本發(fā)明涉及一種新型生物活性多肽及其制備方法，具體涉及一種通過陽離子交換hplc以及兩步反相hplc分離獲得新型生物活性多肽的方法。

背景技術(shù)：

生物毒素是一種重要的生命現(xiàn)象，是生物界在億萬年進(jìn)化過程中為了生存而形成的，是一個(gè)巨大的潛在發(fā)現(xiàn)新的生物活性分子的重要資源。目前國(guó)際上已經(jīng)成功篩選到一些生物毒素分子用于治療某些相關(guān)疾病或作為新型藥物的設(shè)計(jì)參考。蜘蛛產(chǎn)生各種作用于神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)毒素，其神經(jīng)毒素根據(jù)它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)分為蛋白多肽類神經(jīng)毒素和多胺類神經(jīng)毒素。其中蜘蛛多肽神經(jīng)毒素最重要，蜘蛛多肽類神經(jīng)毒素根據(jù)它們的功能和分子特征可分為兩種類型:第一種是低分子量多肽類，它們能與興奮性細(xì)胞膜上的陽離子通道相互作用；第二種是高分子量多肽類，它們與突觸前膜的受體組分及增強(qiáng)神經(jīng)介質(zhì)的分泌作用密切相關(guān)。蜘蛛毒液已成為神經(jīng)毒素的一個(gè)重要新來源，而且蜘蛛毒液中特異性藥物和毒素分子也是我們尋找農(nóng)業(yè)殺蟲劑的較好模式分子。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的旨在于提供一種從廣西纓毛蛛粗毒中制備新型生物活性多肽的方法，所述的生物活性多肽為蜘蛛抑鉀肽-35（spkp-35），其氨基酸序列為：

nh2-aspcysargalaleutyrglyglycysthrlysaspgluaspcyscyslyshisleualacysargargthrleuprothrtyrcysalatrpaspleuthrphepro-oh,

所述的蜘蛛抑鉀肽-35的n端第2位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之間，n端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之間，n端第15位半胱氨酸和第29位半胱氨酸之間分別形成二硫鍵。

所述方法包括：（1）粗毒干粉用雙蒸水溶解配成5mg/ml的毒素溶液，12000rpm離心5min,上清用millipore公司一次性過濾器(0.22μm)過濾后，置于4°c保存。粗毒上樣陽離子交換hplc(ion-exchangehplc)進(jìn)行第一步分離。采用waters650型hplc、美國(guó)pharmacia公司的hiprep^tm16/10cmff預(yù)裝柱進(jìn)行分離。486檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm。流動(dòng)相為四相洗脫系統(tǒng)，流速為1.5ml/min。洗脫液分別為a相0.1mnah2po4,b相0.1mna2hpo4,c相1mnacl,d相ddh2o。上述經(jīng)ion-exchangehplc分離后收集的各洗脫峰分別上樣反相hplc進(jìn)行進(jìn)一步純化。采用分析型vydacc18rp-hplc反相柱(218tp54,4.6×250mm)于分析型waters2690高效液相色譜儀上進(jìn)行梯度洗脫，996檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm，流動(dòng)相為含0.1%tfa的水（a）和乙腈（b），洗脫速度為1ml/min，柱溫為40℃。

（2）通過上述陽離子交換hplc以及兩步反相hplc共三步分離獲得的spkp-35，運(yùn)用質(zhì)譜鑒定純度達(dá)到98%以上，其分子量約為4120.8da，經(jīng)序列測(cè)定，該多肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)由36個(gè)氨基酸殘基組成，其中含6個(gè)半胱氨酸并形成三對(duì)二硫鍵，c-端未酰胺化。多肽spkp-35純化凍干粉的理化性狀為白色或類白色疏松體，無氣味，極易溶解于水，水溶液近于無色透明。

附圖說明

圖1是廣西纓毛蛛粗毒陽離子交換hplc圖譜?！?”表示目的峰，縱坐標(biāo)表示洗脫峰在280nm的吸收值，橫坐標(biāo)表示洗脫時(shí)間。

圖2是廣西纓毛蛛粗毒目的陽離子交換峰反相hplc圖譜。箭頭表示目的峰，縱坐標(biāo)表示各個(gè)洗脫峰在280nm下的吸收值，橫坐標(biāo)表示洗脫時(shí)間。

圖3是目的多肽spkp-35的反相hplc圖譜。

具體實(shí)施方式

1、實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1粗毒的獲取

廣西纓毛蛛采集于海南省瓊中縣境內(nèi)的山區(qū)，粗毒毒液采于雌性蛛種。簡(jiǎn)述如下：使蜘蛛張開螯爪伸入塑料杯中，然后用5～10v的脈沖電流刺激兩螯肢基部外側(cè)3～5s。蜘蛛感受電刺激后，即用觸肢緊緊抱住杯壁，同時(shí)將螯爪有力刺向杯內(nèi)壁并射出毒液。毒液收集后，放入-40℃冷凍干燥機(jī)中經(jīng)真空冷凍干燥成淺黃色或白色粉末即為粗毒。

