(lèi)似物和衍生物的非限制性實(shí)例包括但不限于棕櫚酰鞘磷脂、n-棕櫚酰-4-羥基二氫鞘氨醇-1-磷酸膽堿(一種形式的植物鞘磷脂)、棕櫚酰鞘磷脂、硬脂酰鞘磷脂、d-赤蘚糖-n-16:0-鞘磷脂及其二氫異構(gòu)體、d-赤蘚糖-n-16:0-二氫-鞘磷脂?？墒褂煤铣傻膕m諸如合成的棕櫚酰鞘磷脂或者n-棕櫚酰-4-羥基二氫鞘氨醇-1-磷酸膽堿(植物鞘磷脂)，以產(chǎn)生更均質(zhì)的復(fù)合物以及更少的污染物和/或者氧化產(chǎn)物(相比于動(dòng)物來(lái)源的鞘脂)。示例性鞘磷脂，即棕櫚酰鞘磷脂和植物鞘磷脂如下顯示?？梢匀斯さ厥褂商烊粊?lái)源分離的鞘磷脂富含一種特殊的飽和或不飽和酰基鏈。例如，乳鞘磷脂(avantiphospholipid,alabaster,ala.)的特征為具有飽和的長(zhǎng)?；?即，具有20個(gè)或更多個(gè)碳原子的酰基鏈)。相反，蛋鞘磷脂的特征為具有飽和的短?；?即，具有少于20個(gè)碳原子的?；?。例如，雖然只有大約20％的乳鞘磷脂包括c16:0(16個(gè)碳,飽和的)?；?，但是卻有約80％的蛋鞘磷脂包括c16:0?；??？梢酝ㄟ^(guò)使用溶劑萃取來(lái)使乳鞘磷脂的組成富含與蛋鞘磷脂具可比性的?；溄M分，反之亦然。為使sm具有特定的?；湥淇梢允前牒铣傻?。例如，首先可將乳鞘磷脂從乳品純化，然后可將一種特定的?；溔鏲16:0?；溋呀獠⑻鎿Q為另一?；?。sm也可以完全通過(guò)例如大規(guī)模合成來(lái)進(jìn)行合成。參見(jiàn)，例如dongetal.,美國(guó)專(zhuān)利5,220,043,標(biāo)題為synthesisofd-erythro-sphingomyelins,issuedjun.15,1993；weis,1999,chem.phys.lipids102(1-2):3-12。可以選擇性地改變構(gòu)成半合成或合成sm的?；湹拈L(zhǎng)度和飽和度。所述?；溈梢允秋柡突虿伙柡偷模⑶铱梢院屑s6至約24個(gè)碳原子。每條鏈可以含有相同數(shù)目的碳原子，或者可選地，每條鏈可以含有不同數(shù)目的碳原子。在一些實(shí)施方案中，半合成或合成的sm包含混合的酰基鏈，以使其中的一條鏈為飽和的而另一條鏈為不飽和的。在具有這樣混合的酰基鏈的sm中，該鏈的長(zhǎng)度可以相同或不同。在其它實(shí)施方案中，半合成或合成sm的?；溈删鶠轱柡突虿伙柡偷?。此外，該鏈可以含有相同或不同數(shù)目的碳原子。在一些實(shí)施方案中，構(gòu)成半合成或合成sm的?；?zhǔn)窍嗤?。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，該鏈與天然形成的脂肪酸的酰基鏈一致，所述天然形成的脂肪酸的例子如油酸、棕櫚酸或硬脂酸。在另外的實(shí)施方案中，使用具有飽和或者不飽和官能鏈的sm。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，這兩種酰基鏈均為飽和的并且均含有6至24個(gè)碳原子。以下的表1提供了可以包含在半合成和合成sm中的、存在于通常形成的脂肪酸中的?；湹姆窍拗菩詫?shí)例：在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述sm為棕櫚酰sm諸如合成的棕櫚酰sm，其具有c16:0?；?，或者其為蛋sm，其包含作為主要成分的棕櫚酰sm。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，使用官能化的sm諸如植物鞘磷脂。所述脂質(zhì)部分優(yōu)選包含負(fù)電荷磷脂。本申請(qǐng)使用的“負(fù)電荷磷脂”為在生理ph條件下具有負(fù)的凈電荷的磷脂。所述負(fù)電荷磷脂可包含單一類(lèi)型的負(fù)電荷磷脂，或者兩種或者更多種不同的荷負(fù)電的磷脂的混合物。在一些實(shí)施方案中，所述荷電磷脂為荷負(fù)電的甘油磷脂。所述一種或者多種荷電磷脂的特性并不是成功的關(guān)鍵所在。適當(dāng)?shù)呢?fù)電荷磷脂的具體實(shí)例包括但不限于1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-[-磷酸-外消旋-(1-甘油)]、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸和磷脂酸。在一些實(shí)施方案中，所述負(fù)電荷磷脂包含一種或者多種磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油和/或者磷脂酸。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述負(fù)電荷磷脂由1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-[-磷酸-外消旋-(1-甘油)]或者dppg構(gòu)成。與sm一樣，負(fù)電荷磷脂可以由天然來(lái)源獲得或者通過(guò)化學(xué)合成制備。如上文與sm相關(guān)的討論一樣，在采用合成的負(fù)電荷磷脂的實(shí)施方案中，可以選擇性地改變?；湹奶匦?。在本申請(qǐng)描述的荷電脂蛋白復(fù)合物的一些實(shí)施方案中，該負(fù)電荷磷脂上的兩種?；?zhǔn)窍嗤?。在一些?shí)施方案中，sm以及負(fù)電荷磷脂上的酰基鏈全部相同。在特定的實(shí)施方案中，所述一種或者多種負(fù)電荷磷脂和/或sm均具有c16:0或c16:1?；?。在特定的實(shí)施方案中，所述sm的脂肪酸部分主要為c16:1棕櫚酰。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述一種或者多種荷電的磷脂和/或sm的酰基鏈與棕櫚酸的?；溡恢隆Ｊ褂玫牧字瑑?yōu)選為至少95％純的和/或者具有降低水平的氧化劑。由天然來(lái)源獲得的脂質(zhì)優(yōu)選具有較少的多不飽和脂肪酸部分和/或者不易于氧化的脂肪酸部分。樣品的氧化水平可使用碘量法來(lái)確定，其提供了過(guò)氧化值，表示為每千克樣品的分離的碘的毫當(dāng)量數(shù)，縮寫(xiě)為meqo/kg。參見(jiàn)例如gray,j.i.,measurementoflipidoxidation:areview,journaloftheamericanoilchemistssociety,vol.55,p.539-545(1978)；heaton,f.w.andurin.,improvediodometricmethodsforthedeterminationoflipidperoxides,journalofthescienceoffoodandagriculture,vol9.p,781-786(1958)。優(yōu)選地，所述氧化水平或者過(guò)氧化物水平是低的，例如小于5meqo/kg、小于4meqo/kg、小于3meqo/kg或者小于2meqo/kg。包含sm和棕櫚酰鞘磷脂的脂質(zhì)部分可任選地包含少量的額外的脂質(zhì)。實(shí)際上，可使用任何類(lèi)型的脂質(zhì)，包括但不限于溶血磷脂質(zhì)、半乳糖腦苷脂、神經(jīng)節(jié)苷酯、腦苷脂、甘油酯、甘油三酯和膽固醇及其衍生物。當(dāng)包括在內(nèi)時(shí)，所述任選的脂質(zhì)通常包含小于約15wt％的脂質(zhì)部分，盡管在一些情況下可包含更任選的脂質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，任選的脂質(zhì)為小于約10wt％、小于約5wt％或者小于約2wt％。在一些實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)部分不包含任選的脂質(zhì)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述磷脂部分含有重量比(sm:負(fù)電荷磷脂)范圍為90:10至99:1、更優(yōu)選范圍為95:5至98:2的蛋sm、棕櫚酰sm或者植物鞘磷脂以及dppg。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述重量比為97:3。本公開(kāi)的脂蛋白復(fù)合物也可用作載體來(lái)遞送疏水性、親脂性或者非極性活性劑以用于各種治療或者診斷應(yīng)用。對(duì)于所述應(yīng)用，所述脂質(zhì)部分可進(jìn)一步包含一種或者多種疏水性、親脂性或者非極性活性劑，包括但不限于脂肪酸、藥物、核酸、維生素和/或者營(yíng)養(yǎng)素。適當(dāng)?shù)氖杷浴⒂H脂性或者非極性活性劑并不限于治療類(lèi)別，且可為例如鎮(zhèn)痛藥、抗炎劑、驅(qū)蟲(chóng)藥、抗心律不齊藥、抗菌劑、抗病毒劑、抗凝血?jiǎng)⒖挂钟羲?、抗糖尿病藥、抗癲癇劑、抗真菌劑、抗痛風(fēng)藥、抗高血壓劑、抗瘧藥、抗偏頭痛藥、抗毒蕈堿劑、抗腫瘤藥、勃起機(jī)能障礙改善劑、免疫抑制劑、抗原蟲(chóng)劑、抗甲狀腺劑、抗焦慮劑、鎮(zhèn)靜藥、安眠藥、神經(jīng)鎮(zhèn)靜藥、β-阻滯劑、心臟收縮藥(cardiacinotropicagents)、皮質(zhì)類(lèi)固醇(corticosteroids)、利尿劑、抗帕金森綜合征劑、胃腸藥、組胺受體拮抗劑、角質(zhì)層分離劑、脂質(zhì)調(diào)節(jié)劑、抗心絞痛藥、cox-2抑制劑、白三烯抑制劑、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、肌肉松弛藥(musclerelaxants)、營(yíng)養(yǎng)劑、核酸(例如小干擾rna)、阿片樣物質(zhì)鎮(zhèn)痛藥、蛋白酶抑制劑、性激素類(lèi)、興奮藥、肌肉松弛藥、抗骨質(zhì)疏松藥(anti-osteoporosisagents)、減肥藥、認(rèn)知增強(qiáng)藥、抗尿失禁藥、營(yíng)養(yǎng)油、抗良性前列腺肥大藥、必需脂肪酸、非必需脂肪酸以及它們的混合物。適當(dāng)?shù)氖杷浴⒂H脂性或者非極性活性劑的具體的非限制性實(shí)例為：阿昔曲丁(acetretin)、阿苯達(dá)唑(albendazole)、沙丁胺醇(albuterol)、氨魯米特(aminoglutethimide)、胺碘酮(amiodarone)、氨氯地平(amlodipine)、安非他命(amphetamine)、兩性霉素b(amphotericinb)、阿托伐他汀(atorvastatin)、阿托伐醌(atovaquone)、阿奇霉素(azithromycin)、巴氯芬(baclofen)、倍氯米松(beclomethasone)、貝那普利(benezepril)、苯佐那酯(benzonatate)、倍他米松(betamethasone)、比卡魯胺(bicalutanide)、布地奈德(budesonide)、安非他酮(bupropion)、白消安(busulfan)、布替萘芬(butenafine)、骨化二醇(calcifediol)、卡泊三烯(calcipotriene)、骨化三醇(calcitriol)、喜樹(shù)堿(camptothecin)、坎地沙坦(candesartan)、辣椒堿(capsaicin)、卡馬西平(carbamezepine)、胡蘿卜素類(lèi)(carotenes)、塞來(lái)考昔(celecoxib)、西立伐他汀(cerivastatin)、西替利嗪(cetirizine)、氯苯那敏(chlorpheniramine)、膽鈣化甾醇(cholecalciferol)、西洛他唑(cilostazol)、西咪替丁(cimetidine)、桂利嗪(cinnarizine)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)、西沙必利(cisapride)、克拉霉素(clarithromycin)、氯馬斯汀(clemastine)、氯米芬(clomiphene)、氯米帕明(clomipramine)、氯吡格雷(clopidogrel)、可待因(codeine)、輔酶q10(coenzymeq10)、環(huán)苯扎林(cyclobenzaprine)、環(huán)孢菌素(cyclosporin)、達(dá)那唑(danazol)、丹曲林(dantrolene)、右氯苯那敏(dexchlorpheniramine)、雙氯芬酸(diclofenac)、雙香豆素(dicoumarol)、地高辛(digoxin)、脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone)、二氫麥角胺(dihydroergotamine)、雙氫速甾醇(dihydrotachysterol)、地紅霉素(dirithromycin)、多奈哌齊(donezepil)、依法韋侖(efavirenz)、頭孢他定(eposartan)、麥角鈣化醇(ergocalciferol)、麥角胺(ergotamine)、必需脂肪酸來(lái)源(essentialfattyacidsources)、依托度酸(etodolac)、依托泊苷(etoposide)、法莫替丁(famotidine)、非諾貝特(fenofibrate)、芬太尼(fentanyl)、非索非那定(fexofenadine)、非那雄胺(finasteride)、氟康唑(fluconazole)、氟比洛芬(flurbiprofen)、氟伐他汀(fluvastatin)、磷苯妥英(fosphenytoin)、夫羅曲普坦(frovatriptan)、呋喃唑酮(furazolidone)、加巴噴丁(gabapentin)、吉非貝齊(gemfibrozil)、格列本脲(glibenclamide)、格列吡嗪(glipizide)、格列本脲(glyburide)、格列美脲(glimepiride)、灰黃霉素(griseofulvin)、鹵泛群(halofantrine)、布洛芬(ibuprofen)、厄貝沙坦(irbesartan)、伊立替康(irinotecan)、硝酸異山梨酯(isosorbidedinitrate)、異維a酸(isotretinoin)、伊曲康唑(itraconazole)、伊維菌素(ivermectin)、酮康唑(ketoconazole)、酮咯酸(ketorolac)、拉莫三嗪(lamotrigine)、蘭索拉唑(lansoprazole)、來(lái)氟米特(leflunomide)、賴(lài)諾普利(lisinopril)、洛哌丁胺(loperamide)、氯雷他定(loratadine)、洛伐他汀(lovastatin)、l-甲狀腺素(l-thryroxine)、葉黃素(lutein)、番茄紅素(lycopene)、甲羥孕酮(medroxyprogesterone)、米非司酮(mifepristone)、甲氟喹(mefloquine)、醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)、美沙酮(methadone)、甲氧沙林(methoxsalen)、甲硝唑(metronidazole)、咪康唑(miconazole)、咪達(dá)唑侖(midazolam)、米格列醇(miglitol)、米諾地爾(minoxidil)、米托蒽醌(mitoxantrone)、孟魯司特(montelukast)、萘丁美酮(nabumetone)、納布啡(nalbuphine)、那拉曲坦(naratriptan)、奈芬納韋(nelfinavir)、硝苯地平(nifedipine)、尼索地平(nilsolidipine)、尼魯米特(nilutanide)、呋喃妥因(nitrofurantoin)、尼扎替丁(nizatidine)、奧美拉唑(omeprazole)、奧普瑞白介素(oprevelkin)、甾二醇(oestradiol)、奧沙普秦(oxaprozin)、紫杉醇(paclitaxel)、旁卡西醇(paracalcitol)、帕羅西汀(paroxetine)、噴他佐辛(pentazocine)、吡格列酮(pioglitazone)、pizofetin、普伐他汀(pravastatin)、潑尼松龍(prednisolone)、普羅布考(probucol)、黃體酮(progesterone)、偽麻黃堿(pseudoephedrine)、吡斯的明(pyridostigmine)、雷貝拉唑(rabeprazole)、雷洛昔芬(raloxifene)、羅非考昔(rofecoxib)、瑞格列奈(repaglinide)、利福布汀(rifabutine)、利福噴汀(rifapentine)、利美索龍(rimexolone)、利托那韋(ritanovir)、利扎曲普坦(rizatriptan)、羅格列酮(rosiglitazone)、沙奎那韋(saquinavir)、舍曲林(sertraline)、西布曲明(sibutramine)、枸櫞酸西地那非(sildenafilcitrate)、辛伐他汀(simvastatin)、西羅莫司(sirolimus)、螺內(nèi)酯(spironolactone)、舒馬普坦(sumatriptan)、他克林(tacrine)、他克莫司(tacrolimus)、他莫昔芬(tamoxifen)、坦洛新(tamsulosin)、塔革雷汀(targretin)、他扎羅汀(tazarotene)、替米沙坦(telmisartan)、替尼泊苷(teniposide)、特比萘芬(terbinafine)、特拉唑嗪(terazosin)、四氫大麻酚(tetrahydrocannabinol)、噻加賓(tiagabine)、噻氯匹定(ticlopidine)、tirofibran、替扎尼定(tizanidine)、托吡酯(topiramate)、托泊替康(topotecan)、托瑞米芬(toremifene)、曲馬多(tramadol)、維a酸(tretinoin)、曲格列酮(troglitazone)、曲伐沙星(trovafloxacin)、泛癸利酮(ubidecarenone)、纈沙坦(valsartan)、文拉法辛(venlafaxine)、維替泊芬(verteporfin)、氨己烯酸(vigabatrin)、維生素a(vitamina)、維生素d(vitamind)、維生素e(vitamine)、維生素k(vitamink)、扎魯司特(zafirlukast)、齊留通(zileuton)、佐米曲坦(zolmitriptan)、唑吡坦(zolpidem)和佐匹克隆(zopiclone)。也可使用上面所列的試劑的鹽、異構(gòu)體和衍生物，以及它們的混合物。6.3.脂蛋白復(fù)合物本公開(kāi)提供了包含蛋白部分和脂質(zhì)部分的脂蛋白復(fù)合物，其各自的組成已經(jīng)如上分別在章節(jié)6.1和6.2中描述。一般而言，所述蛋白部分包含一種或者多種提供治療和/或者預(yù)防益處的脂質(zhì)-結(jié)合蛋白諸如載脂蛋白和/或者其衍生物或者類(lèi)似物。所述復(fù)合物可包含單一類(lèi)型的脂質(zhì)-結(jié)合蛋白，或者可衍生自相同或者不同種類(lèi)的兩種或者更多種不同的脂質(zhì)-結(jié)合蛋白的混合物。適當(dāng)?shù)闹|(zhì)-結(jié)合蛋白如上在段落6.1中描述。盡管不必需，但是所述脂蛋白復(fù)合物將優(yōu)選包含衍生自待治療的動(dòng)物物種的脂質(zhì)-結(jié)合蛋白或者相應(yīng)于待治療的動(dòng)物物種的氨基酸序列的脂質(zhì)-結(jié)合蛋白，以避免產(chǎn)生對(duì)治療免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)作用。因此，對(duì)于治療人類(lèi)患者，人源的脂質(zhì)-結(jié)合蛋白優(yōu)選用于本公開(kāi)的復(fù)合物。肽模擬載脂蛋白的使用也可降低或者避免免疫應(yīng)答。認(rèn)為具有高純度(例如成熟且未被截短、未氧化、未被脫去酰胺的，未污染有內(nèi)毒素和/或者未污染有其它蛋白或者核酸)的載脂蛋白增強(qiáng)了治療效能和/或者增強(qiáng)脂蛋白復(fù)合物的安全性。因此，所述蛋白部分可包含至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％成熟的全長(zhǎng)apoa-i，其任選具有不超過(guò)25％、不超過(guò)20％、不超過(guò)15％、不超過(guò)10％、不超過(guò)5％或者約0％的氧化的蛋氨酸-112或者蛋氨酸-148和/或者不超過(guò)15％、不超過(guò)10％、不超過(guò)5％或者約0％的脫胺的氨基酸。所述載脂蛋白可根據(jù)本申請(qǐng)所述的任何方法來(lái)純化。任選地，所述載脂蛋白可如在段落6.1.4中所述來(lái)制備。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述蛋白部分包含apoa-i或者基本上由apoa-i構(gòu)成，例如，所述apoa-i為基本純的成熟的全長(zhǎng)apoa-i，如上在段落6.1.5中所述。所述脂質(zhì)部分包含一種或者多種脂質(zhì)，其可為飽和的、不飽和的、天然和合成的脂質(zhì)和/或者磷脂。適當(dāng)?shù)闹|(zhì)包括但不限于小烷基鏈磷脂、蛋磷脂酰膽堿、大豆磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、1-肉豆蔻酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿、1-棕櫚酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、1-棕櫚酰-2-硬脂酰磷脂酰膽堿、1-硬脂酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰甘油磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油諸如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕櫚酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰絲氨酸、二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸、腦磷脂酰絲氨酸、腦鞘磷脂、二棕櫚酰鞘磷脂、二硬脂酰鞘磷脂、二棕櫚酰磷脂酰甘油鹽、磷脂酸、半乳糖腦苷脂、神經(jīng)節(jié)苷酯、腦苷脂、二月桂基磷脂酰膽堿、(1,3)-d-甘露糖基-(l,3)甘油二酯、氨基苯基糖苷、3-膽固醇基-6'-(糖基硫基)己基醚糖脂以及膽固醇及其衍生物。包含sm和棕櫚酰鞘磷脂的磷脂部分可任選地包含少量的任何類(lèi)型的脂質(zhì)，包括但不限于溶血磷脂質(zhì)、除了棕櫚酰鞘磷脂之外的鞘磷脂、半乳糖腦苷脂、神經(jīng)節(jié)苷酯、腦苷脂、甘油酯、甘油三酯和膽固醇及其衍生物。合成的脂質(zhì)為優(yōu)選的，諸如合成的棕櫚酰鞘磷脂或者n-棕櫚酰-4-羥基二氫鞘氨醇-1-磷酸膽堿(植物鞘磷脂)。上面在段落6.2中描述了其它脂質(zhì)。優(yōu)選地，脂蛋白復(fù)合物包含鞘磷脂。任選地，本公開(kāi)的脂蛋白復(fù)合物可負(fù)載有用于多種治療或者診斷應(yīng)用的疏水性、親脂性或者非極性活性劑，包括但不限于脂肪酸、藥物、核酸、維生素和/或者營(yíng)養(yǎng)素。適當(dāng)?shù)脑噭┤缟厦枋鲇诙温?.2中。所述脂蛋白復(fù)合物可使用本申請(qǐng)所述的任何方法來(lái)制備。優(yōu)選地，所述復(fù)合物如在段落6.5.1-6.5.4中所述的來(lái)制備。本申請(qǐng)所述的荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物中脂質(zhì)部分與蛋白部分的摩爾比可以改變，并且除了其它因素之外，該摩爾比取決于構(gòu)成所述蛋白部分的載脂蛋白的特性、構(gòu)成所述脂質(zhì)部分的荷電磷脂的特性和數(shù)量以及荷電脂蛋白復(fù)合物的期望尺寸。由于認(rèn)為載脂蛋白(諸如apoa-i)的生物活性受構(gòu)成載脂蛋白的兩親性螺旋介導(dǎo)，因此可方便地使用apoa-i蛋白質(zhì)當(dāng)量來(lái)表示脂質(zhì):載脂蛋白摩爾比的載脂蛋白部分。一般公認(rèn)apoa-i含有6-10個(gè)兩親性螺旋，并且其取決于用來(lái)計(jì)算螺旋的方法?？梢詀poa-i當(dāng)量來(lái)表示其它的載脂蛋白，根據(jù)它們含有的兩親性螺旋數(shù)目。例如，可將通常以二硫橋鍵二聚體存在的apoa-im表示為2當(dāng)量的apoa-i，原因是每分子apoa-im含有的兩親性螺旋是每分子apoa-i的兩倍。相反，可將含有一個(gè)兩親性螺旋的肽載脂蛋白表示為1/10-1/6當(dāng)量的apoa-i，原因是其每分子含有的兩親性螺旋是每分子apoa-i的1/10-1/6。一般而言，脂蛋白復(fù)合物(此處定義為“ri”)中脂質(zhì):apoa-i當(dāng)量的摩爾比范圍為約105:1至110:1。在一些實(shí)施方案中，ri約為108:1。對(duì)于磷脂，使用約為650-800的mw可以獲得重量比。在一些實(shí)施方案中，脂質(zhì):apoa-i等價(jià)物的摩爾比(“rsm”)的范圍為約80:1至約110:1，例如約80:1至約100:1。在一個(gè)具體的實(shí)例中，脂蛋白復(fù)合物的rsm可為約82:1?？