本發(fā)明屬于藥物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種β2-ar激動和抗炎雙功能生物堿及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是嚴重危害人類健康的常見病和多發(fā)病。據(jù)who估計，全球哮喘病的患者高達2.75億人。流行病學(xué)調(diào)查分析，呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病率占總?cè)丝诨疾÷实?6％，占城市總死亡率的第三位，哮喘發(fā)病率在工業(yè)化國家中約為5％。隨著全球范圍內(nèi)的空氣污染和環(huán)境惡化，哮喘的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升態(tài)勢，全球范圍內(nèi)，每年有超過18萬人死于哮喘。哮喘已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。

哮喘為慢性非特異性氣道炎癥性疾病，由多種炎性細胞和細胞組分參與、涉及多種炎性介質(zhì)和細胞因子、以氣道高反應(yīng)性和氣道痙攣為特征。哮喘病因復(fù)雜，包括病毒和細菌感染、過敏、某些藥物或刺激性物質(zhì)誘發(fā)的支氣管痙攣等，其發(fā)病機制至今尚未完全明確。

擴張支氣管快速緩解癥狀和長期抗炎控制是治療哮喘的兩大策略。支氣管擴張藥主要包括β2-ar激動劑和茶堿類藥物；抗炎藥主要包括糖皮質(zhì)激素和抗白三烯類藥物，其中β2-ar激動劑和糖皮質(zhì)激素是哮喘防治指南推薦的一線藥物。由于單用、長期使用激素易產(chǎn)生骨質(zhì)疏松、高血壓、糖尿病、下丘腦-垂體-腎上腺軸抑制、肥胖、白內(nèi)障、青光眼等諸多副作用，糖皮質(zhì)激素/β2-ar激動劑復(fù)合制劑具有協(xié)同抗炎平喘作用，可減少大劑量糖皮質(zhì)激素用量，已成為抗哮喘創(chuàng)新藥物研發(fā)方向之一，如布地奈德/福莫特羅、氟替卡松/沙美特羅復(fù)合制劑，但這類藥物仍不適用于激素抵抗型哮喘患者，新型β2-ar激動和抗炎雙功能抗哮喘藥物有待發(fā)現(xiàn)。

腎上腺素受體(ar)包括α受體(包括α1和α2兩種亞型)和β受體(包括β1、β2和β3三種亞型)，其區(qū)別在于偶聯(lián)的g蛋白種類不同，激活的酶系不同，產(chǎn)生的第二信使物質(zhì)和生物效應(yīng)不同。β2-ar激動劑是擴張支氣管的首選藥物，其作用機制是與氣道平滑肌細胞表面具有高親和力狀態(tài)的β2-ar結(jié)合，導(dǎo)致跨膜蛋白在胞漿的末端部分發(fā)生構(gòu)型重排，激活腺苷酸環(huán)化酶(ac)，在激活的ac作用下三磷酸腺苷(atp)轉(zhuǎn)變成3,5-環(huán)磷酸腺苷(camp)，使camp在細胞內(nèi)的濃度增加；camp通過使胞內(nèi)的鈣離子外排，造成胞內(nèi)粗細絲微細結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致肌節(jié)延長，使氣道平滑肌松弛，從而達到支氣管解痙的目的。此外，β2-ar激動劑可通過抑制炎性細胞扣押、聚集、黏附、炎癥介質(zhì)的合成與釋放等對哮喘氣道炎癥亦具有拮抗作用。由于β2-ar激動劑可快速緩解氣道痙攣癥狀，且具有抗氣道炎癥等作用，已成為哮喘治療的首選藥物。

馬齒莧(portulacaoleraceal.)廣布于全世界溫帶和熱帶地區(qū)，在我國和其他許多國家作為藥食兩用植物使用。馬齒莧具有清熱解毒、抗菌消炎、散血消腫等功效。生物堿是馬齒莧中的一類重要的化學(xué)成分，而且其結(jié)構(gòu)類型眾多。本申請發(fā)明人在前期研究中從馬齒莧中分離得到多種結(jié)構(gòu)新穎的生物堿，如四氫異喹啉類酰胺生物堿(馬齒莧酰胺e)，以及吲哚啉類酰胺生物堿(馬齒莧酰胺a、b、c、d、f、g)等，并且研究發(fā)現(xiàn)上述生物堿具有體外自由基清除活性、體外神經(jīng)元細胞保護作用和抗老年癡呆作用。但目前尚未有關(guān)于從馬齒莧中分離得到具有β2-ar激動和抗炎雙功能活性的兒茶酚胺類生物堿的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種β2-ar激動和抗炎雙功能生物堿及其應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一方面，提供一種式i或式ii所示的生物堿，其類似物、異構(gòu)體、消旋體或者衍生物；

