本發(fā)明涉及新發(fā)現(xiàn)的源自于腫瘤抗原pasd1的短肽，該短肽與mhc分子形成的復(fù)合物以及所述短肽與復(fù)合物的用途。同時(shí)，本發(fā)明還涉及與上述短肽或復(fù)合物結(jié)合的分子，以及這些分子的用途。
背景技術(shù)：
：眾所周知，在許多病理?xiàng)l件下，如感染、癌癥、自身免疫疾病等，都會(huì)有一些特定分子的不適宜表達(dá)。因此，這些分子就成了病理或異常狀態(tài)的“標(biāo)記”。這些分子不但可以作為疾病診斷的標(biāo)記物，還可用于產(chǎn)生診斷試劑和/或治療劑。例如，用癌癥的標(biāo)記物來(lái)產(chǎn)生特定的抗體。另外，這些分子還可以有效地激發(fā)細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctl)的特異性免疫應(yīng)答，發(fā)揮抗腫瘤效能，同時(shí)，還可以通過(guò)激活的ctl來(lái)獲得能夠與該“標(biāo)記”結(jié)合的t細(xì)胞受體(tcr)作為治療劑。因此，這些分子，在相關(guān)疾病的診斷和治療中發(fā)揮著非常重要的作用。對(duì)于腫瘤而言，已有很多文獻(xiàn)發(fā)表過(guò)不同的內(nèi)源性的腫瘤抗原分子。但這并不是相關(guān)疾病真正的靶點(diǎn)，因?yàn)橐餭tl免疫應(yīng)答反應(yīng)的并非完整的腫瘤抗原分子，而是來(lái)自于抗原的特異性ctl表位(epitope)。一般情況下，腫瘤抗原在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)蛋白水解作用將其加工成為8-16個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的多肽片段，即ctl表位，進(jìn)而與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的主要組織相容性復(fù)合體(mhc，人類(lèi)的mhc通常稱為hla基因或hla復(fù)合體)分子結(jié)合形成多肽-mhc復(fù)合物(peptide-mhccomplex，pmhc)，并最終將pmhc遞呈到細(xì)胞表面供cd8+t細(xì)胞表面的tcr識(shí)別。雖然相關(guān)的內(nèi)源性腫瘤抗原分子早已有發(fā)表，但我們并不知曉被呈遞出的具體多肽片段。因此，無(wú)論是作為疫苗還是用于產(chǎn)生相關(guān)疾病的診斷試劑或是治療試劑，鑒定出這些被呈遞到細(xì)胞表面的8-16個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的多肽片段，即ctl表位，是至關(guān)重要的。本領(lǐng)域技術(shù)人員致力于發(fā)現(xiàn)并確定這些被呈遞到靶細(xì)胞表面的多肽片段。這種被遞呈的多肽片段的發(fā)現(xiàn)與確定是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，因?yàn)槎嚯谋籬la遞呈是抗原蛋白的酶解以及多肽片段與hla的相互作用的共同結(jié)果。這說(shuō)明，完整的腫瘤抗原分子并不能為多肽片段的發(fā)現(xiàn)與鑒定提供任何信息。很多文獻(xiàn)發(fā)表了利用電腦模擬的方法，如公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)syfpeithi(rammensee，etal.，immunogenetics.1999(50)：213-219)和bimas(parker，etal.，j.immunol.1994.152：163)，提供預(yù)測(cè)算法來(lái)鑒定哪個(gè)多肽片段可能會(huì)被遞呈。但這只是一種預(yù)測(cè)，具有很大的不確定性，因?yàn)樗⒉皇钦嬲陌麅?nèi)處理以及翻譯后的修飾過(guò)程。腫瘤組織經(jīng)過(guò)處理后，可以利用質(zhì)譜儀直接鑒定出腫瘤細(xì)胞表面被遞呈出的多肽片段，雖然這是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，但這樣得到的結(jié)果是非?？煽康摹Ｍ瑫r(shí)，質(zhì)譜儀的靈敏度也足以能夠鑒別低濃度的多肽片段以及翻譯后的修飾，因此它是發(fā)現(xiàn)及確定腫瘤表面多肽片段的理想工具。研究發(fā)現(xiàn)，pasd1抗原常見(jiàn)于彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤，而在除睪丸外的多數(shù)正常組織中不表達(dá)(joseph-pietrasd1，gaoy，zojern，ait-tahark，banhamah，pulfordk，ricej，savelyevan，sahotass.dnavaccinestotargetthecancertestisantigenpasd1inhumanmultiplemyelomaleukemia.2010nov；24(11)：1951-9；coopercd，ligginsap，ait-tahark，roncadorg，banhamah，pulfordk.pasd1，adlbcl-associatedcancertestisantigenandcandidateforlymphomaimmunotherapy.leukemia2006；20：2172-2174.)。因此，源自于pasd1抗原的肽，作為上述多種癌癥的靶點(diǎn)，不但可以作為上述疾病診斷的標(biāo)記物，還可用于產(chǎn)生上述疾病的預(yù)防試劑和/或治療劑，如抗體或t細(xì)胞受體。本發(fā)明利用質(zhì)譜儀分析并鑒定出了腫瘤細(xì)胞表面被呈遞的源自于腫瘤抗原pasd1的新的多肽片段。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供了一種新發(fā)現(xiàn)的源自于腫瘤抗原pasd1的短肽，該短肽與mhc分子形成的復(fù)合物以及所述短肽與復(fù)合物的用途。