梢允褂萌魏伪绢I(lǐng)域已知的、可檢測(cè)的標(biāo)記物對(duì)構(gòu)成荷電脂蛋白復(fù)合物的各種載脂蛋白和/或磷脂分子進(jìn)行標(biāo)記，所述標(biāo)記物包括穩(wěn)定的同位素(如，13c、15n、2h等)、放射性同位素(如，14c、3h、125i等)、熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光物或酶標(biāo)記物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述脂蛋白復(fù)合物為荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物，其包含蛋白部分和脂質(zhì)部分，所述蛋白部分優(yōu)選為成熟的全長(zhǎng)apoa-i，且所述脂質(zhì)部分包含中性磷脂、鞘磷脂(sm)和負(fù)電荷磷脂。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，構(gòu)成脂蛋白復(fù)合物的脂質(zhì)部分的sm和負(fù)電荷磷脂的組成以及相對(duì)量影響構(gòu)成所述復(fù)合物的組合物的均質(zhì)性和穩(wěn)定性。如在實(shí)施例章節(jié)所示例說(shuō)明，相比于類(lèi)似的組合物(其中除了sm之外，脂質(zhì)部分包含dppc)而言，脂質(zhì)部分包含sm和負(fù)電荷磷脂的構(gòu)成復(fù)合物的組合物為更均質(zhì)的且更穩(wěn)定的。因此，含有sm和荷負(fù)電的脂質(zhì)的本公開(kāi)的復(fù)合物優(yōu)選在不存在卵磷脂的情況下形成以改善它們的均質(zhì)性和穩(wěn)定性。一旦形成均質(zhì)的含有sm和荷負(fù)電的脂質(zhì)的復(fù)合物，可摻入另外的脂質(zhì)諸如卵磷脂。當(dāng)包括在內(nèi)時(shí)，任選的脂質(zhì)將通常構(gòu)成小于約15％的脂質(zhì)部分，盡管在一些情況下可包括更任選的脂質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，任選的脂質(zhì)為小于約10％、小于約5％或者小于約2％wt％。在一些實(shí)施方案中，荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物的脂質(zhì)部分不包含任選的脂質(zhì)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述磷脂部分含有重量比范圍為90:10至99:1、更優(yōu)選范圍為95:5至98:2例如97:3(sm:負(fù)電荷磷脂)的蛋sm、棕櫚酰sm或者植物sm以及dppg。一些載脂蛋白在體內(nèi)從一種脂蛋白復(fù)合物交換至另一種(對(duì)于載脂蛋白apoa-i而言，這是真實(shí)存在的)。在所述交換的過(guò)程中，所述載脂蛋白通常攜帶一種或者多種磷脂分子。由于這種性質(zhì)，預(yù)期的是，本申請(qǐng)所述的荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物將負(fù)電荷磷脂“接種”于內(nèi)源性hdl，由此將它們轉(zhuǎn)化為對(duì)腎消除更具抗性的α顆粒。因此，預(yù)期的是，給予本申請(qǐng)所述的荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物和組合物將增加hdl的血清水平和/或者改變內(nèi)源性hdl半衰期以及內(nèi)源性hdl代謝作用。預(yù)期的是這將導(dǎo)致膽固醇代謝的改變和逆轉(zhuǎn)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。如在實(shí)施例章節(jié)所示例說(shuō)明，相比于具有其它重量:重量比的類(lèi)似的組合物而言，apoa-i:sm和dppg磷脂的重量比為約1:2.7的構(gòu)成復(fù)合物的組合物為更均質(zhì)的且更穩(wěn)定的。因此，本公開(kāi)提供了脂蛋白組合物，其中所述蛋白:脂質(zhì)重量比針對(duì)均質(zhì)的復(fù)合物群體的形成進(jìn)行優(yōu)化。對(duì)于apoa-i、sm和dppg的復(fù)合物以及具有相似分子量組成的復(fù)合物而言，該重量:重量比的范圍為1:2.6至1:3，且優(yōu)選為1:2.7。在一些具體的實(shí)施方案中，apoa-i蛋白部分與脂質(zhì)部分的比的范圍通常為約1:2.7至約1:3，其中1:2.7是優(yōu)選的。這相應(yīng)于apoa-i蛋白與磷脂的摩爾比為約1:90至1:140。因此，本公開(kāi)提供了復(fù)合物，其中所述蛋白與脂質(zhì)的摩爾比為約1:90至約1:120、約1:100至約1:140或者約1:95至約1:125。具體地在處于該優(yōu)選比時(shí)，所述apoa-i蛋白部分以及sm和dppg脂質(zhì)部分形成基本上均質(zhì)的復(fù)合物，其具有與天然hdl相同的粒度和電荷特征，如經(jīng)柱色譜法和凝膠電泳所分別測(cè)定。荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物粒度可通過(guò)改變r(jià)i來(lái)控制。也就是說(shuō)，ri越小，圓盤(pán)越小。例如，大的盤(pán)狀圓盤(pán)一般具有的ri的范圍為約200:1至100:1，而小的盤(pán)狀圓盤(pán)一般具有的ri的范圍為約100:1至30:1。在一些具體實(shí)施方案中，所述荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物為大的盤(pán)狀圓盤(pán)，其含有2-4個(gè)apoa-i等價(jià)物(例如2-4個(gè)apoa-i分子、1-2個(gè)apoa-im二聚體分子或者12-40個(gè)單螺旋肽分子)、1個(gè)負(fù)電荷磷脂分子和400個(gè)sm分子。在其它具體實(shí)施方案中，所述荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物為小的盤(pán)狀圓盤(pán)，其含有2-4個(gè)apoa-i等價(jià)物；1-10個(gè)、更優(yōu)選3-6個(gè)負(fù)電荷磷脂分子；以及90-225個(gè)、更優(yōu)選100-210個(gè)sm分子。6.3.1.復(fù)合物和粒度的測(cè)量脂蛋白復(fù)合物的組成以及它們的粒度和在制備所述脂蛋白復(fù)合物中所用的脂質(zhì)顆粒的粒度可使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)來(lái)確定。溶液中的脂蛋白復(fù)合物的蛋白和脂質(zhì)濃度可由本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)測(cè)量，包括但不限于蛋白和磷脂測(cè)定、色譜法諸如hplc、凝膠過(guò)濾、gc，所述gc偶聯(lián)有各種檢測(cè)器包括質(zhì)譜檢測(cè)、uv或者二極管陣列、熒光、彈性光散射等。脂質(zhì)和蛋白的完整性也可通過(guò)相同的色譜技術(shù)以及肽作圖、sds-page凝膠電泳、apoa-i的n-和c-末端序列測(cè)定以及用于確定脂質(zhì)氧化的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定來(lái)確定。脂蛋白復(fù)合物以及在制備所述脂蛋白復(fù)合物中所用的脂質(zhì)顆粒的粒度范圍如本申請(qǐng)所述。脂質(zhì)粒度和/或者脂質(zhì)和蛋白復(fù)合物粒度可使用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)確定。示例性方法包括動(dòng)態(tài)光散射和凝膠滲透色譜法。動(dòng)態(tài)光散射(dls)，也稱(chēng)為光子相關(guān)光譜學(xué)，其測(cè)量轟擊在溶液中經(jīng)布朗運(yùn)動(dòng)移動(dòng)的顆粒的光束的波長(zhǎng)位移。具體地，當(dāng)被激光照明時(shí)所述移動(dòng)的顆粒散射光以及所導(dǎo)致的所述散射光的強(qiáng)度波動(dòng)可用于計(jì)算溶液中的球狀粒度分布。參見(jiàn)，zetasizernanoseriesusermanual,man0317issue2.1(july2004)。dls確定了溶液中的顆粒的強(qiáng)度分布以及平均值，基于此，可計(jì)算顆粒體積和數(shù)目分布以及平均值。dls技術(shù)可用于確定用于制備脂蛋白復(fù)合物的脂質(zhì)顆粒的粒度以及脂蛋白復(fù)合物本身的粒度。適當(dāng)?shù)膁ls儀器為zetasizernanobymalverninstruments。凝膠滲透色譜法(gpc)也可用于確定含有蛋白的復(fù)合物的粒度。基于分子大小，凝膠滲透色譜法將混合物中的成分分離。脂質(zhì)-蛋白復(fù)合物的粒度可通過(guò)以下方法來(lái)確定：將復(fù)合物的洗脫特征與已知的標(biāo)準(zhǔn)或者參比樣品的洗脫特征進(jìn)行比較，通常通過(guò)與校正曲線比較。參比樣品為可商購(gòu)得到的且可包括蛋白和非蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，諸如白蛋白、鐵蛋白和維生素b12。currentprotocolsinmolecularbiology(1998),sectioniv,10.9.1-10.9.2。用于制備本公開(kāi)的脂蛋白復(fù)合物的脂質(zhì)顆粒的粒度可為至少45nm、至少50nm、至少55nm、至少60nm，如經(jīng)dls(例如使用基于強(qiáng)度的測(cè)量)測(cè)量。此外，脂質(zhì)顆粒的粒度可為至多65nm、至多70nm、至多80nm、至多90nm、至多100nm、至多120nm、至多150nm、至多200nm、至多250nm、至多300nm或者至多500nm，如經(jīng)dls測(cè)量。本公開(kāi)的脂蛋白復(fù)合物的粒度范圍可為4nm至15nm、6nm至15nm、4nm至12nm、5to12nm、6nm至12nm、8nm至12nm或者8nm至10nm，如經(jīng)本申請(qǐng)所述的技術(shù)測(cè)量。6.4.脂蛋白復(fù)合物群體本公開(kāi)進(jìn)一步提供了本申請(qǐng)所述的脂蛋白復(fù)合物群體。所述群體包含多個(gè)本申請(qǐng)所述的脂蛋白復(fù)合物，其各自包含蛋白部分和脂質(zhì)部分，所述蛋白部分和脂質(zhì)部分例如如本申請(qǐng)段落6.3中所述。申請(qǐng)人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了認(rèn)為單獨(dú)地或者組合地對(duì)于脂蛋白復(fù)合物群體的效能和安全性特征起作用的若干特征。脂蛋白復(fù)合物群體可結(jié)合本申請(qǐng)所述的單獨(dú)的或者組合的任何數(shù)目的特征。首先，認(rèn)為群體中的脂蛋白復(fù)合物的均一性(即群體中的一種或者多種離散的脂蛋白復(fù)合物的普及性，如經(jīng)群體中的脂蛋白復(fù)合物的一個(gè)或者多個(gè)離散的峰所表示)以及成熟的未修飾的載脂蛋白的脂蛋白復(fù)合物的普及性增強(qiáng)了效能。因此，所述脂蛋白復(fù)合物的群體可包含蛋白部分以及脂質(zhì)部分，所述蛋白部分包含載脂蛋白例如apoa-i或者基本上由載脂蛋白例如apoa-i構(gòu)成，且其中所述群體為至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％均質(zhì)的，如經(jīng)凝膠滲透色譜法的單峰中的群體百分?jǐn)?shù)所測(cè)量。在一些實(shí)施方案中，群體中的脂蛋白復(fù)合物的粒度的范圍可為4nm至15nm，例如5nm至12nm、6nm至15nm或者8nm至10nm。群體中的載脂蛋白例如apoa-i可為成熟的優(yōu)選全長(zhǎng)(未截短的)apoa-i，且所述群體可含有至少75wt％、至少80wt％、至少85wt％、至少90wt％、至少95wt％、至少96wt％、至少97wt％、至少98wt％、至少99wt％的成熟的優(yōu)選全長(zhǎng)(未截短的)apoa-i。在一些實(shí)施方案中，所述群體包含不超過(guò)25wt％、不超過(guò)20wt％、不超過(guò)15wt％、不超過(guò)10wt％或者不超過(guò)5wt％的不成熟或者不完全加工的apoa-i和/或者不超過(guò)20wt％、不超過(guò)15wt％、不超過(guò)10wt％或者不超過(guò)5wt％的截短的apoa-i。第二，復(fù)合物中的載脂蛋白和脂質(zhì)的純度以及脂蛋白復(fù)合物中的污染物的相對(duì)缺失，也稱(chēng)為脂蛋白復(fù)合物的純度，被認(rèn)為降低副作用諸如肝酶(例如轉(zhuǎn)氨酶)增加所反映的肝損傷的風(fēng)險(xiǎn)。載脂蛋白的純度可由氧化和/或者脫酰胺作用的相對(duì)缺失來(lái)測(cè)量。因此，在某些實(shí)施方案中，脂蛋白復(fù)合物群體可具有降低量的氧化的載脂蛋白，諸如不超過(guò)20％、不超過(guò)15％、不超過(guò)10％、不超過(guò)5％、不超過(guò)4％、不超過(guò)3％、不超過(guò)2％、不超過(guò)1％的氧化的蛋氨酸，具體為蛋氨酸-112或者蛋氨酸-148，或者不超過(guò)15％、不超過(guò)10％、不超過(guò)5％、不超過(guò)4％、不超過(guò)3％、不超過(guò)2％或者不超過(guò)1％的氧化的色氨酸。脂蛋白復(fù)合物群體也可具有降低的百分比的被脫去酰胺的氨基酸，例如不超過(guò)15％、不超過(guò)10％、不超過(guò)5％、不超過(guò)4％、不超過(guò)3％、不超過(guò)2％或者不超過(guò)1％的脫氨氨基酸。還希望控制脂蛋白復(fù)合物中的脂質(zhì)純度。因此，在一些實(shí)施方案中，所述群體中不超過(guò)5％、不超過(guò)4％、不超過(guò)3％、不超過(guò)2％或者不超過(guò)1％的脂質(zhì)被氧化。復(fù)合物及其群體的純度的另外的測(cè)量為由產(chǎn)生或者純化載脂蛋白的方法或者制備所述脂蛋白復(fù)合物本身的方法所產(chǎn)生的污染物的減少或者缺失。因此，當(dāng)所述載脂蛋白由宿主細(xì)胞例如哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞純化時(shí)，所述脂蛋白復(fù)合物群體優(yōu)選不含宿主細(xì)胞dna或者蛋白。在一些具體的實(shí)施方案中，所述群體含有不超過(guò)500納克、不超過(guò)200納克、不超過(guò)100納克、不超過(guò)50納克或者不超過(guò)20納克的宿主細(xì)胞蛋白/毫克的脂蛋白，和/或者不超過(guò)100皮克、不超過(guò)50皮克、不超過(guò)25皮克、不超過(guò)10皮克或者不超過(guò)5皮克的宿主細(xì)胞dna/毫克的脂蛋白，通常為apoa-i?？僧a(chǎn)生并且應(yīng)避免的其它污染物為內(nèi)毒素以及溶劑和洗滌劑，所述內(nèi)毒素可存在于細(xì)胞培養(yǎng)物和血漿樣品等中，且所述溶劑和洗滌劑可取決于用于制備和/或者純化所述脂蛋白復(fù)合物的方法而存在。脂蛋白復(fù)合物群體可含有至多約1eu、約0.5eu、約0.3eu或者約0.1eu的內(nèi)毒素/毫克的脂蛋白例如apoa-i。脂蛋白復(fù)合物群體也可被限制為含有不超過(guò)200ppm、250ppm、100ppm的非水溶劑。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述群體不含有任何洗滌劑，例如膽酸鹽。此外，使用本申請(qǐng)公開(kāi)的方法，將大多數(shù)載脂蛋白起始物質(zhì)摻入至復(fù)合物中是可能的，從而限制存在于群體中的非復(fù)合的載脂蛋白的量。非復(fù)合的載脂蛋白的量的降低是有益的，這是因?yàn)槠浣档陀捎诒┞吨廉愒葱缘鞍姿鶎?dǎo)致的免疫源應(yīng)答的風(fēng)險(xiǎn)。所述脂蛋白復(fù)合物的群體可具有以下組成：其中至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或者100％的蛋白存在于脂蛋白復(fù)合物(即復(fù)合形式)中。任選地，所述脂蛋白復(fù)合物的群體可具有以下組成：其中至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或者100％的脂質(zhì)存在于脂蛋白復(fù)合物中。任選地，所述群體可包含這樣的復(fù)合物，其中所述脂質(zhì)部分包含占脂質(zhì)重量不超過(guò)15％、不超過(guò)10％、不超過(guò)5％、不超過(guò)4％、不超過(guò)3％、不超過(guò)2％、不超過(guò)1％或者0％的膽固醇。某些脂質(zhì)和蛋白成分可形成多個(gè)不同的但均質(zhì)的脂蛋白復(fù)合物。因此，本公開(kāi)還提供了組合物，其包含兩個(gè)、三個(gè)或者四個(gè)脂蛋白復(fù)合物群體，所述脂蛋白復(fù)合物包含不同量的載脂蛋白分子(例如兩個(gè)、三個(gè)或者四個(gè)apoa-i分子或者apoa-i等價(jià)物)。在示例性實(shí)施方案中，組合物包含兩個(gè)脂蛋白復(fù)合物群體，即分別為包含具有2個(gè)apoa-i分子或者apoa-i等價(jià)物/脂蛋白復(fù)合物的脂蛋白復(fù)合物的第一群體，包含具有3或者4個(gè)apoa-i分子或者apoa-i等價(jià)物/脂蛋白復(fù)合物的脂蛋白復(fù)合物的第二群體，以及任選的包含具有4或者3個(gè)apoa-i分子或者apoa-i等價(jià)物/脂蛋白復(fù)合物的脂蛋白復(fù)合物的第三群體。包含兩個(gè)或者更多個(gè)脂蛋白復(fù)合物群體的組合物優(yōu)選具有低水平的非復(fù)合的脂蛋白和/或者脂質(zhì)。因此，組合物中優(yōu)選不超過(guò)15％、不超過(guò)12％、不超過(guò)10％、不超過(guò)9％、不超過(guò)8％、不超過(guò)7％、不超過(guò)6％、不超過(guò)5％、不超過(guò)4％、不超過(guò)3％、不超過(guò)2％或者不超過(guò)1％的脂質(zhì)為非復(fù)合形式，和/或者組合物中不超過(guò)15％、不超過(guò)12％、不超過(guò)10％、不超過(guò)9％、不超過(guò)8％、不超過(guò)7％、不超過(guò)6％、不超過(guò)5％、不超過(guò)4％、不超過(guò)3％、不超過(guò)2％或者不超過(guò)1％的脂蛋白為非復(fù)合形式。本申請(qǐng)還提供了特別用于商業(yè)應(yīng)用的脂蛋白復(fù)合物或者其群體的大規(guī)模制備，諸如用于治療目的的脂蛋白復(fù)合物的大規(guī)模制備。本申請(qǐng)涵蓋的制劑包括脂蛋白復(fù)合物的群體，例如本申請(qǐng)所述的荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物。本申請(qǐng)?zhí)峁┝酥苿?，其脂蛋白?fù)合物的體積、量和所得濃度適于按照商業(yè)規(guī)模制備組合物例如藥物組合物和劑型。典型的制劑體積的范圍為約5l至約50l，或者更多，例如，約10l至約40l、約15l至約35l、約15l至約30l、約20l至約40l、約20l至約30l、約25l至約45l、約25l至約35l。制劑體積可為約5l、約6l、約7l、約8l、約9l、約10l、約11l、約12l、約13l、約14l、約15l、約16l、約17l、約18l、約19l、約20l、約25l、約30l、約35l、約40l、約45l或者約50l。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述制劑具有約20l的體積。制劑進(jìn)一步含有脂蛋白復(fù)合物或者其群體，其量足以實(shí)現(xiàn)范圍為約5mg/ml至多至約15mg/ml、5mg/ml至約10mg/ml、約10mg/ml至約15mg/ml或者約8mg/ml至約12mg/ml的載脂蛋白的載脂蛋白濃度。取決于制劑的體積，所述量的范圍可為約25g至多至約350g，其表示為在制劑中載脂蛋白例如apoa-i的量。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述制劑含有約8mg/ml的apoa-i。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述制劑具有15l至25l的體積且含有約100g至約250g的apoa-i。在另外的具體實(shí)施方案中，所述制劑具有30l至50l的體積且含有約240g至約780g的apoa-i。6.5.制備脂蛋白復(fù)合物的方法6.5.1.基于熱循環(huán)的制備脂蛋白復(fù)合物的方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，使用本申請(qǐng)所述的蛋白和脂質(zhì)成分的熱循環(huán)的方法可用于產(chǎn)生脂蛋白復(fù)合物且具有優(yōu)于其它方法的優(yōu)勢(shì)。在本申請(qǐng)?zhí)峁┑臒嵫h(huán)方法中，蛋白成分和脂質(zhì)成分經(jīng)歷熱循環(huán)，直到大部分蛋白成分(例如至少60％、至少70％、至少80％或者至少90％)與脂質(zhì)成分復(fù)合，從而形成脂蛋白復(fù)合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，該方法優(yōu)于用于產(chǎn)生脂蛋白復(fù)合物的其它方法的優(yōu)勢(shì)包括：導(dǎo)致基本上均質(zhì)的且純的終產(chǎn)物的高復(fù)合效能，在所得的產(chǎn)物中存在極少的副產(chǎn)物至沒(méi)有副產(chǎn)物(例如非復(fù)合的蛋白)或者制備雜質(zhì)(例如洗滌劑或者表面活性劑、降解蛋白、氧化成分)，從而避免對(duì)于高成本和高消耗的純化步驟的需求。因此，所述方法是有效的且導(dǎo)致起始物質(zhì)極少-至-無(wú)浪費(fèi)。此外，所述方法易于擴(kuò)大規(guī)模且具有低儀器消耗。不使用工業(yè)溶劑而進(jìn)行這些方法的能力使得它們也是環(huán)境友好的。優(yōu)選地，為了使得蛋白和脂質(zhì)成分的氧化最小化，復(fù)合物形成(包括脂質(zhì)成分的均質(zhì)化)的一個(gè)、多于一個(gè)或者所有步驟在惰性氣體(例如氮?dú)狻鍤饣蛘吆?層下進(jìn)行。6.5.2.脂質(zhì)成分本公開(kāi)的熱循環(huán)方法可采用單獨(dú)或者組合的多種脂質(zhì)，包括飽和的、不飽和的、天然的和合成的脂質(zhì)和/或者磷脂，如上在段落6.2中所述?？墒褂卯a(chǎn)生脂質(zhì)顆粒的任何方法制備脂質(zhì)，用于與蛋白成分一起熱循環(huán)，諸如多層脂囊(“mlv”)、小單層脂囊(“suv”)、大單層脂囊(“l(fā)uv”)、膠束、分散體等。用于產(chǎn)生脂質(zhì)顆粒的一系列技術(shù)是已知的。已經(jīng)使用各種規(guī)程產(chǎn)生脂質(zhì)顆粒，形成不同類(lèi)型的脂囊。優(yōu)選的是在本公開(kāi)熱循環(huán)方法中使用的顆粒的粒度范圍主要為45-80nm，最優(yōu)選55nm至75nm。高壓勻漿例如微流化有利地產(chǎn)生具有適當(dāng)粒度的顆粒。所述勻漿壓力優(yōu)選為至少1,000巴、至少1,200巴、至少1,400巴、至少1,600巴、至少1,800巴，且最優(yōu)選至少2,000巴，例如至少2,200巴、至少2,400巴、至少2,600巴、至少2,800巴、至少3,000巴、至少3,200巴、至少3,400巴、至少3,600巴、至少3,800巴或者至少4,000巴。在一些具體的實(shí)施方案中，所述勻漿壓力的范圍為前述數(shù)值的任意一對(duì)之間，例如1,600至3,200巴；1,800至2,800巴；1,900至2,500巴；2,000至2,500巴；2,000至3,000巴；2,400至3,800巴；2,800至3,400巴等。1巴等于100kpa、1,000,000達(dá)因/平方厘米(巴)、0.987atm(大氣壓)、14.5038psi、29.53inhg和750.06托。在一種適當(dāng)?shù)膭驖{方法中，將脂質(zhì)的乳液轉(zhuǎn)移至microfluidizermodel110y(microfluidicsinc,newton,mass.)的填料容器中。將所述單元浸沒(méi)在浴中以在勻漿過(guò)程中保持工藝溫度(例如55℃、58℃、62℃等)，且將其在使用前用惰性氣體諸如氬氣沖洗。啟動(dòng)后，使得所述乳液以連續(xù)的再循環(huán)和跨越相互作用頂部的壓力梯度經(jīng)過(guò)勻漿器，歷時(shí)5-20分鐘。在不存在蛋白成分的情況下所述脂質(zhì)成分的勻漿防止所述蛋白成分被勻漿技術(shù)中使用的高剪切破壞。也可適當(dāng)使用其它方法，條件是可獲得具有適當(dāng)粒度的顆粒。例如，脂質(zhì)通過(guò)含水溶液的水合可導(dǎo)致脂質(zhì)的分散和多層脂囊(“mlv”)的自發(fā)形成。mlv為具有圍繞中心含水核心的多個(gè)脂質(zhì)雙層的顆粒。這些類(lèi)型的顆粒大于小單層脂囊(suv)且直徑可為350-400nm。mlv可通過(guò)以下方法來(lái)制備：將脂質(zhì)在圓底燒瓶中在氯仿中溶解，并蒸發(fā)所述氯仿，直到所述脂質(zhì)在燒瓶壁上形成薄層。加入所述含水溶液并使得所述脂質(zhì)層再水化。