1.2spkp-35的分離純化及質(zhì)譜分析

粗毒干粉用雙蒸水溶解配成5mg/ml的毒素溶液，12000rpm離心5min,上清用millipore公司一次性過濾器(0.22μm)過濾后，置于4°c保存。粗毒上樣陽離子交換hplc(ion-exchangehplc)進(jìn)行第一步分離。采用waters650型hplc、美國(guó)pharmacia公司的hiprep^tm16/10cmff預(yù)裝柱進(jìn)行分離。486檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm。流動(dòng)相為四相洗脫系統(tǒng)，流速為1.5ml/min。洗脫液分別為a相0.1mnah2po4,b相0.1mna2hpo4,c相1mnacl,d相ddh2o。上述經(jīng)ion-exchangehplc分離后收集的各洗脫峰分別上樣反相hplc進(jìn)行進(jìn)一步純化。采用分析型vydacc18rp-hplc反相柱(218tp54,4.6×250mm)于分析型waters2690高效液相色譜儀上進(jìn)行梯度洗脫，996檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm，流動(dòng)相為含0.1%tfa的水（a）和乙腈（b），洗脫速度為1ml/min，柱溫為40℃。

利用maldi-tof質(zhì)譜（voyager-de?strbiospectromitry?workstation）測(cè)定分子量。線性陽離子模式；n2光源337nm；離子加速電壓為20000v。基質(zhì)為α-氰基-4-羥基-肉桂酸（cca），通過以下方式制備樣品：取1ml（約0.5mg）樣品液加入到9mlcca0.1%tfa/50%乙腈飽和溶液，混勻后取1ml點(diǎn)樣，室溫干燥后測(cè)定，并采用內(nèi)標(biāo)法校正。

1.3spkp-35的氨基酸序列測(cè)定

spkp-35氨基酸序列測(cè)定采用n-端edman降解法在appliedbiosystems公司491a型氣相測(cè)序儀上完成。測(cè)30個(gè)循環(huán)，采用儀器配備的標(biāo)準(zhǔn)程序測(cè)序，在線hplc檢測(cè)，準(zhǔn)確讀出spkp-35的氨基酸序列。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1spkp-35的分離純化

由于廣西纓毛蛛成分非常復(fù)雜，通常采用二維色譜的方法分離純化毒素多肽：即首先經(jīng)過陽離子交換分離粗毒后，洗脫成分進(jìn)一步采用反相hplc分離純化。二維色譜是一種非常有效的分離純化的方法，通過陽離子交換hplc以及反相hplc兩步分離，我們從廣西纓毛蛛粗毒中成功分離到spkp-35。圖1是廣西纓毛蛛粗毒的陽離子交換hplc圖譜，在280nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，可觀察到8個(gè)非常明顯的洗脫峰，其中第3個(gè)峰是目的峰。收集此峰后，在akta純化系統(tǒng)上進(jìn)行脫鹽處理所得圖譜見圖2。收集目的峰并冷凍干燥后，在alliance系統(tǒng)上進(jìn)行再次反相hplc（見圖3）。圖中顯示含spkp-35的洗脫峰為單一峰，通過質(zhì)譜鑒定它們的純度達(dá)到98%以上。

2.2質(zhì)譜分析

洗脫峰用maldi-tof質(zhì)譜分析表明所含組分單一。經(jīng)鑒定spkp-35的分子量為4120.8da，樣品純度達(dá)到98%以上，說明目的肽的分離純化是很成功的。

2.3氨基酸序列分析

spkp-35的序列測(cè)定在491-a測(cè)序儀上進(jìn)行。測(cè)序之前對(duì)spkp-35進(jìn)行碘乙酰胺烷基化修飾，結(jié)果表明，spkp-35是單鏈多肽分子，由36個(gè)氨基酸殘基組成，其中包括6個(gè)cys。spkp-35含有6個(gè)半胱氨酸，形成三對(duì)二硫鍵。蜘蛛抑鉀肽-35的n端第2位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之間，n端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之間，n端第15位半胱氨酸和第29位半胱氨酸之間分別形成二硫鍵。spkp-35是新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)序列獨(dú)特的蜘蛛毒素分子，spkp-35與其它ick模體毒素半胱氨酸殘基位置非常保守，因此spkp-35也是一種ick模體多肽毒素。

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<110>長(zhǎng)沙沁才生物科技有限公司

<120>一種天然活性多肽spkp-35的制備方法

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<213>廣西纓毛蛛(chilobrachysguangxiensis)

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