本發(fā)明的第一方面，提供了一種肽，所述肽包含：(i)氨基酸序列qleertwll(seqidno：1)；或(ii)在seqidno：1中具有1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)氨基酸取代，和/或1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)氨基酸插入，和/或1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)氨基酸缺失的氨基酸序列；其中，所述肽能夠與mhc分子形成復(fù)合物。在另一優(yōu)選例中，所述肽由7-25個(gè)氨基酸組成。在另一優(yōu)選例中，所述肽由8-16個(gè)氨基酸組成。在另一優(yōu)選例中，所述肽的氨基酸序列為seqidno：1。本發(fā)明的第二方面，提供了一種pmhc復(fù)合物，所述復(fù)合物包含本發(fā)明第一方面所述的肽。在另一優(yōu)選例中，所述pmhc復(fù)合物中的肽的氨基酸序列為seqidno：1。在另一優(yōu)選例中，mhc分子的類(lèi)型是hla-a*02。在另一優(yōu)選例中，mhc分子的類(lèi)型是hla-a*0201。在另一優(yōu)選例中，所述pmhc復(fù)合物為多聚體。在另一優(yōu)選例中，所述pmhc復(fù)合物是可溶的。在另一優(yōu)選例中，所述pmhc復(fù)合物是生物素化的。本發(fā)明的第三方面，提供了一種分離的細(xì)胞，所述細(xì)胞表面呈遞本發(fā)明第二方面所述pmhc復(fù)合物。本發(fā)明的第四方面，提供了一種核酸分子，所述核酸分子包含編碼本發(fā)明第一方面所述肽的核酸序列或其互補(bǔ)序列。本發(fā)明的第五方面，提供了一種載體，所述載體含有本發(fā)明第四方面所述的核酸分子。本發(fā)明的第六方面，提供了一種宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞中含有本發(fā)明第五方面所述的載體。本發(fā)明的第七方面，提供了一種分子，所述分子能夠結(jié)合本發(fā)明第一方面所述的肽和/或本發(fā)明第二方面所述的pmhc復(fù)合物。在另一優(yōu)選例中，所述分子能夠特異性結(jié)合本發(fā)明第一方面所述的肽和/或本發(fā)明第二方面所述的pmhc復(fù)合物。在另一優(yōu)選例中，所述分子為t細(xì)胞受體。在另一優(yōu)選例中，所述t細(xì)胞受體是可溶的。在另一優(yōu)選例中，所述分子為抗體或其結(jié)合片段。在另一優(yōu)選例中，所述抗體為單克隆抗體。本發(fā)明的第八方面，提供了一種分離的單克隆t細(xì)胞，所述t細(xì)胞結(jié)合本發(fā)明第二方面所述pmhc復(fù)合物。在另一優(yōu)選例中，所述t細(xì)胞特異性結(jié)合本發(fā)明第二方面所述pmhc復(fù)合物。本發(fā)明的第九方面，提供了本發(fā)明第一方面所述肽、本發(fā)明第二方面所述pmhc復(fù)合物或本發(fā)明第三方面所述細(xì)胞的用途，用于激活和/或分離t細(xì)胞。本發(fā)明的第十方面，提供了本發(fā)明第一方面所述肽、本發(fā)明第二方面所述pmhc復(fù)合物的用途，用于篩選t細(xì)胞受體或抗體文庫(kù)。本發(fā)明的第十一方面，提供了本發(fā)明第一方面所述肽、本發(fā)明第二方面所述pmhc復(fù)合物、本發(fā)明第三方面所述細(xì)胞、本發(fā)明第四方面所述的核酸分子、本發(fā)明第七方面所述分子或本發(fā)明第八方面所述t細(xì)胞的用途，用于制備預(yù)防或治療癌癥的藥物。本發(fā)明的第十二方面，提供了一種藥物組合物，所述組合物含有藥學(xué)上可接受的載體以及本發(fā)明第一方面所述肽、本發(fā)明第二方面所述pmhc復(fù)合物、本發(fā)明第三方面所述細(xì)胞、本發(fā)明第七方面所述分子或本發(fā)明第八方面所述t細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物為疫苗。本發(fā)明的第十三方面，提供了一種預(yù)防或治療疾病的方法，包括給需要的對(duì)象施用適量的本發(fā)明第一方面所述肽、本發(fā)明第二方面所述pmhc復(fù)合物、本發(fā)明第三方面所述細(xì)胞、本發(fā)明第七方面所述分子或本發(fā)明第八方面所述t細(xì)胞。本發(fā)明的第十四方面，提供了一種獲得與權(quán)利本發(fā)明第二方面所述pmhc復(fù)合物結(jié)合的分子的方法，包括：(i)將備選分子與本發(fā)明第二方面所述pmhc復(fù)合物接觸；(ii)篩選出與(i)中pmhc復(fù)合物結(jié)合的分子。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說(shuō)明圖1為鑒定本發(fā)明短肽的具有代表性的質(zhì)譜圖。圖2為本發(fā)明可溶性pmhc復(fù)合物的sds-page膠圖。左側(cè)條帶為分子量標(biāo)記，右側(cè)條帶分別為mhc分子的輕鏈和重鏈。圖3為單克隆細(xì)胞的cd8+及四聚體-pe雙陽(yáng)性染色結(jié)果。圖4為單克隆細(xì)胞的elispot實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。圖5為可溶性tcr與本發(fā)明pmhc復(fù)合物結(jié)合的proteon圖譜。具體實(shí)施方式本發(fā)明通過(guò)廣泛而深入的研究，獲得了源自于抗原pasd1的肽，該肽由mhc分子呈遞到腫瘤細(xì)胞表面，作為腫瘤標(biāo)記物。因此，本發(fā)明提供了源自于抗原pasd1的肽，該肽與mhc分子形成的復(fù)合物以及所述肽與復(fù)合物的用途。同時(shí)，本發(fā)明還涉及與上述肽或復(fù)合物結(jié)合的分子。應(yīng)理解，在本發(fā)明中，本發(fā)明的肽與本發(fā)明多肽或本發(fā)明短肽可互換使用，都指本發(fā)明提供的源自于抗原pasd1的肽。