其中，r為氫、羥基、甲氧基或烷基；所述烷基優(yōu)選為甲基或乙基；

r1為氫或烷基；所述烷基優(yōu)選為甲基或乙基；

r2為氫或烷基；所述烷基優(yōu)選為甲基或乙基；

r3為呋喃環(huán)、被取代的呋喃環(huán)、根據(jù)電子等排定律改造的可以被取代的噻吩環(huán)、吡咯環(huán)或c1-c10的脂肪鏈；

r4為h、羥基、甲氧基或烷基；所述烷基優(yōu)選為甲基或乙基；

r5為h、羥基、甲氧基或烷基；所述烷基優(yōu)選為甲基或乙基。

優(yōu)選的，r、r1、r2、r4、r5均為h。

優(yōu)選的，上述式i或式ii所示的生物堿，其類似物、異構(gòu)體、消旋體或者衍生物選自如下化合物：

本發(fā)明的第二方面，提供式i、式ii或式iii所示的生物堿在制備β2-腎上腺素受體激動劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第三方面，提供式i、式ii或式iii所示的生物堿在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第四方面，提供式i、式ii或式iii所示的生物堿在制備β2-ar激動和抗炎雙功能藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第五方面，提供式i、式ii或式iii所示的生物堿在制備治療和/或預(yù)防與激動腎上腺素受體相關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用。

所述與激動腎上腺素受體相關(guān)的疾病包括：哮喘性疾病或其它相關(guān)炎癥性疾病。

所述哮喘性疾病包括：哮喘性支氣管炎、肺氣腫、支氣管哮喘、夜間哮喘、運動性哮喘或慢性阻塞性肺病。

本發(fā)明的第六方面，提供一種β2-腎上腺素受體激動劑，其活性成分為上述式i或式ii所示的生物堿，其類似物、異構(gòu)體、消旋體或者衍生物。

本發(fā)明的第七方面，提供一種治療炎癥性疾病的藥物，其活性成分為上述式i或式ii所示的生物堿，其類似物、異構(gòu)體、消旋體或者衍生物。

本發(fā)明的第八方面，提供一種治療哮喘性疾病的藥物，其活性成分為上述式i或式ii所示的生物堿，其類似物、異構(gòu)體、消旋體或者衍生物。

本發(fā)明的第九方面，提供一種β2-ar激動和抗炎雙功能藥物，其活性成分為上述式i或式ii所示的生物堿，其類似物、異構(gòu)體、消旋體或者衍生物。

上述技術(shù)方案具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明首次從馬齒莧中分離得到具有β2-ar激動和抗炎雙功能活性的兒茶酚胺類生物堿，其結(jié)構(gòu)如式i和式ii所示。

(2)本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)了申請人之前從馬齒莧中分離得到的生物堿oleraceine(馬齒莧酰胺e)的新用途，其具有較好的β2-ar激動和抗炎雙功能活性。

基于上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的具有β2-ar激動和抗炎雙功能生物堿為治療哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病及相關(guān)的炎癥性疾病提供了有用的化合物。

附圖說明

構(gòu)成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本申請的進一步理解，本申請的示意性實施例及其說明用于解釋本申請，并不構(gòu)成對本申請的不當限定。

圖1：實施例2中化合物對β2-ar受體的激動效應(yīng)。

圖2：實施例3中化合物的抗炎活性及對lps刺激raw264.7巨噬細胞存活率的影響。

具體實施方式

應(yīng)該指出，以下詳細說明都是示例性的，旨在對本發(fā)明提供進一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術(shù)語僅是為了描述具體實施方式，而非意圖限制根據(jù)本發(fā)明的示例性實施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當理解的是，當在本說明書中使用術(shù)語“包含”和/或“包括”時，其指明存在特征、步驟、操作和/或它們的組合。