在燒瓶旋動(dòng)或者渦旋時(shí)形成脂囊。deameretal.,1983,inliposomes(ostro,ed.),marceldekker,inc.newyork(citingbanghametal.,1965,j.mol.biol.13:238)。該方法也可用于產(chǎn)生單一片狀脂囊。johnsonetal.,1971,biochim.biophys.acta233:820。小單層脂囊(suv)為具有封閉含水核心的單一脂質(zhì)雙層的顆粒。取決于用于產(chǎn)生suv的方法，它們的粒度的直徑范圍為25-110nm。第一suv通過(guò)以下方法制備：將在氯仿中的磷脂制劑在氮?dú)庀赂稍?，加入水層以產(chǎn)生毫摩爾范圍的脂質(zhì)濃度，并在45℃超聲所述溶液至澄清。deameretal.,1983,inliposomes(ostro,ed.),marceldekker,inc.newyork。以該方式制備的suv獲得直徑范圍為25-50nm的顆粒。制備suv的另外的方法為將乙醇/脂質(zhì)溶液快速注射至含水溶液以包囊。deameretal.,1983,inliposomes(ostro,ed.),marceldekker,inc.newyork(citingbatzrietal.,1973,biochim.biophys.acta298:1015)。由該方法產(chǎn)生的suv的粒度的直徑范圍為30-110nm。suv也可通過(guò)以下方法來(lái)制備：使得多層脂囊在20,000psi經(jīng)過(guò)frenchpress達(dá)四次。所產(chǎn)生的suv的粒度的直徑范圍為30-50nm。deameretal.,1983,inliposomes(ostro,ed.),marceldekker,inc.newyork(citingbarenholzetal.,1979,febsletters99:210)。多層和單層磷脂脂囊也可通過(guò)將磷脂的含水制劑在高壓經(jīng)過(guò)小孔膜擠出來(lái)形成(hopeetal.,1996,chemistryandphysicsoflipids,40:89-107)。大單層脂囊與suv類(lèi)似，原因在于它們均為圍繞所述中心含水核心的單一脂質(zhì)雙層，但luv遠(yuǎn)大于suv。取決于它們的組成部分以及用于制備它們的方法，luv的粒度的直徑范圍為50-1000nm。deameretal.,1983,inliposomes(ostro,ed.),marceldekker,inc.newyork。通常使用以下三種方法中的一種來(lái)制備luv：洗滌劑稀釋、反相蒸發(fā)以及輸注。在洗滌劑稀釋技術(shù)中，洗滌劑溶液諸如膽酸鹽、脫氧膽酸鹽、辛基葡糖苷、庚基葡糖苷和tritonx-100用于形成來(lái)自脂質(zhì)制備的膠束。然后將所述溶液透析以除去所述洗滌劑。deameretal.,1983,inliposomes(ostro,ed.),marceldekker,inc.newyork。所述反相蒸發(fā)技術(shù)將脂質(zhì)在含水非極性溶液中溶解，形成倒置的膠束。將所述非極性溶劑蒸發(fā)并將所述膠束凝聚以形成luv。該方法通常需要大量脂質(zhì)。所述輸注方法將溶解在非極性溶液中的脂質(zhì)注射至水溶液中以包囊。當(dāng)所述非極性溶液蒸發(fā)時(shí)，在氣體/液體界面上收集脂質(zhì)。當(dāng)氣體鼓泡經(jīng)過(guò)所述水溶液時(shí)，所述脂質(zhì)片形成luv和少層顆粒。將顆粒濾過(guò)以劃分粒度。deameretal.,1983,inliposomes(ostro,ed.),marceldekker,inc.newyork(citingdeameretal.,1976,biochim.biophys.acta443:629andschierenetal.,1978,biochim.biophys.acta542:137)?？杀碚魉玫闹|(zhì)制劑的等分溶液以證實(shí)所述脂質(zhì)顆粒適用于作為本申請(qǐng)公開(kāi)的熱循環(huán)方法中的脂質(zhì)成分。脂質(zhì)制劑的表征可使用本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)進(jìn)行，包括但不限于尺寸排阻過(guò)濾、凝膠過(guò)濾、柱過(guò)濾、凝膠滲透色譜法以及非變性凝膠電泳。6.5.3.蛋白成分脂蛋白復(fù)合物的蛋白成分并不是本公開(kāi)熱循環(huán)方法成功的關(guān)鍵所在。事實(shí)上，提供治療和/或預(yù)防益處的任何脂質(zhì)-結(jié)合蛋白諸如載脂蛋白和/或其衍生物或類(lèi)似物均可包括在該復(fù)合物中。此外，由于在與脂質(zhì)締合時(shí)可活化lcat或形成盤(pán)狀的顆粒而“模擬”載脂蛋白(諸如apoa-i)活性的任何α螺旋肽或肽類(lèi)似物或任何其它類(lèi)型的分子可包括在脂蛋白復(fù)合物中，并且由此而包括在“脂質(zhì)-結(jié)合蛋白”的定義內(nèi)?？稍跓嵫h(huán)方法中使用的脂質(zhì)-結(jié)合蛋白包括如上在段落6.1中所述的那些。所述脂質(zhì)-結(jié)合蛋白可如上在段落6.1.2中所述重組產(chǎn)生。所述脂質(zhì)-結(jié)合蛋白可通過(guò)本申請(qǐng)所述的任何方法純化，包括如上在段落6.1.3或者段落6.1.4中所述的方法。本領(lǐng)域熟知的是，所述蛋白成分可由動(dòng)物來(lái)源(且具體地來(lái)自人來(lái)源)純化，化學(xué)合成或者重組產(chǎn)生，參見(jiàn)例如chungetal.,1980,j.lipidres.21(3):284-91；cheungetal.,1987,j.lipidres.28(8):913-29。也參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,059,528、5,128,318、6,617,134；美國(guó)公開(kāi)20002/0156007、2004/0067873、2004/0077541和2004/0266660；以及pct公開(kāi)wo/2008/104890和wo/2007/023476。所述蛋白成分可包含脂質(zhì)，其中蛋白/肽與脂質(zhì)的比為在預(yù)期復(fù)合物中的蛋白/肽與脂質(zhì)的比的至少5-倍(例如至少5-倍、至少10-倍或者至少20-倍)。例如，為了產(chǎn)生其中預(yù)期的蛋白與脂質(zhì)比為1:200(基于摩爾濃度)的脂蛋白復(fù)合物，所述蛋白成分中的蛋白可與脂質(zhì)以例如1:10至1:20的比例混合，所述脂質(zhì)通常為僅表示最終復(fù)合物中的脂質(zhì)的少部分的脂質(zhì)。并未暗示任何機(jī)制，當(dāng)預(yù)期的復(fù)合物具有多于一種類(lèi)型的脂質(zhì)時(shí)，所述蛋白與少量的脂質(zhì)的該“前-”復(fù)合是有用的，這允許在由熱循環(huán)產(chǎn)生的脂蛋白復(fù)合物中以少量(例如在預(yù)期的脂蛋白復(fù)合物中，占總脂質(zhì)的重量的10％或者更低、5％或者更低、3％或者更低、2％或者更低或者1％或者更低)存在的脂質(zhì)的更均勻的分布。6.5.4.由熱循環(huán)產(chǎn)生脂蛋白復(fù)合物所述方法通常使得包含脂質(zhì)顆粒和脂質(zhì)結(jié)合蛋白的混懸液在“高”溫度范圍和“低”溫度范圍之間進(jìn)行熱循環(huán)，直到形成脂蛋白復(fù)合物。進(jìn)行熱循環(huán)的混懸液含有脂質(zhì)成分和蛋白成分，其優(yōu)選在高溫度范圍內(nèi)的溫度混合在一起以形成“起始”混懸液，然后使其進(jìn)行熱循環(huán)。起始混懸液中的脂質(zhì)和蛋白的最佳比例可由在待產(chǎn)生的最終脂蛋白復(fù)合物中的成分的預(yù)期化學(xué)計(jì)量來(lái)確定。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，除了其它因素之外，脂質(zhì)部分與蛋白部分的摩爾比將取決于蛋白成分中的蛋白和/或者肽的性質(zhì)、脂質(zhì)部分中的脂質(zhì)的性質(zhì)和量以及脂蛋白復(fù)合物的預(yù)期粒度。脂蛋白復(fù)合物中的適當(dāng)?shù)闹|(zhì)與蛋白比可以使用本領(lǐng)域已知的任何數(shù)目的功能性測(cè)定來(lái)確定，所述功能性測(cè)定包括但不限于凝膠電泳遷移率測(cè)定、尺寸排阻色譜法、與hdl受體的相互作用、經(jīng)由atp-結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子(abca1)的識(shí)別、肝的攝取以及藥物動(dòng)力學(xué)/藥效學(xué)。例如，可以使用凝膠電泳遷移率測(cè)定來(lái)確定復(fù)合物中脂質(zhì)成分與蛋白成分的最佳比例。當(dāng)本公開(kāi)的方法所產(chǎn)生的復(fù)合物荷電(作為在脂質(zhì)成分中包含磷脂的結(jié)果)時(shí)，應(yīng)將所述復(fù)合物設(shè)計(jì)成類(lèi)似于天然前-β-hdl或α-hdl顆粒的電泳遷移率。因此，在一些實(shí)施方案中，可將天然前-β-hdl或α-hdl顆粒用作確定復(fù)合物的遷移率的標(biāo)準(zhǔn)品。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，最終復(fù)合物具有至少一種載脂蛋白或者載脂蛋白模擬物(最優(yōu)選分別為成熟人apoa-i或者apoa-i肽)、至少一種中性脂質(zhì)以及至少一種荷負(fù)電的脂質(zhì)，諸如在pctwo2006/100567中所述的那些，將其內(nèi)容通過(guò)引用的方式并入本申請(qǐng)。由于認(rèn)為載脂蛋白(諸如apoa-i)的生物活性受構(gòu)成載脂蛋白的兩親性螺旋介導(dǎo)，因此可方便地使用apoa-i蛋白當(dāng)量來(lái)表示脂質(zhì):載脂蛋白摩爾比的載脂蛋白部分。一般公認(rèn)apoa-i含有6-10個(gè)兩親性螺旋，并且其取決于用來(lái)計(jì)算螺旋的方法。根據(jù)載脂蛋白含有的兩親性螺旋數(shù)目，可以apoa-i當(dāng)量來(lái)表示其它的載脂蛋白。例如，通常以二硫橋鍵二聚體存在的apoa-im可表示為2當(dāng)量的apoa-i，原因是每分子apoa-im含有的兩親性螺旋是每分子apoa-i的兩倍。相反，含有一個(gè)兩親性螺旋的肽載脂蛋白可以表示為1/10-1/6當(dāng)量的apoa-i，原因是其每分子含有的兩親性螺旋是每分子apoa-i的1/10-1/6。一般而言，脂蛋白復(fù)合物的脂質(zhì):apoa-i當(dāng)量摩爾比(本申請(qǐng)定義為“ri”)的范圍為約2:1至200:1。在一些實(shí)施方案中，所述ri為約50:1至150:1，或者75:1至125:1、10:1至175:1。對(duì)于磷脂，可使用約650-800的mw獲得重量比。在某些實(shí)施方案中，所述成分的摩爾比為2-6(荷負(fù)電的脂質(zhì)，例如dppg):90-120(中性脂質(zhì)，例如sm):1(apoa-i等價(jià)物)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，如在實(shí)施例1中所述，所述復(fù)合物包含以約108:1的脂質(zhì)與蛋白摩爾比的dppg、sm和apoa-i，其中dppg表示3wt％(+/-1％)的總脂質(zhì)且sm表示97wt％(+/-5％)的脂質(zhì)。在開(kāi)始熱循環(huán)之前，起始混懸液中的脂質(zhì)和蛋白成分的濃度的范圍可為1至30mg/ml濃度的apoa-i等價(jià)物以及1至100mg/ml濃度的脂質(zhì)。在一些具體的實(shí)施方案中，蛋白成分的濃度選自1至30mg/ml、2至20mg/ml、5至20mg/ml、2至10mg/ml、5至15mg/ml、5至20mg/ml和10至20mg/ml，且脂質(zhì)成分的濃度獨(dú)立選自10至100mg/ml、10至75mg/ml、25至50mg/ml、10至75mg/ml、25至100mg/ml、25至75mg/ml和1至75mg/ml。熱循環(huán)方法的高和低溫度范圍是基于脂蛋白復(fù)合物的脂質(zhì)和蛋白成分的相轉(zhuǎn)變溫度?？蛇x擇地，當(dāng)脂質(zhì)成分不顯示限定的或者離散的相轉(zhuǎn)變時(shí)，如可在使用具有不飽和脂肪酸鏈的磷脂或者磷脂混合物時(shí)所發(fā)生，熱循環(huán)的高和低度范圍的差異在于至少約20℃，至多至約40℃或者更大。例如，在一些實(shí)施方案中，所述高和低度范圍的差異為20℃-30℃、20℃-40℃、20℃-50℃、30℃-40℃、30℃-50℃、25℃-45℃、35℃-55℃。對(duì)于脂質(zhì)，相轉(zhuǎn)變包括由緊密填充的有序結(jié)構(gòu)(已知為凝膠狀態(tài))向疏松填充的較無(wú)序結(jié)構(gòu)(已知為流體狀態(tài))的變化。脂蛋白復(fù)合物通常在本領(lǐng)域中通過(guò)以下方法形成：將脂質(zhì)顆粒和載脂蛋白在接近使用的具體脂質(zhì)或者脂質(zhì)混合物的轉(zhuǎn)變溫度的溫度孵育。脂質(zhì)成分的相轉(zhuǎn)變溫度(其可由量熱法確定)+/-5℃-10℃表示在本公開(kāi)的方法中的“低”溫度范圍。對(duì)于蛋白，相轉(zhuǎn)變溫度包括由折疊的三維結(jié)構(gòu)向二維結(jié)構(gòu)的變化。對(duì)于脂質(zhì)，相轉(zhuǎn)變包括由緊密填充的有序結(jié)構(gòu)(已知為凝膠狀態(tài))向疏松填充的較無(wú)序結(jié)構(gòu)(已知為流體狀態(tài))的變化。脂蛋白復(fù)合物通常在本領(lǐng)域中通過(guò)以下方法形成：將脂質(zhì)顆粒和載脂蛋白在接近使用的具體脂質(zhì)或者脂質(zhì)混合物的轉(zhuǎn)變溫度的溫度孵育。脂質(zhì)成分的相轉(zhuǎn)變溫度(其可由量熱法確定)+/-12℃、更優(yōu)選+/-10℃表示在本公開(kāi)的方法中的“低”溫度范圍。在某些實(shí)施方案中，所述低溫度范圍為脂質(zhì)成分的相轉(zhuǎn)變溫度+/-3℃、+/-5℃或者+/-8℃。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述低溫度范圍為所述脂質(zhì)成分的相轉(zhuǎn)變溫度的不小于-5℃或者不小于-10℃至所述脂質(zhì)成分的相轉(zhuǎn)變溫度的+5℃。對(duì)于蛋白，相轉(zhuǎn)變溫度包括由三級(jí)結(jié)構(gòu)向二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。蛋白成分的相轉(zhuǎn)變溫度+/-12℃、更優(yōu)選+/-10℃表示在本公開(kāi)的方法中的“高”溫度范圍。在一些具體的實(shí)施方案中，所述高溫度范圍為蛋白成分的相轉(zhuǎn)變溫度+/-3℃、+/-5℃或者+/-8℃。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述低溫度范圍為低于所述蛋白成分的相轉(zhuǎn)變溫度達(dá)10℃至高于所述蛋白成分的相轉(zhuǎn)變溫度達(dá)不超過(guò)5℃、不超過(guò)10℃或者不超過(guò)15℃。使得起始混懸液在高溫度和低溫度之間、優(yōu)選起始于高溫度來(lái)進(jìn)行熱循環(huán)，直到將起始混懸液中至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％的蛋白摻入至脂蛋白復(fù)合物中。使用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)計(jì)量的脂質(zhì)和蛋白成分，可在若干循環(huán)之后實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)和蛋白成分的基本上完全復(fù)合。循環(huán)的次數(shù)取決于蛋白和脂質(zhì)成分、循環(huán)的持續(xù)時(shí)間，但通常基本上完全復(fù)合將需要5次或者更多次循環(huán)、10次或者更多次循環(huán)或者15次或者更多次循環(huán)(在高和低溫度)。所述循環(huán)的范圍通常為2分鐘至60分鐘。在一些具體的實(shí)施方案中，在每個(gè)溫度，所述循環(huán)的范圍為5至30分鐘、10至20分鐘、5至20分鐘、2至45分鐘或者5至45分鐘。由所述方法產(chǎn)生的復(fù)合物通常為超分子集合物，其形態(tài)為膠束、脂囊、球狀或者盤(pán)狀顆粒且具有均勻的粒度分布，其中所述蛋白成分以所述磷脂和蛋白之間的具體化學(xué)計(jì)量范圍物理結(jié)合至所述磷脂。本方法有利地導(dǎo)致起始混懸液中的脂質(zhì)和/或者蛋白的基本上完全復(fù)合，產(chǎn)生基本上不含脂質(zhì)和/或者不含蛋白的組合物，如經(jīng)分離方法諸如色譜法所觀察。因此，本公開(kāi)的方法可在不存在純化步驟的情況下進(jìn)行。本公開(kāi)的方法有利地產(chǎn)生粒度分布均勻的復(fù)合物，這避免了對(duì)于粒度分級(jí)的需求。在本公開(kāi)的一些實(shí)施方案中，所述脂蛋白復(fù)合物將含有多于一種類(lèi)型的脂質(zhì)，包含相對(duì)少量(例如小于10％、小于5％、小于3％或者小于1％的脂質(zhì)成分)的一種或者多種脂質(zhì)。為了優(yōu)化分散，以少量使用的脂質(zhì)可預(yù)先與蛋白成分共混，而不是摻入至脂質(zhì)成分中的脂質(zhì)顆粒?？蓪?duì)所得的脂蛋白復(fù)合物的等分溶液進(jìn)行表征以證實(shí)所述復(fù)合物具有預(yù)期的特征，例如所述蛋白成分基本上完全的(例如>90％、>95％、>97％或者>98％)摻入至所述脂質(zhì)成分中。復(fù)合物的表征可使用本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)進(jìn)行，包括但不限于尺寸排阻過(guò)濾、凝膠過(guò)濾、柱過(guò)濾、凝膠滲透色譜法以及非變性凝膠電泳。本申請(qǐng)所述的脂蛋白復(fù)合物或者組合物的均質(zhì)性和/或者穩(wěn)定性可由本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)測(cè)量，所述方法包括但不限于色譜方法諸如凝膠過(guò)濾色譜法。例如，在一些實(shí)施方案中，單峰或者有限數(shù)目的峰可與穩(wěn)定的復(fù)合物相關(guān)。所述復(fù)合物的穩(wěn)定性可通過(guò)監(jiān)測(cè)隨時(shí)間推移新的峰的出現(xiàn)來(lái)確定。新的峰的出現(xiàn)為由于顆粒的不穩(wěn)定性所導(dǎo)致的復(fù)合物的重組的征象。優(yōu)選地，為了使得蛋白和脂質(zhì)成分的氧化最小化，所述熱循環(huán)在惰性氣體層(例如氮?dú)?、氬氣或者氦?下進(jìn)行。6.5.5.制備脂蛋白復(fù)合物的其它方法可以將本申請(qǐng)所述的脂蛋白復(fù)合物(包括荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物)制備成多種形式，其包括但不限于囊泡、脂質(zhì)體、脂蛋白體、膠束和盤(pán)狀的顆粒。除了如上所述的熱循環(huán)方法之外，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種方法來(lái)制備所述脂蛋白復(fù)合物?？梢允褂么罅靠捎糜谥苽渲|(zhì)體或脂蛋白體的技術(shù)。例如，載脂蛋白可以與合適的磷脂一起超聲(使用超聲浴或探針超聲波儀)以形成復(fù)合物?？蛇x擇地，載脂蛋白例如apoa-i可以與預(yù)成型的脂質(zhì)囊泡組合以便自發(fā)形成脂蛋白復(fù)合物。還可以通過(guò)洗滌劑透析法或通過(guò)使用擠出裝置或通過(guò)均化作用來(lái)形成荷電的脂蛋白復(fù)合物，所述洗滌劑透析法例如將載脂蛋白、荷電的磷脂和sm以及諸如膽酸鹽的洗滌劑的混合物進(jìn)行透析，以除去洗滌劑并重構(gòu)形成荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物(參見(jiàn)，例如jonasetal.,1986,methodsinenzymol.128:553-82)。在一些實(shí)施方案中，復(fù)合物通過(guò)使用高壓(例如約32000p.s.i.)進(jìn)行均化達(dá)約40、約50或者約60分鐘來(lái)制備。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，包含apoa-i、sn和dppg的復(fù)合物如下制備。將apoa-i溶解于磷酸鹽緩沖劑中，并在50℃與dppg在磷酸鹽緩沖劑中的分散液(使用高剪切混合器制備)一起孵育。然后將所述apoa-i/dppg混合物與sm的分散液混合，并在高于30,000p.s.i.的壓力在30-50℃均化，直到復(fù)合物形成基本上完成，如經(jīng)動(dòng)態(tài)光散射或者凝膠滲透色譜法監(jiān)測(cè)。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)美國(guó)公開(kāi)2004/0067873的實(shí)施例1中描述的膽酸鹽分散法來(lái)制備脂蛋白復(fù)合物，將其內(nèi)容通過(guò)引用的方式并入本申請(qǐng)。簡(jiǎn)要地，將干燥的脂質(zhì)在nahco3緩沖液中進(jìn)行水合，然后進(jìn)行渦旋和超聲直至所有脂質(zhì)分散。加入膽酸鹽溶液，并將該混合物孵育30分鐘，同時(shí)周期性進(jìn)行渦旋和超聲，直至該混合物變澄清，此時(shí)表明形成了脂質(zhì)膽酸鹽膠束。加入原apoa-i的nahco3緩沖液，并將該溶液在約37℃-50℃孵育1小時(shí)。可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法除去膽酸鹽。例如，可以通過(guò)透析、超濾而除去膽酸鹽，或者通過(guò)吸附吸收至親合珠(affinitybead)或樹(shù)脂而除去膽酸鹽分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，將親合珠，如bio-(bio-rad實(shí)驗(yàn)室)加于荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物與膽酸鹽的制劑以吸附膽酸鹽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將該制劑，比如脂蛋白復(fù)合物與膽酸鹽的膠束制劑通過(guò)填裝有親合珠的柱子。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，通過(guò)將該制劑裝載于注射器內(nèi)的bio-上而由脂蛋白復(fù)合物制劑除去膽酸鹽。然后使用隔膜密封該注射器并于4℃搖擺孵育過(guò)夜。使用前，通過(guò)將該溶液注射通過(guò)bio-而除去膽酸鹽，膽酸鹽在bio-中被所述珠吸附。當(dāng)具有類(lèi)似于hdl，特別是類(lèi)似于前-β-1或前-β-2hdl群中的hdl的尺寸與密度時(shí)，本申請(qǐng)所述的脂蛋白復(fù)合物諸如荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物預(yù)期具有延長(zhǎng)的循環(huán)半衰期?？梢酝ㄟ^(guò)冷凍干燥來(lái)制備具有較長(zhǎng)有效期的穩(wěn)定制劑。在一些實(shí)施方案中，使用通常為本領(lǐng)域已知的共冷凍干燥法來(lái)制備apoa-i-脂質(zhì)復(fù)合物。簡(jiǎn)要地，共冷凍干燥步驟包括將apoa-i和脂質(zhì)的混合物一起溶解于有機(jī)溶劑或溶劑混合物中，或者將apoa-i和脂質(zhì)單獨(dú)溶解后再把它們混合到一起。用于共冷凍干燥的溶劑或溶劑混合物的期望特征包括：(i)能夠溶解疏水性脂質(zhì)和兩性蛋白質(zhì)的介質(zhì)相對(duì)極性，(ii)溶劑應(yīng)屬于根據(jù)fda溶劑指導(dǎo)原則(聯(lián)邦公報(bào)，第247號(hào)，62卷)的2或3類(lèi)溶劑，以避免與殘留的有機(jī)溶劑相關(guān)的潛在毒性，(iii)具有較低的沸點(diǎn)以確保冷凍干燥過(guò)程中更易除去溶劑，(iv)具有較高的熔點(diǎn)以便提供更快速的冷凍、更高的冷凝溫度，以及由此更少的冷凍干燥器損耗。在一些實(shí)施方案中，使用了冰醋酸。還可以使用如甲醇、冰醋酸、二甲苯或環(huán)己烷的組合。然后將apoa-i-脂質(zhì)溶液進(jìn)行冷凍干燥以獲得均質(zhì)的粉末?？梢詫?duì)冷凍干燥的條件進(jìn)行優(yōu)化以獲得溶劑的快速蒸發(fā)，并使冷凍干燥的載脂蛋白-脂質(zhì)粉末中殘留溶劑的量達(dá)到最少。冷凍干燥條件的選擇可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定，并且其取決于溶劑的特性、容器的類(lèi)型和尺寸、容納的溶液、填裝體積以及使用的冷凍干燥機(jī)的性能。所述冷凍干燥的脂蛋白復(fù)合物可用于制備用于藥物再配制的散裝供應(yīng)品(bulksupplies)，或者制備可以重構(gòu)以獲得脂蛋白復(fù)合物的溶液或者混懸液的單獨(dú)等分部分或劑量單位。