具體地，本發(fā)明的第一方面提供了一種肽，所述肽包含：(i)氨基酸序列qleertwll(seqidno：1)；或(ii)在seqidno：1中具有1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)氨基酸取代，和/或1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)氨基酸插入，和/或1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)氨基酸缺失的氨基酸序列；其中，述肽能夠與mhc分子形成復(fù)合物。氨基酸取代意味著在相同位置，某個(gè)氨基酸殘基被其他氨基酸殘基替代。插入的氨基酸殘基可以在任何位置插入，插入的氨基酸殘基也可以全部或部分彼此相鄰，或插入的氨基酸之間都不彼此相鄰?？梢詮膕eqidno：1的序列中刪除1、2或3個(gè)氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，本發(fā)明所述的肽可以在氨基酸序列之間的一個(gè)或多個(gè)位置進(jìn)行翻譯后修飾。翻譯后修飾的例子可以在engelhard等curropinimmunol.2006年2月；18(1)：92-7中找到，并且包括磷酸化作用、乙?；饔煤兔擋０被饔?。較佳地，本發(fā)明所述的肽與mhc結(jié)合于mhc分子的肽結(jié)合位點(diǎn)。通常，上述描述的修飾的氨基酸不會(huì)破壞所述肽與mhc的結(jié)合能力。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的氨基酸修飾提高了肽與mhc結(jié)合的能力。例如，突變可能發(fā)生在肽與mhc的結(jié)合位點(diǎn)。這些結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合位點(diǎn)上優(yōu)選的殘基為本領(lǐng)域已知的，尤其是對(duì)哪些結(jié)合hla-a*02的肽來(lái)說(shuō)(參見(jiàn)，比如parkhurst等，j.immunol.157：2539-2548(1996))。更具體地，本發(fā)明的肽的氨基酸的長(zhǎng)度可以是7-25個(gè)，優(yōu)選8-16個(gè)，較佳地，9、10、或11個(gè)。本發(fā)明所述的肽可以由qleertwll(seqidno：1)組成，或主要由qleertwll(seqidno：1)組成，其對(duì)應(yīng)于pasd1蛋白全長(zhǎng)的383-391殘基的位置。發(fā)明還提供seqidno：1所示的蛋白或肽的類(lèi)似物。這些類(lèi)似物與天然的肽差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類(lèi)似物還包括具有不同于天然l-氨基酸的殘基(如d-氨基酸)的類(lèi)似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類(lèi)似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的肽并不限于上述例舉的代表性的肽。修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括：體內(nèi)或體外的肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的肽。這種修飾可以通過(guò)將肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的肽。在本發(fā)明中，“seqidno：1所示的蛋白保守性變異肽”指與seqidno：1的氨基酸序列相比，有至多3個(gè)，更佳地至多2個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成肽。這些保守性變異肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。表1最初的殘基代表性的取代優(yōu)選的取代ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；gln；asnlysasn(n)gln；his；lys；argglnasp(d)gluglucys(c)sersergln(q)asnasnglu(e)aspaspgly(g)pro；alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu；val；met；ala；pheleuleu(l)ile；val；met；ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu；phe；ileleuphe(f)leu；val；ile；ala；tyrleupro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)sersertrp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serpheval(v)ile；leu；met；phe；alaleu本發(fā)明所述的肽可以用merrifield合成方法(又被稱為多肽固相合成法)簡(jiǎn)單合成。gmp級(jí)別的肽可以用多肽系統(tǒng)(multiplepeptidesystems，sandiego，ca)的固相合成技術(shù)予以合成?；蛘?，所述肽可以重組合成，如果需要，可以用本領(lǐng)域已知的方法予以合成。典型的此類(lèi)方法涉及載體的使用，所述載體包括編碼多肽的核酸序列，在體內(nèi)表達(dá)多肽；例如，在細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。或者，還可以使用體外無(wú)細(xì)胞體系進(jìn)行表達(dá)。此類(lèi)系統(tǒng)為本領(lǐng)域已知的，并且可以從商業(yè)途徑獲得。