正如背景技術(shù)所介紹的，現(xiàn)有技術(shù)中尚未有關(guān)于從馬齒莧中分離得到具有β2-ar激動和抗炎雙功能活性的兒茶酚胺類生物堿的報道。基于此，本發(fā)明提出了一種β2-ar激動和抗炎雙功能生物堿及其應(yīng)用。

本發(fā)明首次從馬齒莧中分離得到具有β2-ar激動和抗炎雙功能活性的兒茶酚胺類生物堿(新化合物9、10、11)，這類生物堿骨架類型包括四氫異喹啉、二氫異喹啉；二氫異喹啉或者四氫異喹啉的c1位與呋喃環(huán)、芐基及脂肪鏈等取代基連接。其結(jié)構(gòu)與臨床哮喘治療藥物曲托喹酚結(jié)構(gòu)相似，均具有兒茶酚胺母核。

在本發(fā)明的一種實施方案中，通過鈣離子熒光檢測技術(shù)并結(jié)合穩(wěn)定表達β2-ar受體的cho-k1/ga15/adrb2細胞模型，檢測各化合物對β2-ar的激動活性。

在本發(fā)明的另一種實施方案中，采用lps刺激raw264.7小鼠巨噬細胞系，檢測各化合物的抗炎活性。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從馬齒莧中分離得到的兒茶酚胺類生物堿具備不同強度的激動β2-ar作用和抗炎雙功能，其中新化合物11和已知生物堿oleraceine的β2-ar激動和抗炎雙功能活性最為顯著，從而完成了本發(fā)明。

為了使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更加清楚地了解本發(fā)明的技術(shù)方案，以下將結(jié)合具體的實施例詳細說明本發(fā)明的技術(shù)方案。

實施例1：化合物9、10、11的分離

由于化合物9、10、11為新的化合物，本發(fā)明提供了從馬齒莧中分離純化化合物9、10、11的制備方法及其結(jié)構(gòu)表征數(shù)據(jù)。

一、新化合物9、10、11的分離制備方法

馬齒莧藥材4kg，用6倍量60％的乙醇，加熱回流提取3次，每次1h，合并三次提取液，濃縮至8l(濃度為0.5g生藥/ml)，靜置，取上清液上樣于兩根聚酰胺色譜柱(60cm×10cm,800g)，依次用水、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、80％乙醇、95％乙醇、25％氨水:80％乙醇(1:7)梯度洗脫，洗脫流分經(jīng)過薄層及hplc對比，將其合并為9個流份，編號為frs.1-9。將frs.1與frs.2合并，共634.5g，分散在1l水中，依次用等量的乙酸乙酯和正丁醇各萃取三次，得到乙酸乙酯相(11.4g)和正丁醇相(52.0g)。

正丁醇相(52.0g)過正相硅膠柱(800g，6×25cm)，用乙酸乙酯-甲醇(9:1～0:10)梯度洗脫，得到流分cfr(1-3)(9.62g)和cfr(4-12)(24.8g)。

cfr(4-12)(24.8g)過聚酰胺柱(100-200目，10×30cm)，依次用含1％甲酸的石油醚-乙酸乙酯(9:1～0:10)梯度洗脫和乙酸乙酯-甲醇(9:1～0:10)梯度洗脫，得到10個流分。

①其中cfr(4-12)-(40-60)(9.6g)過聚酰胺柱(100-200目，6×50cm)，依次用含石油醚-乙酸乙酯(9:1～0:10)梯度洗脫和乙酸乙酯-甲醇(9:1～0:10)梯度洗脫，得到10個流分。其中cfr(4-12)-(40-60)-(23-38)(2.00g)過mci柱(4×30cm)，用水-甲醇(95:5～0:10)梯度洗脫，得到12個流分，其中cfr(4-12)-(40-60)-(23-38)-(19-21)(25mg)過凝膠柱(2×120cm)，甲醇洗脫得到化合物11(4mg)。

②其中cfr(4-12)-(61-70)(1.72g)過聚酰胺柱(100-200目，4.5×35cm)，依次用含石油醚-乙酸乙酯(9:1～0:10)梯度洗脫和乙酸乙酯-甲醇(20:1～0:10)梯度洗脫，得到10個流分，cfr(4-12)-(61-70)-(13-19)(506mg)過聚酰胺柱(100-200目，6×50cm)，依次用含石油醚-乙酸乙酯(9:1～0:10)梯度洗脫和乙酸乙酯-甲醇(9:1～0:10)梯度洗脫，得到5個流分，cfr(4-12)-(61-70)-(13-19)-(8-10)(112mg)過反相柱(3.0×33cm)，用水-甲醇(95:5～0:10)梯度洗脫，得到10個流分，cfr(4-12)-(61-70)-(13-19)-(8-10)-(6-10)(14mg)過凝膠柱(2.5×150cm)，甲醇洗脫，得到化合物10(3mg)。