對(duì)于重構(gòu)，使用水溶液將冷凍干燥的粉末再水化為適當(dāng)?shù)捏w積(例如5mg多肽/ml，其便于靜脈內(nèi)注射)。在一些實(shí)施方案中，使用磷酸鹽緩沖鹽水或者生理鹽水溶液將冷凍干燥的粉末再水化。可將所述混合物振搖或者渦旋以便于再水化。重構(gòu)步驟可在等于或者大于復(fù)合物的脂質(zhì)成分的相轉(zhuǎn)變溫度的溫度進(jìn)行。在冷凍干燥的載脂蛋白-脂質(zhì)粉末與具有合適ph和滲透壓的水性介質(zhì)進(jìn)行水合后可自發(fā)形成apoa-i-脂質(zhì)復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，該水合介質(zhì)含有穩(wěn)定劑，選自但不限于蔗糖、海藻糖和甘油。在一些實(shí)施方案中，為了形成復(fù)合物，將該溶液加熱超過(guò)脂質(zhì)的轉(zhuǎn)變溫度幾次。脂質(zhì)與蛋白的比可為1:1至200:1(摩爾/摩爾)，且優(yōu)選3:1至2:1的脂質(zhì):蛋白(w/w)，更優(yōu)選2.7:1至2.1:1的脂質(zhì):蛋白(w/w)，例如7:1的脂質(zhì):蛋白(w/w)。將粉末進(jìn)行水合以獲得最終的復(fù)合物濃度，其以蛋白當(dāng)量表示為約5-30mg/ml。在多個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)將多肽溶液的nh4co3水溶液進(jìn)行冷凍干燥而獲得apoa-i粉末。然后apoa-i與脂質(zhì)(例如鞘磷脂)的均勻溶液通過(guò)以下方法形成：將脂質(zhì)粉末與apoa-i粉末溶解于冰醋酸中。然后將該溶液進(jìn)行凍干，并通過(guò)使所得的粉末與水性介質(zhì)水合而形成類(lèi)似于hdl的載脂蛋白-脂質(zhì)復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，可以通過(guò)將磷脂與蛋白溶液或混懸液進(jìn)行共冷凍干燥而形成apoa-i-脂質(zhì)復(fù)合物?？梢詫poa-i和脂質(zhì)(例如磷脂)于有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑混合物中的均勻溶液進(jìn)行凍干，并且可以通過(guò)使凍干的粉末與水性緩沖液水合而自發(fā)形成apoa-i-脂質(zhì)復(fù)合物。用于該方法的有機(jī)溶劑和溶劑混合物的實(shí)例包括但不限于乙酸、乙酸/二甲苯混合物、乙酸/環(huán)己烷混合物以及甲醇/二甲苯混合物?？蓪?duì)所得的重構(gòu)制劑的等分溶液進(jìn)行表征以證實(shí)所述復(fù)合物具有預(yù)期的粒度分布；例如，hdl的粒度分布。用于表征所述粒度的示例性方法為凝膠過(guò)濾色譜法。具有已知分子量和斯托克斯直徑的一系列蛋白以及人hdl可用作用于定標(biāo)所述柱的標(biāo)準(zhǔn)物。在其它實(shí)施方案中，重組apoa-i-脂質(zhì)復(fù)合物通過(guò)將apoa-i與脂質(zhì)復(fù)合來(lái)制備，如在美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)2006/0217312和國(guó)際公開(kāi)wo2006/100567(pct/ib2006/000635)所披露，將其內(nèi)容通過(guò)引用方式并入本申請(qǐng)。美國(guó)專(zhuān)利6,004,925、6,037,323、6,046,166和6,287,590(將其內(nèi)容通過(guò)引用方式并入本申請(qǐng))公開(kāi)了一種用于制備具有類(lèi)似于hdl性質(zhì)的荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物的簡(jiǎn)單方法。這種方法包括載脂蛋白與脂質(zhì)溶液在有機(jī)溶劑(或溶劑混合物)中的共冷凍干燥以及冷凍干燥的粉末在水合過(guò)程中形成荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物，且該方法具有以下優(yōu)勢(shì)：(1)該方法需要很少的步驟；(2)該方法使用價(jià)格低廉的溶劑；(3)所包括的成分中的大部分或全部均被用來(lái)形成設(shè)計(jì)的復(fù)合物，因而避免了對(duì)于其它方法而言常見(jiàn)的起始材料的浪費(fèi)；(4)形成了貯存期間很穩(wěn)定的凍干復(fù)合物，因而使所得的復(fù)合物可以在即將使用前進(jìn)行重構(gòu)；(5)所得的復(fù)合物在形成后以及在使用前通常不必進(jìn)行進(jìn)一步的純化；(6)避免了毒性化合物，包括諸如膽酸鹽的洗滌劑；和(7)該制造方法易于工業(yè)化并且適用于gmp生產(chǎn)(即，在無(wú)內(nèi)毒素的環(huán)境中)。其它適當(dāng)?shù)姆椒枋鲇诿绹?guó)公開(kāi)的申請(qǐng)2006/0217312和國(guó)際公開(kāi)wo2006/100567(pct/ib2006/000635)，將其各自的內(nèi)容通過(guò)引用的方式并入本申請(qǐng)。優(yōu)選地，為了使得蛋白和脂質(zhì)成分的氧化最小化，復(fù)合物形成的一個(gè)、多于一個(gè)或者所有步驟在惰性氣體(例如氮?dú)?、氬氣或者氦?層下進(jìn)行?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)測(cè)量載脂蛋白-脂質(zhì)顆粒溶液中的蛋白與脂質(zhì)濃度，所述方法包括但不限于蛋白與磷脂測(cè)定以及色譜法，諸如hplc、凝膠過(guò)濾、與各種檢測(cè)器連接的gc，而所述檢測(cè)器包括質(zhì)譜、uv或二極管陣列、熒光、彈性光散射及其它。還可以通過(guò)相同的色譜技術(shù)以及肽作圖、sds-page凝膠電泳、n-和c-末端的apoa-i序列測(cè)定以及用于確定脂質(zhì)氧化的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定來(lái)確定脂質(zhì)與蛋白的完整性。6.6.藥物組合物本公開(kāi)所涵蓋的藥物組合物包括作為活性成分的荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物，該復(fù)合物包含在藥用的、適用于體內(nèi)給藥和遞送的載體中。由于肽可以包含酸性和/或堿性的端鏈和/或側(cè)鏈，因此肽模擬的載脂蛋白可以游離酸或堿的形式、或者以藥用鹽形式包括在該組合物中。還可以使用改性的蛋白，如酰胺化、?；⒁阴；蚓垡叶蓟牡鞍?。任選地，所述藥物組合物可包含加載有一種或者多種疏水性、親脂性或者非極性活性劑的脂蛋白復(fù)合物，如上在段落6.2和6.3中所述?？勺⑸涞慕M合物包括活性成分在水性或油性媒介物中的無(wú)菌混懸液、溶液或乳劑。該組合物還可包含多種配方成分，如助懸劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。在一些實(shí)施方案中，可注射的組合物包含在磷酸鹽緩沖鹽水(10mm磷酸鈉，80mg/ml蔗糖，ph8.2)中的荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物。用于注射的組合物可以單位劑量形式存在，如，在安瓿中或在多劑量的容器中，并且可包括添加的防腐劑。對(duì)于輸注，組合物可在輸液袋中進(jìn)行供應(yīng)，該輸液袋由與荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物相容的材料制成，如乙烯乙酸乙烯酯或本領(lǐng)域已知的任何其它相容的材料。適當(dāng)?shù)膭┬桶罱K濃度為約5mg/ml至約15mg/ml的脂蛋白的荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述劑型包含最終濃度為約8mg/ml至約10mg/ml的載脂蛋白a-i、優(yōu)選約8mg/ml的荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物。優(yōu)選地，為了使得蛋白和脂質(zhì)成分的氧化最小化，所述藥物組合物在惰性氣體(例如氮?dú)?、氬氣或者氦?層下配制和/或者填充。6.7.治療方法事實(shí)上，本申請(qǐng)所述的脂蛋白復(fù)合物例如荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物和組合物可以用于脂蛋白復(fù)合物的各種顯示為有用的目的。脂蛋白復(fù)合物諸如荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物有效地動(dòng)員膽固醇，甚至在以顯著低于目前可用的治療方案所需的載脂蛋白的量的劑量給藥(每2-5天給予20mg/kg至100mg/kg，1.4g至8g/平均身高的人類(lèi))時(shí)。因此，本公開(kāi)的復(fù)合物和組合物特別用于治療或者預(yù)防心血管疾病、障礙和/或者相關(guān)病癥。治療或者預(yù)防受試者中的心血管疾病、障礙和/或者相關(guān)病癥的方法通常包括向所述受試者給予低(<15mg/kg)劑量或者量的本申請(qǐng)所述的脂蛋白復(fù)合物或者藥物組合物，其根據(jù)有效治療或者預(yù)防具體適應(yīng)癥的治療方案。以足以或者有效提供治療益處的量給予脂蛋白復(fù)合物。在治療心血管疾病、障礙和/或者相關(guān)病癥的情境下，可推斷出治療益處，條件是出現(xiàn)以下的一種或者多種：相比于基線而言膽固醇動(dòng)員的增加、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊體積的降低、相比于基線水平而言游離膽固醇的高密度脂蛋白(hdl)部分的增加，而沒(méi)有平均血漿甘油三酯濃度的增加或者肝轉(zhuǎn)氨酶(或者丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)水平的正常范圍之上的增加。盡管希望完全治愈，但是完全治愈不是存在治療益處所必需。在一些實(shí)施方案中，所述脂蛋白復(fù)合物以每次注射約2mg/kgapoa-i等價(jià)物至約12mg/kgapoa-i等價(jià)物的劑量給予。在一些實(shí)施方案中，所述脂蛋白復(fù)合物以約3mg/kgapoa-i等價(jià)物的劑量給予。在一些實(shí)施方案中，所述脂蛋白復(fù)合物以約6mg/kgapoa-i等價(jià)物的劑量給予。在一些實(shí)施方案中，所述脂蛋白復(fù)合物以約12mg/kgapoa-i等價(jià)物的劑量給予。待治療的受試者為患有心血管疾病、障礙和/或者相關(guān)病癥的個(gè)體?？墒褂帽旧暾?qǐng)所述的脂蛋白復(fù)合物和組合物治療或者預(yù)防的所述心血管疾病、障礙和/或者相關(guān)病癥的非限制性實(shí)例包括外周血管性疾病、再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化以及動(dòng)脈粥樣硬化的眾多臨床表現(xiàn)諸如中風(fēng)、缺血性中風(fēng)、短暫性缺血發(fā)作、心肌梗塞、急性冠脈綜合征、心絞痛、間歇性跛行、嚴(yán)重肢體缺血、心瓣狹窄和房脈瓣硬化。受試者可為具有急性冠脈綜合征諸如心肌梗塞(具有或者不具有st升高)或者不穩(wěn)定心絞痛的先前發(fā)病的個(gè)體。所治療的受試者可為任意動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物，具體為人類(lèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法涵蓋治療或者預(yù)防心血管疾病的方法，包括以在給予后不改變患者的基線apoa-i的量向受試者給予本申請(qǐng)所述的荷電的脂蛋白復(fù)合物或者組合物。在其它實(shí)施方案中，所述方法涵蓋治療或者預(yù)防心血管疾病的方法，包括向受試者給予有效量的本申請(qǐng)所述的脂蛋白復(fù)合物(例如荷電的復(fù)合物)或者組合物，以便在給藥約2小時(shí)后，獲得比給藥前基線(最初的)濃度高出約5mg/dl至100mg/dl的游離或復(fù)合的載脂蛋白血清濃度，和/或者在給藥后約24小時(shí)后，獲得比給藥前基線(最初的)濃度高出約5mg/dl至20mg/dl的游離或復(fù)合的載脂蛋白血清濃度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括治療或預(yù)防心血管疾病的方法，其包括向受試者給予本申請(qǐng)所述的、有效量的脂蛋白復(fù)合物(例如荷電的復(fù)合物)或者組合物，以便在給藥后至少一天內(nèi)，獲得比給藥前最初的hdl-膽固醇成分高至少約10％的hdl-膽固醇成分的循環(huán)血漿濃度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括治療或預(yù)防心血管疾病的方法，其包括向受試者給予本申請(qǐng)所述的、有效量的脂蛋白復(fù)合物(例如荷電的復(fù)合物)或者組合物，以便在給藥后的5分鐘到1天之間，獲得30至300mg/dl的hdl-膽固醇成分的循環(huán)血漿濃度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括治療或預(yù)防心血管疾病的方法，其包括向受試者給予本申請(qǐng)所述的、有效量的脂蛋白復(fù)合物(例如荷電的復(fù)合物)或者組合物，以便在給藥后的5分鐘到1天之間，獲得30至300mg/dl的膽固醇酯的循環(huán)血漿濃度。在另外的實(shí)施方案中，該方法包括治療或預(yù)防心血管疾病的方法，其包括向受試者給予本申請(qǐng)所述的、有效量的脂蛋白復(fù)合物(例如荷電的復(fù)合物)或者組合物，以便在給藥后至少一天內(nèi)，獲得比給藥前的基線(最初的)濃度高至少約10％的增加的糞便膽固醇分泌。本申請(qǐng)所述的脂蛋白復(fù)合物(包括荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物)或者組合物可以單獨(dú)使用或與用于治療或預(yù)防前述病癥的其它藥物進(jìn)行聯(lián)合治療。這樣的治療包括但不限于所包括藥物的同時(shí)或依序給藥。例如，在高膽固醇血癥諸如家族性高膽固醇血癥(純合或者雜合)或動(dòng)脈粥樣硬化的治療中，荷電的脂蛋白制劑可以與目前使用的任何一種或多種降低膽固醇的療法一起施用；如膽汁酸樹(shù)脂、煙酸、他汀類(lèi)藥物、膽固醇吸收抑制劑和/或貝特類(lèi)藥物。由于在膽固醇的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)中，每種藥物作用于不同的靶點(diǎn)，因而使得這樣的聯(lián)合方案可以產(chǎn)生特別有益的療效，即，膽汁酸樹(shù)脂影響膽固醇的再循環(huán)、乳糜微粒和ldl群；煙酸主要影響vldl和ldl群；他汀類(lèi)藥物抑制膽固醇的合成，減少ldl群(并且也許增加ldl受體的表達(dá))；而本申請(qǐng)所述的脂蛋白復(fù)合物(包括荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物)影響rct，增加hdl并促進(jìn)膽固醇外流。在另外的實(shí)施方案中，本申請(qǐng)所述的脂蛋白復(fù)合物(包括荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物)或者組合物可以結(jié)合貝特類(lèi)藥物使用以治療或預(yù)防冠心病、冠狀動(dòng)脈疾病、心血管疾病、再狹窄、血管或外周血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化(包括治療和預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化)；如下描述了示例性制劑和治療方案。本申請(qǐng)所述的脂蛋白復(fù)合物(包括荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物)或者組合物可以以增加小hdl成分的劑量給藥，所述小hdl成分例如前-β、前-γ和前-β?tīng)頷dl成分、αhdl成分、hdl3和/或hdl2成分。在一些實(shí)施方案中，該劑量可有效地實(shí)現(xiàn)如經(jīng)由顯像技術(shù)所測(cè)量的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的減少，所述顯像技術(shù)如磁共振成像(mri)或血管內(nèi)超聲(ivus)。ivus追蹤的參數(shù)包括但不限于粥樣斑體積由基線改變的百分比以及粥樣斑總體積的改變。mri追蹤的參數(shù)包括但不限于ivus的那些參數(shù)以及斑塊的脂質(zhì)組成和鈣化?？梢栽谧詈蟮妮斪⒔Y(jié)束時(shí)，或在最后的輸注后數(shù)周內(nèi)，或在開(kāi)始治療后的3個(gè)月、6個(gè)月或1年內(nèi)使用患者作為自身對(duì)照來(lái)測(cè)量斑塊的消退(時(shí)間0比時(shí)間t)。通過(guò)腸胃外的給藥途徑可實(shí)現(xiàn)最佳的給藥，其包括靜脈內(nèi)注射(iv)、肌內(nèi)注射(im)、皮內(nèi)注射、皮下注射(sc)以及腹膜內(nèi)注射(ip)。在某些實(shí)施方案中，經(jīng)由注樣器、吸入器或?qū)Ч苓M(jìn)行給藥。在一些實(shí)施方案中，該脂蛋白復(fù)合物例如荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物以獲得與通過(guò)腸胃外給藥獲得的循環(huán)血清濃度相等的循環(huán)血清濃度的量，通過(guò)注射、皮下植入泵或貯庫(kù)制品進(jìn)行給藥。例如，該復(fù)合物還可吸收在支架或其它的裝置中?？梢酝ㄟ^(guò)多種不同的治療方案來(lái)實(shí)現(xiàn)給藥。例如，可以在一天內(nèi)定期地給藥幾次靜脈內(nèi)注射，其中累積的注射總體積不能達(dá)到每日毒性劑量。所述方法包括以6、7、8、9、10、11或者12天的間隔給藥脂蛋白復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，所述脂蛋白復(fù)合物以一周的間隔給藥。所述方法可進(jìn)一步包括以如上所述的任何間隔給予所述脂蛋白復(fù)合物4、5、6、7、8、9、10、11或者12次。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，給予脂蛋白復(fù)合物六次，在每次給藥之間的間隔為1周。在一些實(shí)施方案中，給藥可如下完成：給予一系列注射，然后停止注射達(dá)6個(gè)月至1年，然后再開(kāi)始另外一系列的注射。然后可在每年或者每3-5年給予維持的系列注射?？蓺v時(shí)一天(灌注以保持復(fù)合物的特定血漿水平)、若干天(例如歷時(shí)8天的時(shí)間內(nèi)四次注射)或者若干周(例如歷時(shí)4周的時(shí)間內(nèi)四次注射)完成所述系列注射，然后在六個(gè)月至一年后重新開(kāi)始。對(duì)于慢性病癥，可在發(fā)展基礎(chǔ)上進(jìn)行給藥。任選地，所述方法可在誘導(dǎo)期后實(shí)施，當(dāng)更頻繁地給予脂蛋白復(fù)合物時(shí)。在又一備選方案中，可以給藥漸增的劑量，開(kāi)始時(shí)以每次給藥50-200mg之間的劑量給藥約1至5次，隨后每次給藥時(shí)重復(fù)200mg和1g之間的劑量。根據(jù)患者的需求，其可以通過(guò)持續(xù)時(shí)間超過(guò)1小時(shí)的緩慢輸注進(jìn)行給藥，通過(guò)1小時(shí)或更少時(shí)間的快速輸注進(jìn)行給藥，或者通過(guò)一次快速推注給藥?？梢允褂眉?xì)胞培養(yǎng)中的標(biāo)準(zhǔn)藥物規(guī)程或者使用確定ld50(群體50％的致死劑量)和ed50(群體50％的治療有效劑量)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)確定各種脂蛋白復(fù)合物的毒性和治療效力。毒性與治療作用之間的劑量比是治療指標(biāo)并且其可以表示為ld50/ed50比值。優(yōu)選表現(xiàn)出更高治療指數(shù)的脂蛋白復(fù)合物諸如荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物?？筛櫟膮?shù)的非限制性實(shí)例包括肝功能轉(zhuǎn)氨酶(不超過(guò)2×正常的基線水平)。其表明過(guò)多的膽固醇被運(yùn)至肝并且不能同化如此大的量。由于膽固醇從紅細(xì)胞的動(dòng)員可使紅細(xì)胞變脆或者影響紅細(xì)胞的形狀，因而還可監(jiān)測(cè)對(duì)紅細(xì)胞的作用?；颊呖梢栽诓扇♂t(yī)療措施之前接受數(shù)天至數(shù)周的治療(如，預(yù)防性治療)、或在采取醫(yī)療措施之中或之后接受數(shù)天至數(shù)周的治療。所述給藥可以與另一種有創(chuàng)療法相伴或同時(shí)進(jìn)行，所述有創(chuàng)療法如血管成形術(shù)、頸動(dòng)脈消融術(shù)、rotoblader或器官移植(如，心臟、腎、肝等)。在某些實(shí)施方案中，將荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物給藥于膽固醇合成受他汀類(lèi)藥物或膽固醇合成抑制劑控制的患者。在其它實(shí)施方案中，將荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物給藥于接受結(jié)合樹(shù)脂(例如，半合成樹(shù)脂如消膽胺)或纖維(如植物纖維)治療的患者，以捕獲膽汁鹽和膽固醇，從而增加膽汁酸的分泌并降低血膽固醇濃度。6.8.其它用途可以在體外檢測(cè)中使用本申請(qǐng)所述的脂蛋白復(fù)合物例如荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物和組合物來(lái)測(cè)量血清hdl，例如，出于診斷的目的。由于apoa-i、apoa-ii和apo肽與血清中的hdl組分締合，因此荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物可作為hdl群和前-β1以及前-β2hdl群的“標(biāo)記物”使用。此外，該荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物可作為在rct中有效的hdl亞群的標(biāo)記物使用。為此，可將荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物加于患者的血清樣品或與其混合，在合適的孵育時(shí)間后，可以通過(guò)檢測(cè)引入的荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物來(lái)分析hdl組分。這可通過(guò)使用標(biāo)記的荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物(如，放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記、染料等)實(shí)現(xiàn)，或者通過(guò)使用對(duì)荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物具有特異性的抗體(或抗體片段)的免疫測(cè)定實(shí)現(xiàn)?？蛇x擇地，成像法(如，cat掃描、mri掃描)可以使用標(biāo)記的荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物以使循環(huán)系統(tǒng)顯像或者監(jiān)測(cè)rct、或者使脂紋、動(dòng)脈粥樣硬化病變等地方蓄積的hdl顯像，其中hdl在膽固醇外流中具有活性。與某種原apoa-1脂質(zhì)復(fù)合物的制備和表征相關(guān)的實(shí)施例以及數(shù)據(jù)在美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)2004/0067873中描述，將其內(nèi)容通過(guò)引用的方式并入本申請(qǐng)。在使用某種原apoa-1脂質(zhì)復(fù)合物的動(dòng)物模型系統(tǒng)中獲得的數(shù)據(jù)在美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)2004/0067873中描述，將其內(nèi)容通過(guò)引用的方式并入本申請(qǐng)。7.實(shí)施例1：apoa-i表達(dá)系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)7.1.人apoa-i在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(cho)細(xì)胞中的克隆和表達(dá)7.1.1.apoa-i表達(dá)載體的制備前原apoa-i基因序列由ncbi(p02647)獲得且加入側(cè)翼序列以便易于克隆和改善表達(dá)。