所述肽可以是分離的和/或以基本上純的形式提供。例如，它們可以以一種基本上沒(méi)有其他肽或蛋白的形式提供。腫瘤抗原在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)蛋白水解作用將其加工成為8-16個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的多肽片段，即ctl表位，進(jìn)而與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的mhc分子結(jié)合形成多肽-mhc復(fù)合物(peptide-mhccomplex，pmhc)，一起遞呈到細(xì)胞表面。因此，本發(fā)明的第二方面提供了一種pmhc復(fù)合物，所述復(fù)合物中包含本發(fā)明第一方面所述的肽。較佳地，所述多肽結(jié)合于mhc分子的肽結(jié)合槽上。所述mhc分子可以是mhci類(lèi)分子或mhcii類(lèi)分子，優(yōu)選地，所述mhc分子是mhci類(lèi)分子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述mhc分子是hla-a*02，更優(yōu)選地，所述mhc分子是hla-a*0201。本發(fā)明所述的pmhc復(fù)合物可以以多聚體形式存在，例如，二聚體、或四聚體、或五聚體、或六聚體、或八聚體、或更大。產(chǎn)生pmhc多聚體的適當(dāng)方法可以參考相關(guān)文獻(xiàn)，如(gretenetal.，clin.diagnosticlab.immunol.2002：216-220)。通常，可以用帶有生物素殘基的pmhc復(fù)合物與通過(guò)熒光標(biāo)記鏈霉親和素復(fù)合產(chǎn)生pmhc多聚體?；蛘?，所述pmhc多聚體也可以通過(guò)免疫球蛋白作為分子支架來(lái)形成。在這個(gè)系統(tǒng)中，mhc分子的胞外區(qū)與免疫球蛋白重鏈的恒定區(qū)通過(guò)一個(gè)短的連接序列(linker)結(jié)合在一起。另外，形成pmhc多聚體也可以利用載體分子，如右旋糖酐(wo02072631)。pmhc多聚體有助于提高與其結(jié)合部分的檢測(cè)，如t細(xì)胞受體?；蛘撸岣遬mhc復(fù)合物在相關(guān)應(yīng)用中的效應(yīng)，如激活t細(xì)胞。本發(fā)明所述的pmhc復(fù)合物可以以可溶形式提供。為獲得可溶形式的pmhc復(fù)合物，優(yōu)選地，所述pmhc復(fù)合物中mhc分子不含跨膜區(qū)。具體地，在pmhc復(fù)合物中，mhci類(lèi)分子可以由其輕鏈及全部或部分重鏈的胞外結(jié)構(gòu)域組成。或者，mhc分子是僅包含其功能結(jié)構(gòu)域的片段。產(chǎn)生本發(fā)明可溶性pmhc復(fù)合物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括，但不限于，本發(fā)明實(shí)施例2中所述的方法。本發(fā)明可溶性pmhc復(fù)合物中的mhc分子也可以利用合成方法產(chǎn)生，然后與本發(fā)明的肽重折疊。通過(guò)確定肽與mhc分子是否能夠重折疊，可以確定本發(fā)明肽能夠與哪類(lèi)mhc分子形成復(fù)合物。本發(fā)明的可溶性pmhc復(fù)合物可以用于篩選或檢測(cè)與其結(jié)合的分子，如tcr或抗體。所述方法包括將所述pmhc復(fù)合物與待測(cè)結(jié)合部分接觸，和測(cè)定待測(cè)結(jié)合部分是否與復(fù)合物結(jié)合。pmhc復(fù)合物的結(jié)合的測(cè)定方法是本領(lǐng)域熟知的。優(yōu)選的方法包括但不限于，表面等離子體共振，或任何其他的生物傳感技術(shù)，elisa、流式細(xì)胞術(shù)、色譜法、顯微鏡檢查?；蛘?，此外，所述結(jié)合可以通過(guò)對(duì)結(jié)合產(chǎn)生的生物響應(yīng)進(jìn)行功能測(cè)定來(lái)檢測(cè)，如細(xì)胞因子釋放或細(xì)胞凋亡。同樣地，本發(fā)明的可溶性pmhc復(fù)合物還可以用于篩選tcr或抗體文庫(kù)。利用噬菌體展示技術(shù)來(lái)構(gòu)建抗體文庫(kù)是本領(lǐng)域熟知的，如參考文獻(xiàn)aitken，antibodyphagedisplay：methodsandprotocols(2009，humana，newyork)中所述。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的pmhc復(fù)合物被用于篩選展示于噬菌體顆粒表面的多樣性tcr文庫(kù)。所述文庫(kù)展示的tcr可能含有非天然的突變。因此，本發(fā)明的可溶性pmhc復(fù)合物可以通過(guò)連接物固定到適當(dāng)?shù)墓滔噍d體上。固相載體的例子包括，但不限于，珠子、膜、瓊脂糖凝膠、磁珠、基板、管子、柱。pmhc復(fù)合物可以固定在elisa反應(yīng)板、磁珠、或表面等離子體共振生物傳感器芯片上。將pmhc復(fù)合物固定到固相載體的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且包括，例如，使用親和結(jié)合對(duì)，比如生物素和鏈霉親和素，或抗體和抗原。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，pmhc復(fù)合物用生物素標(biāo)記，并且固定在鏈霉親和素包被的表面。本發(fā)明所述的肽可以與mhc復(fù)合物一起遞呈到細(xì)胞表面。因此，本發(fā)明還提供了一種細(xì)胞，所述細(xì)胞能夠遞呈本發(fā)明的pmhc復(fù)合物到其表面。此類(lèi)細(xì)胞可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，較佳地，免疫系統(tǒng)細(xì)胞，并且優(yōu)選為專門(mén)的抗原呈遞細(xì)胞，比如樹(shù)突細(xì)胞或b細(xì)胞。