③其中cfr(4-12)-(71-77)(2.88g)過聚酰胺柱(100-200目，4.5×35cm)，依次用含石油醚-乙酸乙酯(9:1～0:10)梯度洗脫和乙酸乙酯-甲醇(20:1～0:10)梯度洗脫，得到15個流分，cfr(4-12)-(71-77)-(5-10)(450mg)過聚酰胺柱(100-200目，4.5×35cm)，用水-甲醇(10:0～7:3)梯度洗脫得到2個流分，cfr(4-12)-(71-77)-(5-10)-(1-4)(180mg)過反相硅膠柱(4.0×20cm)，用水-甲醇(95:5～0:10)梯度洗脫，得到化合物9(5mg)。

二、新化合物9、10、11的數(shù)據(jù)表征

1.化合物9:(s)-(-)-3-(6,7-二羥基-1,2,3,4-四氫異喹啉-1-基)丙酸乙酯的數(shù)據(jù)表征

化合物9的結(jié)構(gòu)式

化合物9:白色粉末；溶于甲醇、水，不溶于石油醚。聚酰胺薄層板以乙酸乙酯-甲醇4:1為展開劑，rf＝0.31；碘熏顯紅棕色，0.5％三氯化鐵乙醇溶液呈棕色。[α]²⁰d–18.6°(c0.04,meoh)；hr-p-esi-msm/z266.1393[m+h]⁺(calcd.forc14h20no4,266.1348),hr-n-esi-msm/z264.1233[m-h]^-(calcd.forc14h18no4,264.1236)；¹hnmr(600mhz,d2o)δ:4.30(1h,s,h-1),3.38(1h,s,h-3a),3.19(1h,s,h-3b),2.80(2h,s,h-4),6.54(1h,s,h-5),6.55(1h,s,h-8),2.15(1h,s,h-1′a),2.06(1h,s,h-1′b),2.40(2h,s,h-2′),3.91(2h,q,j6.0hz,h-5′),1.04(3h,s,h-6′)；¹³cnmr(150mhz,d2o)δ:54.0(c-1),38.8(c-3),23.7(c-4),115.7(c-5),144.0(c-6),142.9(c-7),113.7(c-8),122.7(c-9a),123.8(c-10b),27.7(c-1′),29.7(c-2′),174.9(c-3′),61.9(c-5′),13.1(c-6′).

2.化合物10:1-(5-羥甲基呋喃-2-基)-6,7-二羥基-3,4-二氫異喹啉的數(shù)據(jù)表征

化合物10的結(jié)構(gòu)式

化合物10:紅色粉末，易溶于甲醇、水，難溶于乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚。在聚酰胺薄膜上以乙酸乙酯-甲醇(4:1)展開，rf值為0.55，自然光下顯紅色斑點，0.5％三氯化鐵乙醇溶液呈棕色，碘化鉍鉀溶液顯紅色。hr-esi-msm/z260.0917[m+h]⁺(calcd.forc14h14no4,260.0923).ir:3202,1504,1612,1077cm^-1；¹hnmr(600mhz,d2o)δ:3.56(2h,t,j7.2hz,h-3),2.77(2h,t,j7.2hz,h-4),6.51(1h,s,h-5),7.16(1h,s,h-8),7.22(1h,d,j3.6hz,h-3′),6.61(1h,d,j3.6hz,h-4′),4.61(2h,s,h-6′)；¹³cnmr(150mhz,d2o)δ:154.5(c-1),39.6(c-3),25.7(c-4),117.3(c-5),165.4(c-6),146.0(c-7),115.6(c-8),136.9(c-9a),109.3(c-10b),143.9(c-2′),124.1(c-3′),111.5(c-4′),160.3(c-5′),55.9(c-6′).