合成了具有側(cè)翼序列的編碼前原apoa-i的dna并將其克隆至bluescriptks+載體中。所述5′側(cè)翼序列含有優(yōu)化的kozak翻譯序列。將前原apoa-i插入物由bluescriptks+載體用hindiii和bglii限制酶切割。將該片段經(jīng)凝膠純化并連接至帶有如下遺傳成分的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體：與莫洛尼小鼠肉瘤病毒5’ltr融合的人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、momulv/sv包裝區(qū)域、即早猿猴巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)、momulv的3’ltr以及細(xì)菌復(fù)制起始區(qū)和β-內(nèi)酰胺酶基因。將所得結(jié)構(gòu)的克隆經(jīng)基因和側(cè)翼區(qū)進(jìn)行序列確定。根據(jù)與預(yù)測(cè)的dna序列的一致性來(lái)選擇最終的克隆(克隆#17)。然后使用共轉(zhuǎn)染有用于水泡性口膜炎病毒包裝糖蛋白的表達(dá)質(zhì)粒的293gp細(xì)胞來(lái)制備用于轉(zhuǎn)導(dǎo)的retrovector。由共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞回收并濃縮的上清液用于如下在段落7.1.2中所述的cho-s轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟。7.1.2.用于表達(dá)apoa-i的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的產(chǎn)生使用如上在段落7.1.1中所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體使得適于在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(cho-s)進(jìn)行三次轉(zhuǎn)導(dǎo)(1x、2x和3x)。將收集的群體擴(kuò)大以用于在每次轉(zhuǎn)導(dǎo)后的深低溫保藏并使得細(xì)胞樣品進(jìn)行基因拷貝分析?；蚩截愔笖?shù)顯示于如下表2中。針對(duì)在16-天加料分批測(cè)試(一式兩份)中在125ml燒瓶中的生產(chǎn)率對(duì)3x轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞系進(jìn)行分析。結(jié)果顯示于表3中。*在進(jìn)行產(chǎn)生2x細(xì)胞系之前將1x細(xì)胞系混合**在進(jìn)行產(chǎn)生3x細(xì)胞系之前將2x細(xì)胞系混合表3cho-s-apoa-i-r(3x)的加料分批生產(chǎn)率數(shù)據(jù)*存活細(xì)胞密度**由于收集誤差未經(jīng)d4細(xì)胞計(jì)數(shù)7.1.3.表達(dá)apoa-i的細(xì)胞系的穩(wěn)定性非gmp表征研究在cho-s-apoa-i-r(3x)克隆(17，其為產(chǎn)生apoa-i的原始細(xì)胞庫(kù))上進(jìn)行，以評(píng)估其在存活率、生長(zhǎng)率、基因插入物的保存以及在長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中的一致的產(chǎn)物分泌方面的穩(wěn)定性。將細(xì)胞系由原始細(xì)胞庫(kù)解凍并使用pfchols培養(yǎng)基(hyclone,loganut)在125ml搖瓶中培養(yǎng)。通過(guò)由第0代至第43代的連續(xù)傳代將細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)。在第4、8、14、19、25、31、36和43代，將細(xì)胞樣品冷凍。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，將來(lái)自所有代的細(xì)胞樣品解凍并用于終末培養(yǎng)以比較在相同試驗(yàn)中不同代的細(xì)胞系的apoa-i蛋白產(chǎn)生。在第12天使用反相hplc分析測(cè)試來(lái)自每個(gè)樣品的上清液以確定apoa-i產(chǎn)生的水平。發(fā)現(xiàn)各個(gè)樣品的apoa-i濃度由1259mg/l變化至1400mg/l(圖2)。為了比較基因插入物的穩(wěn)定性，將第0、4、14、25、36和43代的cho細(xì)胞樣品用于dna分離。使用對(duì)基因組dna的實(shí)時(shí)pcr來(lái)確定用于每個(gè)樣品的遺傳插入物的數(shù)目。如在表3中顯示，根據(jù)在第0代至第43代之間的重疊的標(biāo)準(zhǔn)偏差，拷貝數(shù)的基于pcr的指數(shù)并非顯著不同。發(fā)現(xiàn)apoa-i的產(chǎn)生以及原始細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞系的基因拷貝指數(shù)值在所測(cè)試的43代中是穩(wěn)定的。表4基因拷貝指數(shù)的穩(wěn)定性代基因拷貝指數(shù)標(biāo)準(zhǔn)偏差07.870.2547.800.27147.800.27257.970.25367.900.17438.200.277.2.apoa-i的細(xì)胞生長(zhǎng)和收集7.2.1.接種物和200l生物反應(yīng)器生產(chǎn)的規(guī)模放大將一瓶穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有來(lái)自原始細(xì)胞庫(kù)的人apoa-i基因的cho-s細(xì)胞在37℃水浴中解凍并加入至含有35mlhyqpf-chols細(xì)胞培養(yǎng)基的單一的搖瓶(250ml)(thermofisherscientific)中。使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定的初始細(xì)胞計(jì)數(shù)為2.48x105個(gè)細(xì)胞/ml且存活率為93.8％。然后將培養(yǎng)物置于在37℃在潮濕的5％co2環(huán)境中保持的孵育箱中的軌道振蕩器(90rpm)上。次代培養(yǎng)步驟將接種密度定標(biāo)在約1.6x105個(gè)細(xì)胞/ml。在燒瓶中第4天的細(xì)胞計(jì)數(shù)和存活率百分?jǐn)?shù)分別為15.01x105個(gè)細(xì)胞/ml以及93.9％。將250ml燒瓶培養(yǎng)物次代培養(yǎng)至1l燒瓶。來(lái)自1l燒瓶中的第3天平均存活的細(xì)胞計(jì)數(shù)為13.56x105個(gè)細(xì)胞/ml且存活率為95.3％。將1l燒瓶培養(yǎng)物經(jīng)次代培養(yǎng)至具有10l一次性wave袋的wave生物反應(yīng)器系統(tǒng)20eh(gehealthcarebiosciencebioprocesscorp,somerset,nj)，其初始培養(yǎng)體積和初始定標(biāo)密度分別為1000ml和1.75x105個(gè)細(xì)胞/ml。所述wave生物反應(yīng)器操作設(shè)定為37℃的孵育溫度、15.0cpm的搖桿速度、10.9°的搖擺角度以及5.0％的co2濃度且在具有0.25l/分鐘的氣體流速的通氣條件下。在3天培養(yǎng)后，wave袋中的存活細(xì)胞密度為10.73x105個(gè)細(xì)胞/ml，且加入新鮮的hyqpf-chols，使得培養(yǎng)基體積為5000ml。在另外的三天后，存活細(xì)胞密度為13.25x105個(gè)細(xì)胞/ml且將wave袋的容積轉(zhuǎn)移至30l生物反應(yīng)器中。對(duì)于溫度、ph、溶解氧、壓力和振動(dòng)率的30l生物反應(yīng)器的操作設(shè)定點(diǎn)分別為37℃、ph7.0、40％氣體飽和度、1磅/平方英寸壓力和50rpm振動(dòng)率。三天培養(yǎng)的30l生物反應(yīng)器中的存活細(xì)胞密度為10.80x105個(gè)細(xì)胞/ml，其足夠以2.40x105個(gè)細(xì)胞/ml的初始靶標(biāo)密度接種于200l生物反應(yīng)器中。轉(zhuǎn)移30l的全部?jī)?nèi)容物且接種后重量、細(xì)胞密度和存活率分別為134.5kg、2.37x105個(gè)細(xì)胞/ml和90.9％。對(duì)于溫度、ph、溶解氧、壓力和振動(dòng)率，200l生物反應(yīng)器的操作設(shè)定點(diǎn)分別為37℃、ph7.0、40％氣體飽和度、1磅/平方英寸壓力和35rpm振動(dòng)率。在第3天，細(xì)胞密度為15.71x105個(gè)細(xì)胞/ml，其足以將60l(v/v)的完全培養(yǎng)基(agtcdcho5x,invitrogen)和200mml-谷氨酰胺(終濃度為10mm)溶液加入至生物反應(yīng)器。在第8和12天，葡萄糖水平跌至低于5g/l，其促使加入3g/l的葡萄糖(20％)溶液。第9天的存活細(xì)胞密度最大值為33.20x105個(gè)細(xì)胞/ml且存活率為92.5％。在第13天收集生物反應(yīng)器中的細(xì)胞，且細(xì)胞存活率為78.5％。整個(gè)培養(yǎng)期間的培養(yǎng)物的細(xì)胞計(jì)數(shù)和存活率顯示于圖3a中且整個(gè)培養(yǎng)期間的培養(yǎng)基中的apoa-i濃度顯示于圖3b中。7.2.2.細(xì)胞的收集、分離和儲(chǔ)存通過(guò)使得生物反應(yīng)器內(nèi)容物先后經(jīng)過(guò)雙重cuno(rutherford,nj,usa)60m02maximizer濾器以及millipore0.22μmopticap(billercia,ma,usa)，將來(lái)自生物反應(yīng)器的培養(yǎng)基收集于200l袋中。然后將澄清的培養(yǎng)基儲(chǔ)存在2-8℃直到開(kāi)始分配操作。將澄清的培養(yǎng)基經(jīng)millipore0.22μm濾器(billerica,ma,usa)濾過(guò)并分配至2l無(wú)菌petg瓶(thermofisher,marietta,oh,usa)中，然后在-20℃冷凍直到釋放以用于裝運(yùn)。8.實(shí)施例2：apoa-i純化系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)8.1.材料和方法表達(dá)、初始分離和預(yù)處理.通過(guò)儲(chǔ)存在環(huán)境溫度將在實(shí)施例1中獲得的apoa-i澄清的細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(約1.8l)解凍。將解凍的培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)處理以用于陰離子交換色譜法(用1mhcl降低ph5.3±0.2)。apoa-i的純化.將以20cm的底料高度填充的q-瓊脂糖ff(gehealthcare)陰離子交換柱用tampa緩沖劑(20mm磷酸鈉,ph5.3)平衡。當(dāng)柱洗脫液的ph為約5.5時(shí)，判斷平衡完成。將預(yù)處理的濾液載入至柱上(25-35gapoa-i/l的陰離子交換樹(shù)脂，流速為3.7cm/min)。將apoa-i經(jīng)柱(tampa流動(dòng)相)洗滌，將其收集。將來(lái)自陰離子交換柱的含有apoa-i的流動(dòng)相用1mnaoh調(diào)節(jié)ph為8.0±0.2。然后將溶液以約12.5l/h/m2的流速經(jīng)0.2μmplanova20n濾器(asahikaseimedical)濾過(guò)以除去病毒和病毒顆粒。當(dāng)柱洗脫液達(dá)到ph9.5時(shí)，將具有25cm的底料高度的source30反相色譜柱用tampd緩沖劑(20mm碳酸銨,ph9.5)洗滌直到平衡。將來(lái)自病毒濾過(guò)步驟的含有apoa-i的濾液以2.8cm/min的流速載入至柱上。將樣品中的apoa-i吸附到基質(zhì)上并用35-50％乙腈在tampd緩沖劑中的梯度洗脫。當(dāng)柱洗脫液達(dá)到ph9.5時(shí)，將以25cm的底料高度填充的反相硅膠c18柱(10μm)在tampe緩沖劑(100mm碳酸銨,ph9.5)中洗滌直到平衡。然后將c18柱以4.7gapoa-i/l基質(zhì)加載。將吸附到柱基質(zhì)上的apoa-i以40-50％乙腈在tampe緩沖劑中的梯度洗脫。通過(guò)如下將乙腈由c18柱洗脫的含有apoa-i的級(jí)份除去：收集并將所述級(jí)份濃縮約2.5倍，然后將所述濃縮物經(jīng)15體積的tampc緩沖劑(3mm磷酸鈉,ph8)滲濾。使用稀磷酸將滲濾的apoa-i溶液的ph降低至約6.0，然后經(jīng)過(guò)mustangq陰離子交換膜(palllifesciences)以除去dna和宿主細(xì)胞蛋白。將mustangq濾液經(jīng)5體積的tampc緩沖劑滲濾。然后使用具有10,000道爾頓的分子量篩截(molecularweightcutoff)的聚醚砜膜(filtronomegaseries)將滲濾的濾液進(jìn)行最終的超濾，以使得所述膜保留28,000道爾頓的apoa-i。所述蛋白溶液含有7.8-17g/l純的apoa-i，如通過(guò)掃描sds-page凝膠且測(cè)量純的apoa-i條帶區(qū)域的密度與所有條帶的總密度的比所確定。8.2.結(jié)果apoa-i的表征.經(jīng)sds-page將apoa-i產(chǎn)物的純度測(cè)定為大于99％純的，其具有低水平的dna和宿主細(xì)胞蛋白，且無(wú)可檢測(cè)量的截短的apoa-i。參見(jiàn)圖4。9.實(shí)施例3：脂蛋白復(fù)合物成分的優(yōu)化9.1.載脂蛋白和磷脂成分的制備原apoa-i:蛋白原apoa-i以每100ml瓶含有約90mg蛋白的凍干品由unitédebiotechnologie,institutmeurice,hteecoleluciadebrouckère,1avenueemilegryzon,b-1070anderlecht,belgium供應(yīng)。批號(hào)為20060202。該蛋白使用前在約4℃保存。在凍干之前，原apoa-i的濃度為3.225mg/ml，其中脲的含量為約0.011mg/ml。通過(guò)將約630mg的原apoa-i溶解于25.6ml的乙酸/5％水中而制備原apoa-i溶液。溶液的終濃度為25mg/ml。apoa-i:apoa-i如上在實(shí)施例1中所述來(lái)制備。鞘磷脂:來(lái)自蛋的鞘磷脂(nm-10)由日本的nof公司,1-56,oohama-cho,amagasaki-shi,660-0095供應(yīng)。批號(hào)為0502es1。鞘磷脂使用前在約-20℃保存。鞘磷脂的純度為99.1％。鞘磷脂溶液通過(guò)以下方法制備：將799.4mg純化的鞘磷脂溶解于16ml的乙酸/5％水中以得到50mg/ml的終濃度。磷脂酰甘油:1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷脂酰甘油(phopsphatidylglycerol)的鈉鹽(dppg-na,mg-6060ls)由日本的nof公司,1-56,oohama-cho,amagasaki-shi,660-0095供應(yīng)。批號(hào)為0309651l。dppg-na使用前在約-20℃保存。dppg-na的純度為99.2％。dppg-na溶液通過(guò)以下方法制備：將49.1mg的dppg-na溶解于1ml的乙酸/5％水中，得到50mg/ml的終濃度。磷脂酰膽堿:二-棕櫚酰磷脂酰膽堿(dppc)由商購(gòu)來(lái)源獲得。9.2.脂蛋白復(fù)合物的制備制備如下脂蛋白復(fù)合物：(a)中性脂蛋白復(fù)合物：a.式a：原apoa-i和sm，其中蛋白:磷脂重量比為1:2.5；b.式b：原apoa-i和sm，其中蛋白:磷脂重量比為1:2.7；c.式c：原apoa-i和sm，其中蛋白:磷脂重量比為1:3.1；d.式d：原apoa-i、sm和dppc，其中脂蛋白wt:總磷脂wt比為1:2.7，sm:dppc比為50:50；e.式e：apoa-i和sm，其中蛋白:磷脂重量比為1:2.7。(b)荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物：a.式f：原apoa-i、sm、dppc和dppg，其中脂蛋白wt:總磷脂wt比為1:2.7，sm:dppc:dppgwt:wt比為48:48:4；b.式g：原apoa-i、sm、dppc和dppg，其中脂蛋白wt:總磷脂wt比為1:2.7，sm:dppc:dppgwt:wt比為73:23:4；c.式h：apoai、sm和dppg，其中脂蛋白wt:總磷脂wt比為1:2.7，sm:dppgwt:wt比為97:3；d.式i：apoai、sm和dppg，其中脂蛋白wt:總磷脂wt比為1:3.0，sm:dppgwt:wt比為97:3；e.式j(luò)：apoai、sm和dppg，其中脂蛋白wt:總磷脂wt比為1:3.3，sm:dppgwt:wt比為97:3。9.3.脂蛋白復(fù)合物的配制率和均質(zhì)性通過(guò)將樣品注射至hplc系統(tǒng)來(lái)測(cè)試式a-j的脂蛋白復(fù)合物的配制，以檢查脂蛋白復(fù)合物的粒度和分布。復(fù)合物經(jīng)共-勻漿產(chǎn)生并在指定時(shí)間取樣。圖5顯示了包含不同的脂蛋白:smwt:wt比的式a-c的中性脂蛋白復(fù)合物以及包含脂蛋白和中性磷脂比為1:2.7的式d的中性脂蛋白復(fù)合物(其中所述中性磷脂為50:50的sm:dppc)的示例性hplc色譜圖。優(yōu)選所述脂蛋白:smwt:wt比為1:2.7。含有sm和dppc混合物的式d顯示出弱的復(fù)合物形成。加入作為第二中性磷脂的磷脂酰膽堿導(dǎo)致緩慢且不完全的復(fù)合物形成。圖6顯示出式d的脂蛋白復(fù)合物在10、20、30和60分鐘的hplc色譜圖。相反地，如在圖7中顯示，式b快速形成復(fù)合物。向sm和dppc加入負(fù)電荷磷脂、dppg導(dǎo)致甚至更弱的復(fù)合物形成，如在圖8中的式f的脂蛋白復(fù)合物在20、40、60和120分鐘的hplc色譜圖中顯示。如在圖9中顯示，僅含有sm作為磷脂的蛋白與脂質(zhì)重量比為1:2.7的脂蛋白復(fù)合物形成更強(qiáng)的前-bhdl復(fù)合物，且與具有相同的蛋白與脂質(zhì)重量比但含有dppc和/或者dppg的脂蛋白復(fù)合物相比更快地形成。因此，僅包含sm作為中性脂質(zhì)的脂蛋白復(fù)合物形成更均質(zhì)的脂蛋白復(fù)合物，其相比于除了sm之外包含dppc且加入或者不加入dppg的復(fù)合物而言以更快的速率形成。最后，相比于包含載脂蛋白:磷脂重量比為1:3.3的復(fù)合物以及未荷電的脂蛋白復(fù)合物而言，包含載脂蛋白:磷脂重量比為1:2.7-1:3的荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物(其中磷脂部分含有97:3重量比的sm和dppg)顯示出優(yōu)化的均質(zhì)性且無(wú)游離脂質(zhì)的峰。參見(jiàn)圖10，顯示出式e、h、i和j的hplc色譜圖。選擇式b和h的脂蛋白復(fù)合物以用于在動(dòng)物中進(jìn)一步研究(實(shí)施例6)，且基于動(dòng)物研究的結(jié)果，選擇式h的脂蛋白復(fù)合物以用于人類(lèi)患者中的臨床評(píng)估(實(shí)施例6和8)。10.實(shí)施例4：使用基于熱循環(huán)的方法形成脂蛋白復(fù)合物10.1.用于制備apoa-i/dppg/鞘磷脂復(fù)合物的方法綜述蛋白濃度為1-30mg/ml、通常為5-20mg/ml的冷凍的apoa-i在磷酸鹽緩沖劑(ph7-9)中的溶液通過(guò)在2-8℃解凍約24-96小時(shí)來(lái)制備并稱(chēng)重。將磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉加入至apoa-i溶液中，獲得在ph7.4緩沖劑中的10mm的最終肽濃度。dppg溶液通過(guò)以下方法制備：將磷酸鹽緩沖劑(10mm磷酸鈉,ph8.0)溫?zé)嶂?0℃的目標(biāo)。將dppg粉末(nof公司)在環(huán)境溫度解凍至少1.5小時(shí)，然后稱(chēng)重并加入至緩沖劑容器中。然后使用ultra-高性能分散器(works,inc.)將dppg在50℃的溫度分散。分散后，將dppg混懸液和apoa-i溶液加熱至57℃。將它們合并并在57℃在氮?dú)庀录訜?0分鐘。將該前-復(fù)合物溶液冷卻至室溫。將鞘磷脂(sm)粉末(nof公司)在環(huán)境溫度解凍，然后在玻璃池中稱(chēng)重。將磷酸鹽磷酸鹽緩沖劑(10mm磷酸鈉,ph8.0)加熱至50℃，與sm粉末混合以獲得sm濃度為220mg/ml。使用ultra-將sm粉末分散在混懸液中并將所述分散液冷卻至4℃，然后經(jīng)過(guò)勻漿器。經(jīng)動(dòng)態(tài)光散射(dls)監(jiān)測(cè)所述sm顆粒，其ζ(z)平均粒度為55-70nm(使用強(qiáng)度測(cè)量)。這可通過(guò)例如使用nanodebee勻漿器在32000+/-3000巴來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中入口溫度為10-18℃且出口溫度優(yōu)選為30-40℃(且不超過(guò)59℃)，導(dǎo)致所述顆粒具有58nm的z-平均粒度。對(duì)于復(fù)合，將所述apoa-i/dppg混合物和sm分散液分開(kāi)溫?zé)嶂?7℃。將溫?zé)岬膕m分散液加入至apoa-i/dppg混合物中，其中初始溫度設(shè)定點(diǎn)為57℃。在攪拌混合后，將溶液冷卻至37℃，然后使其經(jīng)過(guò)一系列熱循環(huán)(57℃-37℃)以形成apoa-i/dppg/sm復(fù)合物。持續(xù)進(jìn)行該加熱-冷卻過(guò)程，其中在各溫度之間的接觸時(shí)間為5分鐘-30分鐘。重復(fù)該加熱-冷卻循環(huán)直到大部分蛋白成分摻入至脂蛋白復(fù)合物中。在熱循環(huán)過(guò)程中的復(fù)合物的粒度和分布經(jīng)凝膠滲透色譜法(gpc)監(jiān)測(cè)。apoa-i/dppg/sm復(fù)合物根據(jù)如上所述的方法來(lái)制備(且于圖11示例說(shuō)明)。所述apoa-i蛋白具有相應(yīng)于圖1中描繪的序列的位置25-267的氨基酸序列。所述復(fù)合物含有97:3的重量比的鞘磷脂(sm)和1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3--磷酸-(1'--外消旋-甘油)(二棕櫚酰磷脂酰甘油或者dppg)。apoa-i蛋白與總脂質(zhì)的比為1:2.7重量/重量(w/w)，其相當(dāng)于1:108的摩爾比。使用如圖12中所述安置的熱交換器將混合的脂質(zhì)和蛋白成分在57℃-37℃之間循環(huán)，每個(gè)溫度循環(huán)5分鐘，所述熱交換器在左側(cè)包括laudaecolinestareditiontype26le水浴(樣品在其中進(jìn)行熱循環(huán))且在右側(cè)包括殼&管熱交換器(模型ef-c50-he)，其具有18-ml保持體積，由蠕動(dòng)泵連接。將180mgdppg加入至2.82克10mm磷酸鹽緩沖劑(ph8.0)中。將所述混懸液在50℃用ultra-分散器分散10分鐘。將22克sm粉末與78克10mm磷酸鹽緩沖劑(ph8.0)混合。將所述混懸液在50℃用ultra-分散器分散20-40分鐘。使用nanobee將sm勻漿化，獲得60nm的平均粒度。使得dppg、sm和蛋白達(dá)到57℃。在57℃將18mg(0.3ml)dppg加入至在10mm磷酸鹽緩沖劑(ph7.4)中的214mgapoa-i蛋白中。在57℃保持30分鐘后，加入559mgsm顆粒(2.54ml)。然后使得該溶液進(jìn)行熱循環(huán)，形成復(fù)合物。在熱循環(huán)30分鐘、60分鐘、120分鐘、180分鐘和210分鐘后顯示apoa-i/dppg/sm復(fù)合物形成的凝膠滲透色譜法分別顯示于圖13a-13e中。隨著循環(huán)時(shí)間的增加，產(chǎn)生更致密的復(fù)合物，如通過(guò)主要gpc峰的銳度增加所顯示。相應(yīng)于非復(fù)合的蛋白的峰也隨著時(shí)間推移而消失。10.2.apoa-i/鞘磷脂復(fù)合物的形成apoa-i/sm復(fù)合物根據(jù)如上所述制備，但不使得apoa-i與dppg預(yù)先復(fù)合。所述蛋白成分為濃度為8.9mg/ml的5mlapoa-i且所述脂質(zhì)成分為已經(jīng)混懸于10mm磷酸鹽緩沖劑(ph8.0)中并均質(zhì)形成60nm的脂質(zhì)顆粒的0.5ml蛋鞘磷脂(220mg/ml)。使得所述蛋白和脂質(zhì)成分在50℃以1:2.5wt:wt的比例混合。使用如在圖12中所述的熱循環(huán)裝置使得所得混懸液進(jìn)行熱循環(huán)達(dá)18小時(shí)(108次循環(huán)且循環(huán)時(shí)間為10分鐘)。凝膠滲透色譜法顯示出形成的蛋白/脂質(zhì)復(fù)合物為基本上均質(zhì)的(參見(jiàn)圖14的gpc色譜圖)。