其他優(yōu)選的細(xì)胞包括t2細(xì)胞(hosken，etal.，science.1990.248：367-70)。呈遞本發(fā)明所述的肽或pmhc復(fù)合物的細(xì)胞可以是分離的，較佳地，以細(xì)胞群體的形式，或以基本上純的形式提供。所述細(xì)胞可以不是天然遞呈本發(fā)明所述的復(fù)合物的，或所述細(xì)胞遞呈復(fù)合物的水平比天然狀態(tài)下的高。此類(lèi)細(xì)胞可以用本發(fā)明所述的肽進(jìn)行脈沖處理而獲得。脈沖處理涉及用所述肽孵育細(xì)胞幾小時(shí)，優(yōu)選地，所用肽的濃度為10-5-10-12m。此外，所述細(xì)胞還可以用hla-a*02分子進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)一步誘導(dǎo)肽的遞呈。遞呈本發(fā)明所述pmhc復(fù)合物的細(xì)胞可以被用于分離t細(xì)胞和t細(xì)胞受體，所述t細(xì)胞由所述細(xì)胞激活并進(jìn)一步被分選出來(lái)，進(jìn)而也能夠獲得表達(dá)在所述t細(xì)胞表面的t細(xì)胞受體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，獲得上述t細(xì)胞的方法包括利用上述遞呈本發(fā)明pmhc復(fù)合物的細(xì)胞刺激從健康志愿者處獲得的新鮮血液?？梢越?jīng)過(guò)幾輪的刺激，如3-4輪。激活的t細(xì)胞的鑒定可以通過(guò)在本發(fā)明的肽脈沖的t2細(xì)胞的存在下，來(lái)測(cè)定細(xì)胞因子的釋放(比如，ifn-γelispot實(shí)驗(yàn))。利用標(biāo)記抗體，激活細(xì)胞可以通過(guò)流式細(xì)胞儀(facs)進(jìn)行分選，分選的細(xì)胞可以擴(kuò)大培養(yǎng)和進(jìn)一步驗(yàn)證，例如，通過(guò)elispot檢測(cè)和/或針對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性和/或pmhc多聚體染色進(jìn)行驗(yàn)證。來(lái)自經(jīng)驗(yàn)證的t細(xì)胞克隆的tcr鏈可以通過(guò)cdna末端快速擴(kuò)增(race)被放大，并進(jìn)行測(cè)序。本發(fā)明還提供了一種核酸分子，所述核酸分子包括編碼本發(fā)明的肽的核酸序列。所述核酸可以是cdna。所述核酸分子可以主要由編碼本發(fā)明所述肽的核酸序列組成，或可以僅編碼本發(fā)明所述的肽。此類(lèi)核酸分子可以用本領(lǐng)域已知的方法合成。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，不同核酸序列的核酸分子可以編碼相同的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了一種載體，所述載體中包括本發(fā)明所述的核酸序列。合適的載體是載體構(gòu)建領(lǐng)域已知的，包括啟動(dòng)子的選擇和其他調(diào)控元件，比如增強(qiáng)子元件。本發(fā)明所述的載體包括適合引入細(xì)胞的序列。比如，所述載體可以是表達(dá)載體，在該載體中，所述多肽的編碼序列受到它自身順式作用調(diào)控元件的控制，載體的設(shè)計(jì)便于宿主細(xì)胞的基因整合或基因替換等。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解，在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“載體”包括dna分子，比如質(zhì)粒、噬菌體、病毒或其他載體，它含有一個(gè)或多個(gè)異源的或重組的核酸序列。合適的噬菌體和病毒載體包括，但不限于：λ-噬菌體，embl噬菌體、猿猴病毒、牛疣病毒、epstein-barr病毒、腺病毒、皰疹病毒、小鼠肉瘤病毒、鼠類(lèi)乳癌病毒、慢病毒等。本發(fā)明還提供了一種結(jié)合分子，所述分子可以用來(lái)作為免疫治療劑或診斷試劑。該結(jié)合分子可以僅和肽結(jié)合，或與肽和mhc分子形成的復(fù)合物結(jié)合。在后一種情況，所述結(jié)合分子可以部分結(jié)合到mhc分子上，同時(shí)，它還與本發(fā)明的肽結(jié)合。本發(fā)明的結(jié)合部分可以是分離的和/或可溶的，和/或非天然存在的，即大自然中沒(méi)有等效物，和/或純的，和/或人工合成的。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述結(jié)合分子是t細(xì)胞受體(tcr)?？梢圆捎脟?guó)際免疫遺傳學(xué)信息系統(tǒng)(imgt)來(lái)描述tcr。天然αβ異源二聚tcr具有α鏈和β鏈。廣義上講，各鏈包含可變區(qū)、連接區(qū)和恒定區(qū)，β鏈通常還在可變區(qū)和連接區(qū)之間含有短的多變區(qū)，但該多變區(qū)常視作連接區(qū)的一部分。本發(fā)明的tcr可以是本領(lǐng)域已知的任何形式。例如，所述tcr可以是異二聚體，或以單鏈的形式存在。所述tcr可以是可溶形式(即無(wú)跨膜或胞漿區(qū))，具體地，所述tcr可以包含全部或部分tcr胞外結(jié)構(gòu)域。所述tcr也可以是包含其跨膜區(qū)的全長(zhǎng)鏈。所述tcr可以被提供到細(xì)胞表面，比如t細(xì)胞。可以結(jié)合本領(lǐng)域中的現(xiàn)有技術(shù)來(lái)獲得可溶性的tcr，例如，在αβtcr的α與β鏈的恒定域之間引入人工二硫鍵，或者在αβtcr的α鏈可變區(qū)與β鏈恒定區(qū)之間引入人工二硫鍵。本發(fā)明的tcr可用于將細(xì)胞毒性劑或免疫刺激劑遞送到靶細(xì)胞，或被轉(zhuǎn)化入t細(xì)胞，使表達(dá)該tcr的t細(xì)胞能夠破壞腫瘤細(xì)胞，以便在被稱為過(guò)繼免疫治療的治療過(guò)程中給予患者。