3.化合物11:1-(呋喃-2-基)-6,7-二羥基-3,4-二氫異喹啉的數(shù)據(jù)表征

化合物11的結(jié)構(gòu)式

化合物11：紅色粉末，易溶于甲醇、水，難溶于乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚。在聚酰胺薄膜上以乙酸乙酯-甲醇4:1展開，rf值為0.65，自然光下顯紅色斑點，0.5％三氯化鐵乙醇溶液呈棕色，碘化鉍鉀溶液顯紅色。hr-esi-msm/z230.0818[m+h]⁺(calcd.forc13h12no3,230.0817),hr-esi-msm/z228.0669[m-h]^-(calcd.forc13h10no3,228.0661),457.1336[2m-h]^-(calcd.forc26h21n2o6,457.1400)；¹hnmr(600mhz,d2o)δ:3.69(2h,t,j6.0hz,h-3),2.77(2h,t,j6.0hz,h-4),6.81(1h,s,h-5),7.35(1h,s,h-8),7.43(1h,br.s,h-3′),6.78(1h,br.s,h-4′),7.94(1h,br.s,h-5′)；¹³cnmr(150mhz,d2o)δ:156.7(c-1),39.8(c-3),24.7(c-4),115.9(c-5),155.0(c-6),143.9(c-7),118.2(c-8),135.0(c-9a),114.2(c-10b),143.7(c-2′),125.4(c-3′),114.2(c-4′),150.5(c-5′).

實施例2：馬齒莧中兒茶酚胺類生物堿激動β2-ar受體的活性篩選

一、實驗材料、試劑與實驗系統(tǒng)

1.待測化合物

14個化合物(化合物9、10、11為從馬齒莧中分離得到的新化合物，其他的化合物為已知的化合物)在-20℃下保存以備用。實驗時，所有待測化合物均用dmso溶解制成儲液，檢測時用hbss-20mmhepes緩沖液進行稀釋，配制成相應(yīng)濃度的工作濃度。

2.試劑

穩(wěn)定表達β2-ar受體的cho-k1/ga15細胞株(genscript，m00308)；calcium4測定試劑盒(moleculardevices，120726-200)；probenecid(sigma，p8761)；dmso(amresco，1988b176)；isoproterenol(sigma，i6504)。

3.實驗系統(tǒng)

穩(wěn)定表達β2-ar受體的cho-k1/ga15細胞培養(yǎng)于10cm培養(yǎng)皿中，在37℃/5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞匯合度達到85％時，進行消化處理，將收集到的細胞懸液接種到384微孔板，即可用于實驗。

(1)細胞培養(yǎng)條件：

cho-k1/ga15/adrb2細胞系常規(guī)培養(yǎng)，傳代在含有10％胎牛血清和100μg/mlhygromycinb，200μg/mlzeocin的ham’sf12中。

(2)化合物的配制：

在檢測前，用hbss-20mmhepes稀釋待測化合物，配制成五倍于檢測濃度的溶液。所有檢測濃度中dmso對照為0.1％，化合物最高檢測濃度為100μm，三復(fù)孔。

二、檢測方法

1.鈣流檢測的準備工作

激動劑檢測的準備工作方案為：將細胞接種到384微孔板，每孔接種20μl細胞懸液含1.5萬個細胞，放置到37℃/5％co2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，18個小時后將細胞取出，加入染料，每孔20μl，然后將細胞板放到37℃/5％co2培養(yǎng)箱孵育1個小時，最后于室溫平衡15分鐘。檢測時加入10μl5×檢測濃度的激動劑檢測rfu值。

2.鈣流信號檢測

將裝有化合物溶液(5×檢測濃度)的384微孔板，細胞板和槍頭盒放到flipr^tetra(moleculedevices)內(nèi)，運行檢測程序，儀器總體檢測時間為120秒，在第21秒時自動將激動劑10μl加入到細胞板內(nèi)。

3.數(shù)據(jù)分析

通過screenworks(version3.1)獲得原始數(shù)據(jù)以*fmd文件保存。數(shù)據(jù)采集和分析使用excel和graphpadprism6軟件程序。對于每個檢測孔而言，以1到20秒的平均熒光強度值作為基線，21到120秒的最大熒光強度值減去基線值即為相對熒光強度值(△rfu)，根據(jù)該數(shù)值并依據(jù)以下方程可計算出激活百分比。