10.3.apoa-i/dppg/n-棕櫚酰-4-羥基二氫鞘氨醇-1-磷酸膽堿(植物鞘磷脂)復(fù)合物的形成apoa-i/dppg/植物鞘磷脂復(fù)合物根據(jù)如上所述的方法形成。將植物鞘磷脂顆粒均質(zhì)為約183nm的粒度(經(jīng)dls測(cè)量)并加入至7.8g/l蛋白:dppg混合物中，獲得1:2.7的最終蛋白與脂質(zhì)(sm和dppg)比。使得含有n-棕櫚酰-4-羥基二氫鞘氨醇-1-磷酸膽堿(植物-鞘磷脂)以及蛋白:dppg成分的混懸液在37℃熱循環(huán)六次，每次循環(huán)10分鐘且在57℃熱循環(huán)六次，每次循環(huán)10分鐘，總計(jì)兩小時(shí)。凝膠滲透色譜法顯示出形成的蛋白/脂質(zhì)復(fù)合物基本上為均質(zhì)的(參見(jiàn)圖15的gpc色譜圖)。10.4.apoa-i/dppg/合成的棕櫚酰鞘磷脂的形成apoa-i/dppg/合成的棕櫚酰鞘磷脂復(fù)合物如下制備。使得合成的棕櫚酰鞘磷脂(220mg/ml)在10mm磷酸鹽緩沖劑(ph7.4)中的8.8ml溶液混合直到達(dá)到3300nm的粒度。使得apoa-i(945mg，14mg/ml)與0.03wt％dppg(60mg/ml)混合并在50℃加熱30分鐘。使得合成的棕櫚酰鞘磷脂微團(tuán)與蛋白/dppg復(fù)合物以1:2.7的載脂蛋白:磷脂重量比混合。使得蛋白和脂質(zhì)的混懸液在37℃和57℃的熱-冷循環(huán)(每十分鐘交替一次)下進(jìn)行熱循環(huán)，總計(jì)達(dá)240分鐘或者直到獲得適當(dāng)?shù)牧６确植?。在熱循環(huán)過(guò)程中的復(fù)合物的粒度和分布經(jīng)gpc監(jiān)測(cè)。在絡(luò)合后，濃度達(dá)到8.0mgapoa-i/ml，然后將蔗糖(40mg/ml)和甘露醇(20mg/ml)加入至復(fù)合物中以用于等滲。將脂蛋白復(fù)合物經(jīng)gpc測(cè)定且發(fā)現(xiàn)其為基本上均質(zhì)的(參見(jiàn)圖16的gpc色譜圖)。10.5.apoa-i/dppg/植物鞘磷脂的形成apoa-i/dppg/植物鞘磷脂復(fù)合物如下制備。將植物鞘磷脂(220mg/ml)在10mm磷酸鹽緩沖劑(ph7.4)中的2.0ml溶液在50℃分散于ultra-中達(dá)40分鐘直到獲得990nm的粒度。使得apoa-i(15.6mg，濃度為7.8mg/ml)與0.03wt％dppg(60mg/ml)混合并在57℃加熱30分鐘。使得植物鞘磷脂溶液與蛋白/dppg混合物以1:2.7的載脂蛋白:磷脂重量比混合。然后將蛋白和脂質(zhì)的混懸液在37℃和57℃的熱-冷循環(huán)(每十分鐘交替一次)下進(jìn)行熱循環(huán)，總計(jì)達(dá)240分鐘或者直到獲得適當(dāng)?shù)牧６确植?。將所述脂蛋白?fù)合物的群體經(jīng)gpc測(cè)量且發(fā)現(xiàn)其為約92.6％均質(zhì)的(參見(jiàn)圖17的gpc色譜圖)。10.6.具有apoa-i肽的復(fù)合物的形成apoa-i肽、dppg和鞘磷脂的復(fù)合物如上(參見(jiàn)段落10.1)所述產(chǎn)生，使用apoa-i肽(h-lys-leu-lys-gln-lys5-leu-ala-glu-leu-leu10-glu-asn-leu-leu-glu15-arg-phe-leu-asp-leu20-val-inp22-oh；seqidno:4)溶液。所述磷脂成分由48.5:48.5:3的重量比的蛋鞘磷脂(sm)、1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(二棕櫚酰磷脂酰膽堿,dppc)和1,2–二棕櫚酰-sn-甘油-3-[-磷酸-外消旋-(1-甘油)](二棕櫚酰磷脂?；?甘油,dppg)組成。肽與總磷脂復(fù)合物的比為1:2.5(w/w)。所述藥物復(fù)合物為cer-522復(fù)合物在磷酸鹽緩沖鹽水(12mm磷酸鈉,130mm氯化鈉,ph8.2)中的溶液。所述復(fù)合物通過(guò)以下方法形成：使得起始溶液在50℃和37℃之間進(jìn)行熱循環(huán)達(dá)兩小時(shí)(流速為1ml/min)。凝膠滲透色譜法顯示出形成的蛋白/脂質(zhì)復(fù)合物為基本上均質(zhì)的，其中大部分蛋白已經(jīng)摻入至脂蛋白復(fù)合物中(參見(jiàn)圖18的gpc色譜圖)。10.7.脂質(zhì)粒度以及熱循環(huán)次數(shù)對(duì)復(fù)合物形成的影響研究了脂質(zhì)粒度以及熱循環(huán)次數(shù)對(duì)粒度的影響。具有四種不同的起始脂質(zhì)粒度(ζ平均值為85nm、77nm、66nm和60nm)的制劑(分別為圖19a-19d)通過(guò)以下方法產(chǎn)生：使得sm溶液以單一路徑經(jīng)過(guò)nanobee。針對(duì)其ζ平均值分析每個(gè)路徑。脂質(zhì)粒度隨著每個(gè)路徑而減小且在達(dá)到預(yù)期粒度時(shí)收集所述脂質(zhì)顆粒。在段落10.1的復(fù)合物形成方法中測(cè)試了四種不同的脂質(zhì)粒度，進(jìn)行五或七次循環(huán)，在37℃的每次循環(huán)3分鐘且在57℃的每次循環(huán)10分鐘。當(dāng)所述脂質(zhì)成分與蛋白成分混合時(shí)，所得的混懸液為渾濁的。當(dāng)復(fù)合物形成時(shí)，渾濁度降低，且所述溶液變得更透明。五次循環(huán)后，由60nm脂質(zhì)顆粒產(chǎn)生的復(fù)合物的混懸液為最透明的。gpc色譜圖(圖20a-20d)顯示了所有樣品的完全或者幾乎完全的復(fù)合，如經(jīng)主峰均質(zhì)性所證實(shí)。當(dāng)起始于66nm脂質(zhì)顆粒時(shí)，在所得的脂蛋白復(fù)合物混懸液中經(jīng)gpc未檢測(cè)到非復(fù)合的蛋白，這表明在五次循環(huán)后所有蛋白與脂質(zhì)復(fù)合，且所得的復(fù)合物為98％純的。七次循環(huán)后，所有四個(gè)混懸液均變得更透明，這顯示更大程度的復(fù)合。使用60nm脂質(zhì)顆粒制備的混懸液似乎最澄清。在分開(kāi)的研究中，使用段落10.1所述的方法使得450nm和40nm的sm顆粒與apoa-i和dppg復(fù)合。使用450nmsm顆粒作為脂質(zhì)成分將大部分(但并非全部)apoa-i摻入至脂蛋白復(fù)合物中，如在圖21a的gpc色譜圖所顯示(9.8分鐘的峰)。使用40nmsm顆粒作為脂質(zhì)成分將極小部分的apoa-i摻入至脂蛋白復(fù)合物中，如在圖21b的gpc色譜圖所顯示(9.551分鐘的峰)。10.8.起始溫度對(duì)于復(fù)合物形成的作用研究了起始熱循環(huán)溫度對(duì)復(fù)合物形成的作用。apoa-i/dppg/sm復(fù)合物如在段落10.1中所述產(chǎn)生，除了將所述脂質(zhì)成分和蛋白成分溫?zé)嶂?7℃(而不是57℃)并在37℃(而不是57℃)混合。所得的復(fù)合物的gpc色譜圖顯示于圖22中。相比于熱循環(huán)初始于57℃時(shí)，基本上較少的蛋白成分摻入至脂蛋白復(fù)合物中，如經(jīng)相對(duì)大的蛋白峰(在9.455分鐘洗脫出，圖22)所證實(shí)。10.9.使用熱循環(huán)方法的脂蛋白復(fù)合物的商業(yè)生產(chǎn)針對(duì)大規(guī)模的商業(yè)制造，本公開(kāi)的方法可提升規(guī)模且任選地結(jié)合配制步驟。商業(yè)的實(shí)施方案描述于圖23中。在該實(shí)施方案中，在熱循環(huán)步驟后，將所述脂蛋白復(fù)合物稀釋?zhuān)c一種或者多種等滲劑(例如蔗糖和/或者甘露醇)混合，濾過(guò)，并等分至小瓶中?？蓪⑿∑恐械膬?nèi)容物冷凍干燥以延長(zhǎng)所得制劑的貯存期限。使用dabee2000將描述于段落10.1的apoa-i/dppg/sm復(fù)合物以20-l的規(guī)模產(chǎn)生。將該復(fù)合物用磷酸鹽緩沖劑(ph7-8)稀釋并與蔗糖和甘露醇混合，獲得含有磷酸鹽緩沖劑(10mmph7.4)、8mg/mlapoa-i、4％(w/w)蔗糖和2％(w/w)甘露醇的最終制劑。10.10.由熱循環(huán)制備的脂蛋白復(fù)合物與由共勻漿制備的脂蛋白復(fù)合物的比較將由本申請(qǐng)所述的熱循環(huán)方法制備的apoa-i/dppg/sm復(fù)合物與由脂質(zhì)和蛋白成分的共勻漿制備的復(fù)合物進(jìn)行比較。相比于由共勻漿制備的復(fù)合物而言，由熱循環(huán)制備的復(fù)合物的純度改善至97％，如經(jīng)凝膠滲透色譜法所測(cè)量。使用sds-page，相比于由共勻漿的復(fù)合物而言，由熱循環(huán)制備的復(fù)合物具有98％的增加的主帶純度，且存在較少截短的蛋白條帶。相比于共勻漿化，apoa-i的氧化也通過(guò)熱循環(huán)法降低。rp-hplc(c18)顯示，在共勻漿的復(fù)合物中在rt0.93和0.99存在兩個(gè)氧化峰，其在熱循環(huán)法中不存在。肽圖也顯示，相比于由共勻漿產(chǎn)生的復(fù)合物而言，在由熱循環(huán)產(chǎn)生的復(fù)合物中在apoa-i蛋氨酸的met112和met148存在氧化降低。數(shù)據(jù)匯總顯示于如下表5中。表5縮寫(xiě)：gpc＝凝膠滲透色譜法，rt＝保留時(shí)間；nmt＝不多于；sds-page＝十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳；hp-sec＝高性能-分子排阻色譜；rp-hplc＝反相-高效液相色譜；rrt＝相對(duì)保留時(shí)間；rp-uplc＝反相-超高效液相色譜法；m112ox＝apoa-i殘基112蛋氨酸氧化；m148ox＝apoa-i殘基148蛋氨酸氧化.10.11.惰性氣體在制造方法中的用途apoa-i為靈敏的蛋白，其易感于化學(xué)不穩(wěn)定性(例如氧化)。為了增強(qiáng)apoa-i在含有apoa-i/sm/dppc的藥物組合物的穩(wěn)定性，在氮?dú)?惰性氣體)氣氛下制備(包括熱循環(huán)、填充和完成步驟)藥物組合物。如下為對(duì)由共勻漿制備的apoa-i/sm/dppc復(fù)合物與由氮?dú)庀碌臒嵫h(huán)制備的apoa-i/sm/dppc復(fù)合物進(jìn)行比較的研究結(jié)果。實(shí)施例5：體外膽固醇外流研究在fu5ah大鼠肝細(xì)胞瘤細(xì)胞中研究apoa-i-脂質(zhì)復(fù)合物的生物活性，其測(cè)量abca1-介導(dǎo)的膽固醇外流。fu5ah大鼠肝細(xì)胞瘤細(xì)胞具有清除劑受體組b類(lèi)型i(srb1)的高表達(dá)，這促進(jìn)細(xì)胞和成熟hdl之間的膽固醇的雙向流動(dòng)。該模型提供了針對(duì)hdl-介導(dǎo)的膽固醇外流活性的特定測(cè)定。所述測(cè)定使用mwevaetal.,2006,“comparisonofdifferentcellularmodelsmeasuringinvitrothewholehumanserumcholesteroleffluxcapacity,”eur.j.clin.invest.36,552-559所述的方法來(lái)進(jìn)行。將fu5ah細(xì)胞用3h-膽固醇標(biāo)記24小時(shí)。針對(duì)每個(gè)測(cè)試樣品(30、20和10μg/ml的apoa-i/dppg/棕櫚酰sm、apoa-i/dppg/蛋sm或者apoa-i/dppg/植物sm，用mem稀釋?zhuān)鰉em經(jīng)25mmhepes緩沖)以及對(duì)照樣品(由人血漿(20μg/ml)純化的apoa-i、hdl3、2％人血清、單獨(dú)培養(yǎng)基)制備用于外流的受體介質(zhì)。將含有測(cè)試或者對(duì)照樣品的受體培養(yǎng)基加入至細(xì)胞達(dá)4小時(shí)，并測(cè)量在外流介質(zhì)和單層細(xì)胞中的膽固醇，以確定由fu5ah細(xì)胞釋放的膽固醇百分?jǐn)?shù)。計(jì)算測(cè)試樣品的生物活性且其表示為膽固醇外流相對(duì)于如上所述的式h的參比標(biāo)準(zhǔn)品(具有與測(cè)試樣品中的脂蛋白復(fù)合物相同的濃度，其用作陽(yáng)性試驗(yàn)對(duì)照)的百分?jǐn)?shù)。結(jié)果顯示于如下表7中，并證實(shí)所測(cè)試的脂蛋白復(fù)合物具有顯著的生物活性，如經(jīng)膽固醇外流測(cè)定所測(cè)量。表7-在基于fu5ah細(xì)胞的測(cè)定中的生物活性(通過(guò)誘導(dǎo)的膽固醇外流)12.實(shí)施例6：兔子中式b和式h復(fù)合物的單一、低劑量給藥的藥效研究正常兔子接受了以下的單一注射：(a)5mg/kg劑量的式b制劑(含有1:2.7的載脂蛋白:磷脂重量比的apoa-i和sm的中性脂蛋白復(fù)合物)；(b)5mg/kg劑量的式h制劑(含有1:2.7的載脂蛋白:磷脂重量比以及97:3的sm:dppg重量比的apoa-i、sm和dppg的荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物)；或者(c)對(duì)照制劑，其含有用于脂蛋白復(fù)合物制劑的稀釋劑。使用式b、式h和對(duì)照的每種來(lái)測(cè)試四只兔子。vldl總膽固醇和甘油三酯隨時(shí)間推移的血漿水平顯示于圖24和25中。相比于用式b(apoa-i和sm的脂蛋白復(fù)合物)處理的動(dòng)物中的水平，在用式h(apoa-i/dppg/sm復(fù)合物)(b)處理的動(dòng)物中的血漿vldl總膽固醇水平增加較少且更快地返回至基線。針對(duì)甘油三酯水平觀察到類(lèi)似效果。該研究顯示，相比于中性脂蛋白復(fù)合物而言，對(duì)于apoa-i/dppg/sm復(fù)合物，這些水平的暫時(shí)升高具有較短的持續(xù)時(shí)間。該結(jié)果與式h的脂蛋白復(fù)合物在人類(lèi)受試者中的i期研究的結(jié)果(描述于如下實(shí)施例8)一致。13.實(shí)施例7：蛋sm與合成的棕櫚酰sm的比較藥效研究研究了靜脈內(nèi)注射至兔的載脂蛋白a-i(apoa-i)/蛋sm和apoa-i/合成的棕櫚酰sm脂蛋白復(fù)合物的藥效作用。在注射脂蛋白復(fù)合物后，測(cè)量了血漿脂質(zhì)和脂蛋白水平的變化。將apoa-i/蛋sm或者apoa-i/合成的sm脂蛋白復(fù)合物以5mg/kg或者20mg/kg的劑量以1ml/min的速率經(jīng)靜脈內(nèi)輸注至耳靜脈來(lái)對(duì)兔給藥。研究了4只動(dòng)物/組。在給藥前采集血漿樣品，在輸注結(jié)束后立即采集血漿樣品，且在輸注開(kāi)始后的30分鐘、45分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)、10小時(shí)和30小時(shí)采集血漿樣品。然后針對(duì)總膽固醇、未酯化的膽固醇、磷脂和總甘油三酯使用商業(yè)酶試劑盒分析血漿樣品。使用商業(yè)elisa試劑盒在血漿樣品中測(cè)定apoa1。經(jīng)gpc分析所述血漿樣品以確定總膽固醇和未酯化膽固醇分布。對(duì)于5mg/kg劑量的處理，基于色譜圖痕跡的曲線下總面積的百分?jǐn)?shù)來(lái)定量所述結(jié)果。圖26a-26d顯示了在用5mg/kg和20mg/kg的apoa-i/蛋sm或者apoa-i/合成的sm輸注的兔中膽固醇、甘油三酯、磷脂和apoa-i隨時(shí)間推移的血漿水平。在給予的兩種劑量的輸注開(kāi)始后30分鐘內(nèi)觀察到快速且顯著的膽固醇動(dòng)員：在給予5mg/kg劑量后30分鐘時(shí)觀察到膽固醇動(dòng)員峰，且在20mg/kg劑量觀察到膽固醇動(dòng)員的大幅增強(qiáng)。在測(cè)試的每個(gè)劑量，兩種制劑均具有血漿甘油三酯、血漿磷脂和血漿重組人apoa-i的相似分布。圖27a-27c顯示了血漿hdl-總膽固醇水平、血漿ldl-總膽固醇水平和血漿vldl-總膽固醇水平。對(duì)于apoa-i/蛋sm和apoa-i/合成的sm，hdl-總膽固醇的增加是相似的(圖27a)。血漿ldl-c和vldl-c水平存在極少變化，且所述水平基本上不被注射每種制劑的脂蛋白復(fù)合物所改變(圖27b-27c)。該研究的結(jié)果顯示apoa-i/蛋sm和apoa-i/合成的sm脂蛋白復(fù)合物具有相似的體內(nèi)反應(yīng)。14.實(shí)施例8：apoa-i/dppg/sm復(fù)合物在健康血脂異常受試者中的i期研究14.1.材料和方法i期臨床試驗(yàn)作為隨機(jī)的、雙盲的、安慰劑對(duì)照的、交叉的、單一升高劑量的研究在具有大于3.0的ldl/hdl比的健康志愿者中使用式h的脂蛋白復(fù)合物進(jìn)行。該i期研究的目標(biāo)是評(píng)估在作為單劑量給藥時(shí)荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物的安全性、耐受性、藥代動(dòng)力學(xué)以及藥效學(xué)。研究了0.25、0.75、2.0、5.0、10.0、15.0、30.0和45.0mg/kg的逐漸升高的劑量。受試者經(jīng)輸注接受了已經(jīng)通過(guò)蛋白和脂質(zhì)成分的共勻漿制備的含有apoa-i(如在實(shí)施例1中所述制備)、sm和dppg(1:2.7的蛋白:脂質(zhì)重量比且97％sm/3％dppg(w/w)的脂質(zhì)組成)的脂蛋白復(fù)合物的無(wú)菌溶液。所述無(wú)菌溶液為除了脂蛋白復(fù)合物之外還含有甘露醇和蔗糖(4％(w/w)蔗糖、2％(w/w)甘露醇)的10mm磷酸鹽緩沖的溶液(ph8.0)。14.2.結(jié)果如下匯總了來(lái)自該i期研究的臨床發(fā)現(xiàn)?？偰懝檀迹涸诿總€(gè)時(shí)間點(diǎn)的平均血漿總膽固醇濃度如下顯示于表8：表8–在單一靜脈內(nèi)給藥后的平均血漿總膽固醇濃度/時(shí)間總膽固醇中的vldl、ldl和hdl：總膽固醇中的vldl、ldl和hdl隨時(shí)間點(diǎn)和劑量的平均值匯總于如下表9-11：表9-在單一靜脈內(nèi)給藥后的總膽固醇中的平均vldl表10-在單一靜脈內(nèi)給藥后的總膽固醇中的平均ldl表11-在單一靜脈內(nèi)給藥后的總膽固醇中的平均hdl未酯化的(游離)膽固醇：在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的平均血漿游離(未酯化的)膽固醇濃度顯示于如下表12：表12-在單一靜脈內(nèi)給藥后的平均血漿游離膽固醇濃度/時(shí)間游離膽固醇中的vldl、ldl和hdl：游離膽固醇中的vldl、ldl和hdl隨時(shí)間點(diǎn)和劑量的平均值顯示于如下表13-15：表13-在單一靜脈內(nèi)給藥后的游離膽固醇中的平均vldl表14-在單一靜脈內(nèi)給藥后的游離膽固醇中的平均ldl表15-在單一靜脈內(nèi)給藥后的游離膽固醇中的平均hdl甘油三酯：在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的平均血漿甘油三酯濃度顯示于如下表16：表16-在單一靜脈內(nèi)給藥后的平均血漿甘油三酯濃度/時(shí)間apoa-i：受試者的基線apoa-i(mg/dl)隨時(shí)間的變化顯示于如下表17。將每個(gè)劑量的血漿apoa-i的最大變化加為粗體。表17-在單一靜脈內(nèi)給藥后的平均血漿apoa-i變化/時(shí)間轉(zhuǎn)氨酶：與毒性相關(guān)的肝丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶或者轉(zhuǎn)氨酶水平的平均值顯示于如下表18。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的正常范圍為9-60iu/l。表18-所選的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶隨處理和時(shí)間點(diǎn)的平均值匯總不良事件：總計(jì)7名(22％)受試者具有不良事件。無(wú)受試者具有由研究者所認(rèn)為的至少可能與研究藥物相關(guān)的不良事件。似乎不存在不良事件發(fā)生的任何劑量相關(guān)的趨勢(shì)。無(wú)受試者具有嚴(yán)重的不良事件，且無(wú)受試者由于不良事件而由所述研究退出。如下表19提供了體系統(tǒng)的不良事件的匯總：14.3.結(jié)論以0.25、0.75、2.0、5.0、10.0、15.0、30.0和45.0mg/kg的單一iv劑量給予包含式h的荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物的無(wú)菌溶液的制劑的該i期研究得到以下結(jié)論。在所有受試者中所有劑量的所述制劑均為很好耐受的，不良事件分布與使用安慰劑所觀察的不良事件分布相似。所述復(fù)合物對(duì)于臨床化學(xué)、血液學(xué)或者凝固參數(shù)的影響與安慰劑相比似乎沒(méi)有差別。未觀察到對(duì)ecg的不良作用。在單一劑量給予后未檢測(cè)到對(duì)apoa-i的抗體。apoa-i和鞘磷脂的血漿濃度隨著劑量的增加而增加：對(duì)于至多10mg/kg的劑量而言在給藥后24小時(shí)內(nèi)apoa-i水平返回至基線且對(duì)于高于10mg/kg的劑量而言在給藥后72小時(shí)內(nèi)apoa-i水平返回至基線。對(duì)于至多5mg/kg的劑量而言在給藥后24小時(shí)內(nèi)鞘磷脂水平返回至基線，對(duì)于10-30mg/kg的劑量而言在給藥后72小時(shí)內(nèi)鞘磷脂水平返回至基線且對(duì)于給予45mg/kg劑量的受試者而言在給藥后7天內(nèi)鞘磷脂水平返回至基線。膽固醇動(dòng)員隨著劑量增加而增強(qiáng)：在低至2.0mg/kg的劑量觀察到游離膽固醇的hdl成分的動(dòng)員(從基線平均增加23％)且其隨劑量的增加而增強(qiáng)。甘油三酯水平瞬時(shí)增加至高于采用15mg/kg和15mg/kg以上的劑量的安慰劑所觀察到的水平。此外，給予復(fù)合物不顯著提升肝轉(zhuǎn)氨酶水平，且在所有情況下，所述水平很好地保持在正常范圍內(nèi)。這與csl-111相反，csl-111是與大豆磷脂酰膽堿復(fù)合的來(lái)自血漿的重組的純化的人apoa-i，其當(dāng)以80mg/kg患者體重的劑量給予時(shí)，已經(jīng)在一些患者中觀察到將丙氨酸氨基-轉(zhuǎn)移酶水平至多提升至正常上限的超過(guò)100-倍。tardifetal.,2007,jama297:1675-1682。因此，本公開(kāi)的復(fù)合物的給藥劑量可以低于針對(duì)模擬hdl的其它制劑所報(bào)道的劑量，且仍然實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)參數(shù)的臨床上顯著的改善而不具有有害副作用。15.實(shí)施例9：在治療具有急性冠脈綜合征的患者中對(duì)apoa-i/sm/dppg復(fù)合物的ii期臨床研究在治療心血管疾病中進(jìn)行臨床試驗(yàn)以進(jìn)一步證實(shí)低劑量的式h的荷負(fù)電的脂蛋白復(fù)合物(apoa-i、蛋-鞘磷脂(蛋-sm)和dppg，載脂蛋白:磷脂重量比為1:2.7，蛋-sm與dppg的重量比為97:3)的治療益處。所述apoa-i如上在實(shí)施例1中所述通過(guò)在cho細(xì)胞中表達(dá)來(lái)制備，且復(fù)合物通過(guò)實(shí)施例4的熱循環(huán)方法來(lái)產(chǎn)生。表現(xiàn)有acs癥狀的受試者符合該研究的篩選。在基線導(dǎo)管插入時(shí)，受試者需要對(duì)用于血管內(nèi)超聲(ivus)的一個(gè)“靶標(biāo)”動(dòng)脈(其不受先前或者目前的pci所影響)具有適當(dāng)?shù)膇vus評(píng)價(jià)，且靶標(biāo)動(dòng)脈的鄰近4cm處應(yīng)具有0和50％之間的直徑狹窄(經(jīng)視覺(jué)血管造影評(píng)估顯示)、≥2.5mm的基準(zhǔn)直徑且不具有暗示血栓的充盈缺損。一旦基線ivus已經(jīng)通過(guò)ivuscorelaboratory針對(duì)總體品質(zhì)、適當(dāng)靶標(biāo)血管的存在以及技術(shù)因素的缺失(可妨礙ivus成像的精確讀取)來(lái)評(píng)價(jià)，所述受試者隨機(jī)接受靜脈內(nèi)輸注，歷時(shí)一小時(shí)給予安慰劑或者復(fù)合物的三種劑量中的一種(3、6或者12mg/kg)。隨機(jī)化受試者以每周間隔(即每7-11天)返回以進(jìn)行五次額外的輸注。在最后一次輸注后一周(5-9天)，撤回治療結(jié)束試驗(yàn)。在最后一次輸注后約3周(14-35天)進(jìn)行隨訪ivus。在最后一次輸注后約6個(gè)月(+/-2周)進(jìn)行隨訪，以采集用于抗-apoa1抗體測(cè)試的樣品且監(jiān)測(cè)主要不良心臟事件(mace)終末點(diǎn)。主要終末點(diǎn)為通過(guò)三維ivus評(píng)估的在靶標(biāo)冠狀動(dòng)脈的30mm切片中的總斑塊體積的額定變化。其它效力測(cè)量包括在靶標(biāo)30mm切片中的斑塊體積的變化百分?jǐn)?shù)以及粥樣斑體積的變化百分?jǐn)?shù)、靶標(biāo)30mm切片的總血管體積百分?jǐn)?shù)，以及在解剖上同等的5mm切片(集中于具有基線最小斑塊負(fù)荷的位點(diǎn))的由基線至隨訪的斑塊、管腔和總血管體積的變化，和在三維ivus上的基線最大斑塊負(fù)荷。