另外，本發(fā)明的tcr中也可以含有突變，優(yōu)選地，突變后的tcr對(duì)本發(fā)明pmhc復(fù)合物的親和力有所提高。本發(fā)明的tcr可以單獨(dú)使用，也可與偶聯(lián)物以共價(jià)或其他方式結(jié)合，優(yōu)選以共價(jià)方式結(jié)合。所述偶聯(lián)物包括可檢測(cè)標(biāo)記物(為診斷目的，其中所述tcr用于檢測(cè)呈遞本發(fā)明pmhc復(fù)合物的細(xì)胞的存在)、治療劑、pk(蛋白激酶)修飾部分或任何以上這些物質(zhì)的組合結(jié)合或偶聯(lián)。本發(fā)明的tcr還可以與抗-cd3的抗體結(jié)合，優(yōu)選以共價(jià)方式結(jié)合，以重定向t細(xì)胞，從而殺傷靶細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明的結(jié)合分子是抗體。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“抗體”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特異性結(jié)合位點(diǎn)的分子，其可以全天然、或部分人工合成、或全部人工合成。術(shù)語(yǔ)“抗體”包括抗體片段、其衍生物、功能性等效物以及同源抗體、人源化抗體，所述抗體片段包括免疫球蛋白結(jié)合區(qū)，所述結(jié)合區(qū)是抗體結(jié)合區(qū)或與抗體結(jié)合區(qū)同源。其可以全天然、或部分人工合成、或全部人工合成。人源化抗體可以是修飾的抗體，其含有非人抗體的可變區(qū)(例如，小鼠)以及人抗體的恒定區(qū)?？贵w的例子可以是同型免疫球蛋白(例如igg、ige、igm、igd以及iga)以及它們同型的亞類(lèi)；片段包括抗原結(jié)合區(qū)，比如fab、scfv、fv、dab、fd；以及雙鏈抗體?？贵w可以是多抗或單抗，優(yōu)選為單克隆抗體。上述tcr與抗體的制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括但不限于，從大腸桿菌細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)，并純化出來(lái)。在另一方面，本發(fā)明進(jìn)一步提供了本發(fā)明的肽、pmhc復(fù)合物、核酸分子、載體、細(xì)胞以及結(jié)合分子在制藥方面的用途。所述肽、pmhc復(fù)合物、核酸、載體、細(xì)胞或結(jié)合分子可以被用于治療或預(yù)防癌癥，優(yōu)選黑色素瘤、膀胱癌、肝癌、表皮樣癌、非小細(xì)胞肺癌和鱗狀細(xì)胞癌等。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的肽、pmhc復(fù)合物、本發(fā)明的核酸分子、本發(fā)明的細(xì)胞或本發(fā)明的結(jié)合分子，以及藥學(xué)上可接受的載體。所述藥物組合物可以是任何合適的形式，(取決于患者需要的給藥方法)。其可以以單位劑型的形式提供，通常置于密封容器中，并且可以作為試劑盒的一部分提供。此類(lèi)試劑盒通常(但不是必須)包含使用說(shuō)明。其可以包含多個(gè)所述的單位劑型。所述藥物組合物適用于任何適當(dāng)?shù)慕o藥途徑，如注射(包括皮下，肌肉，腹腔或靜脈注射)、吸入或口服、或經(jīng)鼻、或經(jīng)肛門(mén)等途徑。所述組合物可以通過(guò)藥學(xué)領(lǐng)域已知的任何方法制備，例如在無(wú)菌條件下，通過(guò)將活性成分與載體或賦形劑混合。根據(jù)用于治療的疾病或病癥(例如癌癥、病毒性感染或自身免疫疾病)、患者的個(gè)體年齡和狀況等，本發(fā)明制劑的給藥劑量可以在較寬的范圍內(nèi)變化。恰當(dāng)?shù)慕o藥劑量將由醫(yī)師最終決定。根據(jù)本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)，與mhc分子一起被呈遞到細(xì)胞表面的肽、pmhc復(fù)合物或遞呈pmhc復(fù)合物的細(xì)胞，可以激活t細(xì)胞或b細(xì)胞，使其發(fā)揮作用。因此，本發(fā)明的肽、pmhc復(fù)合物或遞呈pmhc復(fù)合物的細(xì)胞可以以疫苗組合物的形式提供。所述疫苗組合物可以用于治療或預(yù)防癌癥。所有的這類(lèi)組合物都包括在本發(fā)明中。應(yīng)理解，所述疫苗可以為多種形式(schlomj.jnatlcancerinst.2012104(8)：599-613)。例如，本發(fā)明的肽可以直接用于免疫患者(salgallerml.cancerres.1996.56(20)：4749-57andmarchandm.intjcancer.1999.80(2)：219-230)。所述疫苗組合物可以包含額外的肽，使得本發(fā)明的肽是肽混合物中的一個(gè)。所述疫苗組合物可以加入佐劑，以增強(qiáng)免疫反應(yīng)?；蛘?，所述疫苗組合物可以是呈遞本發(fā)明肽和mhc復(fù)合物的抗原遞呈細(xì)胞的形式。優(yōu)選地，所述抗原呈遞細(xì)胞為免疫細(xì)胞，更優(yōu)選地為樹(shù)突細(xì)胞。所述肽也可以脈沖到細(xì)胞的表面(thumerbi.etal.，j.exp.med.1999.190：1669)，或者可以將本發(fā)明肽的編碼核酸引入到樹(shù)突細(xì)胞中，例如，利用電穿孔法(vantendeloo，vf.etal.，blood2001.98：49)。下面的具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如(sambrook和russell等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(molecularcloning-alaboratorymanual)(第三版)(2001)cshl出版社)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。