激活率(％)＝(△rfucompound-△rfubackground)/(△rfuagonistcontrol-△rfubackground)×100％

使用graphpadprism6用四參數(shù)方程對數(shù)據(jù)進行分析，從而計算出ec50值。四參數(shù)方程如下：y＝bottom+(top-bottom)/(1+10^(logec50/ic50-x)*hillslope))

x是濃度的log值，y是激動率。

三、實驗結(jié)果

檢測14個化合物對adrb2受體的激動活性，化合物最高檢測濃度為100μm，三復(fù)孔。

化合物對β2-ar受體的激動效應(yīng)見圖1a-d，結(jié)果表明，新化合物11(91.77±2.78％)>化合物13(90.83±5.98％)>化合物1(多巴胺，86.42±8.42％)>化合物8(70.89±9.13％)>新化合物10(70.60±5.18％)>化合物3(oleraceine，70.20±1.93％)>新化合物9(42.03±2.70％)>化合物6(41.06±3.80％)>化合物2(39.25±3.55％)>化合物5(37.70±3.62％)>化合物7(豬毛菜堿，35.47±1.14％)>新化合物12(11.44±5.77％)>化合物4(0.49±2.52％)>化合物30(-11.50±1.18％)，其中11、13、1、3、10、8活性強。

劑量效應(yīng)曲線(圖1c-d)首次發(fā)現(xiàn)13和11為高效β2-ar激動劑，其ec50值分別為87.86nm和5.125μm。

實施例3：馬齒莧中兒茶酚胺類生物堿對lps刺激raw264.7小鼠巨噬細胞系的抗炎活性篩選。

一、細胞培養(yǎng)：

raw264.7小鼠巨噬細胞株購自中科院上海細胞庫(atcc)；用含10％胎牛血清、100μg/ml的鏈霉素、100u/ml青霉素的dmem培養(yǎng)液，于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，隔天傳代，細胞于對數(shù)生長期呈半貼壁狀態(tài)生長。

二、一氧化氮(no)的測定：

raw264.7細胞接種于96孔板(8.0×10⁴細胞/孔)，培養(yǎng)1h后分別加入不同濃度的化合物及l(fā)ps(終濃度為1μg/ml)，同時設(shè)空白對照組。50和100μm3,4-二羥基-苯基異羥肟酸(3,4-dihydroxy-benzohydroxamicacid,didox)作為陽性對照。培養(yǎng)24h后，吸取100μl細胞上清液置于一個新的96孔板中，加入100μlgriess試劑[0.1％萘乙二胺溶液與1％磺胺(5％)磷酸溶液于用前12h等體積混合]，室溫放置15min，用酶標儀測定570nm的吸光度。根據(jù)亞硝酸鈉標準曲線計算no2^-的含量。由于no自由基不穩(wěn)定，在體內(nèi)和水溶液中極易氧化生成較穩(wěn)定的不易揮發(fā)的no2^-，在酸性條件下，其與磺胺發(fā)生重氮反應(yīng)，生成重氮化合物，后者進一步與萘乙二胺發(fā)生耦合反應(yīng)，該反應(yīng)生成的產(chǎn)物濃度與no2^-濃度具有線性關(guān)系，間接反應(yīng)了no的含量。

三、細胞存活率的測定：

為避免no測定出現(xiàn)假陽性結(jié)果，利用mtt法檢測化合物對raw264.7細胞的存活率是否存在影響。即在吸取培養(yǎng)液上清100μl測定no濃度后，于上述96孔板內(nèi)每孔加入100μl含0.4％mtt[即3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽]的dmem培養(yǎng)基，37℃孵育3h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入100μldmso，振搖至生成的藍色甲瓚結(jié)晶完全溶解后，用酶標儀測定570nm的吸光度值(a570)。

細胞存活率(％)＝100×試驗組平均a570值/空白對照組平均a570值。

四、實驗結(jié)果

化合物的抗炎活性及對lps刺激raw264.7巨噬細胞存活率的影響見圖2。實驗首次發(fā)現(xiàn)，馬齒莧中16個水溶性兒茶酚胺類生物堿對lps誘導(dǎo)raw264.7巨噬細胞no過量釋放均有不同程度的抑制活性(ec50值在17.96-497.67μm)。其中多巴胺(1)和生物堿11(新化合物)、3、9(新化合物)活性很強，其ec50值分別為17.96、18.12、35.36和36.33μm，強于已報道具有顯著抗炎活性的結(jié)構(gòu)類似物3,4-二羥基-苯甲羥肟酸(ec50＝82.39μm)

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。