斑塊體積的變化百分?jǐn)?shù)如下計(jì)算：將額定變化除以基線值，再乘以100。粥樣斑(梗阻)體積百分?jǐn)?shù)如下經(jīng)計(jì)算機(jī)計(jì)算：將斑塊體積除以彈性外膜(eem)體積，然后乘以100。16.具體實(shí)施方案、參考文獻(xiàn)的引用本公開(kāi)的各個(gè)方面描述于如下編號(hào)的段落中所闡述的實(shí)施方案。1.脂蛋白復(fù)合物，包含載脂蛋白部分和脂質(zhì)部分，其中所述脂質(zhì)部分基本上由95-99wt％的中性磷脂和1-5wt％的負(fù)電荷磷脂構(gòu)成，其中所述載脂蛋白部分與磷脂部分的比在約1:2.7wt至約1:3wt的范圍內(nèi)。2.實(shí)施方案1的脂蛋白復(fù)合物，其中所述載脂蛋白選自前原載脂蛋白、前原apoa-i、原apoai、apoa-i、前原apoa-ii、原apoaii、apoaii、前原apoa-iv、原apoa-iv、apoa-iv、apoa-v、前原apoe、原apoe、apoe、前原apoai米蘭、原apoa-i米蘭、apoa-i米蘭、前原apoa-i巴黎、原apoa-i巴黎和apoa-i巴黎，以及它們的混合物。3.實(shí)施方案2的脂蛋白復(fù)合物，其中所述載脂蛋白基本上由具有與相應(yīng)于seqidno:1的氨基酸25-267的蛋白至少90％或者至少95％序列同一性的apoai構(gòu)成。4.實(shí)施方案3的脂蛋白復(fù)合物，其中所述載脂蛋白包含單體、二聚體和/或者四聚體。5.實(shí)施方案1-4中任一項(xiàng)的脂蛋白復(fù)合物，其中所述載脂蛋白包含apoa-i肽模擬物。6.實(shí)施方案1-5中任一項(xiàng)的脂蛋白復(fù)合物，其中所述載脂蛋白部分與磷脂部分的重量比為1:2.7。7.實(shí)施方案1-6中任一項(xiàng)的脂蛋白復(fù)合物，其中所述脂質(zhì):載脂蛋白摩爾比的范圍為約1:105至約110，其中所述載脂蛋白值表示為apoa-i等價(jià)物。8.實(shí)施方案7的脂蛋白復(fù)合物，其中脂質(zhì):載脂蛋白摩爾比為1:108。9.實(shí)施方案1-8中任一項(xiàng)的脂蛋白復(fù)合物，其中所述中性脂質(zhì)為天然鞘磷脂或者合成鞘磷脂。10.實(shí)施方案9的脂蛋白復(fù)合物，其中所述鞘磷脂為蛋-鞘磷脂。11.實(shí)施方案9的脂蛋白復(fù)合物，其由至少95％純的鞘磷脂制備。12.實(shí)施方案1-11中任一項(xiàng)的脂蛋白復(fù)合物，其中所述脂質(zhì)部分基本上由96-98wt％的中性磷脂和2-4wt％的負(fù)電荷磷脂構(gòu)成。13.實(shí)施方案12的脂蛋白復(fù)合物，其中所述脂質(zhì)部分基本上由97wt％的中性磷脂和3wt％的負(fù)電荷磷脂構(gòu)成。14.實(shí)施方案13的脂蛋白復(fù)合物，其中所述負(fù)電荷磷脂包含磷脂酰甘油。15.實(shí)施方案14的脂蛋白復(fù)合物，其中所述負(fù)電荷磷脂包含1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-[-磷酸-外消旋-(1-甘油)](dppg)的鹽或者由1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-[-磷酸-外消旋-(1-甘油)](dppg)的鹽組成。16.實(shí)施方案15的脂蛋白復(fù)合物，其中所述鹽為鈉鹽或者鉀鹽。17.實(shí)施方案1-16中任一項(xiàng)的脂蛋白復(fù)合物，其中所述中性和/或者負(fù)電荷磷脂的?；湼髯员舜霜?dú)立地選自含有12-26個(gè)、14-26個(gè)或者16-26個(gè)碳原子的飽和或者單不飽和烴。18.實(shí)施方案17的脂蛋白復(fù)合物，其中所述中性和/或者負(fù)電荷磷脂的每個(gè)酰基鏈?zhǔn)窍嗤摹?9.實(shí)施方案17的脂蛋白復(fù)合物，其中所述中性和/或者負(fù)電荷磷脂的每個(gè)?；?zhǔn)遣煌摹?0.實(shí)施方案17的脂蛋白復(fù)合物，其中所述中性和負(fù)電荷磷脂的?；満邢嗤瑪?shù)目的碳原子。21.實(shí)施方案17的脂蛋白復(fù)合物，其中所述中性和負(fù)電荷磷脂的?；溇哂胁煌娘柡投?。22.實(shí)施方案17的脂蛋白復(fù)合物，其中所述中性和負(fù)電荷磷脂的酰基鏈含有16個(gè)碳原子。23.實(shí)施方案1-22中任一項(xiàng)的脂蛋白復(fù)合物的群體。24.脂蛋白復(fù)合物的群體，其各自包含脂質(zhì)部分和基本上由載脂蛋白a-i(“apoa-i”)構(gòu)成的載脂蛋白部分，其中所述群體的特征在于以下特征中的一、二、三、四、五、六、七、八、九或者所有十種：(a)所述群體中至少80wt％、至少85wt％、至少90wt％或者至少95wt％的apoa-i為成熟形式；(b)所述群體中不超過(guò)20wt％、不超過(guò)15wt％、不超過(guò)10wt％或者不超過(guò)5wt％的apoa-i為不成熟形式；(c)所述群體含有不超過(guò)100皮克、不超過(guò)50皮克、不超過(guò)25皮克、不超過(guò)10皮克或者不超過(guò)5皮克宿主細(xì)胞dna/毫克的apoa-i；(d)所述群體含有不超過(guò)500納克、不超過(guò)200納克、不超過(guò)100納克、不超過(guò)50納克或者不超過(guò)20納克宿主細(xì)胞蛋白/毫克的apoa-i；(e)所述群體中不超過(guò)20wt％、不超過(guò)15wt％、不超過(guò)10wt％或者不超過(guò)5wt％的apoa-i為截短形式；(f)所述群體中的所述apoa-i的蛋氨酸112和蛋氨酸148各自的不超過(guò)20％、不超過(guò)15％、不超過(guò)10％、不超過(guò)5％、不超過(guò)3％、不超過(guò)2％或者不超過(guò)1％被氧化；(g)至少80％、至少85％、至少90％或者至少90％的所述脂蛋白復(fù)合物為粒度為4nm至15nm或者6nm至15nm的顆粒形式，如經(jīng)凝膠滲透色譜法(“gpc”)或者動(dòng)態(tài)光散射(“dls”)所測(cè)量；(h)所述群體含有不超過(guò)1eu內(nèi)毒素/毫克apoa-i、不超過(guò)0.5eu內(nèi)毒素/毫克apoa-i、不超過(guò)0.3eu內(nèi)毒素/毫克apoa-i或者不超過(guò)0.1eu內(nèi)毒素/毫克apoa-i；以及(i)所述群體中的所述apoa-i中不超過(guò)10％、不超過(guò)5％、不超過(guò)4％、不超過(guò)3％、不超過(guò)2％或者不超過(guò)1％的氨基酸被脫去酰胺。25.實(shí)施方案24的群體，其中所述復(fù)合物中的脂質(zhì)部分中不超過(guò)15wt％、不超過(guò)10wt％、不超過(guò)5wt％或者不超過(guò)2wt％的脂質(zhì)為膽固醇。26.實(shí)施方案25的群體，其不含有膽固醇。27.實(shí)施方案24-26中任一項(xiàng)的群體，其中至少85％、至少90％或者至少95％的蛋白為成熟apoa-i蛋白。28.實(shí)施方案27的群體，其中小于15％、小于10％或者小于10％的蛋白被氧化、被脫去酰胺和/或者被截短的。29.實(shí)施方案24-28中任一項(xiàng)的群體，其中所述脂蛋白復(fù)合物為至少90％純的、至少92.5％純的、至少95％純的、至少96％純的、至少97％純的或者至少98％純的。30.實(shí)施方案24-29中任一項(xiàng)的群體，其中所述脂蛋白復(fù)合物為至少80％均質(zhì)的、至少85％均質(zhì)的、至少90％均質(zhì)的或者至少95％均質(zhì)的，如由凝膠滲透色譜法中的單峰所反映。31.實(shí)施方案30的群體，其中至少80％、至少85％、至少90％或者至少95％的脂蛋白復(fù)合物的粒度范圍為4nm至12nm、6nm至12nm或者8nm至12nm，如經(jīng)gpc或者dls所測(cè)量。32.實(shí)施方案24-31中任一項(xiàng)的群體，其中至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％的蛋白為復(fù)合物。33.實(shí)施方案24-32中任一項(xiàng)的群體，其不含有膽酸鹽。34.實(shí)施方案24-33中任一項(xiàng)的群體，其不含有任何洗滌劑。35.實(shí)施方案24-34中任一項(xiàng)的群體，其含有小于200ppm、小于100ppm或者小于50ppm的非水溶劑。36.實(shí)施方案24-35中任一項(xiàng)的群體，其中所述apoa-i為人apoa-i蛋白。37.實(shí)施方案24-36中任一項(xiàng)的群體，其中所述apoa-i為重組apoa-i。38.實(shí)施方案24-37中任一項(xiàng)的群體，其中所述apoa-i具有與相應(yīng)于seqidno:1的氨基酸25-267的蛋白至少90％或者至少95％序列同一性的氨基酸序列。39.實(shí)施方案24-38中任一項(xiàng)的群體，其中所述脂質(zhì)部分基本上由95-99wt％中性磷脂和1-5wt％負(fù)電荷磷脂構(gòu)成。40.實(shí)施方案39的群體，其中所述脂質(zhì)部分基本上由96-98wt％中性磷脂和2-4wt％負(fù)電荷磷脂構(gòu)成。41.實(shí)施方案24-40中任一項(xiàng)的群體，其中所述脂質(zhì)部分基本上由97wt％中性磷脂和3wt％負(fù)電荷磷脂構(gòu)成。42.實(shí)施方案41的群體，其中所述中性脂質(zhì)為天然鞘磷脂或者合成鞘磷脂，任選地其中所述脂質(zhì)具有小于5meqo/kg、小于4meqo/kg、小于3meqo/kg或者小于2meqo/kg的過(guò)氧化值。43.實(shí)施方案42的群體，其中所述鞘磷脂為蛋-鞘磷脂。44.實(shí)施方案42的群體，其由至少95％純的鞘磷脂制備。45.實(shí)施方案41-44中任一項(xiàng)的群體，其中所述負(fù)電荷磷脂包含磷脂酰甘油。46.實(shí)施方案45的群體，其中所述負(fù)電荷磷脂包含1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-[-磷酸-外消旋-(1-甘油)](dppg)的鹽或者由1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-[-磷酸-外消旋-(1-甘油)](dppg)的鹽組成。47.實(shí)施方案46的群體，其中所述鹽為鈉鹽或者鉀鹽。48.實(shí)施方案24-47中任一項(xiàng)的群體，其中所述中性和/或者負(fù)電荷磷脂的?；湼髯员舜霜?dú)立地選自含有12-26個(gè)、14-26個(gè)或者16-26個(gè)碳原子的飽和或者單-不飽和的烴。49.實(shí)施方案48的群體，其中所述中性和/或者負(fù)電荷磷脂的每個(gè)酰基鏈?zhǔn)窍嗤摹?0.實(shí)施方案48的群體，其中所述中性和/或者負(fù)電荷磷脂的每個(gè)?；?zhǔn)遣煌摹?1.實(shí)施方案48的群體，其中所述中性和負(fù)電荷磷脂的?；満邢嗤瑪?shù)目的碳原子。52.實(shí)施方案48的群體，其中所述中性和負(fù)電荷磷脂的?；溇哂胁煌娘柡投?。53.實(shí)施方案48的群體，其中所述中性和負(fù)電荷磷脂的?；満?6個(gè)碳原子。54.實(shí)施方案24-41中任一項(xiàng)的群體，其具有的載脂蛋白部分:脂質(zhì)部分摩爾比的范圍為1:80-120、1:85-1:110或者1:100-1:115，其中所述載脂蛋白值表示為apoa-i等價(jià)物。55.實(shí)施方案54的群體，其具有的載脂蛋白部分:脂質(zhì)部分摩爾比的范圍為1:80-1:90、1:90-1:100、1:100-1:110或者1:105-1:110，其中所述載脂蛋白值表示為apoa-i等價(jià)物。56.實(shí)施方案24-55中任一項(xiàng)的群體，其具有的載脂蛋白部分與磷脂部分的重量比的范圍為1:2至約1:3。57.實(shí)施方案24-40中任一項(xiàng)的群體，其中所述載脂蛋白部分與磷脂部分的重量比的范圍為1:2.1-1:2.7。58.實(shí)施方案57的群體，其中所述載脂蛋白部分與磷脂部分的重量比為1:2.7。59.藥物組合物，包含實(shí)施方案1-22中任一項(xiàng)的脂蛋白復(fù)合物或者實(shí)施方案23-58中任一項(xiàng)的脂蛋白復(fù)合物的群體以及一種或者多種藥用載體、稀釋劑和/或者賦形劑或者基本上由實(shí)施方案1-22中任一項(xiàng)的脂蛋白復(fù)合物或者實(shí)施方案23-58中任一項(xiàng)的脂蛋白復(fù)合物的群體以及一種或者多種藥用載體、稀釋劑和/或者賦形劑構(gòu)成。60.工程化以表達(dá)apoa-i蛋白的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，所述apoa-i蛋白包含與seqidno:1的位置25-267具有至少95％的同一性的氨基酸序列。61.實(shí)施方案60的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，其中當(dāng)在培養(yǎng)宿主細(xì)胞時(shí)所述蛋白分泌至培養(yǎng)基中。62.實(shí)施方案60或者實(shí)施方案61的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，其中所述蛋白進(jìn)一步包含信號(hào)序列mkaavltlavlfltgsqa。63.實(shí)施方案60-62中任一項(xiàng)的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，其中所述蛋白進(jìn)一步包含前肽序列rhfwqq。64.實(shí)施方案60-63中任一項(xiàng)的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，其為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(cho)、cho-s、cho-k1、vero、bhk、bhk570、hela、cos-1、cos-7、mdck細(xì)胞、293、3t3、骨髓瘤、pc12和w138。65.實(shí)施方案64的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，其為cho細(xì)胞。66.實(shí)施方案65的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，其為cho-s細(xì)胞或者cho-k1細(xì)胞。67.實(shí)施方案60-66中任一項(xiàng)的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，其能夠在培養(yǎng)物中產(chǎn)生至少0.5、1、2、3或者4g/l的所述apoa-i蛋白。68.實(shí)施方案67的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，其能夠在培養(yǎng)物中產(chǎn)生至多4、5、6、7、8、9、10、12、15或者20g/l的所述apoa-i蛋白。69.實(shí)施方案67或者實(shí)施方案68的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，其中所述培養(yǎng)物為大規(guī)模培養(yǎng)物。70.實(shí)施方案69的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，其中所述大規(guī)模培養(yǎng)物為至少15升、至少20升、至少25升或者至少30升。71.實(shí)施方案70的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，其中所述大規(guī)模培養(yǎng)物為約50升、約100升、約200升或者約300升。72.實(shí)施方案60-71中任一項(xiàng)的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，其包含至少約5拷貝的編碼所述apoa-i蛋白的核苷酸序列。73.實(shí)施方案72的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，其中每個(gè)核苷酸序列可操作地與啟動(dòng)子連接。74.實(shí)施方案73的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，其中所述啟動(dòng)子為巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子。75.實(shí)施方案74的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，其中所述啟動(dòng)子為即早猿猴巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子。76.實(shí)施方案60-75中任一項(xiàng)的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，其分泌成熟apoa-i蛋白，所述成熟apoa-i蛋白包含相應(yīng)于seqidno:1的氨基酸25-267的氨基序列或者由相應(yīng)于seqidno:1的氨基酸25-267的氨基序列構(gòu)成。77.哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物，包含多個(gè)實(shí)施方案60-76中任一項(xiàng)的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。78.實(shí)施方案77的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物，其包含至少約0.5g/l的成熟apoa-i蛋白，其包含相應(yīng)于seqidno:1的氨基酸25-267的氨基序列或者由相應(yīng)于seqidno:1的氨基酸25-267的氨基序列構(gòu)成。79.實(shí)施方案78的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物，其中至少80％、至少85％或者至少90％的所述成熟apoa-i蛋白缺失信號(hào)序列。80.實(shí)施方案78的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物，其中至少80％、至少85％或者至少90％的所述成熟apoa-i蛋白缺失信號(hào)序列和前肽序列。81.實(shí)施方案78-80中任一項(xiàng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物，其中至少80％、至少85％或者至少90％的所述成熟apoa-i蛋白未被截短、氧化或者被脫去酰胺。82.產(chǎn)生成熟的生物學(xué)活性apoa-1蛋白的方法，包括在表達(dá)并分泌apoa-i蛋白的條件下培養(yǎng)實(shí)施方案60-76中任一項(xiàng)的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。83.實(shí)施方案82的方法，進(jìn)一步包括由所述培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的上清液回收所述成熟的生物學(xué)活性apoa-1蛋白。84.實(shí)施方案82或者實(shí)施方案83的方法，進(jìn)一步包括純化apoa-i蛋白。85.藥物組合物，包含治療有效量的由實(shí)施方案84的方法獲得的apoa-i蛋白或者可由實(shí)施方案84的方法獲得的apoa-i蛋白。86.實(shí)施方案85的藥物組合物，其中所述apoa-i蛋白與脂質(zhì)復(fù)合。87.用于在包含apoa-i的藥物組合物中最小化氧化產(chǎn)物的方法，包括在惰性氣體下制造所述藥物組合物。88.實(shí)施方案87的方法，其中所述惰性氣體為氮?dú)?、氦氣或者氬氣?9.實(shí)施方案87或者實(shí)施方案88的方法，其中所述藥物組合物為包含apoa-i的脂蛋白復(fù)合物的藥物組合物。90.制備脂蛋白復(fù)合物的方法，包括：(a)從第一溫度范圍內(nèi)的溫度至第二溫度范圍內(nèi)的溫度冷卻包含脂質(zhì)成分和蛋白成分的起始混懸液，其中所述脂質(zhì)成分基本上由脂質(zhì)顆粒構(gòu)成，且其中所述蛋白成分基本上由脂質(zhì)-結(jié)合肽和/或者脂質(zhì)-結(jié)合蛋白構(gòu)成；(b)從在所述第二溫度范圍內(nèi)的溫度至所述第一溫度范圍內(nèi)的溫度加熱所述(a)的冷卻的混懸液；(c)從在所述第一溫度范圍內(nèi)的溫度至所述第二溫度范圍內(nèi)的溫度冷卻所述(b)的加熱的混懸液；以及(d)重復(fù)步驟(b)和(c)至少一次，由此形成脂蛋白復(fù)合物。91.實(shí)施方案90的方法，其中步驟(c)包括重復(fù)步驟(a)和(b)直到至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或者至少99％的所述脂質(zhì)成分和/或者所述蛋白成分為復(fù)合物形式。92.實(shí)施方案90或者實(shí)施方案91的方法，其中步驟(c)包括重復(fù)步驟(a)和(b)直到獲得至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或者至少99％均質(zhì)性的脂蛋白復(fù)合物。93.實(shí)施方案90-92中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(d)包括重復(fù)步驟(b)和(c)至少三次、至少四次或者至少五次。94.實(shí)施方案90-93中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(c)包括重復(fù)步驟(b)和(c)至多六次、至多八次或者至多十次。95.實(shí)施方案90-94中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(a)后，將所述混懸液保持在第二溫度范圍達(dá)至少1、至少2、至少3、至少4或者至少5分鐘，之后進(jìn)行所述加熱步驟(b)。96.實(shí)施方案90-95中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(a)后，將所述混懸液保持在第二溫度范圍達(dá)至多6、至多8、至多10、至多20分鐘、至多30分鐘或者至多1小時(shí)，之后進(jìn)行所述加熱步驟(b)。97.實(shí)施方案90-96中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(b)后，將所述混懸液保持在第一溫度范圍達(dá)至少1、至少2、至少3、至少4或者至少5分鐘，之后進(jìn)行所述冷卻步驟(c)。98.實(shí)施方案90-97中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(b)后，將所述混懸液保持在第一溫度范圍達(dá)至多6、至多8、至多10、至多20分鐘、至多30分鐘或者至多1小時(shí)，之后進(jìn)行所述冷卻步驟(c)。99.實(shí)施方案90-98中任一項(xiàng)的方法，其中不使所得的脂蛋白復(fù)合物進(jìn)行離心。100.實(shí)施方案90-99中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(a)的所述起始混懸液中，所述脂質(zhì)成分和蛋白成分分別代表大部分脂質(zhì)以及蛋白和肽。101.實(shí)施方案90-100中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(a)的所述起始混懸液中，所述脂質(zhì)成分代表至少60％、至少70％、至少80％或者至少90％的脂質(zhì)。102.實(shí)施方案90-101中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(a)的所述起始混懸液中，所述蛋白成分代表至少60％、至少70％、至少80％或者至少90％的蛋白和肽。103.實(shí)施方案90-102中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(a)的所述起始混懸液中，在所述混懸液中的至多5％、至多10％、至多15％或者至多20％的脂質(zhì)預(yù)先與所述蛋白成分復(fù)合。104.實(shí)施方案90-103中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一溫度范圍包括低于所述蛋白成分的轉(zhuǎn)變溫度不小于10℃且高于所述蛋白成分的轉(zhuǎn)變溫度不超過(guò)15、不超過(guò)10或者不超過(guò)5℃的溫度。105.實(shí)施方案90-104中任一項(xiàng)的方法，其中所述第二溫度范圍包括低于所述蛋白成分的轉(zhuǎn)變溫度不小于5或者不小于10℃且高于所述蛋白成分的轉(zhuǎn)變溫度不超過(guò)5℃的溫度。