實(shí)施例1通過(guò)質(zhì)譜鑒定源自于pasd1抗原的多肽將購(gòu)自atcc的腫瘤細(xì)胞系im-9(多發(fā)性骨髓瘤b淋巴細(xì)胞)在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)。使用商業(yè)化抗-hla-a/b/c抗體w6/32來(lái)純化hla-a*02復(fù)合物。具體地，用含有非離子型表面活性劑tritonx-100(1％v/v)的緩沖液裂解細(xì)胞，按2*10^7細(xì)胞加入1ml裂解液，在4℃滾動(dòng)孵育1h。離心去除細(xì)胞碎片，上清先與抗體孵育，再加入rproteina-sepharose捕獲“抗體-hla-a/b/c復(fù)合物”。過(guò)柱，收集“rproteina-sepharose-抗體-hla-a/b/c復(fù)合物”。用低鹽和高鹽緩沖液洗滌柱子，最后用10％的乙酸洗脫掛于免疫親和柱上hla復(fù)合物，再經(jīng)過(guò)95℃加熱，以及10kda(amiconrultrcentrifugalfilters，millipore)超濾膜過(guò)濾掉大分子，最終得到多肽混合物。多肽混合物經(jīng)agilent1260高效液相色譜分餾：zorbax300sb-c18；1.0*150mm，3.5um；流動(dòng)相a為98％水，2％乙腈，0.1％三氟乙酸，流動(dòng)相b為98％乙腈，2％水，0.1％三氟乙酸，流動(dòng)相梯度為10分鐘內(nèi)流動(dòng)相b由5％升到70％。每一分鐘收集一餾份?？傔\(yùn)行時(shí)間為30分鐘。多肽的hplc餾份經(jīng)濃縮后，進(jìn)樣nanolc-msms系統(tǒng)分析：eksigentnanolc-absciextripletof5600系統(tǒng)：質(zhì)譜采用ida分析方法。液相色譜采用：預(yù)柱：(eksigent)nanolctrapcolumn.5μmc18.100μm*2.5cm，910-00050，分析柱：(eksigent)c18-cl-120，3μm，0.075×150mm，805-00120。dionexultimate3000-thermoqeplus系統(tǒng)：質(zhì)譜采用ddms2分析方法.液相色譜采用：預(yù)柱：(thermo)acclaim100，100um×2cm，nanoviper，c18，5um，100a，164564，分析柱：(thermo)acclaim100，75um×15cm，nanoviper，c18，3um，100a，164568。上述兩個(gè)系統(tǒng)的納流色譜的流動(dòng)相a為98％水，2％乙腈，0.1％甲酸，流動(dòng)相b為98％乙腈，2％水，0.1％甲酸，流動(dòng)相梯度為74分鐘內(nèi)流動(dòng)相b由5％升到50％?？傔\(yùn)行時(shí)間為90分鐘。質(zhì)譜分析結(jié)果，借助搜庫(kù)軟件proteinpilot和peaks，搜索人類(lèi)蛋白的uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)。根據(jù)軟件給出的結(jié)果，如圖1所示，最終得出本發(fā)明的抗原短肽序列。實(shí)施例2可溶性pmhc復(fù)合物的制備i型hla-a*0201分子的重鏈和輕鏈(β2m)分別以包涵體的形式在大腸桿菌中(e.coli)表達(dá)。應(yīng)注意，為獲得可溶性的pmhc復(fù)合物，本實(shí)施例中所用的hla-a*0201分子的重鏈不包含其跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)。另外，為方便后續(xù)對(duì)可溶性的pmhc復(fù)合物進(jìn)行生物素化，可以在重鏈的c末端加入生物素化標(biāo)簽。制備本發(fā)明可溶性pmhc復(fù)合物的具體過(guò)程如下：a.純化收集100ml誘導(dǎo)表達(dá)重鏈或輕鏈的e.coli菌液，于4℃8000g離心10min后用10mlpbs洗滌菌體一次，之后用5mlbugbustermastermixextractionreagents(merck)劇烈震蕩重懸菌體，并于室溫旋轉(zhuǎn)孵育20min，之后于4℃，6000g離心15min，棄去上清，收集包涵體。將上述包涵體重懸于5mlbugbustermastermix中，室溫旋轉(zhuǎn)孵育5min；加30ml稀釋10倍的bugbuster，混勻，4℃6000g離心15min；棄去上清，加30ml稀釋10倍的bugbuster重懸包涵體，混勻，4℃6000g離心15min，重復(fù)兩次，加30ml20mmtris-hclph8.0重懸包涵體，混勻，4℃6000g離心15min，最后用20mmtris-hcl8m尿素溶解包涵體，sds-page檢測(cè)包涵體純度，bca試劑盒測(cè)濃度。b.復(fù)性將本發(fā)明的肽qleertwll(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成)溶解于dmso至20mg/ml的濃度。輕鏈和重鏈的包涵體用8m尿素、20mmtrisph8.0、10mmdtt來(lái)溶解，復(fù)性前加入3m鹽酸胍、10mm醋酸鈉、10mmedta進(jìn)一步變性。將qleertwll肽以25mg/l(終濃度)加入復(fù)性緩沖液(0.4ml-精氨酸、100mmtrisph8.3、2mmedta、0.5mm氧化性谷胱甘肽、5mm還原型谷胱甘肽、0.2mmpmsf，冷卻至4℃)，然后依次加入20mg/l的輕鏈和90mg/l的重鏈(終濃度，重鏈分三次加入，8h/次)，復(fù)性在4℃進(jìn)行至少3天至完成，sds-page檢測(cè)能否復(fù)性成功。c.復(fù)性后純化用10體積的20mmtrisph8.0作透析來(lái)更換復(fù)性緩沖液，至少更換緩沖液兩次來(lái)充分降低溶液的離子強(qiáng)度。透析后用0.45μm醋酸纖維素濾膜過(guò)濾蛋白質(zhì)溶液，然后加載到hitrapqhp(ge通用電氣公司)陰離子交換柱上(5ml床體積)。利用akta純化儀(ge通用電氣公司)，20mmtrisph8.0配制的0-400mmnacl線性梯度液洗脫蛋白，pmhc約在250mmnacl處洗脫，收集諸峰組分，sds-page檢測(cè)純度。得到的本發(fā)明可溶性pmhc復(fù)合物的膠圖如圖2所示。d.生物素化用millipore超濾管將純化的pmhc分子濃縮，同時(shí)將緩沖液置換為20mmtrisph8.0，然后加入生物素化試劑0.05mbicineph8.3、10mmatp、10mmmgoac、50μmd-biotin、100μg/mlbira酶(gst-bira)，室溫孵育混合物過(guò)夜，sds-page檢測(cè)生物素化是否完全。e.純化生物素化后的復(fù)合物用millipore超濾管將生物素化標(biāo)記后的pmhc分子濃縮至1ml，采用凝膠過(guò)濾層析純化生物素化的pmhc，利用akta純化儀(ge通用電氣公司)，用過(guò)濾過(guò)的pbs預(yù)平衡hipreptm16/60s200hr柱(ge通用電氣公司)，加載1ml濃縮過(guò)的生物素化pmhc分子，然后用pbs以1ml/min流速洗脫。實(shí)施例3結(jié)合本發(fā)明pmhc復(fù)合物的tcr本實(shí)施例提供了利用本發(fā)明pmhc復(fù)合物來(lái)獲得單克隆t細(xì)胞及tcr的例證。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知獲得tcr的多種方法，包括但不限于，從t細(xì)胞克隆中將tcrα與β鏈的序列分離出來(lái)，所述t細(xì)胞克隆是被遞呈本發(fā)明pmhc復(fù)合物的細(xì)胞刺激的。獲得的tcr序列可以被克隆到適合的載體上面，然后在大腸桿菌如e.coli中表達(dá)，或表達(dá)在噬菌體的表面。利用本發(fā)明的短肽獲得的t細(xì)胞克隆如圖3所示。通過(guò)elispot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)該t細(xì)胞克隆的功能及特異性。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知利用elispot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞功能的方法。本實(shí)施例ifn-γelispot實(shí)驗(yàn)中所用的效應(yīng)細(xì)胞為本發(fā)明中獲得的t細(xì)胞克隆，靶細(xì)胞為負(fù)載了本發(fā)明短肽的lcla02細(xì)胞，對(duì)照組為負(fù)載了其他短肽的lcla02細(xì)胞及未負(fù)載任何短肽的lcla02細(xì)胞。首先準(zhǔn)備elispot平板，elispot實(shí)驗(yàn)步驟如下：按以下順序?qū)⒃囼?yàn)的各個(gè)組分加入elispot平板：40μllcla02細(xì)胞5×105個(gè)細(xì)胞/毫升(即20,000個(gè)lcla02細(xì)胞/孔)、40μl效應(yīng)細(xì)胞(2000個(gè)t細(xì)胞克隆/孔)后，實(shí)驗(yàn)組加入20μl特異性短肽，對(duì)照組加入20μl非特異性短肽，空白組加入20μl培養(yǎng)基(試驗(yàn)培養(yǎng)基)，并設(shè)置2復(fù)孔。然后溫育過(guò)夜(37℃，5％co2)。隨后洗滌平板并進(jìn)行二級(jí)檢測(cè)和顯色，干燥平板1小時(shí)，再利用免疫斑點(diǎn)平板讀數(shù)計(jì)(elispotreadersystem；aid公司)計(jì)數(shù)膜上形成的斑點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，得到的特定抗原特異性t細(xì)胞克隆對(duì)負(fù)載本發(fā)明短肽的lcla02細(xì)胞有特異性反應(yīng)。用quick-rnatmminiprep(zymoresearch)抽提上述t細(xì)胞克隆的總rna，并獲得tcr序列。為進(jìn)一步驗(yàn)證獲得的tcr能夠結(jié)合本發(fā)明的pmhc復(fù)合物，本實(shí)施例在e.coli中表達(dá)出了可溶的tcr蛋白，并通過(guò)proteon檢測(cè)其與pmhc復(fù)合物的結(jié)合。應(yīng)注意，可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)來(lái)獲得可溶性的tcr，包括但不限于，專利文獻(xiàn)pct/cn2015/093806中所述。使用proteonxpr36實(shí)時(shí)分析系統(tǒng)檢測(cè)可溶性tcr蛋白與pmhc復(fù)合物的結(jié)合活性。將抗鏈霉親和素的抗體(genscript)加入偶聯(lián)緩沖液(10mm醋酸鈉緩沖液，ph4.77)，然后將抗體流過(guò)預(yù)先用edc和nhs活化過(guò)的glm芯片，使抗體固定在芯片表面，最后用乙醇胺的鹽酸溶液封閉未反應(yīng)的活化表面，完成偶聯(lián)過(guò)程，偶聯(lián)水平約為12,000ru。使低濃度的鏈霉親和素流過(guò)已包被抗體的芯片表面，然后將按實(shí)施例2中所述方式制得的pmhc物流過(guò)檢測(cè)通道，另一通道作為參比通道，再將0.05mm的生物素以50μl/min的流速流過(guò)芯片30sec，封閉鏈霉親和素剩余的結(jié)合位點(diǎn)。利用proteonmanager3.0軟件計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)，得到本發(fā)明可溶性的tcr分子與本發(fā)明pmhc復(fù)合物結(jié)合的動(dòng)力學(xué)圖譜如圖5所示，圖譜顯示出了二者的結(jié)合。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。當(dāng)前第1頁(yè)12