106.實(shí)施方案90-105中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一溫度范圍的跨度不超過(guò)1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、7℃或者10℃。107.實(shí)施方案90-106中任一項(xiàng)的方法，其中所述第二溫度范圍的跨度不超過(guò)1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、7℃或者10℃。108.實(shí)施方案90-107中任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括形成所述起始混懸液的步驟。109.實(shí)施方案108的方法，其中形成所述混懸液包括使得各自在所述第一范圍的溫度預(yù)先加熱的脂質(zhì)顆粒的混懸液以及所述脂質(zhì)-結(jié)合肽和/或者脂質(zhì)-結(jié)合蛋白的溶液混合的步驟。110.實(shí)施方案108的方法，其中形成所述混懸液包括使得各自在所述第一范圍的溫度預(yù)先加熱的脂質(zhì)顆粒群體和預(yù)先與脂質(zhì)復(fù)合的所述脂質(zhì)-結(jié)合肽和/或者脂質(zhì)-結(jié)合蛋白混合。111.實(shí)施方案110的方法，其中所述起始混懸液中的預(yù)先與脂質(zhì)-結(jié)合肽和/或者脂質(zhì)-結(jié)合蛋白復(fù)合的脂質(zhì)占總脂質(zhì)的不超過(guò)5％、不超過(guò)10％、不超過(guò)15％或者不超過(guò)20％。112.實(shí)施方案109-111中任一項(xiàng)的方法，其中所述脂質(zhì)溶液為均質(zhì)的脂質(zhì)溶液。113.實(shí)施方案112的方法，進(jìn)一步包括在所述混合步驟之前使用高壓勻漿形成均質(zhì)的脂質(zhì)的溶液的步驟。114.實(shí)施方案113的方法，其中所述高壓勻漿處于高于1500巴、高于1800巴或者高于2000巴的壓力。115.實(shí)施方案114的方法，其中所述高壓勻漿在1900-2500巴的壓力進(jìn)行。116.實(shí)施方案90-115中任一項(xiàng)的方法，其中所述脂質(zhì)成分基本上由脂質(zhì)顆粒構(gòu)成，所述脂質(zhì)顆粒：(i)具有至少45nm、至少50nm、至少55nm或者至少60nm的粒度，如經(jīng)dls所測(cè)量；以及(ii)具有至多65nm、至多70nm、至多75nm、至多80nm、至多100nm、至多120nm、至多150nm、至多200nm、至多250nm、至多300nm、至多500nm的粒度，如經(jīng)dls所測(cè)量。117.實(shí)施方案116的方法，所述脂質(zhì)顆粒具有至多65nm、至多70nm、至多75nm或者至多80nm的粒度，如經(jīng)dls所測(cè)量。118.實(shí)施方案116的方法，所述脂質(zhì)顆粒具有至多100nm、至多120nm、至多150nm、至多200nm、至多250nm、至多300nm、至多500nm的粒度，如經(jīng)dls所測(cè)量。119.實(shí)施方案90-116中任一項(xiàng)的方法，其中重復(fù)步驟(b)和(c)直到獲得4nm至15nm、5nm至15nm、6nm至15nm或者8nm至15nm粒度的脂蛋白復(fù)合物。120.實(shí)施方案90-116中任一項(xiàng)的方法，其中重復(fù)步驟(b)和(c)直到獲得5nm至12nm、6nm至12nm或者8nm至12nm粒度的脂蛋白復(fù)合物。121.實(shí)施方案90-120中任一項(xiàng)的方法，其中一個(gè)、多于一個(gè)或者所有步驟在惰性氣體下進(jìn)行。122.實(shí)施方案121的方法，其中所述惰性氣體為氮?dú)狻?23.實(shí)施方案90-122中任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白成分包含脂質(zhì)-結(jié)合蛋白或者由脂質(zhì)-結(jié)合蛋白組成。124.實(shí)施方案123的方法，其中所述脂質(zhì)-結(jié)合蛋白為apoa-i、apoa-ii、apoa-iv、apoc-i、apoc-ii、apoc-iii、apoe或者它們的混合物。125.實(shí)施方案90-122中任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白成分包含脂質(zhì)-結(jié)合肽或者由脂質(zhì)-結(jié)合肽組成。126.實(shí)施方案125的方法，其中所述脂質(zhì)結(jié)合肽為apoa-i、apoa-ii、apoa-iv、apoc-i、apoc-ii、apoc-iii、apoe的類(lèi)似物或者它們的混合物。127.實(shí)施方案90-126中任一項(xiàng)的方法，其中所述脂質(zhì)成分包含天然脂質(zhì)、合成的脂質(zhì)或者它們的混合物或者由天然脂質(zhì)、合成的脂質(zhì)或者它們的混合物組成。128.實(shí)施方案127的方法，其中所述脂質(zhì)成分包含以下物質(zhì)或者由以下物質(zhì)組成：醚磷脂、短鏈磷脂、膽固醇、膽固醇衍生物、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、鞘脂質(zhì)、磷脂酰甘油、神經(jīng)節(jié)苷酯和/或者腦苷脂。129.實(shí)施方案128的方法，其中所述脂質(zhì)成分包含以下物質(zhì)或者由以下物質(zhì)組成：蛋磷脂酰膽堿、大豆磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、1-肉豆蔻酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿、1-棕櫚酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、1-棕櫚酰-2-硬脂酰磷脂酰膽堿、1-硬脂酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕櫚酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰絲氨酸、二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸、鞘磷脂、二棕櫚酰鞘磷脂、二硬脂酰鞘磷脂、二棕櫚酰磷脂?；视望}、磷脂酸、半乳糖腦苷脂、二月桂基磷脂酰膽堿、(1,3)-d-甘露糖基(1,3)甘油二酯、氨基苯基糖苷和/或者3-膽固醇基-6'-(糖基硫基)己基醚糖脂。130.實(shí)施方案90-126中任一項(xiàng)的方法，其中所述脂質(zhì)成分包含中性脂質(zhì)。131.實(shí)施方案130的方法，其中所述脂質(zhì)成分主要為中性脂質(zhì)。132.實(shí)施方案130或者實(shí)施方案131的方法，其中所述中性脂質(zhì)包含鞘磷脂。133.實(shí)施方案132的方法，其中所述中性脂質(zhì)主要為鞘磷脂。134.實(shí)施方案132或者實(shí)施方案133的方法，其中所述鞘磷脂包含d-赤蘚糖-鞘磷脂和/或者d-赤蘚糖二氫鞘磷脂或者由d-赤蘚糖-鞘磷脂和/或者d-赤蘚糖二氫鞘磷脂構(gòu)成。135.實(shí)施方案130-135中任一項(xiàng)的方法，其中所述起始混懸液進(jìn)一步包含負(fù)電荷磷脂。136.實(shí)施方案135的方法，其中所述負(fù)電荷磷脂包含磷脂酰甘油或者由磷脂酰甘油構(gòu)成。137.實(shí)施方案136的方法，其中所述磷脂酰甘油具有c16:0?；?。138.實(shí)施方案136或者實(shí)施方案137的方法，其中所述磷脂酰甘油包含1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3--磷酸-(1'--外消旋-甘油)的鹽或者由1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3--磷酸-(1'--外消旋-甘油)的鹽構(gòu)成。139.實(shí)施方案138的方法，其中所述鹽為鈉鹽。140.實(shí)施方案90-139中任一項(xiàng)的方法，其中所述起始混懸液的脂質(zhì):蛋白摩爾比為約2:1至約200:1。141.實(shí)施方案140的方法，其中所述起始混懸液的脂質(zhì):蛋白摩爾比為約10:1至約125:1。142.實(shí)施方案140的方法，其中所述起始混懸液的脂質(zhì):蛋白摩爾比為約10:1至約150:1。143.實(shí)施方案140的方法，其中所述起始混懸液的脂質(zhì):蛋白摩爾比為約75:1至125:1。144.實(shí)施方案90-143中任一項(xiàng)的方法，其中所述起始混懸液含有范圍為2-6(荷負(fù)電的脂質(zhì)):90-120(中性脂質(zhì)):1(脂質(zhì)-結(jié)合肽、脂質(zhì)結(jié)合蛋白或者它們的混合物)的摩爾比的荷負(fù)電的脂質(zhì)、中性脂質(zhì)和脂質(zhì)-結(jié)合肽。145.實(shí)施方案90-144中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一溫度范圍為55℃至60℃。146.實(shí)施方案90-145中任一項(xiàng)的方法，其中所述第二溫度范圍為35℃至40℃。147.實(shí)施方案90-146中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括將所得的脂蛋白復(fù)合物低壓凍干的步驟。148.實(shí)施方案147的方法，進(jìn)一步包括在低壓凍干前加入等滲劑的步驟。149.藥物組合物，包含脂蛋白復(fù)合物的群體，其中所述脂蛋白復(fù)合物：(a)具有4nm至15nm、6nm至15nm、5至12nm或者8至10nm的粒度，如經(jīng)gpc或者dls所測(cè)量；以及(b)為至少75％均質(zhì)的、至少80％均質(zhì)的、至少85％均質(zhì)的、至少90％均質(zhì)的、至少95％均質(zhì)的、至少97％均質(zhì)的、至少98％均質(zhì)的或者至少99％均質(zhì)的，如由凝膠滲透色譜法中的單峰所反映。150.制備藥物組合物的方法，包括：(a)制備實(shí)施方案90-146中任一項(xiàng)的脂蛋白復(fù)合物的群體；和(b)使得所述脂蛋白復(fù)合物的群體與一種或者多種藥用賦形劑混合。151.實(shí)施方案150的方法，其中所述藥物組合物在惰性氣體下制備。152.實(shí)施方案151的方法，其中所述惰性氣體為氮?dú)?、氦氣或者氬氣?53.實(shí)施方案150-152中任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括將藥物組合物低壓凍干的步驟。154.實(shí)施方案150-152中任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括將藥物組合物等分為單獨(dú)的單位劑量的步驟。155.實(shí)施方案154的方法，進(jìn)一步包括將單獨(dú)的單位劑量低壓凍干的步驟。156.制備藥物組合物的方法，包括將經(jīng)實(shí)施方案147的方法或者實(shí)施方案153或者實(shí)施方案155的方法制備的低壓凍干的脂蛋白復(fù)合物制劑重構(gòu)。157.實(shí)施方案156的方法，進(jìn)一步包括使得重構(gòu)的脂蛋白復(fù)合物與一種或者多種藥用賦形劑混合。158.實(shí)施方案156或者實(shí)施方案157的方法，進(jìn)一步包括將藥物組合物等分為單獨(dú)的單位劑量的步驟。159.經(jīng)實(shí)施方案150或者實(shí)施方案156的方法制備的液體藥物組合物。160.經(jīng)實(shí)施方案153的方法制備的低壓凍干的藥物組合物。161.經(jīng)實(shí)施方案158的方法制備的液體單位劑型。162.液體單位劑型，包含治療有效量的實(shí)施方案149的藥物組合物。163.經(jīng)實(shí)施方案155的方法制備的無(wú)水單位劑型。164.治療血脂異常障礙的方法，包括向有此需要的受試者給予治療有效量的：(a)實(shí)施方案1-22中任一項(xiàng)的脂蛋白復(fù)合物；(b)實(shí)施方案23-58中任一項(xiàng)的脂蛋白復(fù)合物的群體；(c)實(shí)施方案59、149和159中任一項(xiàng)的藥物組合物；(d)經(jīng)實(shí)施方案90-148中任一項(xiàng)的方法制備的治療有效量的脂蛋白復(fù)合物；(e)實(shí)施方案161或者實(shí)施方案162的單位劑型；(f)在單一給藥至多45mg/kg至健康志愿者之后不導(dǎo)致肝酶提升的脂蛋白復(fù)合物；(g)在向人類(lèi)受試者進(jìn)行二、三、四、五或者六次給藥后不導(dǎo)致肝酶提升的脂蛋白復(fù)合物；(h)在向人類(lèi)受試者以1mg/kg至20mg/kg的劑量單一給藥后不導(dǎo)致肝酶提升的脂蛋白復(fù)合物；(i)在向人類(lèi)受試者以1mg/kg至20mg/kg的每次給藥劑量進(jìn)行二、三、四、五或者六次給藥后不導(dǎo)致肝酶提升的脂蛋白復(fù)合物；(j)在單一給藥至多20mg/kg至健康志愿者之后不導(dǎo)致多于兩倍的甘油三酯的增加的脂蛋白復(fù)合物；(k)在向人類(lèi)受試者進(jìn)行二、三、四、五或者六次給藥后不導(dǎo)致多于兩倍的甘油三酯的增加的脂蛋白復(fù)合物；(l)在向人類(lèi)受試者以1mg/kg至20mg/kg的劑量單一給藥后不導(dǎo)致多于兩倍的甘油三酯的增加的脂蛋白復(fù)合物；或者(m)在向人類(lèi)受試者以1mg/kg至20mg/kg的每次給藥劑量進(jìn)行二、三、四、五或者六次給藥后不導(dǎo)致多于兩倍的甘油三酯的增加的脂蛋白復(fù)合物。165.實(shí)施方案164的方法，進(jìn)一步包括重復(fù)所述給藥。166.實(shí)施方案165的方法，其中所述給藥以6天至12天的間隔重復(fù)。167.實(shí)施方案166的方法，其中每周給藥。168.實(shí)施方案165-167中任一項(xiàng)的方法，其中歷時(shí)一個(gè)月、五周、六周、兩個(gè)月、三個(gè)月、六個(gè)月、一年、2年、3年或者更長(zhǎng)的時(shí)間進(jìn)行給藥。169.實(shí)施方案165-167中任一項(xiàng)的方法，其中進(jìn)行給藥一次、兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次或者十二次。170.實(shí)施方案164-169中任一項(xiàng)的方法，其中進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥。171.實(shí)施方案170的方法，其中經(jīng)輸注給藥。172.實(shí)施方案實(shí)施方案171的方法，其中歷時(shí)一至四小時(shí)進(jìn)行輸注。173.實(shí)施方案171的方法，其中歷時(shí)至多24小時(shí)進(jìn)行輸注。174.實(shí)施方案170-173中任一項(xiàng)的方法，其中脂蛋白復(fù)合物的量的范圍為每次給藥約0.25mg/kgapoa-i等價(jià)物至約30mg/kgapoa-i等價(jià)物。175.實(shí)施方案174的方法，其中脂蛋白復(fù)合物的量的范圍為每次給藥約1mg/kgapoa-i等價(jià)物至約15mg/kgapoa-i等價(jià)物。176.實(shí)施方案175的方法，其中脂蛋白復(fù)合物的量的范圍為每次給藥約2mg/kgapoa-i等價(jià)物至約12mg/kgapoa-i等價(jià)物。177.實(shí)施方案176的方法，其中脂蛋白復(fù)合物的量為每次給藥約3mg/kgapoa-i等價(jià)物。178.實(shí)施方案176的方法，其中脂蛋白復(fù)合物的量為每次給藥約6mg/kgapoa-i等價(jià)物。179.實(shí)施方案176的方法，其中脂蛋白復(fù)合物的量為每次給藥約12mg/kgapoa-i等價(jià)物。180.治療血脂異常障礙的方法，包括：(a)向受試者給予1mg/kg至12mg/kg的初始劑量的以下物質(zhì)：(i)實(shí)施方案1-22中任一項(xiàng)的脂蛋白復(fù)合物；(ii)實(shí)施方案23-58中任一項(xiàng)的脂蛋白復(fù)合物的群體；(iii)實(shí)施方案59、149和159中任一項(xiàng)的藥物組合物；(iv)經(jīng)實(shí)施方案90-148中任一項(xiàng)的方法制備的治療有效量的脂蛋白復(fù)合物；(v)實(shí)施方案161或者實(shí)施方案162的單位劑型；(vi)在單一給藥至多45mg/kg至健康志愿者之后不導(dǎo)致肝酶提升的脂蛋白復(fù)合物；(vii)在向人類(lèi)受試者進(jìn)行二、三、四、五或者六次給藥后不導(dǎo)致肝酶提升的脂蛋白復(fù)合物；(viii)在向人類(lèi)受試者以1mg/kg至20mg/kg的劑量單一給藥后不導(dǎo)致肝酶提升的脂蛋白復(fù)合物；(ix)在向人類(lèi)受試者以1mg/kg至20mg/kg的每次給藥劑量進(jìn)行二、三、四、五或者六次給藥后不導(dǎo)致肝酶提升的脂蛋白復(fù)合物；(x)在單一給藥至多20mg/kg至健康志愿者之后不導(dǎo)致多于兩倍的甘油三酯的增加的脂蛋白復(fù)合物；(xi)在向人類(lèi)受試者進(jìn)行二、三、四、五或者六次給藥后不導(dǎo)致多于兩倍的甘油三酯的增加的脂蛋白復(fù)合物；(xii)在向人類(lèi)受試者以1mg/kg至20mg/kg的劑量單一給藥后不導(dǎo)致多于兩倍的甘油三酯的增加的脂蛋白復(fù)合物；或者(xiii)在向人類(lèi)受試者以1mg/kg至20mg/kg的每次給藥劑量進(jìn)行二、三、四、五或者六次給藥后不導(dǎo)致多于兩倍的甘油三酯的增加的脂蛋白復(fù)合物；(b)在所述給藥后4、8、12、24、48、72、168、336或者504小時(shí)確定所述受試者的甘油三酯、vldl-膽固醇和/或者vldl-甘油三酯是否提升至多于兩倍；以及(c)如果所述受試者的甘油三酯、vldl-膽固醇和/或者vldl-甘油三酯提升至給藥前水平的多于兩倍，則以較低劑量重復(fù)所述給藥，且如果所述受試者的甘油三酯、vldl-膽固醇和/或者vldl-甘油三酯并未提升至給藥前水平的多于兩倍，則以相同或者更大的劑量重復(fù)所述給藥。181.實(shí)施方案165-180中任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者具有高脂血癥或者心血管疾病或者易發(fā)高脂血癥或者心血管疾病。182.實(shí)施方案181的方法，其中所述患者具有高脂血癥或者易發(fā)高脂血癥，且所述高脂血癥為高膽固醇血癥。183.實(shí)施方案181的方法，其中所述患者具有心血管疾病或者易發(fā)心血管疾病，且其中所述心血管疾病為動(dòng)脈粥樣硬化、中風(fēng)、心肌梗塞、急性冠脈綜合征、心絞痛、間歇性跛行、嚴(yán)重肢體缺血、房脈瓣硬化或者再狹窄。184.實(shí)施方案165-183中任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括另外給予膽汁酸樹(shù)脂、煙酸、抗炎劑、他汀類(lèi)藥物、貝特類(lèi)、cetp抑制劑、血小板凝聚抑制劑、抗凝血?jiǎng)?、pcsk9激動(dòng)劑和/或者膽固醇吸收抑制劑。185.實(shí)施方案181的方法，進(jìn)一步包括給予選自阿托伐他汀、羅蘇伐他汀、普伐他汀或者洛伐他汀的他汀類(lèi)藥物。186.實(shí)施方案181的方法，進(jìn)一步包括給予貝特類(lèi)非諾貝特。187.實(shí)施方案181的方法，進(jìn)一步包括給予膽固醇吸收抑制劑zetia。188.實(shí)施方案181的方法，進(jìn)一步包括給予選自安塞曲匹和達(dá)塞曲匹的cetp抑制劑。189.實(shí)施方案181的方法，進(jìn)一步包括給予pcsk9抗體激動(dòng)劑或者pcsk9配體激動(dòng)劑。190.實(shí)施方案181的方法，進(jìn)一步包括給予膽固醇吸收抑制劑氯吡格雷硫酸氫鹽。191.實(shí)施方案181的方法，進(jìn)一步包括給予抗凝血?jiǎng)┤A法林。192.實(shí)施方案181的方法，進(jìn)一步包括給予抗炎劑阿司匹林。193.組合物，包含一個(gè)、兩個(gè)或者三個(gè)均質(zhì)的脂蛋白復(fù)合物群體。194.實(shí)施方案193的組合物，其中在至少一個(gè)均質(zhì)的群體中的脂蛋白復(fù)合物具有實(shí)施方案1-22中任一項(xiàng)的復(fù)合物特征。195.實(shí)施方案193或者實(shí)施方案194的組合物，其中所述群體中的至少一個(gè)、兩個(gè)或者三個(gè)具有實(shí)施方案23-58中任一項(xiàng)的群體特征。所有引用的參考文獻(xiàn)均通過(guò)引用的方式將其內(nèi)容并入本申請(qǐng)中以用于所有目的，就如同每個(gè)單獨(dú)的公開(kāi)、專(zhuān)利或?qū)＠暾?qǐng)都被具體地、單獨(dú)地通過(guò)引用的方式將其內(nèi)容并入本申請(qǐng)以用于所有目的。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，可對(duì)本發(fā)明作出多種改進(jìn)和變化而不脫離其實(shí)質(zhì)和范圍。所描述的特定實(shí)施方案僅通過(guò)舉例的方式提供，并且本發(fā)明不單限于所附權(quán)利要求的術(shù)語(yǔ)，而且還可以覆蓋此類(lèi)權(quán)利要求具有的等價(jià)的全部范圍。序列表<110>塞勒尼斯醫(yī)療控股公司(cerenistherapeuticsholdings.a.)<120>脂蛋白復(fù)合物及其制備和用途<130>376201-015wo(114437)<140><141><150>61/487,263<151>2011-05-17<150>61/452,630<151>2011-03-14<150>61/440,371<151>2011-02-07<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>267<212>prt<213>人<400>1metlysalaalavalleuthrleualavalleupheleuthrglyser151015glnalaarghisphetrpglnglnaspgluproproglnserprotrp202530aspargvallysaspleualathrvaltyrvalaspvalleulysasp354045serglyargasptyrvalserglnphegluglyseralaleuglylys505560glnleuasnleulysleuleuaspasntrpaspservalthrserthr65707580pheserlysleuarggluglnleuglyprovalthrglngluphetrp859095aspasnleuglulysgluthrgluglyleuargglnglumetserlys100105110aspleuglugluvallysalalysvalglnprotyrleuaspaspphe115120125glnlyslystrpglngluglumetgluleutyrargglnlysvalglu130135140proleuargalagluleuglngluglyalaargglnlysleuhisglu145150155160leuglnglulysleuserproleuglygluglumetargaspargala165170175argalahisvalaspalaleuargthrhisleualaprotyrserasp180185190gluleuargglnargleualaalaargleuglualaleulysgluasn195200205glyglyalaargleualaglutyrhisalalysalathrgluhisleu210215220serthrleuserglulysalalysproalaleugluaspleuarggln225230235240glyleuleuprovalleugluserphelysvalserpheleuserala245250255leugluglutyrthrlyslysleuasnthrgln260265<210>2<211>18<212>prt<213>人<220><221>信號(hào)<222>(1)..(18)<400>2metlysalaalavalleuthrleualavalleupheleuthrglyser151015glnala<210>3<211>6<212>prt<213>人<220><221>propep<222>(1)..(6)<400>3arghisphetrpglngln15<210>4<211>22<212>prt<213>人工序列<220><221>來(lái)源<223>/注意="人工序列的描述:合成多肽"<220><221>mod_res<222>(22)..(22)<223>哌啶-4-甲酸<400>4lysleulysglnlysleualagluleuleugluasnleuleugluarg151015pheleuaspleuvalxaa20當(dāng)前第1頁(yè)12